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Methodenartikel

Nagetier-Nierenexplantierung und Etablierung der primären ureterischen Knospe-Epithelzellkulturen

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DOI:

10.3791/69462

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30. Dezember 2025

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1Stem Cells and Metabolism Research Program Unit, Faculty of Medicine, University of Helsinki, 2GM Unit, Helsinki Institute of Life Science, University of Helsinki, 3Department of Pediatric Surgery, Section of Pediatric Urology, New Children's Hospital, Helsinki University Hospital, 4Laboratory Animal Centre, University of Helsinki

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Etablierung der am häufigsten verwendeten Säugetier-Nierenkultur, die das Nierenwachstum und die Differenzierung in einem Trowell-ähnlichen Luft-Flüssigkeit-Interphasensystem ermöglicht. Wir erläutern außerdem, wie man primäre ureterische Knospe-Epithelzellkulturen aus den frühen Nierenrudimenten aufbaut.

Zusammenfassung

Die sich entwickelnde Niere ist ein weit verbreitetes Modellsystem zur Untersuchung der Organogenese von Säugetieren. Die Nierendifferenzierung wird durch reziproke induktive Gewebewechselwirkungen zwischen Mesenchym, Stroma und Epithel orchestriert. Die verzweigte Morphogenese der epithelialen Harnstoffknospen fördert nicht nur das embryonale Nierenwachstum und 3D-Musterbildung, sondern induziert auch Übergänge vom Mesenchym zum Epithel im umliegenden Nephron-Vorläuferpool, wodurch die für die funktionelle Filtration erforderliche Nephronbildung gewährleistet wird.

Kritische Entscheidungen über das Zellschicksal in allen drei Gewebeschichten – Epithel, Mesenchym und Stroma – bilden die Grundlage für ein dynamisches Gleichgewicht zwischen der Selbsterneuerung der Vorläufer und dem Differenzierungsgleichgewicht. Diese komplexen, mehrschichtigen regulatorischen Interaktionen hängen von Natur aus von der strukturellen Integrität des Organs ab, weshalb intakte Nierenmodelle für die Untersuchung morphogenetischer Prozesse und zellulärer Verhaltensweisen im natürlichen Kontext unerlässlich sind.

Methoden der Nierenorgankultur bieten aufschlussreiche Plattformen, um Entwicklungsprozesse zu visualisieren und morphologische, zelluläre und molekulare Mechanismen zu analysieren, die die Nierendifferenzierung steuern. Es gibt verschiedene Methoden zur Nierenkultur, die jeweils unterschiedliche Vorteile bieten. In diesem Artikel erläutern wir die Einrichtung eines traditionellen Trowell-ähnlichen Luft-Flüssigkeits-Interphasenkultursystems für die In-vitro-Nierenentwicklung . Um die Auflösung zellulärer und molekularer Analysen zu verbessern, beschreiben wir außerdem den Aufbau einer primären ureterischen Knospenepithelzellkultur, die gezielte Untersuchungen epithelialer Mechanismen ermöglicht.

Abschließend zeigen wir, dass die traditionelle Technik der Nierenorgankultur auf die embryonale Niere eines neuartigen Modellorganismus, der Stachelmaus (Acomys dimidiatus), anwendbar ist. Dies eröffnet interessante innovative Wege für die Forschung an Stammzellen und Regeneration, da Acomys über eine bemerkenswerte funktionelle Reparaturkapazität in mehreren bisher untersuchten Organsystemen verfügt.

Einleitung

Die Praxis der Organkultivierung reicht bis zum Beginn des 20. Jahrhunderts zurück. Nieren gehörten zu den ersten Organen, die in vitro kultiviert wurden, als Rienhoff 1922 die Hängetropfen-Methode für embryonale Hühnernieren einführte. In den 1950er Jahren zeigten embryonale Nierenkulturen der Maus (Mus musculus) die Bedeutung von Mesenchym-Epithel-Interaktionen bei der Steuerung der Entwicklungsprozesse 3,4. Seitdem dienen Gewebe- und Organkulturen als Methode zur Untersuchung der Verzweigungsmorphogenese 5,6,7,8,9,10,11,12, induktiver Signalwege 3,4,13,14, Differenzierung 15,16,17, 18, 19 und ihre Mechanismen. Dennoch ermöglicht eine hochrelevante In-vitro-Organkultur die Zugabe verschiedener Signalmoleküle, Agonisten oder Antagonisten/Inhibitoren zu den Kulturen, um deren Auswirkungen auf morphologische Ereignisse zu überwachen 20,21,22.

Die Kultivierung gentechnisch veränderter (GM) Nieren hat wertvolle Informationen zur Regulation der renalen Differenzierunggeliefert: 6,7,9,20,23,24,25,26,27. Genetische Markierungsmethoden und Live-Imaging-Techniken ermöglichen die Visualisierung spezifischer Zellpopulationen oder sogar einzelner Zellen und erleichtern so die Analyse ihres Beitrags zu morphologischen Prozessen 9,10,12,18,24,25,26,28,29,30.

Es existieren mindestens vier verschiedene Arten von Nieren-ex-vivo-Kultursystemen: 1) die Methode der hängenden Tropfen, bei der Gewebe in einem kleinen mittelgroßen Tropfen, der an einem Deckel oder einem Petrischalfendeckel hängt,kultiviert wird 2,31; 2) Trowell-Luftflüssigkeits-Interphasenkultur, bei der Explants auf einer Membran auf einem Metallgitter oder an einem Kunststoffrahmen (kommerzielle Einsätze) mit Medien unter der Membran32,33 platziert werden; 3) Kultur mit geringem Volumen, bei der eine sehr kleine Menge (~85 μL) Kulturmedium und das Gewebe in einem Siliziumring auf einem Glasobjektträger34 platziert werden; und 4) Fixed Z-Direction (FiZD)-Kultur, optimiert für konfokale Live-Bildgebung, bei der die Niere zwischen einem Glasobjektträger und einer durchSpacer 35 getrennten Membran zusammengedrückt wird. Die Trowell-Nierenkultur wird hier wegen ihrer Einfachheit, hohen Kosteneffizienz, der einfachen Visualisierung morphologischer Prozesse und weil sie nicht mit spezieller Mikroskopie6 verbunden ist, präsentiert.

Nierenkulturmethoden bieten eine Möglichkeit, die Organogenese ganzheitlich zu verstehen. Primärzellkulturen bieten einen ergänzenden Ansatz zur Untersuchung biochemischer und molekularer Mechanismen, insbesondere solcher, die an zellulärer Adhäsion sowie deren Veränderungen, Delamination und Beweglichkeit beteiligt sind. Dafür ist die In-vitro-Kultur von Epithelzellen ein ausgezeichnetes Modell36. Die Monoschichtkultur der primären Harnstoffknospe (UB) wird etwa 48 Stunden etabliert, danach teilen sich die Zellen nicht mehr, sondern überleben etwa zwei Wochen7 am Leben. Ein solcher nicht-proliferativer Phänotyp kann effektiv genutzt werden, um z. B. Zellmigration mit Scratch-Assay oder interzelluläre und Zell-zu-Matrix-Adhäsionskräfte 7,37,38 zu analysieren. Zusätzlich können Zellen, die von globalen gentechnisch veränderten Mäusen stammen, wesentliche zelltypspezifische Informationen über die Nierendifferenzierungliefern 6,7.

Die Entwicklung der permanenten Niere (Metanephros) beginnt mit dem Prozess, der als Niereninduktion bekannt ist, bei dem reziproke induktive Gewebewechselwirkungen zwischen dem epithelialen Wolff-Gang (WD, auch nephrischer Gang genannt) und dem metanephrischen Mesenchym (MM) die Bildung der anfänglichen Harntreiberknospe (UB) induzieren13,39,40,41. Das MM sezerniert Signale wie Fibroblastenwachstumsfaktoren (FGFs) und glialzelllinienabgeleiteten neurotrophen Faktor (GDNF), wodurch sich die Zellen im WD zunächst gruppieren und dann herauswachsen, um das anfängliche primäre UB zu bilden, das in das MM 5,40,42,43 eindringt. Bei der Maus, dem am häufigsten verwendeten Säugetiermodell zur Untersuchung der Organogenese, geschieht dies am embryonalen Tag 10,5 (E10,5) und beim Menschen etwa in der Gestationswoche 4–5 40,44,45,46.

Auf den Prozess der Niereninduktion folgt der Beginn der UB-Verzweigungsmorphogenese. Hier verlängert sich die Knospenspitze zunächst, dann bläht sie zu einer Ampulle auf, um sich schließlich zu einer T-Knospenstruktur mit zwei brandneuen Spitzen zu verteilen (Abbildung 1)12,37,39,47,48. Die neu gebildeten UB-Tipps erhalten nicht nur regulatorische Hinweise vom MM, sondern beeinflussen auch aktiv das Schicksal und Verhalten des MM 6,42,49. Dementsprechend wird die Differenzierung des Nephronepithels durch jede UB-Spitze induiert (Abbildung 1). Auf diese Weise bestimmt das Ausmaß der UB-Verzweigung die endgültige Nephronzahl in der Niere. Die Verzweigungsmorphogenese setzt sich mit iterativen Zyklen bis zur Geburt fort, aber der Großteil der Verzweigung erfolgt über 10 bis 13 Runden, die bei Mäusen durch E15,5 erfolgen, danach sinkt die Rate der Neuspitzenbildung deutlichum 30,49. Interessanterweise dauert die Nephronbildung länger an, und die morphologische und molekulare Grundlage dafür wird erst langsam geklärt.

Die UB ist molekular und funktional in zwei Subpopulationen unterteilt, die Spitze und den Stiel, die sich in ihren Genexpressionsprofilen und ihrer Proliferationskapazität unterscheiden: 12,55,56,57,58,59. Die meisten Bifurkationen, die neue Äste erzeugen, finden in den Spitzen statt, während die Differenzierung im Stammbereich stattfindet, in dem die beiden Arten von Sammel-Ductalzellen, Haupt- und Interkalationszellen, entstehen: 11,12,60,61,62. Studien, die stark auf den in-vitro-Nierenkulturen basieren, haben festgestellt, dass die UB-Spitzen eine Vorläuferpopulation beherbergen, die in der Lage ist, neue Spitzen hervorzubringen: den Rumpf, den Harnleiter und das gesamte Sammelsystem 5,25. Trotz der bekannten Spitzen-Stamm-Regionalisierung sind die Mechanismen, die die Differenzierungs- versus Selbsterneuerungsentscheidungen innerhalb der Sammelkanal-Vorläufer steuern, wenig bekannt. Wichtig ist, dass die in-situ-Identität der Sammel-Kanalvorläufer und deren Methoden erst37 in Erscheinung treten.

Die UB-Spitze bildet eine grundlegende Nische für die Etablierung des Cap-Mesenchyms, das den Nephron-Vorläuferpool (NP)13,63 bildet. Auf der einen Seite ist das Kappen-Mesenchym vom UB umgeben, auf der anderen Seite von den stromalen Vorläufern, wodurch interstitielle Zellen wie Perizyten und Mesangialzellen entstehen (Abbildung 1)27,64,65,66,67,68. Während jedes UB-Zweigzyklus erneuern sich eine Teilmenge der NP-Zellen selbst, um die NP-Population aufrechtzuerhalten, und ein weiterer Teil wird zur Differenzierung zu funktionellen Nephronen66 induziert. Über das Verhalten stromaler Vorläufer ist viel weniger bekannt, die jedoch um die NP-Zellen am Rand der wachsenden embryonalen Niere65,69 verharren.

Das Cap-Mesenchym, das die NP-Zellen beherbergt, ist von Natur aus hochorganisiert und dynamisch28,66. Die Zellen, die den Spitzen am nächsten sind, sind die wahren Vorläufer, während diejenigen, die etwas weiter entfernt, in den Achselhöhlen von T-Bud, zur Differenzierung 18,28,67 vorbestimmt sind. Daher beeinflusst die Position der NP-Zellen innerhalb der Kappe eindeutig ihr Schicksal, während ihr dynamisches Verhalten, wie sich ihre Fähigkeit zeigt, in und aus dem Kappenkompartiment zu wandern, auf Flexibilität bei Schicksalsentscheidungen auf individueller Zellebene hindeutet. Jüngste vergleichende Studien haben gezeigt, dass die übergeordneten regulatorischen Themen der renalen Vorläufer zwischen Maus und Menschen gut konserviert sind, was auch die Nutzung von Organkulturen in der Zukunft unterstützt.

Die Nephron-Differenzierung findet in der unmittelbaren Nähe des UB-Epithels statt und beginnt, wenn Signale vom UB und möglicherweise vom umgebenden Stroma die gebundenen Nephron-Vorläufer dazu bringen, eine Zellkondensation zu bilden, die als prätubuläres Aggregat bekannt ist (Abbildung 1)13,47. Dieser zelluläre Cluster durchläuft dann einen mesenchymalen zu epithelialen Übergang und bildet die Nierenblase, eine axial polarisierte Struktur mit etablierten Schicksalen der proximalen und distalen Nephronsegmente. Das bedeutet, dass die Position der Zelle im Vesikel bestimmt, ob sie Teil des Nierenkorpuskels wird, das Podozyten, glomeruläre Büschel und Mesangiale Zellen enthält, oder ob sie in die distaleren Segmente des proximalen gewickelten Tubulus, der absteigenden Henle-Schleife, der aufsteigenden Henle-Schleife, der Macula densa und des distalen gewundenen Tubulus integriert wird. Die endgültige Identität wird durch die komplexen Signale bestimmt, die vom UB, dem Stroma und dem Vesikel selbst ausgehen, und umfasst z. B. die NOTCH-, RHO- und WNT-Wege 19,21,73,74. Die Bestimmung des Schicksals im Nierenvesikel stellt ein klassisches Beispiel für induktive Gewebeinteraktionen in einem intakten Organ dar, die ohne 3D-Strukturorganisation nicht untersucht werden können.

Vom Nierenvesikel aus schreitet die Nephrogenese durch gut beschriebene morphologische Schritte voran, um komma- und S-förmige Körper zu bilden, bei denen die regionalen Identitäten weiter gestärkt werden und zusätzliche Zelltypen wie Endothel in die Entwicklung von Glomeruli48,75 eindringen. Schließlich wird nach Ende der Organogenese der undifferenzierte Vorläuferpool verbraucht, um die Nierenfiltrationskapazität für das Lebenbereitzustellen. Die anatomischen und morphologischen Schritte der Nephrogenese, einschließlich der Innervation, sind in der in vitro Nephrogenese76,77 gut vertreten. Allerdings findet die Gefäßversorgung der Niere in den klassischen Nierenkultursystemen nicht statt. Dieser Aspekt kann mit bestimmten Einschränkungen durch Nierentransplantation auf die vogelartige chorioallanttontoische Membran78,79 untersucht werden.

Neben der Ganzorgankultur gibt es Methoden, um niereähnliche Organoide aus pluripotenten Zellen zu erzeugen. Verschiedene Protokolle mit besonderem Schwerpunkt auf der Erzeugung von Nephronen 80,81,82,83, Harnleiterknosper 84,85,86 und Organoiden mit höhergeordneten Strukturen 87 sowie Tubuloiden, den 3D-Kulturen des Nephronsegments und dem Sammelrohrepithel 88,89, existieren. Diese sind wertvolle Werkzeuge zur Untersuchung der renalen Morphogenese z. B. beim Menschen, wo nur eine begrenzte Menge fetales Material vorhanden ist. Organoid-Methoden können die intakte Organogenese jedoch nicht ähnlich rekapitulieren wie in vitro-Organkultur. In diesem Artikel geben wir detaillierte Anweisungen zur Etablierung von Trowell-Typ-Nierenkulturen und primären Epithelzellkolonien aus dem UB. Diese Protokolle wurden hauptsächlich bei embryonalen Nieren der Maus eingesetzt, wirken aber auch bei der Entwicklung von Rattennieren. Wir zeigen, dass die Trowell-Typ-Kultur auch für die embryonalen Nieren der Stachelmaus (Acomys dimidiatus) wirksam ist – ein neuartiges Nagetiermodell mit außergewöhnlicher Regenerationskapazität(90,91,92,93,94). Der Vorteil der embryonalen Nierenkultur liegt in ihrer einfachen Einrichtung und kosteneffizienten Nutzung.

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Protokoll

Alle Experimente wurden gemäß den relevanten nationalen und EU-Richtlinien und -Vorschriften durchgeführt. Das Komitee für Tierversuche der Universität Helsinki genehmigte den Einsatz von Nagetieren für diese Experimente unter den Lizenzen KEK22-016 (gültig: 1.7.2022-30.6.2025) und KEK25-014 (gültig: 1.7.2025-30.6.2028).

HINWEIS: Achten Sie darauf, alle Spitzen und Chemikalien gemäß institutionellen Richtlinien und guten Laborpraktiken zu entsorgen. Nierenkulturen können mit frühen Nierenrudimenten aus Nagetierembryonen etabliert werden. Die typischen Stadien zur Einrichtung der Nierenkultur sind E11.5–E13.5. Je früher die Orgel ist, desto schwerer ist es, sie zu erkennen. Außerdem wachsen sehr frühe Nierenrudimente (E10-11) in vitro schlechter, da sie oft die UB-Verzweigungsmorphogenese nicht einleiten. Andererseits nimmt die Komplexität des UB-Epithelbaums mit dem Nierenwachstum zu, und später wird es etwas schwieriger, primäre UB-Zellkulturen zu etablieren, da dies sowohl visuelle Erkennung als auch sorgfältige Trennung der Spitzen vom umgebenden MM erfordert. Letztlich wird die wissenschaftliche Fragestellung das geeignete Entwicklungsstadium der Niere bestimmen, das im Experiment verwendet werden soll.

1. Embryonale Nierenkultur

  1. Sammlung embryonaler Nieren
    HINWEIS: Maus- und Rattenweibchen zeigen ein spezifisches reproduktives biologisches Merkmal, bei dem sie nach der Empfängnis eine vaginale Verstopfung, bekannt als Plug, bilden. Der Tag des vaginalen Plugs wird als 0,5 Tage nach der Empfängnis angegeben, auch bekannt als embryonaler Tag 0,5 (E0,5)95. Nach dieser embryonalen Stadieneinschläferung werden die Nierenkulturen typischerweise bei E11-12,5 durch Euthanasierung der trächtigen Maus mit allmählicher Befüllung der Kammer mitCO2 und anschließend einer zervikalen Verrenkung etabliert.
    1. Besprühen Sie die Haut des Bauches mit 70 % Ethanol (Abbildung 2A). Öffnen Sie die Bauchhaut und Muskelschichten, lokalisieren Sie die Gebärmutter mit Embryonen (Mus E11.5-E12,5, Acomys E18-E19) (Abbildung 2B) und schneiden Sie sie heraus. Setzen Sie die Gebärmutter mit Embryonen in eine 100 mm große Petrischale mit Dulbeccos PBS.
      HINWEIS: Als Sicherheitshinweis sollte dieCO2-Kammer entweder in der Haube platziert oder in einem Raum mit angemessener Belüftung verwendet werden, um Schäden an den Nutzern zu vermeiden. Außerdem ist Ethanol leicht entflammbar und sollte nicht in der Nähe einer potenziellen Funken- oder Brandquelle verwendet werden. Als allgemeine Anmerkung: Dulbeccos PBS ist austauschbar mit einemCO-2-unabhängigen Medium, bei dem Embryonen und Gewebe gut für kurz- und langfristigeLagerung geschützt sind. Denken Sie außerdem daran, immer saubere und sterile Dissektionswerkzeuge zu verwenden, um jede Kontaminationsquelle zu vermeiden.
    2. Halten Sie die Gebärmutter mit der Pinzette fest und öffnen Sie gleichzeitig die Muskelschichten, indem Sie mit einer Schere schneiden.
    3. Nehmen Sie die Embryonen heraus und reißen Sie sie von den extraembryonalen Geweben und der Plazenta heraus, indem Sie vorsichtig mit einer dünnen Pinzette ziehen (Abbildung 2C). Um das Gewebe bestmöglich zu erhalten, lassen Sie während der Dissektion alle anderen Embryonen außer dem, mit dem Sie arbeiten, auf Eis.
    4. Mit Nadeln als chirurgische Messer wird der Embryo diagonal unterhalb der Leber in zwei Hälften geschnitten (Abbildung 2D). Sparen Sie mehr Gewebe von der dorsalen Seite als von der ventralen Seite. Entferne Hintergliedmaßen, eventuelle Restreste von Leberreste und Darm, um die sich entwickelnden Nieren genauer betrachten zu können. Zur Unterstützung der Orientierung befinden sich in den Entwicklungsstadien E11.5-E12.5 die Nieren beidseitig auf beiden Seiten der dorsalen Aorta und des Rückenmarks, ventral vom Neuralrohr und des Somit, auf Höhe der Hintergliedmaßen.
    5. Als Nächstes werden die Nieren aus der Körperhöhle herausgezogen. Zuerst entfernen Sie die dorsale Haut und das Rückenmark. Dann drehen Sie den Embryo auf den Rücken und entfernen Sie vorsichtig die lateralen Körperwände, indem Sie die Nadeln in die lateralen Körperhöhlen schieben und gleichzeitig diese zusätzlichen Gewebe vorsichtig abschneiden. Die Nieren befinden sich nun als ein Block im dünnen Gewebestreifen, wobei sich der Wolff-Gang auf einer Seite und der MM auf der gegenüberliegenden Seite befindet (Abbildung 2E).
    6. Entfernen Sie überschüssiges Gewebe sowohl am hinteren als auch am schwanzigen Ende des Streifens und trennen Sie schließlich die beiden Nieren voneinander, indem Sie von der Wolff-Seite zwischen ihnen schneiden. Nun sind die beiden Nieren vom Embryo und voneinander befreit (Abbildung 2F) und können in Dulbeccos PBS auf die Platzierung auf der Kulturschale warten (1.2.2).
      HINWEIS: Bei der Untersuchung genetisch veränderter Nieren werden Prozessniere immer paarweise behandelt, um deren Ursprung zu verfolgen und ihre Genotypisierung zu ermöglichen. Dies kann beispielsweise erreicht werden, indem die beiden Nieren in einem der 24-Well-Plattenbrunnen platziert werden.
  2. Aufbau der Trowell-Nierenkultur
    1. Bereite Kulturgerichte zu. Platzieren Sie den Transwell-Insertfilter mit einer Porengröße von 0,1 μm in den Brunnen und fügen Sie 1,5 ml Kulturmedium (DMEM/F12 ergänzt mit 10 % FBS, 1x Penicillin-Streptomycin (100 U/mL Penicillin, 100 μL Streptomycin) und 1x L-Glutamin) auf den Boden des Brunnens (Abbildung 3A). Luftblasen können die Adsorption von Nährstoffen und Reagenzien aus dem Medium stören. Achte darauf, dass keine Luftblasen in Kontakt mit dem Filter sind. Um dies zu erleichtern, geben Sie das Kulturmedium den Transwell-Platten zu, indem Sie es durch die kleinen seitlichen Löcher zwischen Insert und Schüsselwand pipettieren.
      HINWEIS: Kommerzielle Transwell-Einsätze können durch Metallgitter als Träger für poröse Filtermembranstücke (Porengröße 0,1 μm) ersetzt werden. Mit gittergestützten Filtern kann das Kultursystem in jeder Art von Zellkulturschüssel eingerichtet werden. Beachten Sie, dass die porösen Filtermembranen mit destilliertem H2O vorgespült und vor der Verwendung in 70 % EtOH gelagert werden müssen. Zur Einrichtung des Kultursystems spülen Sie die Filter gründlich mit destilliertem H2 Ooder Dulbeccos PBS ab und legen Sie entweder den gesamten Filter oder kleinere Stücke aus dem Filter auf das Gitter. Verwenden Sie das Medium gerade so weit, dass es Kontakt hat, aber den Filter nicht bedeckt. So wird eine ordnungsgemäße Anhaftung des Gewebes gewährleistet, um zu verhindern, dass es abfließt.
    2. Verwenden Sie die Kapillare oder eine sehr kleine Pipette (0,5–10 μL), um jeweils eine einzelne Niere auf den Filter zu setzen (Abbildung 3B). Vermeiden Sie zusätzliche Flüssigkeit beim Einsetzen der Niere und entfernen Sie sichtbare Flüssigkeit um die Niere herum, indem Sie sanft mit einer Kapillare saugen. Vermeiden Sie es, das Gewebe zu schlagen.
      HINWEIS: Es ist äußerst wichtig, die Nieren in einer bestimmten Reihenfolge auf einen Filter zu setzen, wenn Nierenkulturen aus den gentechnisch veränderten Mauslinien entstehen, da die Informationen über den Genotyp zum Zeitpunkt der Kulturaufstellung unzureichend sind. Die nummerierte Reihenfolge der Nieren im Filter ermöglicht ihre Erkennung während und nach der Kultur. Bei frei rotierenden Transwell-Einsätzen verwenden Sie Markierungen oben auf dem Deckel, aber auch an den Seiten der Schüssel, um einen Verlust der Orientierung zu vermeiden, falls der Transwell-Einsatz sich dreht.
    3. Platzieren Sie die Kulturschal(en) mit den Nierenexplants in den Inkubator mit +37 °C Temperatur und 5 %CO2 für die gewünschte Kultur (Abbildung 3B).

2. Etablierung primärer ureterischer Knospenepithelkulturen

  1. Isolierung der Harnstoffknospen und Aufbau der Zellkultur
    1. Sammeln Sie die Nieren wie in Schritt 1.1 beschrieben.
    2. Inkubieren Sie die Nieren in 4 mg/mL Kollagenase in D-MEM/F12, ergänzt mit 10 % entblößtem fetalem Kalbserum für 15 Minuten bei +37 °C. Um das Enzym zu schonen, pipettieren Sie eine kleine Menge (1–2 ml) Kollagenase auf eine trockene, saubere 30-mm-Schale mit einer schönen Tropfen und erhitzen Sie sie bei 37 °C vor. Fügen Sie die Nieren mit Hilfe einer Glaskapillare hinzu und entfernen Sie sie zur Behandlung. Bei der Anwendung der Kollagenase-Behandlung auf 24-Well-Platten ist es sicherer, die Lösung hinzuzufügen und zu entfernen, anstatt die Nieren zu bewegen, die bei dieser Behandlung klebrig werden.
    3. Beenden Sie die Kollagenase-Funktion, indem Sie 25 U/mL DNase in DMEM/F12 + 10 % FBS hinzufügen. Lassen Sie die Nieren 10-15 Minuten auf Eis ruhen.
    4. Entkoppeln Sie die UB mechanisch frei vom MM. Dafür verwenden Sie Nadeln (z. B. 26 G), um das umliegende Mesenchym vorsichtig abzukratzen. Für die erfolgreiche Isolierung von UBs ist es äußerst wichtig, die genaue Morphologie der frühen Niere zu verstehen, insbesondere wo sich die UB im MM befindet. UB ist in den früheren Nierestufen deutlicher sichtbar, wo MM nicht dick ist und es aus mehreren Blickwinkeln bedeckt. Das UB-Epithel erscheint als knospen- oder T-knoppförmiges, hohles Rohr bei E11-11,5, und die Form wird in späteren Stadien wiederholt, jedoch in einer komplizierteren Form.
      1. Beginnen Sie mit der Isolierung von UB, indem Sie das Mesenchym mit Nadeln im Stängelbereich der Knospe eindringen. Entferne das MM, indem du es wegschiebst, beginnend am Stiel und gehe zu den Spitzen. Der Stiel wäre in der Nähe des Wolffian-Ducts bei E11.5 Nieren und auf der Medullarseite bei E12.5 Nieren. Da der E12.5 UB-Baum in 3D komplexer ist, ist er möglicherweise zugänglicher und somit leichter von den Spitzen als vom Stängel aus erreichbar. Es ist möglich, eine UB-Primärzellkultur allein anhand der Spitzen zu etablieren. Bemerkenswert ist, dass dies weniger Zellen erzeugt und daher nur für E11.5- oder ältere Nieren empfohlen wird.
        HINWEIS: Um Vergleiche zu ermöglichen, muss die Anzahl der UBs oder die relative Menge an UB-Epithel, die zur Herstellung der primären Zellkultur verwendet wird, zwischen verschiedenen Proben und/oder Behandlungen so ähnlich wie möglich sein. Dies stellt vergleichbare Kulturen für jede Art von Downstream-Analyse her.
    5. Geben Sie im Voraus 0,5–0,75 ml Kulturmedium (DMEM/F12, ergänzt mit 10 % FBS, 1x Penicillin-Streptomycin und 1x L-Glutamin), ergänzt mit GDNF (5 ng/mL), FGF2 (25 ng/mL) und HGF (50 ng/mL) auf die mit Fibronectin beschichtete Kulturplatte. Anschließend werden isolierte UBs in die Mitte des mit Fibronectin beschichteten Bohrlochs gelegt (Abbildung 4A). Alle Knospen sollten nah beieinander liegen, um eine einzige Monoschicht-Kultur zu bilden.
      HINWEIS: Fertige fibronektinbeschichtete Platten sind kommerziell erhältlich. Solche Platten sollten mindestens 30 Minuten vor der Verwendung vorgeheizt werden. Eine hauseigene Beschichtung mit Fibronektin ist jedoch eine günstigere Option. Die Platten (oder Glasdeckel, die ideal für Bildgebung sind) werden 1 Stunde lang bei Raumtemperatur / 30 Minuten bei 37 °C mit 10 mg/mL Fibronectin inkubiert. Um überschüssiges Fibronektin zu entfernen, waschen Sie 3x 15 Minuten mit 0,2 % BSA bei 37 °C und anschließend mit Kulturmedium, damit die Platten gebrauchsbereit sind.
    6. Stelle die Platte besonders vorsichtig in den Zellkultur-Inkubator, damit UBS nicht bewegt werden, die leicht im Brunnen herumschweben. Seien Sie äußerst vorsichtig, wenn Sie die Platten nach dem Einsetzen der UBs in die Brunnen bewegen. Das Anhaften von Geweben/Zellen am Fibronektin dauert einige Stunden, sodass jede plötzliche Bewegung UBs dazu bringen kann, überall auf der Platte zu schweben. Dies kann dazu führen, dass sich die UBs an die Ränder der Platte ausbreiten, was für die Dokumentation ihres Wachstums und Verhaltens während des Experiments nicht optimal ist.
    7. Lassen Sie die UBs sich beruhigen und festhalten. Während der 42-48-Stunden-Kultur bilden sie eine Monoschicht (Abbildung 4B). Um eine Vorstellung davon zu bekommen, wo sich die UBs im Bohrloch absetzen, können die Kulturen einmal täglich während der ersten 48 Stunden überwacht werden. Wenn die UBs aus unterschiedlichen genetischen Hintergründen stammen, könnte es hilfreich sein, ihren Delaminationsprozess mittels Zeitrafferbildgebung zu dokumentieren, um mögliche Unterschiede in den adhäsiven Eigenschaften oder der Monoschichtbildungskapazität abzuschätzen.

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Ergebnisse

Die ex-vivo-Nierenkulturmethode kann verwendet werden, um eine Vielzahl von Forschungsfragen zur Nierenentwicklung zu beantworten, wobei das Ergebnis jedes Experiments vom experimentellen Aufbau abhängt. Mit der Verwendung geeigneter Kontrollproben ist es jedoch wichtig sicherzustellen, dass die Kulturbedingungen selbst die Entwicklung nicht beeinflussen. Idealerweise rekapitulieren die Kontrollproben ex vivo die Nierenentwicklung in vivo. Die Hausmaus ist das Standardmodell für Nierenkulturexp...

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Diskussion

Die Niere ist ein lebenswichtiges Organ mit bedeutender Blutfiltration und Funktionen zur Ausgleichung von Körperflüssigkeiten. Die Grundlage für die nierenfunktionelle Kapazität wird während des fetalen Lebens gebildet, wenn alle lebenslangen Nephronegebildet werden. Das Verständnis sowohl des Nierenwachstums durch verzweigte Morphogenese als auch der Nephron-Differenzierung an sich ha...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Wir danken Frau Agnés Viherä für ihre fachkundige technische Hilfe bei all unseren Nieren- und UB-Epithelzellkulturen. Die Tiere wurden im Labortierzentrum der Universität Helsinki untergebracht. Die Arbeit wurde von der Aamu Pediatric Cancer Foundation gefördert; HiLIFE und iCANDOC an der Universität Helsinki; Väre Kinderkrebsstiftung, Liv och hälsä und Perklén Stiftung.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
10X PBSLonza Biosciences512261X-Lösung für die Verwendung
1-ml-SpritzenThermo Fisher Scientific10564431
23-25G Einweg-InjektionsnadelnThermo Fisher Scientific10482792
24-BrunnenplattenGreiner662160
6-Well-CellStar-Platten MerckM8562
70 % Ethanol (EtOH), verdünnt in MilliQ-H2OJeder kommerzielle AnbieterVerwendet zur Sterilisation von Oberflächen und Haut
Rinderserumalbumin (BSA)Thermo FisherB14Endkonzentration von 0,2 %
Kollagenase Invitrogen17018029200 mg/ml Aktie in PBS
DMEM/F12 Thermo Fisher31331028
DnaseFisher10649890
Drummond Wiretrol II Mikro-Spender, 10-20µ lTranskat-PipettenDRMC064
Dulbecco' s PBS (mit Ca2+ und Mg2+)Thermo Fisher Scientific14040117Dulbecco' s PBS ist austauschbar mit CO2 unabhängigem Medium (Gibco/ThermoFisher), wo Embryonen und Gewebe gut geschützt für kurz- und langfristige Speicherung sind. 
E11.5 - E12.5 MausembryonenJeder kommerzielle Züchter / eigener Bestandhttps://janvier-labs.com/en/Mausembryonen werden typischerweise durch hauseigene Verstopfung produziert. Der Tag des Erscheinens des vaginalen Plugs ist E0,5. Commercial  Weibliche Mäuse mit zeitgesteuerten Prägranzen sind ebenfalls erhältlich.
E18-19 stachelige MausembryonenN/AN/AEntsprechende Alternative für Mausembryonen. 
Fetales Rinderserum (FBS)GibcoA5256801
FibronectinNovus Biologicals1030-FN-05M1 mg/ml Fond
Glas- oder Kunststoffschalen (100 mm, 60 mm und 30 mm).Gibco150476, 174888, 153066
GlutaMAXGibco35050061
Humaner rekombinanter Fibroblast-Wachstumsfaktor (rFGF2)PeproTech100-18B
Humaner rekombinanter Glialzelllinien-abgeleiteter neurotropher Faktor (rGDNF)R& D212-GD-010/CF
Menschlicher rekombinanter Hepatozytenwachstumsfaktor (rHGF)PeproTech100-39
Penicillin-StreptomycinGibco15140122
Kleine Schere und feine Pinzette;Feine wissenschaftliche Werkzeuge14040-10, 11254-20Verwenden Sie nur saubere und sterile Dissektionswerkzeuge, um jede Kontaminationsquelle zu vermeiden.
StereomikroskopLeica MZ7.5 oder Olympus SZ x9https://www.leica-microsystems.com/
Transwell-Durchlässige Stützen, 24-mm-Einsätze;Fisher10619141

Referenzen

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