Effiziente Reinigung von elastinähnlichen Polypeptiden (ELPs) aus E. coli mittels einer organisch-lösungsmittelbasierten Extraktions- und Ausfällungsmethode

Summary

Dieses Protokoll beschreibt eine schnelle, reproduzierbare organische, lösungsmittelbasierte Extraktions- und Ausfällungsmethode zur Reinigung von elastinähnlichem Polypeptide (ELP) aus Escherichia coli und bietet eine potenziell skalierbare Alternative zu herkömmlichen ELP-Reinigungsmethoden.

Abstract

Elastin-ähnliche Polypeptide (ELP) sind konstruierte Biopolymere, die aus repetitiven Pentapeptidsequenzen bestehen und Motive im Tropoelastin von Säugetieren nachahmen. Ihre einzigartigen Eigenschaften machen sie zu idealen Kandidaten für eine Vielzahl biomedizinischer Anwendungen, von der Arzneimittel- und Genlieferung bis hin zur Gewebetechnik und gezielter molekularer Bildgebung. Konventionelle Reinigungsmethoden aus der Expression von Escherichia coli (E. coli) können für ELP aufgrund der Bildung von Inklusionskörpern ineffektiv sein. Andere Methoden, wie der inverse Übergangszyklus (ITC), nutzen die Eigenschaften der niedrigeren kritischen Lösungstemperatur (LCST) des ELP, um es von Schadstoffen wie Lipopolysaccharide (LPS) zu trennen, erfordern jedoch typischerweise mehrere Heiz- und Kühlschritte, die zeitaufwendig sind und je nach Sequenz, Konzentration und Molekulargewicht des ELP-Konstrukts zu geringen Rückgewinnungen führen können. Um diese Herausforderungen zu bewältigen, haben wir einen organischen, lösungsmittelbasierten Extraktions- und Ausfällungsworkflow entwickelt, der die intrinsische Hydrophobie von ELP nutzt, um eine schnelle, robuste und breit anwendbare Reinigung direkt aus E.-coli-Zellpellets zu ermöglichen. Diese Methode verwendet polare organische Lösungsmittel, um die Zellzerstörung zu unterstützen und ELP in einem einzigen Schritt selektiv löslich zu machen. Ein anschließender Ausfällungsschritt entfernt effektiv organische Restlösungsmittel, niedrigmolekulare Verunreinigungen und Endotoxine und liefert hochreines ELP mit LPS-Werten unter 1 EU/mL in weniger als 3 Stunden. Daten der Atomkraftmikroskopie deuten darauf hin, dass auf diese Weise gereinigte ELP-Fusionsproteine sich selbst zu umgekehrten Mizellenstrukturen zusammensetzen können, die die Funktion des Fusionsproteins erhalten. Diese schnelle Reinigungsmethode bietet Forschern eine einfache und potenziell skalierbare Möglichkeit zur Reinigung von ELP und schafft neue Möglichkeiten, ELP und deren Fusionsproteine als flexible Bausteine für Material- und biomedizinische Anwendungen zu nutzen.

Introduction

Elastinähnliche Polypeptide (ELPs) sind Biopolymere, die aus sich wiederholenden (VPGXG)n-Motiven 1,2,3,4,5,6,7,8,9 bestehen. Der Gastrest X in der Pentapeptideinheit kann jede andere Aminosäure als Prolin sein. Variationen in X können verwendet werden, um die Hydrophobie, das thermische Übergangsverhalten und die funktionalen Eigenschaften des ELP-Konstrukts abzustimmen, um modulare biokompatible Materialien zu schaffen, die in verschiedenen biomedizinischen Anwendungen umfassend erforscht wurden 10,11,12.

Obwohl chemische Synthese zur Herstellung kurzer Peptide verwendet werden kann, ist sie schlecht geeignet für hochmolekulare ELPs oder zur Erhaltung der Funktionalität von Fusionsproteinen^13,14. Aus solchen Gründen werden ELPs typischerweise rekombinant in E. coli angegeben, was eine sequenzdefinierte Produktion in großen Mengen ermöglicht. Dieser Ansatz kann jedoch auch Herausforderungen mit sich bringen. Während ihrer Expression in E. coli sammeln sich ELPs häufig in dichten Inklusionskörpern an, was effiziente Wiederherstellungsstrategien zur Gewinnung des funktionellen Proteins ¹⁵ erfordert. Darüber hinaus führt die bakterielle Expression unerwünschte Biomoleküle wie Wirtszellproteine, Nukleinsäuren und Lipopolysaccharide (Endotoxine) ein, die während der Reinigung vom ELP getrennt werden müssen. Traditionelle Solubilisierungsstrategien mit Reinigungsmitteln (z. B. Natriumdodecylsulfat (SDS) oder Triton X-100) oder chaotropen Mitteln wie Harnstoff hatten für unsere ELP-Fusionssequenzen nur begrenzten Erfolg. Nach unserer Erfahrung gelang es Triton und Harnstoff nicht, ELPs aus der Pelletphase zu extrahieren, während SDS eine teilweise Solubilisation ermöglichte, aber die nachgelagerte Affinitätsreinigung beeinträchtigte und schwer vollständig aus der hydrophoben ELP-Sequenz zu entfernen war.

Bis heute bleibt das inverse Übergangszyklus (ITC) die am weitesten verbreitete Reinigungsmethode für ELPs. Diese Technik nutzt ihr LCST-Verhalten, um das ELP selektiv über Temperatur- und Salzgradienten^hinweg auszufällen und wieder aufzulösen. Bei Proteinen mit niedrigerem Molekulargewicht ist ITC jedoch ein zeitaufwändiger mehrstufiger Prozess, der für ELPs, die in Inklusionskörpern gefangen sind, schlecht geeignet ist und mehrere ITC-Zyklen erfordert, die bei jedem^{Schritt 7,16} zu einem Proteinverlust führen können.

Um diese Einschränkungen zu überwinden, haben wir einen organischen, lösungsmittelbasierten Extraktions- und Niederschlagsworkflow eingeführt. Während Yakhnin et al. erstmals 1998 eine hydrophobizgetriebene Partitionierungsstrategie für die GFP-Reinigung mit Ethanol- und Salzgradienten demonstrierten^, verwendet die von uns entwickelte neuartige Methode organische Lösungsmittelmischungen, um ELP-Fusionsproteine direkt aus E. coli-Zellen ⁷ zu extrahieren. Sweet et al. und Darji et al. passten diesen Ansatz an ELP-Fusionen an und zeigten, dass die organische Lösungsmittelextraktion eine schnelle Rückgewinnung funktioneller ELPs ermöglicht, während strukturelle Integrität und Bioaktivität^{erhalten bleiben 8,9}. Dieser Ansatz verwendet Sonikation und organische Lösungsmittel, um Bakterienzellen zu lysieren und ELPs in einer einzigen Operation zu extrahieren, wobei die meisten Wirtsproteine und Nukleinsäuren ausgefällt werden. Die Rückgewinnung der ELP-reichen organischen Phase, gefolgt von schneller Ausfällung zur Isolierung der ELPs aus Lösungsmitteln und löslichen Verunreinigungen, ergibt hochreine ELPs. Dieser Ansatz kann auch reines ELP aus E. coli-Pellets mit Endotoxinwerten unter 1 EU/mL in weniger als drei Stunden ^7,8 liefern.

Bisherige Studien zeigen, dass diese Methode in der Lage ist, ELP-Konstrukte und ELP-Fusionsproteine mit unterschiedlichem Molekulargewicht und isoelektrischem Punkt zu reinigen, ohne mehrere ITC-Zyklen oder Lösungsschritte (Abbildung 1). Die Atomkraftmikroskopie (AFM) und die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) deuten darauf hin, dass auf diese Weise gereinigte ELP-Fusionsproteine umgekehrte Micelle-ähnliche Strukturen bilden (Abbildung 2), wodurch die Struktur und Funktion der ELP-Fusionsdomänen während der Extraktion organischer Lösungsmittel erhalten bleiben. Dieser optimierte Arbeitsablauf ermöglicht eine schnellere und zuverlässigere ELP-Reinigung für vielfältige biomedizinische Anwendungen ^7,8. Bemerkenswert ist, dass Aayush et al. berichteten, dass ELP-Konstrukte, die mit dieser Methode gereinigt wurden, die epidermale Wachstumsfaktor-Rezeptor-Bindungsfunktion¹⁸ behalten, was unterstreicht, dass diese Methode nicht nur reines ELP-Material erzeugt, sondern auch die Aktivität der Fusionsproteindomäne aufrechterhält.

Als weitere Demonstration des Nutzens dieser Methode zur Isolierung einer ELP-Enzym-Fusion beschreiben wir eine detaillierte organische, lösungsmittelbasierte Methode zur Reinigung eines ELP-Intein-Chorismat-Mutase-2 (ELP-I-Cm2)-Konstrukts (Abbildung 3). Diese Methode kann für die schnelle Reinigung anderer ELPs für die Arzneimittelabgabe und Nanomaterialanwendungen nützlich sein.

Protocol

1. Materialvorbereitung

1. Bakterienstamm: Verwenden Sie chemisch kompetente Zellen von Escherichia coli BL21(DE3) als Expressionswirt.
   HINWEIS: Sie wurden aufgrund ihrer hohen Transformationseffizienz und Eignung für die Produktion rekombinanter Proteine ausgewählt.
2. Expressionsplasmid: Verwendung des pET21(+)-Vektors, der das ELP-I-Cm2-Fusionsprotein mit Ampicillinresistenz⁹ codiert. Kaufen Sie den Plasmidvektor bei addgene. Fügen Sie das Cm2-Gen mit der BsrG-I-Stelle am Ende des Interins ein.
   HINWEIS: Die Plasmid-DNA-Sequenz für dieses Protein ist in Supplementary File 1 bereitgestellt.
3. Wachstumsmedien: Großartige Brühe (TB) Medienvorbereitung für 1200 mL Medien
   1. Bereiten Sie das Medium (Teil 1) vor, indem Sie 16 g Trypton, 32 g Hefeextrakt, 16 g Prolin und 6,8 ml Glycerol zu 1100 ml ultrareinem Wasser hinzufügen. Gründlich mischen, um alle Komponenten aufzulösen. Stellen Sie das Endvolumen mit ultrareinem Wasser auf 1200 mL ein.
   2. Bereiten Sie den Kaliumphosphatpuffer (Teil 2) vor, indem Sie 23,1 g KH₂PO₄ und 125,4 g K₂HPO₄ mischen und dann das Volumen mit ultrareinem Wasser auf 1 L bringen.
   3. Autoklaven der Komponenten (Teil 1 und 2) separat. Nach dem Autoklavieren wird die Medienproduktion gesammelt, indem die TB-Basis in vier 300-mL-Aliquots unterteilt wird. Fügen Sie unter sterilen Bedingungen 33 ml Phosphatpuffer zu jedem Aliquot hinzu.
4. Additive zur Expression
   1. IPTG: Induktion mit IPTG bei einer Endkonzentration von 1,2 mM durchführen (z. B. 396 μL 1 M IPTG zu 330 mL Kultur hinzufügen).
   2. Antibiotikum: Ampicillin zu einer Endkonzentration von 100 μg/mL hinzufügen, um die Plasmidselektion sicherzustellen.
5. Lysepuffer (pH 8,5): Bereiten Sie den Lysepuffer mit 10 mM Tris-Base und 22 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) vor. Stellen Sie den pH-Wert bei Bedarf mit HCl oder NaOH auf 8,5 ein.
6. Organische Lösungsmittel zur Extraktion
   1. Verwenden Sie verschiedene organische Lösungsmittel (Tabelle 1), um das ELP-I-Cm2-Fusionsprotein aus Einschlusskörpern zu extrahieren. Testen Sie diese Lösungsmittel sowohl einzeln als auch in binären Kombinationen (1:1 Bd: Bd.), um Effizienz und ELP-Reinheit zu bewerten.
      HINWEIS: Alle verwendeten Lösungsmittel waren HPLC-Qualität, außer Acetonitril (Optima-Qualität), Ethanol (USP-Qualität) und 1-Butanol (99 % Reinheit).
      VORSICHT: Alle oben aufgeführten Lösungsmittel sind flüchtig und brennbar. Sie müssen in einer chemischen Abzugshaube mit geeigneter PSA (Laborkittel, Nitrilhandschuhe und Augenschutz) behandelt werden. Viele Arten von Kunststoffwaren sind nicht mit organischen Lösungsmitteln kompatibel. Polypropylen-Kunststoffwaren werden für Extraktions- und Ausfällungsexperimente mit organischen Lösungsmitteln sehr empfohlen; Andernfalls sollte das zu verwendende Plastikgeschirr ohne wertvolle Probe getestet werden, um sicherzustellen, dass es für die Verwendung geeignet ist. Die Entsorgung von Lösungsmittelabfällen sollte den in den entsprechenden institutionellen Richtlinien für gefährlichen Abfälle festgelegten Verfahren folgen.

2. Zelllyse und -präparation (Abbildung 4A)

1. Resuspension: 1 g Zellpellet abwägen und in 4 ml frisch vorbereitetem Lysispuffer neu suspendieren. Vortexen vorsichtig, bis das Pellet vollständig verteilt und mit dem Puffer vermischt ist.
2. Enzymatische Lyse: Fügen Sie ~5 mg Lysozym hinzu, um die Zellwandverdauung zu unterstützen. Lassen Sie die Suspension 1 Stunde bei 4 °C inkubieren. Dies erleichtert die partielle enzymatische Verdauung, um die Zelllyse zu fördern.
3. Sonikation: Nach der Inkubation wird die Probe sonikiert, um die Zelllyse abzuschließen und genomische DNA zu scheren. Verwenden Sie kurze Stöße der Mikrotipp-Sonikation (350-W-Gerät, Leistungsstufe 3) mit Intervallen, um Überhitzung zu vermeiden (z. B. 5 Sekunden ein/10 Sekunden aus, je nach Bedarf wiederholt). Sonikieren Sie die Proben auf Eis und wenden Sie die Ultraschallenergie an, bis ein gleichmäßiges Lysat ohne sichtbare Partikel erreicht wird, typischerweise für etwa 5–8 Minuten.
   HINWEIS: Nach Abschluss der Sonikation wird ein 100 μL Aliquot der Probe (oder des Lysats) für die ELP-Expressionsanalyse aufbewahrt, um den Reinigungsfortschritt vor und nach der Extraktions- und Ausfällungsschritte zu überwachen.
4. Zentrifugations- und Expressionsanalyse.
   1. Klären Sie das Lysat durch Zentrifugation bei 10.000 g für 10 Minuten bei 20 °C und trennen Sie dann vorsichtig das Supernatant (lösliche Fraktion) vom Pellet (unlösliche/Inklusions-Körper-Fraktion).
   2. ELP-Expression in beiden Fraktionen mittels SDS-PAGE bewerten: Ein Aliquot (z. B. 10–20 μL) des Supernatanten entnehmen und eine äquivalente Pelletmasse im Lysepuffer (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA) auf dasselbe Volumen aufsetzen; Mische jede mit 4x Laemmli-Puffer zu einem finalen 1x, erhitze 5 Minuten bei 95 °C und lade gleiche Mengen ein, um einen direkten Vergleich zu ermöglichen.
   3. Wenn das Ziel-ELP überwiegend löslich ist, wird mit der organisch-lösungsmittel-Extraktion mit dem geklärten Supernatant fortgeführt. Wenn es überwiegend unlöslich ist (Inklusionskörper), entsorgen Sie das Überdachungsmittel und setzen Sie den Inklusions-Körper-Workflow (Waschen/Löslichkeit und Extraktion) durch Verarbeitung des Pellets durch organische Lösungsmittelextraktion fort.
5. Pelletwäsche und -trocknung (nur für ELP in Einschlusskörpern): Invertieren Sie die Zentrifugenröhren, um eine gravitationsunterstützte Entwässerung eines restlichen Lysispuffers zu ermöglichen. Sobald die sichtbare Flüssigkeit abgelaufen ist (~1–2 Minuten), lass das Pellet 5–10 Minuten an der Luft bei Zimmertemperatur trocknen, wobei du sicherstellst, dass es frei von überschüssiger Feuchtigkeit ist, bevor du mit der organischen Extraktion fortgehst.

3. Organische Extraktion (Abbildung 4B)

HINWEIS: Jede ELP hat ihre eigene bevorzugte Lösungsmittelbedingung für hochreine Extraktionen (z. B. AC-Leistung in Abbildung 1). Daher sollte ein Erstscreening von 28 organischen Lösungsmitteln und deren Kombinationen getestet und die Isolate von PAGE analysiert werden, um die optimalen Löslichkeitseffizienzbedingungen für das betreffende Konstrukt zu identifizieren.

1. Lösungsmittel-Screening. Screenen Sie die einzelnen Lösungsmittel aus Schritt 1.6 und ihre 1:1 (v/v) binären Lösungsmittelmischungen. Bewerten Sie zusätzliche Mischungen (z. B. 1:2, 2:1, 4:1), um die Wirksamkeit des Prozesses zu steigern.
   HINWEIS: Derzeit gibt es keine Richtlinien für die rationale Auswahl der wirksamsten Lösungsmittel oder Kombinationen, daher ist eine Screening-Kampagne erforderlich, um aus Lösungsmitteln auszuwählen, die zuvor erfolgreich hydrophobe Proteinaggregate gelöst haben. Die endgültige Auswahl des für die Reinigung verwendeten organischen Lösungsmittelextraktors sollte auf der SDS-PAGE-Analyse der aus diesem Sieb gewonnenen Isolate erfolgen.
2. Extraktionsverfahren
   1. Lösungsmittelzugabe: Fügen Sie 4 ml organisches Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemisch zum luftgetrockneten Pellet/Supernatant hinzu, das nach der Lyse gewonnen wird. Für gemischte Kombinationen sollten präzise volumetrische Verhältnisse sichergestellt werden (z. B. 2 ml von jeder für eine 1:1-Kombination).
   2. Vortexen: Vortexen Sie die Suspension kräftig für 1 Minute, um eine gründliche Mischung und das Eindringen des Lösungsmittels in das Pellet sicherzustellen.
   3. Inkubation (Retentionszeit): Lassen Sie die Suspension bei 20 °C für 5 Minuten inkubieren, um ausreichend Interaktionszeit sicherzustellen, damit extrazelluläre Proteine aggregieren und absetzen können, während die ELPs sich in der organischen Phase lösen.
   4. Zentrifugation: Zentrifugieren Sie das Gemisch bei 13.000 × g für 10 Minuten bei 20 °C, um lösliche Proteine von unlöslichen Resten zu trennen.
   5. Supernatant sammeln: Sammeln Sie das Supernatant vorsichtig ein, ohne das Pellet zu stören. Der Supernatant enthält das lösliche ELP, während das Pellet Proteine der Wirtszelle, Nukleinsäuren und Lipide enthält.
   6. Volumenmessung: Zeichnen Sie das Volumen des gewonnenen Supernatants genau auf. Es sollte darauf geachtet werden, dass der Supernatant frei von Pelletpartikeln ist. Diese Messung ist entscheidend für den nachgeschalteten Niederschlagsschritt.

4. Proteinpräzipitation

1. Anti-Lösungsmittelzusatz: Aceton oder Acetonitril zum organischen Supernatant mit 2,33-fachem des gemessenen Volumens des Supernatanten hinzufügen.
2. Brutzeit: Die Mischung bei 20 °C 5–7 Minuten inkubieren.
3. Zentrifugation: Zentrifugieren bei 10.000 g für 10 Minuten bei 20 °C.
4. Pellethandhabung: Nach der Zentrifugation entsorgen Sie das Überlagerungsmittel vorsichtig und lassen Sie die Probe an der Luft trocknen, indem Sie das Rohr 10–15 Minuten unter einem sanften Stickstoffgasstrom unbedeckt lassen oder inkubieren, indem Sie die Zentrifugenröhrchen für 1 Stunde bei 20 °C auf fusselfreien Tüchern in einer Dampfhaube verkehrt herum auf fusselfreie Tücher legen (keine Hitze anwenden).

5. Umgang mit Proteinpellets und Wiederaufhängung

1. Resuspension: Nach Ausfällung und Lufttrocknung wird das Proteinpellet in 50 μL phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) erneut suspendiert. Pipette vorsichtig auf und ab, um sicherzustellen, dass das Pellet vollständig aufgelöst ist.
2. Speicherung: Lagert das resuspendierte Protein bei -20 °C für kurzfristige bis mittelfristige Nutzung. Vermeiden Sie wiederholte Gefrier-Tau-Zyklen, um die funktionelle Integrität des Proteins zu erhalten.

6. Validierung über SDS-PAGE

1. Probenvorbereitung: Das gereinigte Protein mit einem 4× SDS-PAGE Ladepuffer im Verhältnis 3:1 mischen und kurz vortexen, um die Homogenität sicherzustellen.
2. Elektrophorese: Auf ein 15%iges SDS-PAGE-Gel für ELP-I-Cm2 laden und mit 100–120 V laufen, bis der Tracking-Farbstoff den Boden erreicht.
   HINWEIS: Der prozentuale Crosslinking im Gel sollte auf der Größe des jeweiligen ELP-Konstrukts basieren
3. Färbung und Visualisierung: Färben Sie das Gel mit Instant Blue Coomassie oder einer anderen geeigneten Farbung für 2 Stunden bei 20 °C. Reinigen Sie die Farbe durch Spülen mit deionisiertem Wasser, bis ein klarer Hintergrund erreicht ist. Testen Sie das in Aktivitätstests isolierte Proteine, um zu bestätigen, dass nach dem Workflow der Extraktion und Ausfällung von organischen Lösungsmitteln die Aktivitätsretention stattgefunden hat.

Results

Nach Durchlaufen der letzten Phasen des Protokolls ist der nächste Schritt die Visualisierung des Extraktions-Niederschlagsergebnisses mittels SDS-PAGE-Analyse und Coomassie-Blaufärbung. Wenn vor der organischen Extraktion ein Lyseschritt erfolgt, sollte ein markantes ELP-Band sichtbar sein. Im Fall von ELP-I-Cm2 erscheint dieses Band bei 100 kDa (Abbildung 3A).

Das Screening verschiedener organischer Lösungsmittelkombinationen zeigte variable Extraktionseffizienz...

Discussion

ITC wurde zuvor zur nicht-chromatographischen Reinigung von ELP¹⁹ verwendet; es kann jedoch eine zeitaufwändige und ertragsarme Methode sein. In den oben beschriebenen Methoden beschreiben wir einen Ansatz zur schnellen Reinigung eines ELP-I-Cm2-Fusionsproteins und demonstrieren, wie die organische, lösungsmittelbasierte Extraktions- und Ausfällungsmethode effektiv zur Reinigung einer Vielzahl von ELP- und ELP-Fusionen eingesetzt werden kann. Das organische Lösung...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Mercaptoethanol	Bio-Rad	161-0710	SDS-PAGE-Komponente
30 % Acrylamid/Bis-Acrylamid	TCI	A3218	SDS-PAGE-Komponente
Aceton	Fisher Scientific	A949	Organisches Lösungsmittel
Acetonitril	Fisher Scientific	A996	Organisches Lösungsmittel
Ampicilin	Gold Bio – Gold Biotechnologie	A-301-25	Antibiotikum
APS (Ammoniumpersulfat)	Bio-Rad	1610700	SDS-PAGE-Komponente
Butanol	Fisher Scientific	L13171	Organisches Lösungsmittel
EDTA	Fisher-Bioreagenzien	BP118-500	Lysis-Pufferkomponente
Ethanol	Decon Labs	UN1170	Organisches Lösungsmittel
Ethylacetat	Fisher Scientific	E195	Organisches Lösungsmittel
Glycerol	Research Products International	G22020-0.5	Großartige Brühe (TB) Medienkomponente
Salzsäure	Fisher Scientific	A144SI-212	Lysis-Pufferkomponente
Sofortiger Coomasie-Fleck	Abcam	ab119211	SDS-PAGE-Komponente
IPTG	Gold Bio – Gold Biotechnologie	12481C25	Proteinexpressionskomponente
Isopropanol	Fisher Scientific	A451-1	Organisches Lösungsmittel
K2HPO4 (Kaliumphosphat monobasisch)	Wards' Science	470302-246	Teil 2 Pufferkomponente
KH2PO4 (Potasiumphosphat-Dibasisk)	Wards' Science	470302-254	Teil 2 Pufferkomponente
L-Prolin	Research Products International	P5200-500,0	Großartige Brühe (TB) Medienkomponente
Lysozym	Gold Bio – Gold Biotechnologie	L-040-1	Lysis-Pufferkomponente
Methanol	Fisher Scientific	A452	Organisches Lösungsmittel
Nativer Samplepuffer	Bio-Rad	161-0738	SDS-PAGE-Komponente
Proteinleiter	Gold Bio – Gold Biotechnologie	P008-500	SDS-PAGE-Komponente
Auflösen des Gelpuffers	Bio-Rad	1610798	SDS-PAGE-Komponente
Sodim-Dodecylsulfat (SDS)	Thermowissenschaftlich	J18220-36	SDS-PAGE-Komponente
Natriumhydroxid	Fisher Scientific	S318-500	Lysis-Pufferkomponente
Stapelgel-Puffer	Bio-Rad	1610799	SDS-PAGE-Komponente
TEMED	Bio-Rad	1610801	SDS-PAGE-Komponente
Tris Base	Fisher-Bioreagenzien	BP-152	Lysis-Pufferkomponente
Trypton	Research Products International	T60065-1000.0	Großartige Brühe (TB) Medienkomponente
Hefeextrakt	Research Products International	Y20025-1000.0	Großartige Brühe (TB) Medienkomponente