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Methodenartikel

Ganz-Mount-Immunfärbung der fetalen und neonatalen Maus-Eierstöcke

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DOI:

10.3791/69455

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28. April 2026

 ,  ,  , 
1Department of Biology, Syracuse University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur vollständigen Immunkennzeichnung sich entwickelnder Maus-Eierstöcke mit Anwendungen auf andere Kleingewebe.

Zusammenfassung

Der Ovarialbestand besteht aus den Eizellen, die einem Weibchen zur Fortpflanzung zur Verfügung stehen und in primordialen Follikeln vorkommen, von denen jede eine Ezyte enthält, die von mehreren Granulosenzellen umgeben ist. Die Eizellen beginnen als primordiale Keimzellen, die außerhalb der Gonade entstehen und während der embryonalen Entwicklung zum sich entwickelnden Eierstock wandern. Sobald sie den Eierstock erreichen, bilden sie Oogonie und teilen sich durch Mitose mit unvollständiger Zytokinese, wodurch Cluster miteinander verbundener Zellen entstehen, die Keimzellzysten genannt werden. Während sie sich in Zysten befinden, treten die Zellen in die Meiose ein und werden zu Oocyten. Bei der Maus beginnen zwei Tage vor der Geburt die Zysten zu zerbrechen, und jede Eizelle wird in einen Primordialfollikel verpackt. Nur einige der Eizellen überleben während dieses Prozesses, der Rest durchläuft Apoptose. Die Regulation des Zystenabbaus und der Urfollikelbildung ist nur teilweise verstanden, und die Identifizierung der beteiligten Moleküle ist entscheidend, um diesen Prozess zu verstehen. Wholemount-Immunfärbung sich entwickelnder Maus-Eierstöcke kann verwendet werden, um die Lokalisierung potenzieller regulatorischer Moleküle zu bestimmen und die Auswirkungen auf die Primordiale Follikelbildung durch Mutationen oder andere molekulare Veränderungen mithilfe von Ozyten- und somatischen Zellmarkern zu bewerten. Die Eierstöcke werden von fetalen oder neonatalen Mäusen entnommen, in Formaldehyd fixiert und blockiert. Die Eierstöcke werden dann Antikörpern gegen ein interessiertes Protein ausgesetzt, gefolgt von sekundären Antikörpern, die zu einem fluoreszierenden Tag konjugiert sind und die primären Antikörper nachweisen. Abschließend werden die Eierstöcke montiert und mittels Konfokalmikroskopie untersucht. Dieses Verfahren kann mehrere interessante Proteine nachweisen und auch auf andere Kleingewüste, wie z. B. fetale Maustestien, angewendet werden.

Einleitung

Ganzmontierte Immunfärbung in Kombination mit konfokaler Bildgebung ist eine leistungsstarke Methode zur Analyse der Proteinexpression und Zellmorphologie in Kleingeweben, ohne1 zu schneiden. Bei dieser Methode werden Gewebe zunächst entnommen, fixiert und blockiert und anschließend Antikörpern gegen interessante Proteine ausgesetzt. Die Antikörper werden entweder direkt mit Fluorophoren konjugiert oder anschließend mit sekundären Antikörpern gekennzeichnet, die zu Fluorophoren konjugiert sind, welche die primären Antikörper erkennen. Das Gewebe wird anschließend mit dem fluoreszierenden Farbstoff 4',6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) inkubiert, um Zellkerne sichtbar zu machen. Dieser Schritt ist wichtig, um eine räumliche Ausrichtung bei der Bildgebung des Gewebes zu ermöglichen. Abschließend wird das Gewebe mit einer konfokalen Mikroskopie montiert und visualisiert. Eine weitere Technik, die zur Untersuchung der Gewebemorphologie verwendet wurde, besteht darin, das Gewebe in Paraffin einzubetten, zu schneiden und entweder mit Farbstoffen wie Hämatoxylin und Eosin oder mit Antikörpern zu markieren. Alternativ können gefrorene Schnitte vorbereitet und immungefärbt werden. Leider beinhalten beide Techniken das Segmentieren, was zum Verlust dreidimensionaler Informationen führt. Obwohl Serienschnitte helfen können, ist die Analyse mühsam und erfordert das Betrachten einer großen Anzahl von Abschnitten. Daher ist die gesamte Montierungsmethode vorteilhaft, da sie die dreidimensionale Struktur des Gewebes bewahrt, die durch optische Schnitte sichtbar werden kann.

Die Entwicklung von Urkeimzellen (PGCs) zu Eizellen und die Zusammensetzung der Eizellen zu Primordialfollikeln sind für die weibliche Fruchtbarkeit unerlässlich. PGCs entstehen extraembryonal und müssen während der embryonalen Entwicklung zum Eierstock wandern. Sobald die PGCs am Eierstock ankommen, beginnend etwa am embryonalen Tag (E) 10,5 bei der Maus, werden sie als Oogonia2 klassifiziert. Die Oogonien durchlaufen eine Mitose, jedoch mit unvollständiger Zytokinese, und bilden miteinander verbundene Zellcluster, sogenannte Keimzellzysten3. Oogonia tritt ab E 13,5 in die Meiose ein, um zu Ozyten zu werden, und schreitet von Prophase I bis zum Diplotenstadium voran. Während sich die Eizellen entwickeln, brechen die Zysten auseinander, sodass jede Ezyste von einer Schicht von Granulosenzellen umgeben wird, die primordiale Follikel bilden, die jeweils eine Diploten-gestoppte Eizelle4 enthalten. Ein Verlust einer großen Anzahl von Oozyten fällt mit dem Zystenabbau zusammen, was als wichtig für die Qualitätskontrolle während der Primordialfollikelbildung gilt. Die Anzahl der Diploten-gestoppten Oozyten in primordialen Follikeln bildet die Ovarialreserve der für die Fortpflanzung verfügbaren Ozyten und steht in direktem Zusammenhang mit der Fruchtbarkeit. Wenn die Follikelbildung gestört wird, könnte dies zu einem kleineren Eierstockvorrat führen und die Fortpflanzungslebensspanne der Frau begrenzen.

Die Whole-Mount-Immunfärbung wurde verwendet, um die Expression von Proteinen während der embryonalen, fetalen und neonatalen Oocytenentwicklung zu identifizieren und zu analysieren. Untersuchte Moleküle sind MSY2, SYCP3, ESR1, ESR2, CYP19A1, 3βHSD, KIT und STAT3 5,6,7,8,9. Diese Technik wurde auch umfangreich eingesetzt, um herauszufinden, wie die Primordialfollikelbildung reguliert wird. Fetale oder neonatale Eierstöcke wurden kultiviert und Signalmolekülen oder Inhibitoren ausgesetzt. Eizellen in kultivierten Eierstöcken durchlaufen eine primordiale Follikelbildung, ähnlich wie in vivo10. Die Eierstockkultur wurde erfolgreich eingesetzt, um die Steroidhormone6, 10, 11, KIT8 und PI3K-Signale12 während dieser Phase der Eierstockentwicklung zu untersuchen. Nach der Kultur wird eine Whole-Mount-Immunfärbung mit Antikörpern gegen DEAD-Box-Helikase 4 (DDX4, auch bekannt als Mouse vasa homolog (MVH)), ein im Zytoplasma der Eizellen exprimiertes Protein, angewendet. Die Eierstöcke werden anschließend mittels einer konfokalen Mikroskopie untersucht, um die Primordialfollikelbildung zu beurteilen.

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Protokoll

Alle Verfahren mit Mäusen wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Syracuse University überprüft und genehmigt. Das folgende Protokoll dient der Beschriftung neonataler Maus-Eierstöcke an den postnatalen Tagen 1–5 (siehe Abbildung 1 für den Schaltplan). Die Reagenzien und die verwendeten Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Ernten und Fixieren der Eierstöcke

  1. Euthanasie neonatale C57BL/6-Mäuse nach dem "Guide for the Care and Use of Laboratory Animals" des National Institutes of Health und den von der IACUC zugelassenen Tierprotokollen. Eierstöcke in 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) zerlegen.
    HINWEIS: Bei diesem Verfahren wurden Neugeborenenmäuse durch Enthauptung eingeschläfert, wie im IACUC-Tierprotokoll zugelassen. Männchen und Weibchen des C57BL/6-Mausstamms lassen sich bei Neugeborenen durch das Vorhandensein eines kleinen dunklen Flecks zwischen den anogenitalen Öffnungen bei Männchen unterscheiden. Um die Eierstöcke zu sezieren, schneiden Sie zuerst am Magen und nehmen Sie den Darm heraus. Dann öffnen Sie den Bauch mit einem Mittellinienschnitt zum Schwanz und machen Sie anschließend zwei horizontale Schnitte. Lokalisieren Sie die Eierstöcke unter jeder Niere, isolieren Sie jeden Eierstock und reinigen Sie überschüssiges Gewebe.
  2. Setzen Sie die Eierstöcke direkt in 600 μL 5,3 % Paraformaldehyd (PFA; 16 % EM-Grade PFA, verdünnt in 1x PBS) (Fix) in einem Mikrofugeröhrchen bei Raumtemperatur (RT). Inkubieren Sie die Eierstöcke über Nacht auf einem Nutator (O/N) bei 4 °C.
    VORSICHT: Paraformaldehyd ist giftig. Verwendung in einer Abzugshaube oder gut belüfteten Bereiche. Tragen Sie Handschuhe, Augenschutz und Schutzkleidung, um Haut- und Augenkontakt zu vermeiden. Entsorgen Sie als gefährlichen Abfall.
  3. Entferne Fixieren und wasche die Eierstöcke zweimal in 1 ml 0,1 % Triton X-100 in 1x PBS (PT) schnell, dann einmal in 1 ml PT mit Nutator für mindestens 30 Minuten bei RT. Inkubiere in 1 ml PT + 5 % BSA (Block) für mindestens 30 Minuten bei RT am Nutator oder lagere bis zu 2 Wochen bei 4 °C.

2. Inkubation mit primären und sekundären Antikörpern

  1. Inkubieren mit primärem Antikörper, verdünnt in 500 μl PT + 5 % BSA O/N bei 4 °C am Nutator. Dreimal mit 1 mL PT + 1 % BSA waschen, 30 Minuten mit RT auf Nutator.
    HINWEIS: Die Verdünnung hängt vom Antikörper ab. Die hier gezeigten repräsentativen Daten sind mit DDX4 verdünnt 1:200 gekennzeichnet. Antikörper gegen zwei verschiedene Proteine können gleichzeitig verwendet werden, solange die primären Antikörper in zwei verschiedenen Arten hergestellt werden und ein sekundärer nicht in der Art hergestellt wird, die die andere sekundäre erkennt (verwenden Sie keine Ziegen-Anti-Maus-Alexa 488 und Esel-Anti-Ziegen-Alexa 568).
  2. Während der Inkubation der Eierstöcke mit primärem Antikörper inkubieren Sie den verdünnten sekundären Antikörper mit einer Prise Embryopulver in 500 μL PT + 5 % BSA O/N bei 4 °C am Nutator (mit Folie bedeckt), um die unspezifische Bindung des sekundären Antikörpers zu reduzieren. Zentrifugieren Sie den sekundären Antikörper bei 6000 x g für 30 Sekunden, um das Restpulver am Boden zu sammeln. Achten Sie darauf, diese Rückstände beim Sekundärtransport auf das Probenröhrchen nicht anzuziehen.
    HINWEIS: Die Verdünnung hängt vom Antikörper ab. Die hier gezeigten repräsentativen Daten sind mit dem Ziegen-Anti-Kaninchen-Alexa 488 verdünnt 1:200 gekennzeichnet.
  3. Inkubieren Sie mit vorresorbiertem fluoreszierendem sekundären Antikörper (hergestellt in Schritt 2.2) für 2–4 Stunden bei RT am Nutator. Ab diesem Punkt mit Alufolie abdecken. Wasche dreimal mit 1 ml PT + 1 % BSA, für 30 Minuten bei RT auf einem Nutator.

3. Kerne mit DAPI beschriften und Eierstöcke auf einem Objektträger montieren

  1. Inkubiere in DAPI 1:1000 in PBS für 90 Minuten bei RT. Wasche einmal mit 1 mL 1x PBS.
  2. Übertrage die Eierstöcke auf einen Mikroskop-Objektträger mit einer breiten 200-μL-Mikropipettenspitze. Entfernen Sie überschüssiges PBS mit Nadel/Spritze. Gib 3 Tropfen Montagemedium auf die Eierstöcke.
  3. Tragen Sie vorsichtig einen Deckdeckel auf die Eierstöcke auf, damit das Montagematerial bis zu den Rändern des Deckdeckels verteilt wird. Versiegeln Sie die Ränder des Deckdeckels mit Nagellack und lassen Sie den Nagellack trocknen, lagern Sie ihn dann bei -20 °C.

4. Herstellung von Embryopulver

  1. Homogenisieren Sie ~ E 12,5–E 14,5 Mausembryonen in einem minimalen Volumen eiskalten 1x PBS. Füge 4 Bände eiskaltes Aceton hinzu, verrühre es und brüte 30 Minuten auf Eis.
    VORSICHT: Aceton ist entflammbar und irritant für Augen und Haut. Verwendung in einer Abzugshaube oder gut belüfteten Bereiche. Tragen Sie Handschuhe, Augenschutz und Schutzkleidung, um Haut- und Augenkontakt zu vermeiden. Entsorgen Sie als gefährlichen Abfall.
  2. Zentrifugiere bei 10.000 x g für 10 Minuten, entferne das Überlagerungsmittel und wasche das Pellet dann mit eiskaltem Aceton und drehe es erneut.
  3. Verteilen Sie das Pellet auf einem Filterpapier, legen Sie es in ein Plastikfach und lassen Sie O/N in einer chemischen Haube trocknen. Mahlen Sie es zu einem feinen Pulver, lassen Sie es vollständig an der Luft trocknen und lagern Sie es bei -20 °C.

5. Analyse der Proteinexpression mittels Konfokalmikroskopie

  1. Nach der Markierung des interessierten Proteins visualisieren Sie es mittels Konfokalmikroskopie. Zur Untersuchung der Proteinexpression verwenden wir typischerweise 3–4 Tiere (6–8 Eierstöcke) und machen mehrere Bilder von jedem Eierstock.
    HINWEIS: Die im Abschnitt repräsentativen Ergebnisse beschriebenen Bilder wurden entweder mit einem rotierenden Scheiben-konfokalen Mikroskop oder einem konfokalen Laserscanning-Mikroskop aufgenommen. Die verwendeten Parameter werden im Abschnitt über repräsentative Ergebnisse beschrieben und variieren je nach verwendetem Mikroskop.

6. Analyse der Primordialfollikelbildung und -entwicklung mittels Konfokalmikroskopie

  1. Nach der Markierung der Eierstöcke für einen zytoplasmatischen Oocytenmarker wie DDX4 werden für jeden Eierstock zufällig zwei Bereiche oder "Kerne" zur Visualisierung zugewiesen.
    HINWEIS: Ein Kern besteht aus 4 Hauptoptischen Abschnitten, die 212 × 212 μm groß sind und jeweils durch eine Tiefe von 15–20 μm getrennt sind. Die vier optischen Abschnitte decken sowohl den Kortex als auch die Medulla ab, um sicherzustellen, dass alle Bereiche des Eierstocks untersucht werden. Für jeden Eierstock gibt es 2 Kerne mit 4 optischen Schnitten, insgesamt 8 Schnitte (siehe Abbildung 2).
  2. Nach der Abbildung des Hauptoptischen Abschnitts zur Analyse wird ein Z-Stack mit 5 Bildern oben und 5 Bildern unter dem Hauptabschnitt aufgenommen, jeweils 1 μm auseinander. Für jeden Hauptabschnitt zählen Sie die Gesamtzahl der Eizellen im Schnitt
  3. Dann bestimmen Sie für jede Eizelle im Hauptabschnitt, ob sie mit einer anderen Ezyzyt assoziiert ist, indem Sie den Hauptabschnitt sowie den Stapel der Schnitte untersuchen, um festzustellen, ob die Eizellen im Hauptabschnitt mit Eierzellen oberhalb oder unterhalb der Fokusebene assoziiert sind. Schließlich bestimmen Sie für jede einzelne Eizelle das Entwicklungsstadium der Follikel (primordial, primär oder sekundär).
    HINWEIS: Es wird empfohlen, mindestens 4 Tiere (8 Eierstöcke) zu analysieren, um statistisch signifikante Daten zu erhalten.

7. Verwendung von Propidiumiodid als alternativen Kernmarker

  1. Nach Schritt 2.3 inkubieren Sie 30 Minuten in 0,1 mg/ml RNase A (10 μL 10 mg/ml in 1 mL PT + 1% BSA). Entfernen Sie RNase A und inkubieren Sie in 10 μg/mL Propidiumiodid (10 μL von 1 mg/mL in 1 mL PT + 1% BSA) für 20 Minuten bei RT auf einem Nutator. Decken Sie ab dieser Stelle das Rohr mit Folie ab.
    VORSICHT: Propidiumiodid ist giftig und mutagen. Verwendung in einer Abzugshaube oder gut belüfteten Bereiche. Tragen Sie Handschuhe, Augenschutz und Schutzkleidung, um Haut- und Augenkontakt zu vermeiden. Entsorgen Sie als gefährlichen Abfall.
    HINWEIS: Toto-3 kann auch als nuklearer Marker verwendet werden.
  2. Entferne Propidiumiodid und wasche 30 Minuten in 1 ml PT + 1 % BSA. Überspringen Sie Schritt 3.1 (DAPI-Verfärbung).

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Ergebnisse

Typische Ergebnisse der hier beschriebenen Immunfärbungsmethode sind dargestellt. Die Bilder in Abbildung 3, Abbildung 4, Abbildung 5 und Abbildung 6 wurden mit einem rotierenden Scheibenkonfokalmikroskop mit einem 40-fachen Ölobjektiv, NA 1,3, aufgenommen, mit einer Belichtungszeit zwischen 100–250 ms und einer Laserleistung zwischen 0,01 und 0,1 %. In...

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Diskussion

Dieser Bericht beschreibt eine Methode, um ganze Eierstöcke fluoreszierend auf interessante Proteine zu markieren. Dieses Verfahren wurde umfassend verwendet, um die Expression von Proteinen während der Primordialfollikelbildung zu bestimmen und auch Veränderungen in der Follikelbildung unter verschiedenen Bedingungen zu charakterisieren 4,5,6,7,8,9,10,11....

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Die Bildgebung wurde im Blatt Imaging Center der Syracuse University durchgeführt. Die Bilder in Abbildung 7 stammen von einem Zeiss LSM980 mit Airyscan2, unterstützt von NIH S10 OD026946-01A1. Diese Arbeit wurde durch Fördermittel R03 HD102016 und R21 HD112756 vom NIH (an MEP) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
anti-menschliches VASA (hergestellt in Ziege)R& DAF2030
Anti-DDX4/MVH (hergestellt in Kaninchen)Abcamab13840
Anti-GCNA1/TRA98 (hergestellt in RAT)Abcamab82527
Rinderserum-Albumin (BSA)FisherBP-1600
Deckungszettel 22 x 22 #1,5Warner Instruments64-0721
DAPI (Pulver)Sigma AldrichD-9542Bereite eine 5 mg/ml Lösung in dH2O vor.
Sektionsbereich
Esel-Anti-Ziegen-Alexa 568InvitrogenA11057
Donkey Anti-Maus Alexa 488InvitrogenA21202
Esel-Anti-Kaninchen-Alexa 568InvitrogenA10042
Esel-Anti-Kaninchen-Alexa 647InvitrogenA31573
Esel-Anti-Ratten-Alexa 488InvitrogenA21208
Ethanol 200 ProofPharmco111000200
Feine Schere – ScharfFeine wissenschaftliche Werkzeuge14060-09Für feine Arbeiten zum Entfernen des Eierstocks und zum Kürzen überschüssigem Gewebe
Pinzette (Dumont-Pinzette, Stil 5)Elektronenmikroskopie-Wissenschaft72705-01 (0209-5-PO)
Ziegen-Anti-Kaninchen-Alexa 488InvitrogenA11008
Mikrozentrifugenröhren 1,5 mLThermowissenschaftlich3451PK
Mikroskop-ObjektträgerFisherbrand12-550-123
Nutierender MixerLabNetS0500
Paraformaldehyd 16 %Elektronenmikroskopie-Wissenschaft15710
Petrischalen 100 x 15 mmBioplastherstellung940-10774
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung 1X(Fisher) S271-1;                   (Sigma) P9541-500G; (Fisher) BP332-500; (Fisher) P285-500800 mL MQ H2O                            80 g NaCl                                        2.0 von KCl                                                14,4 g Na2HPO4                  2,4 g KH2PO4                  Stelle den pH-Wert mit HCl auf 7,4 ein; Endvolumen 1 L Dann von 10X auf 1X verdünnen für die Verwendung
StifthalterFeine wissenschaftliche Werkzeuge26016-12um eine gerade Nadel in einer leichten Krümmung zu halten
PipettenfilterspitzenOneTip(10uL) 1121-3810;                           (20 uL) 1120-1810;                   (200 uL) 1120-8810;         (1000 uL XL) 1122-1830
PipettenspitzenOneTIp(10 uL) 1111-3800;                   (200 uL) 1111–1800;         (1250 uL) 1112–1820
Pipetten 0,2-2, 2-20, 20-200, 100-1000Gilson(0,1–2 μL) F144054M;       (2-20 μL) F144056M;     (20–200 μL) F144058M;       (100–1000 uL) F144059M
Propidiumiodid, 1 mg/ml in dH2OInvitrogenP3566
RNase A-PulverSigma AldrichRG513-50mgBereite eine 10 mg/ml-Lösung in 0,1 M Natriumacetat (pH 5,2) vor. Erhitze auf 100 OC für 15 Minuten. Kühlen zum RT und pH-Wert anpassen, indem man 0,1 Volumen von 1 M Tris-Cl (pH 7,4) hinzufügt.
Gerade NadelGerade Nadel in eine Krümmung gebogen, um überschüssiges Gewebe vom Eierstock abzutrennen
Triton X-100ThermowissenschaftlichX100-100ML
Tuberkulinspritze 28G x 1/2Tyco/Gesundheitswesen Kendall-Monojekt1180128012
VectashieldVektorlaboratorienH-1900
Wagner-SchereFeine wissenschaftliche Werkzeuge14068-12Für Enthauptung und größere Schnitte
Breite Rohrpipettenspitze 20 μlLabCon1026-965-008-9

Referenzen

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