Methodenartikel

Bestimmung der mikrobiellen Biomasse im Boden mittels Digital Droplet PCR (ddPCR)

DOI:

10.3791/69467

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24. April 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Geography, Faculty of Environment, Science and Economy, University of Exeter

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Studie präsentiert eine schnelle ddPCR-Methode zur Quantifizierung des Bodenmikroorganismus-Biomasse- und Pilz-zu-Bakterien-Verhältnisses. Obwohl ddPCR-abgeleiteter mikrobieller Biomassekohlenstoff nur eine schwache Korrelation mit Chloroform-Fumigationsschätzungen aufweist, bietet die Methode einen sensiblen, skalierbaren molekularen Ansatz zur Beurteilung der mikrobiellen Häufigkeit ohne zusätzliche Bodenprobennahmen oder den Einsatz von Härte.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Der Boden stellt den größten terrestrischen Pool organischen Kohlenstoffs dar, dennoch wurden in den letzten zwei Jahrhunderten mehr als 133 Gt Kohlenstoff aus Böden verloren. Eine genaue Quantifizierung der mikrobiellen Biomasse im Boden, insbesondere von Pilzen und Bakterien, die den Kohlenstoff- und Nährstoffkreislauf antreiben, ist für das Verständnis der ökologischen Funktionsweise und Gesundheit des Bodens unerlässlich. Konventionelle Ansätze, einschließlich Chloroform-Begasungsextraktion und PLFA-Analyse, sind durch hohe Probenanforderungen und Unsicherheiten bei der Umwandlung biochemischer Marker in mikrobielle Biomasse begrenzt. Hier präsentieren wir einen optimierten Arbeitsablauf zur Quantifizierung bakterieller und pilzialer Häufigkeit im Boden mittels digitaler Tröpfchen-PCR (ddPCR), die auf die 16S- und 18S-rRNA-Gene abzielt. Die Methode ermöglicht eine absolute Quantifizierung mikrobieller Genkopienkopien, die in Zellzahlen mittels Genkopienkorrekturfaktoren und anschließende Schätzung des mikrobiellen Biomasse-Kohlenstoffs möglich sind. Dieses Protokoll haben wir auf Böden aus fünf global verteilten landwirtschaftlichen Systemen angewandt, die sich in Bodentextur, Landnutzung und organischem Materialgehalt unterscheiden. ddPCR-abgeleitete Schätzungen wurden mit konventionellen Chloroform-Begasungsschätzungen des mikrobiellen Biomasse-Kohlenstoffs verglichen. ddPCR lieferte eine hochauflösende Quantifizierung der mikrobiellen Häufigkeit und lieferte breitere und sensiblere Schätzungen der F:B-Verhältnisse über Bodentypen hinweg als die Ganzgenomsequenzierung. Obwohl ddPCR-abgeleitetes MBC nur eine schwache Korrelation mit Chloroform-Begasungswerten zeigte, bietet diese Methode einen effektiven molekularen Ansatz zur Bewertung mikrobieller Biomasse und ökologischer Indikatoren wie das F:B-Verhältnis. Dieses Protokoll bietet eine reproduzierbare und skalierbare Strategie zur Integration mikrobieller Häufigkeitsmessungen mit Zusammensetzungsanalysen, um die Bewertung der Bodengesundheit voranzutreiben.

Einleitung

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Der Boden ist der größte terrestrische organische Kohlenstoffpool und enthält mehr Kohlenstoff als Vegetation und atmosphärischer Kohlenstoff zusammen1. In den letzten 200 Jahren sind über 133 Gigatonnen (Gt) Kohlenstoff aus dem Boden verloren gegangen, und laufende Bemühungen zur Wiederherstellung und Erhaltung der Bodenkohlenstoffvorräte sind für die globale Bodengesundheit von entscheidender Bedeutung2. Angesichts der enormen Kohlenstoffspeicherkapazität der Böden ist die genaue Bestimmung der Hauptverursacher dieser Kohlenstoffvorräte grundlegend wichtig3. Mikroben spielen eine grundlegende Rolle im Nährstoffkreislauf im Boden, und mikrobielle Biomasse stellt einen bedeutenden Anteil des organischen Kohlenstoffs im Boden (SOC)3 dar. Pilze und Bakterien sind die Hauptzersetzer in Bodenumgebungen und sind wesentlich für die biogeochemischen Zyklen dieser Ökosysteme 4,5. In bakteriendominierten Böden sind die Zersetzung organischer Substanz und die Mineralisierung der Nährstoffe deutlich schneller als in einem pilzdominierten5. Das Pilz-zu-Bakterien-Verhältnis (F:B) wird zunehmend als Indikator für die Bodengesundheit 6,7 verwendet; daher ist eine genaue Bewertung sowohl von Pilzen als auch von Bakterien entscheidend.

Mikrobielle Biomasseschätzungen in Böden basieren oft auf disruptiven chemischen Behandlungen wie der Chloroform-Fumigation8. Andere Ansätze zielen gezielt auf die aktive mikrobielle Gemeinschaft gezielt durch Techniken wie substratinduzierte Atmungoder Analyse von Phospholipid-Fettsäuren (PLFA). PLFA-Analyse wurde häufig verwendet, um die Zusammensetzung mikrobieller Gemeinschaften zu bewerten und das F:B-Verhältnis zu schätzen. Erhebliche Variationen der Zellgröße zwischen verschiedenen Pilz- und Bakterienarten führen jedoch zu Unsicherheit bei der Umwandlung von PLFA-Konzentrationen in Biomasse- oder populationsbasierte F:B-Verhältnisse, wodurch solche Schätzungen potenziell unzuverlässig sind10. Andere Methoden, wie die Flowzytometrie, können verwendet werden, um den Probendurchsatz zur Bestimmung der bakteriellen Häufigkeit im Boden zu erhöhen; ihre Genauigkeit kann jedoch durch ähnliche Größe, Form und Autofluoreszenzeigenschaften wie die Mikroben11 reduziert werden. Die Chloroform-Begasung erfordert eine relativ große Menge Boden (>10 g), um die mikrobielle Biomasse zu schätzen, während eine Stichprobengröße von 500 mg Boden für DNA-basierte Methoden bei Extraktionen mit kommerziellen Bausätzen ausreicht. Ein früherer Vergleich zwischen DNA-basierten Methoden und Chloroform-Begasung zeigte, dass beide Ansätze zwar in der Lage waren, die mikrobielle Biomasse abzuschätzen, deren Kombination jedoch eine robustere Bewertung der mikrobiellenBiomasse 12 im Boden ermöglichte.

Bewertungen von mikrobiellen Gemeinschaften sind eine wenig genutzte Messung der Bodengesundheit, die das Potenzial hat, die Messung und das Verständnis von Böden zu verändern13. Metabarcoding-Ansätze werden konventionell verwendet, um die mikrobielle Gemeinschaft im Boden zu bestimmen, wobei die relativen bakteriellen Häufigkeiten durch die Amplifizierung von Regionen des 16S rRNA-Gens bewertet werden, während Pilztaxa mit dem 18S-rRNA-Gen oder der intern transkribierten Spacer-Region (ITS)14 gezielt angenommen werden. Metabarcodierungsansätze für Pilze können auf unterschiedlichen genomischen Zielregionen basieren, was die Vielfalt und Häufigkeit der identifizierten Pilzarten beeinflusst. Die ungleiche ITS-Länge unter Pilzarten kann eine bevorzugte Amplifizierung und Sequenzierung fördern, daher eine falsche Schätzung ihrer Häufigkeit, was zu einer falschen Bewertung der Pilzgemeinschaften15 führt. Die Fungiquant-Primer wurden entwickelt, um spezifische variable Regionen innerhalb des 18S-rRNA-Gens anzusprechen, die eine umfassende Abdeckung vielfältiger Pilze und Spezifität im Vergleich zu anderen Eukaryotenzeigen.

Die meisten Bakterien und Pilze besitzen mehr als eine Kopie des Zielgens, was zu verzerrten Zellanzahlschätzungen führt. Außerdem haben Pilze oft multinukleare Zellen mit variabler Anzahl von Kernen proZelle 6. Es gibt erhebliche Variationen in der rRNA-Genkopienzahl sowohl innerhalb als auch zwischen taxonomischen Gruppen, typischerweise weniger als 15 Kopien bei Prokaryoten, geschätzt zwischen 28 und 511 bei Pilzen17. Aufgrund dieser Variation gelten molekulare Techniken, die zur Analyse mikrobieller Gemeinschaftsstrukturen verwendet werden, als semi-quantitativ, da sie die Schätzung der Artenrelativhäufigkeit in einer Gemeinschaft18 verzerren können. Gemessene Genkopienzahlen (GCN) werden routinemäßig in Zellhäufigkeiten umgerechnet, wobei das geschätzte durchschnittliche GCN in der taxonomischen Gruppevon Interesse 18,19,20 verwendet wird.

Einige Studien haben metagenomische Ansätze verwendet, da sie mehrere Vorteile gegenüber Metabarcodierung bieten, darunter die Beseitigung von Amplifikationsbias und die Möglichkeit, die gesamte mikrobielle Gemeinschaft umfassend zu untersuchen21. Darüber hinaus ermöglichen sie den gleichzeitigen Vergleich von Pilz- und Bakterienzusammensetzungen sowie deren Beziehungenzueinander 22. Im Allgemeinen wird RT qPCR häufig verwendet, um mikrobielle Inhalte und Funktionen23 zu erkennen. qPCR hat Einschränkungen im Vergleich zu digitaler Tröpfchen-PCR (ddPCR) bei absoluter Quantifizierung aufgrund seiner Empfindlichkeit gegenüber Inhibitoren, da ein externer Standard24 erforderlich ist.

ddPCR ist eine bahnbrechende Technologie, die darauf beruht, einzelne Amplifikationsreaktionen in separate Tröpfchen zu unterteilen. Die Vorlage wird anschließend in jedem einzelnen Tropfen als separate Reaktion durch PCR amplifiziert. ddPCR hat eine geringere Empfindlichkeit gegenüber enzymatischen Inhibitoren, bessere Präzision, Wiederholbarkeit, Sensitivität und Stabilität bei bakterieller und pilzbezogener Quantifizierung als qPCR25. Darüber hinaus ist es eine Methode, die zur absoluten Quantifizierung von Bakterien und Pilzen im Boden5 eingesetzt werden kann. Da ddPCR auf derselben extrahierten DNA basiert, die zur Bewertung mikrobieller Zusammensetzungsverschiebungen verwendet wird, können Häufigkeitsdaten aus ddPCR direkt mit Gemeinschaftszusammensetzungsdaten26 verknüpft werden und zur Quantifizierung der mikrobiellen Biomasse im Boden verwendet werden.

Diese Studie bietet eine Methodik zur Quantifizierung von Pilzen und Bakterien in Böden mittels digitaler Tröpfchen-PCR (ddPCR). Diese optimierte Methode wurde auf Böden aus fünf verschiedenen globalen Standorten und Landnutzungen angewandt. Die Probenstandorte wurden ausgewählt, um ein breites Spektrum von Bodeneigenschaften, Umweltbedingungen und Managementpraktiken abzudecken, wodurch die Bewertung der Robustheit und Allgemeingültigkeit unseres Ansatzes in unterschiedlichen Umgebungen ermöglicht wird. Diese Daten ermöglichten die Bestimmung des F:B-Verhältnisses als molekularen Bioindikator für die ökologische Bodenqualität. Schließlich wurde ein Vergleich der geschätzten mikrobiellen Biomasse zwischen den mikrobiellen ddPCR-Daten und herkömmlichen Chloroform-Fumigationsmethoden durchgeführt.

Protokoll

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Ein Gesamtschema dieser Protokolle ist in Abbildung 1 dargestellt. Die Reagenzien und die verwendeten Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Bodenprobenentnahme

  1. Sammeln Sie zusammengesetzte Oberbodenproben (0–20 cm) von fünf globalen Standorten, wobei drei Proben von zufällig ausgewählten Punkten innerhalb eines Bereichs von 25 m von jedem Ort entfernt sind.
    HINWEIS: Alle Proben wurden aus landwirtschaftlichen Systemen entnommen, die die regionale Landnutzung repräsentieren, in der sie sich befanden. Die Bodentextur wurde mittels Laserbeugung charakterisiert, gemessen mit einem Laser-Beugungsgrößenanalysator (Tabelle 1). Die Proben wurden bei Umgebungstemperatur transportiert und bis zur weiteren Analyse bei 4 °C gelagert.

2. DNA-Extraktion

HINWEIS: Führen Sie die DNA-Extraktion mit einem Boden-DNA-Extraktions-Set gemäß den Anweisungen des Herstellers durch. Für alle Schritte betrug die Raumtemperatur 20 °C.

  1. Drehen Sie das 2-mL-Perlenschlagrohr kurz, um sicherzustellen, dass die Perlen am Boden abgesackt sind. Fügen Sie 100 mg Erde und 800 μL Lösung CD1 hinzu. Vortexen kurz zum Mischen.
  2. Homogenisiere die Proben gründlich mit einem Perlenmühlenhomogenisierer, wobei die Proben für 40 Sekunden bei 6 m s−1 lysiert werden.
  3. Zentrifugiere ein Perlenschlagrohr für mechanische Zelllyse bei 15.000 x g für 1 Minute bei Raumtemperatur.
  4. Übertragen Sie das Überstandsmittel in ein sauberes 2-mL-Mikrozentrifugenrohr.
    HINWEIS: Das Überdachungsmittel kann weiterhin Bodenpartikel enthalten.
  5. Fügen Sie 200 μL Lösung CD2 hinzu und Wirbel für 5 Sekunden.
  6. Zentrifugiere bei 15.000 x g für 1 Minute bei Raumtemperatur.
  7. Übertragen Sie bis zu 700 μL Überstand in ein sauberes 2-mL-Mikrozentrifugenrohr und vermeiden Sie das Pellet. Das Pellet sollte sichtbar sein.
  8. Fügen Sie 600 μL Lösung CD3 hinzu und Wirbel für 5 Sekunden.
  9. Laden Sie 650 μL des Lysats auf eine Spin-Säule und zentrifugieren Sie bei 15.000 x g für 1 Minute bei Raumtemperatur.
  10. Verwerfen Sie den Durchfluss und wiederholen Sie Schritt 2.9, um sicherzustellen, dass das gesamte Lysat durch die Spin-Säule gegangen ist.
  11. Setze die Spin-Säule in ein sauberes 2-mL-Sammelrohr.
  12. Fügen Sie 500 μL Lösung EA in die Spin-Säule ein. Zentrifugieren Sie bei 15.000 x g für 1 Minute bei Raumtemperatur.
  13. Verwerfen Sie den Durchfluss und setzen Sie die Spin-Säule zurück in dasselbe 2-mL-Sammelrohr.
  14. Fügen Sie 500 μL Lösung C5 zur Spin-Säule hinzu. Zentrifugieren Sie bei 15.000 x g für 1 Minute bei Raumtemperatur.
  15. Entferne den Durchfluss und setze die Spin-Säule in ein neues 2-mL-Sammelrohr.
  16. Zentrifugiere bei bis zu 16.000 x g für 2 Minuten bei Raumtemperatur.
  17. Setzen Sie die Spin-Säule in ein neues 1,5-mL-Elutionsrohr.
  18. Fügen Sie 50–100 μL Lösung C6 in die Mitte der weißen Filtermembran hinzu.
  19. Zentrifugiere bei 15.000 x g für 1 Minute bei Raumtemperatur. Entsorge die Spin-Säule und bewahre das Elut bei -20 °C auf.

3. Quantifizierung gereinigter DNA

HINWEIS: Gereinigte DNA wurde mit einem Fluorometer und einem doppelsträngigen (dsDNA) Broad Range (BR) Assay-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers quantifiziert.

  1. Bereiten Sie eine funktionierende Lösung mit einem Verhältnis von 199:1 zwischen Puffer und Reagenz vor.
  2. Fügen Sie 10 μL jedes DNA-Standards zu 190 μL der Arbeitslösung hinzu.
  3. Fügen Sie 1–20 μL gereinigte DNA zu 180–199 μL Arbeitslösung hinzu. Das endgültige Volumen sollte 200 μL betragen. Vortex und Inkubation von Standard- und DNA-Proben bei Umgebungstemperatur für 2 Minuten.
  4. Analysieren Sie die Standards vor den DNA-Proben auf dem Fluorometer anhand der Bildschirmanweisungen.

4. Wahl des Primers

  1. Für die Analyse von Bodenmikroorganismen werden spezifische Primer basierend auf relevanten Referenzen ausgewählt. Für Bakterien wurden 16S rRNA-Primer verwendet, 25,27, und für Pilze 18S rRNA-Primer16.
  2. Führen Sie eine Amplifikation mit der DNA-bindenden Farbstoff-basierten Echtzeit-PCR-(qPCR)-Mastermischung und einem Thermocycler durch. Die Primer-Sequenzen sind in Tabelle 2 aufgeführt.

5. Mikrobielle Quantifizierung mittels ddPCR

  1. Auftauen und Vortex sind alle auf Eis.
  2. Richten Sie die ddPCR-Reaktion wie folgt ein: 0,1 μL (10 μM) vorwärts und 0,1 μL (10 μM) umgekehrter 16S- oder 18S-Primer, 10 μL ddPCR Evagreen Supermix, 0,5 ng Template DNA X μL, wobei nukleasefreies Wasser (NFW) verwendet wird, um das Endreaktionsvolumen auf 22 μL anzupassen. Erzeugen Sie eine negative Kontrolle, indem Sie NFW anstelle der Vorlage für jede Spalte hinzufügen.
  3. Stecke das DG8 in den Patronenhalter.
  4. Geben Sie insgesamt 20 μL des Reaktionsgemisch in die Probenschächte der Kartusche ein.
  5. Fügen Sie 70 μL Tropfengenerierungsöl für Evagreen in das mit der Beschriftung 'Öl' gekennzeichnete Patronenbohrung hinzu.
  6. Setzen Sie die Kartusche in den Tröpfchengenerator und decken Sie die Kartusche mit einer Dichtung ab.
  7. Übertragen Sie 40 μL der erzeugten Tröpfchen auf eine 96-Well-Platte (halbgesockelt) zur PCR-Verstärkung.
  8. Versiegeln Sie die 96-Well-Platte mit dem Plattenversiegler (Temperatur, 180 °C für 5 S).
  9. Verwenden Sie die folgenden Zyklusbedingungen mit einem beheizten Deckel auf 105 °C.
    HINWEIS: (a) Bakterien: 98 °C für 5 Minuten, 40 Zyklen von; 94 °C für 30 Sekunden, 61 °C für 60 Sekunden, 5 Minuten bei 4 °C, 10 Minuten bei 98 °C. (b) Pilze: 95 °C für 5 Minuten, 40 Zyklen von; 95 °C für 30 Sekunden, 55 °C für 1 Minute, 72 °C für 30 Sekunden, 5 Minuten für 4 °C und 5 Minuten für 90 °C.
  10. Übertragen Sie die 96-Well-Platte auf den Plattenleser.
  11. Bewerten Sie die Kopienkonzentration jedes Bohrlochs mit QuantaSoft Version 1.2. Passen Sie die Schwelle der Amplitude an, um negative und positive Tröpfchen zu trennen.
  12. Berechnen Sie die Anzahl der Genkopien pro ng DNA in der Reaktion, indem man Kopien/μL mit dem finalen Reaktionsvolumen (20 μL) multipliziert und durch die gesamte DNA-Template-Eingabe in die Reaktion wie folgt teilt: (kopiert μL-1 x Reaktionsvolumen) / Gesamt-DNA-Eingabe in die Reaktion.
  13. Berechnen Sie die Gesamtgenkopien pro ng extrahierter DNA, indem Sie die Genkopien pro ng mit der insgesamt extrahierten DNA (ng) multiplizieren, wie folgt: (Genkopien pro ng x insgesamt extrahierte DNA).
  14. Berechnen Sie die Genkopien pro Gramm, indem Sie die Gesamtzahl der Genkopien pro ng der extrahierten DNA durch die Menge des Trockengewichts des bei der Extraktion verarbeiteten Bodens (g) teilen, wie folgt:
    Genkopien pro Gramm = (Gesamtgenkopien pro ng der extrahierten DNA / Gramm Trockengewicht des Bodens (GDW) des bei der Extraktion verarbeiteten Bodens).
  15. Berechnen Sie die Zellzahl pro GDW, indem Sie die Genkopien mit der durchschnittlichen Genkopienzahl (GCN) gemäß folgender Gleichung umrechnen:
    Zellanzahl = Genkopien pro Gramm / Mittlere Genkopien Zell-1).
  16. Rechnen Sie die Zellzahlen mit folgender Gleichung in mikrobiellen Biomassekohlenstoff (MBC) um:
    MBC für 16S (mg C g-1 Boden) = Zellen GDW-1 × (100 fg Zelle-1) × 10−15 (g fg-1) × 103 (mg g-1)28
    MBC für 18S (mg C g-1 Boden) = Zellen GDW-1 × (6 fg Zelle-1) x 10−12 (g fg-1) × 103 (mg g-1)29
    Der vollständige Prozess wird in Abbildung 2 erklärt.
    HINWEIS: Die durchschnittliche 16S rRNA-Genkopie (Mittelwert ± SD) für 46 bakterielle Phyla20 wurde berechnet und als Korrekturfaktor für Bakterien verwendet, mit einem Endwert von 2,48. Für Pilze hingegen wurde die Genkopienzahl laut Lofgren et al.17 mit einem Korrekturfaktor von 113 berechnet. Mikrobieller Biomassekohlenstoff (MBC) wurde anhand von ddPCR-abgeleiteten Zellzählungen geschätzt, wobei angenommene zelluläre Kohlenstoffgehalt von 100 fg pro bakteriellerZelle 28 und 6 pg pro Pilzzelle29 verwendet wurden.

6. Bodenmolekulare Analyse aus der Ganzgenomsequenzierung

  1. Bereiten Sie die Sequenzierungsbibliothek nach dem Oxford Nanopore Technologies SQK-NBD114-Protokoll vor, unter Verwendung des Native Barcoding Kit 24 V14 (SQK-NBD114.24) (siehe Materialtabelle). Stellen Sie sicher, dass für jede Probe ein im Kit bereitgestellter Barcode verwendet wird.
  2. Sequenzieren Sie die vorbereitete Bibliothek mit einer Oxford Nanopore Technologies R10.4.1 Flowcell.
  3. Führen Sie während des Sequenzierungslaufs Basecalling in MinKnow durch, indem Sie das Super Accuracy (SUP)-Modell auswählen und das Barcode-Trimming "ON" auswählen. Dorado-Version: 0.7.2+9ac85c6.
  4. Taxonomische Klassifikation der DNA-Sequenz wird mit dem taxonomischen Klassifikator Kraken2 (v2.1.3)30 gegen die NCBI Non-redundant Protein (nr) Datenbank durchgeführt, Konfidenz 0,05.
  5. Überprüfen Sie die Kraken2-Berichtsdateien auf die Gesamtklassifikationen von Bakterien und Pilzen.
  6. Berechnen Sie die relative Häufigkeit von Bakterien und Pilzen für jede Probe.

7. Schätzung des Kohlenstoffs der mikrobiellen Biomasse im Boden durch Chloroform-Begasung

  1. Frische Bodenproben in vorgewogene Pfannen zu wiegen und 24 Stunden lang im Ofen bei 105 °C trocknen.
  2. Berechnen Sie den Bodenfeuchtigkeitsgehalt, indem Sie das trockene Bodengewicht vom frischen Bodengewicht abziehen und die Differenz durch das frische Bodengewicht teilen.
    Feuchtigkeitsgehalt (%) = (W feucht – Wtrocken)/ Wtrocken) × 100
  3. Verwenden Sie den Feuchtigkeitsgehalt, um die Trockensubstanz des Bodens zu berechnen.
    Trockensubstanz (%) = 100 – Feuchtigkeitsgehalt (%)
  4. Fügen Sie 5 g Erde in zwei einzelne 50-mL-Zentrifugenröhren hinzu, die als unbefumigiert und befumigiert gekennzeichnet sind.
  5. Fügen Sie insgesamt 25 mL 0,5 M K2SO4 in das unbefumigierte, beschriftete Rohr ein.
  6. Schütteln Sie die unbegassten Proben 1 Stunde lang in einem Orbitalshaker bei Raumtemperatur.
  7. Gib 2 ml ethanolfreies Chloroform direkt in die als begasten bezeichneten Röhrchen in den Boden. Schließen und sichern Sie die Deckel mit Parafilm und inkubieren Sie 24 Stunden im Dunkeln bei Zimmertemperatur.
  8. Zentrifugieren Sie die unbefumigierte Probe für 10 Minuten bei 2.500 x g bei Raumtemperatur.
  9. Das Überstandsmittel aus der unbegassten Probe dekantieren, durch einen 0,45 μm Zellulosefilter abseihen und bei -20 °C lagern.
  10. Entfernen Sie die Deckel von den befumigierten Proben und lassen Sie sie 2 Stunden im Dampfhaube entlüften, führen Sie dann die K2SO4-Extraktion durch (wiederholte Schritte 5-9) und lagern Sie bei -20 °C.
  11. Missen Sie die Kohlenstoffkonzentration des Extrakts sowohl für 'bespründigte' als auch für 'unbeugte' Proben mit einem Total Organic Carbon Analyzer.
  12. Berechnung des mikrobiellen Biomassekohlenstoffs (MBC) mit folgender Gleichung: MBC = (Fumigierter C-Gehalt – Unbefumigierter C-Gehalt)/0,45. Normalisieren für pro Gramm trockenen Boden.

8. Schätzung des organischen Materialsgehalts im Boden

  1. Trocknen Sie einen Porzellantiegel 30 Minuten lang in einem Umluftofen bei 105 °C und wägen Sie ihn dann nach dem Abkühlen auf 20 °C (WC).
  2. Gib bis zu 2 g Erde in den getrockneten Tiegel und wiege erneut.
  3. Trocknen Sie die Bodenproben im gefüllten Schmelztiegel in einem Umluftofen bei 105 °C für 24 Stunden.
  4. In einen verschlossenen Trockener legen, um abzukühlen und erneut zu wiegen (WS).
  5. Vorheizen Sie einen Schallofen auf 550 °C vor, dann stellen Sie den Tiegel mit dem Boden für 4 Stunden in den Ofen.
  6. Entferne den Tiegel mit Erde aus dem Ofen und lege ihn in einen Trockener zum Abkühlen.
  7. Wige den Tiegel mit Erde (WA).
  8. Messen Sie den Prozentsatz von SOM, indem Sie den Unterschied im Trockengewicht des Bodens vor und nach der Inkubation bei 550 °C berechnen.
    SOMLOI = [(WS –W A)/(WS –WC)] × 100

Ergebnisse

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Bodenproben wurden an fünf Standorten entnommen, und der organische Stoffgehalt im Boden wurde durch Zündverlust bestimmt. Der organische Bodengehalt lag zwischen 3,38 % und 10,34 % in jedem der in der Studie verwendeten Böden (Tabelle 1). DNA-Extraktionen wurden an jeder Bodenprobe in dreifacher Form durchgeführt, mit resultierenden DNA-Erträgen von 32 ng bis 4.590 ng pro Gramm trockenen Bodens (Abbildung 3A).

Die DNA-Konzentration unterschied sich signifikant zwischen Böden mit unterschiedlichem organischen Materialgehalt (Einweg-ANOVA p < 0,0001, R2=0,97). Der Boden mit dem niedrigsten organischen Materialgehalt, Boden A, zeigte nicht die niedrigste DNA-Konzentration. Der Boden E, der den höchsten organischen Stoffgehalt aufwies, wies jedoch eine signifikant höhere DNA-Konzentration aus allen anderen Böden auf (A–D, p < 0,0001), während Boden B die niedrigste Konzentration aufwies, was sich signifikant von A und D unterschied (S. < 0,05). Das ddPCR-Protokoll wurde mit DNA durchgeführt, die aus jeder Bodenprobe mit den 16S- und 18S-rRNA-Genprimern 16S und 18S rRNA (Abbildung 3C) gereinigt wurde. Die Anzahl der Genkopien pro Gramm Trockengewicht des Bodens wurde mit dem ddPCR bestimmt. In allen Bodenproben gab es weniger Kopien des 18S rRNA-Gens als des 16S rRNA-Gens. Tukeys Post-hoc-Tests zeigten, dass Boden B die wenigsten 16S- und 18S-rRNA-Genkopien aufwies, mit durchschnittlich 8,8 x 107 bzw. 4,6 x 106 Genkopien pro Gramm trockenen Bodens. Soil E unterschied sich signifikant von allen anderen Böden und zeigte die größte Anzahl an 16S- und 18S-rRNA-Genkopien mit 4,4 x 109 bzw. 2,5 x 10 9 bzw. 2,5 x 109 Genkopien pro Gramm trockenen Boden. Pilzkopien in Böden A–D unterschieden sich nicht signifikant voneinander, während bakterielle Kopien im Boden D sich signifikant von Boden-B und E unterschieden.

Eine Ganzgenom-Shotgun-(WGS)-Sequenzierung wurde auf DNA angewendet, die aus jeder Bodenproben gereinigt wurde, und taxonomische Klassifikationen wurden mit Kraken2 gegen die NCBI-NR-Datenbank durchgeführt. Die Gesamtzahl der gegen Bakterien und Pilze klassifizierten DNA-Sequenzwerte wurde verwendet, um das Pilz-Bakterien-Verhältnis (F:B) für jeden Boden zu berechnen und mit Pilz-Bakterien-Verhältnissen aus den Genkopienzahlen von ddPCR zu vergleichen (ergänzende Abbildung 1). Die mit ddPCR erhaltenen F:B-Verhältniswerte lagen zwischen 0,022 und 0,66 über allen Bodenproben und waren höher als die durch die Ganzgenomsequenzierung. Das höchste durchschnittliche F:B wurde im Boden-E beobachtet, mit einem F:B von 0,56 für ddPCR und 0,038 für die WGS-Methoden. Außerdem wurde in den Bodenproben mit ddPCR ein größerer Bereich an F:B-Werten identifiziert als bei WGS. Zusätzlich wurde eine positive Korrelation zwischen dem F:B-Verhältnis der ddPCR-Methode und den WGS-Daten (r = 0,59, R2 = 0,35, p = 0,019) beobachtet, wie in ergänzender Abbildung 1 dargestellt.

Eine durchschnittliche Genkopienzahl für Bakterien und Pilze wurde verwendet, um berechnete Genkopien auf die Anzahl der Bakterien- und Pilzzellen in den ursprünglichen Proben umzurechnen (ergänzende Abbildung 2). Diese Daten wurden kombiniert, um die Gesamtzahl der mikrobiellen Zellen im Boden zu schätzen (Abbildung 3D) und unterschieden sich signifikant zwischen den Böden (Einweg-ANOVA p < 0,0001). Tukeys paarweise Vergleichsanalyse zeigte, dass der höchste mikrobielle Gehalt in Boden E beobachtet wurde, während der niedrigste mikrobielle Gehalt in Proben aus Boden B gefunden wurde und sich signifikant von A, D und E unterschied.

Eine Chloroform-Bezugsprobe wurde an jeder Bodenprobe in dreifacher Form durchgeführt, um den gesamten mikrobiellen Biomassekohlenstoff (MBC) in jeder Probe zu schätzen (Abbildung 4A). Zwischen 3,6 und 9,6 mg Kohlenstoff pro Gramm trockenen Boden wurden über die verwendeten Böden hinweg identifiziert, wobei keine signifikanten Unterschiede zwischen den einzelnen Proben beobachtet wurden (Einweg-ANOVA p = 0,266). Ein durchschnittlicher Kohlenstoffgehalt für bakterielle und Pilzzellen wurde verwendet, um die von ddPCR geschätzte Anzahl mikrobieller Zellen in einen geschätzten Gesamtkohlenstoff der mikrobiellen Biomasse umzurechnen. Diese ddPCR-abgeleiteten Schätzungen wurden mit der Chloroform-Begasungsmethode verglichen (Abbildung 4B). Um die Beziehung zwischen MBC gemessen durch Chloroform-Begasung und der ddPCR-Methode zu bewerten, wurde eine Pearson-Korrelation durchgeführt (n = 15). Es wurde eine positive Korrelation zwischen den beiden Methoden festgestellt (r = 0,43, R2 = 0,18, p-Wert = 0,05). Ausreißer aus Boden E, die durch den höchsten organischen Stoffgehalt gekennzeichnet sind, trugen wahrscheinlich unverhältnismäßig zu diesem marginal signifikanten Ergebnis bei (Abbildung 4B).

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Abbildung 1: Ein Überblick über die Verarbeitung von Bodenproben. Die Abbildung zeigt die molekularen Methoden, die Boden-DNA zur mikrobiellen Quantifizierung verwenden, sowie die herkömmlichen Methoden zur Messung von mikrobieller Biomasse, Kohlenstoff und organischer Substanz im Boden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 2: Flussdiagramm des Zellzählprozesses von ddPCR-Kopien für sowohl 16S als auch 18S bis zur endgültigen Kohlenstoffschätzung der mikrobiellen Biomasse, die die Schritte 5.11–5.16 des Protokolls zeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 3: Mikrobielle Quantifizierung von Böden. (A) Die durchschnittliche DNA-Konzentration, die aus jeder Bodenprobe gereinigt wurde. (B) Durchschnittliche Gesamtzahl von 16S rRNA-Genkopien pro Gramm Trockengewicht des Bodens mittels ddPCR. (C) Durchschnittliche Gesamtzahl von 18S rRNA-Genkopien pro Gramm Trockengewicht des Bodens mittels ddPCR. (D) Durchschnittliche Gesamtzahl mikrobieller Zellen pro Gramm Trockengewicht über Bodenproben. Alle Fehlerbalken zeigen den Standardfehler des Mittelwerts an. Eine Einweg-ANOVA und der anschließende Tukey's Post-hoc-Test für paarweise Vergleiche wurden durchgeführt, und die signifikanten Unterschiede werden mittels kompakter Buchstabenanzeige angezeigt (Signifikanzschwelle = 0,05). Die Proben sind von niedrigster bis höchster OM% geordnet. Bodenherkunft (OM%) A: Niederlande (3,38), B: Irak (5,14), C: China (6,41), D: Großbritannien (8,19) und O: UK (10,34). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 4: Mikrobieller Biomassekohlenstoff, gemessen durch Chloroform-Begasungsextraktion und genbasierte Zellschätzungen. (A) MBC extrahiert durch Chloroform-Begasung – geordnet von niedrigem bis hohem organischen Stoffgehalt. Fehlerbalken zeigen den Standardfehler des Mittelwerts an. Eine Einweg-ANOVA und der anschließende Tukey-Post-hoc-Test für paarweise Vergleiche wurden durchgeführt, und die signifikanten Unterschiede werden mittels kompakter Buchstabenanzeige dargestellt (Signifikanzschwelle = 0,05). (B) MBC, geschätzt aus der Zellmenge (Zell-GDW -1), abgeleitet aus ddPCR-Genkopienzahl und in Biomassekohlenstoff umgewandelt, gegen die gesamte organische Substanz derselben Probe dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

BeispielBodenherkunftpHFeuchtigkeitsgehalt %Organische Substanz %TexturLandnutzung
ATexel, Niederlande7.1619.043.38Sandiger LehmGartenbau
BNajaf, Irak7.588.335.14Schlammiger LehmReis
CJiangxi, China4.118.456.41Schlammiger LehmSesam/Raps
DCambridge, Großbritannien6.8121.88.19Schlammiger LehmWeizen
EExeter, Großbritannien5.4420.2710.34Schlammiger LehmGrasland

Tabelle 1: Physiochemische Eigenschaften und Landnutzungsmerkmale von fünf Bodenproben (A–E) zur Bestimmung der mikrobiellen Biomasse.

ZielBPVorwärtsRückwärtsReferenz
16S rRNA1805′- ACTCCTACGGGAGGCAGCAG5′- ATTACCGCGGCTGCTGG(Le Geay et al., 2024; Ovreås et al., 1997)
18S rRNA3515′-GGRAAACTCACCAGGTCCAG5′-GSWCTATCCCCAKCACGA(Liu et al., 2012)

Tabelle 2: Primerpaare, die zur Zielsetzung des 16S- und 18S-rRNA-Gens mit dem ddPCR ausgewählt wurden.

Ergänzende Abbildung 1: Eine Korrelation zwischen dem F:B-Verhältnis aller Bodenproben, bestimmt durch die ddPCR-Methode, und WGS. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 2: Anzahl der Zellen in verschiedenen Bodenproben, gemessen mit der ddPCR-Methode: (A) Bakterien; und (B) Pilze. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

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Bodenmikroben sind die Hauptzersetzer in terrestrischen Ökosystemen und spielen eine wesentliche Rolle im Nährstoffkreislauf sowie als Kohlenstoffspeicherung im Boden. Trotz der Bedeutung von Bodenmikroben ist es schwierig, ihre absolute Häufigkeit mit genkopiebasierten Methoden genau zu quantifizieren. Dies liegt an vielen Faktoren, wie der variablen Anzahl der Zielgene in verschiedenen Arten. Diese Studie zeigt, wie die mikrobielle Biomasse im Boden mittels ddPCR quantifiziert werden kann, indem Prokaryoten und Eukaryoten in den jeweiligen 16S- und 18S-rRNA-Gen-Kodierungsregionen gezielt werden. Das höchste F:B-Verhältnis wurde im Boden-E beobachtet, wobei auch diese Probe den höchsten Anteil an organischer Substanz aufwies. Das zweithöchste F:B-Verhältnis wurde in Probe C beobachtet, was mit der hohen Säure dieser Böden korrelierte. Dies wurde für die Proben C und E erwartet, da das Pilzwachstum mit einem niedrigerenpH-Wert von 31 zunimmt. Die Ganzgenomsequenzierung wurde an denselben DNA-Extrakten durchgeführt, die auch für ddPCR-Methoden verwendet wurden. Das F:B-Verhältnis zwischen WGS und ddPCR wurde verglichen. Das aus WGS-Daten berechnete F:B-Verhältnis war für alle analysierten Proben niedriger als das F:B-Verhältnis aus ddPCR-Daten. Der Gesamttrend des F:B-Verhältnisses zwischen den Proben war jedoch zwischen den einzelnen Methoden visuell vergleichbar. Dies führte zu höheren F:B-Verhältnissen bei Bodenproben im Vergleich zur Ganzgenomsequenzierung und zeigte eine größere F:B-Variabilität zwischen verschiedenen Bodentypen. Das niedrigere F:B-Verhältnis aus den WGS-Daten ist wahrscheinlich durch die Unterschiede in der Genomgröße zwischen Pilzen und Bakterien verursacht, und die Pilzsequenzen könnten ohne Anreicherung32 unterrepräsentiert sein. Außerdem zeigte Soil A trotz des niedrigsten organischen Materialsgehalts nicht die geringste Anzahl mikrobieller Kopien und mikrobieller Biomasse-Kohlenstoff, was unterstreicht, dass organische Substanz nicht immer direkt mit mikrobieller Biomasse korreliert. Bemerkenswert ist, dass die beobachteten Trends zwischen der ursprünglichen DNA-Konzentration (Abbildung 3A) und den gesamten mikrobiellen Zellen (Abbildung 3D) visuell ähnlich waren, was darauf hindeutet, dass die DNA-Konzentration ein guter Proxy für mikrobielle Biomasse ist.

ddPCR ermöglicht eine genaue Quantifizierung der Genkopienzahlen in Bodenproben, und diese Methode kann verwendet werden, um die Gesamtzahl der mikrobiellen Zellen zu schätzen. Es gibt jedoch Einschränkungen, die berücksichtigt werden müssen. Die Anzahl der 16S- und 18S-rRNA-Genkopien variiert stark zwischen den mikrobiellenTaxa 23. Daher kann die Verwendung eines einzelnen Korrekturfaktors für die Genkopienzahl zu einer Über- oder Unterschätzung der mikrobiellen Häufigkeit in einerProbe 33 führen. Diese Einschränkung kann durch die Einbeziehung von Vorwissen über die mikrobielle Gemeinschaft18, die Nutzung von Ganzgenomsequenzierungsdaten und die Anwendung geeigneter Genkopienzahlen-Korrekturen, die repräsentativ für die spezifische Bodenmikrobiota sind, behoben werden. Obwohl molekulare Methoden weiterhin eine Schätzung statt einer exakten Zählung liefern, bieten sie eine genauere Vorhersage der mikrobiellen Häufigkeit. In Kombination mit Daten zur Gemeinschaftszusammensetzung ermöglicht dieser Ansatz Interpretationen, die über die relative Häufigkeit hinausgehen19,34.

Mikrobieller Biomassekohlenstoff (MBC), geschätzt mittels Chloroform-Begasung, zeigte keine signifikanten Unterschiede zwischen den analysierten Proben, obwohl große Variationen bei MBC zwischen den Proben A–D beobachtet wurden. Im Gegensatz dazu wurden signifikante Unterschiede bei den gesamten mikrobiellen Zellzahlen mit der ddPCR-Methode festgestellt, was darauf hindeutet, dass dieser molekulare Ansatz eine höhere Auflösung als herkömmliche Techniken bieten kann. Die Berechnung des mikrobiellen Biomassekohlenstoffs aus mikrobiellen Zellzahlen hat jedoch ihre eigenen Einschränkungen. Variabilität der Zellgröße kann die Umwandlung von Zellzählungen in Biomasse beeinflussen. Ähnlich wie bei der Verwendung eines einzelnen Umwandlungsfaktors für die Genkopienzahl kann die Verwendung eines einzelnen Umwandlungsfaktors für bakterielle und pilzbedingte Kohlenstoffgehalt zu einer Über- oder Unterschätzung des mikrobiellen Biomassekohlenstoffs führen.

Darüber hinaus können DNA-basierte Methoden besonders problematisch im Vergleich zu Böden sein, die große Unterschiede im Dominanz zwischen Bakterien und Pilzen aufweisen. Sowohl der DNA-Ertrag als auch der GCN können ebenfalls durch die Wahl der DNA-Extraktionsmethode und des Primer-Designsbeeinflusst werden, was Laborvergleiche zwischen Laborenerschwert. Außerdem können sowohl GCN- als auch DNA-Ertragsmethoden aufgrund sogenannter "Relikt-DNA", also DNA in toten Organismen oder an Ton gebunden, überschätzt werden. Obwohl ddPCR-Methoden eine bessere Präzision und Wiederholbarkeit zeigen, sind einige Nachteile die komplizierten Prozesse, hohe Kosten und der Einsatz unspezifischer DNA-Farbstoffe bei der Verwendung der Evagreen-Chemie5. Dies kann zu schwachen falsch-positiven Ergebnissen führen, was es erschwert, positive von negativen Tröpfchen zu unterscheiden, und eine leichte Fehlanpassung des Schwellenwerts könnte das F:B-Verhältnis beeinflussen, wenn Genkopien niedrig14 sind. Um die Anzahl der mit dieser ddPCR-Methode verarbeiteten Proben zu erhöhen, kann Automatisierung mit Flüssigkeitshandhabungsrobotik für DNA-Extraktionen und Reaktionsaufbau39 eingesetzt werden. Zusätzlich ermöglicht das neue ddPCR-System ein größeres Multiplexing, das gleichzeitig Tröpfchen für 96 Proben erzeugt.

Es ist wichtig zu beachten, dass alle mikrobiellen Biomassemessungen Schätzungen sind und verallgemeinerte Umrechnungsfaktoren zur Bestimmung derZahlen 37 enthalten. Daher sollten Vergleiche zwischen den Methoden mit Vorsicht durchgeführt werden, da unbekannt ist, welche die genauesten sind. Dennoch wurden in den letzten Jahrzehnten Chloroform-Begasungs- und Extraktionsmethoden weit verbreitet eingesetzt und setzen auf Chlorformdämpfe zur Begasung des Bodens. Dies hat aufgrund seiner Toxizität für Menschen und Umwelt sowie seiner Wirksamkeit bei der Lysierung von Bodenmikrobienviele Bedenken aufgeworfen. Außerdem kann die Chloroform-Begasung zu einer Überschätzung von MBC führen, die aus nichtlebenden Quellen wie Pflanzenresten41 produziert werden. Schließlich setzt diese Methode im Vergleich zu anderen molekularen Methoden, die sehr geringe Bodenmengen (<500 mg) benötigen, auch relativ große Mengen Boden.

Diese Studie liefert Hinweise darauf, dass ddPCR-basierte Methoden zur Messung der mikrobiellen Biomasse im Boden über verschiedene Böden hinweg robust sind und nicht von unterschiedlichen Bodentypen und potenziellen Inhibitoren beeinflusst werden. Der Erfolg dieser Methode wird durch die ursprüngliche DNA-Probe beeinflusst, weshalb eine effektive DNA-Reinigung aus den Proben entscheidend ist. Diese Methode zeigt vielversprechende Ergebnisse für mikrobielle Erkennung und Quantifizierung in verschiedenen Bodentypen und -texturen, ergänzt bestehende Methoden zur Schätzung mikrobieller Biomasse und ermöglicht wertvolle zukünftige Anwendungen zur Überwachung des Bodenzustands und der Skalierbarkeit für regionale oder globale Mikrobiomüberwachung.

Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autoren geben keine Interessenkonflikte an.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir danken Dr. Nina Lindstrom-Friggens, Dr. Liz Cressey, Dr. Joanna Zaragoza-Castells, Angela Elliott, Dr. Kees Jan van Groenigen und Prof. Iain Hartley. Wir möchten auch den Landbesitzern danken, dass sie die Böden für diese Studie bereitgestellt haben. Diese Forschung wurde von Shell Research Ltd (CW648947-PT34767) finanziert. Die während der aktuellen Studie erstellten Datensätze sind im NCBI Sequence Read Archive-Repository PRJNA1305539 verfügbar.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Bettersizer S3 Plus Bettersize, ChinaBT-803
ZentrifugeThermowissenschaftlich SL16 
Chloroform ThermoScientificL14759. AU 
ddPCR 96-Well-PlattenBio-Rad, Watford, Großbritannien12001925
ddPCR Tropfenlese-Öl Bio-Rad, Watford, Großbritannien1863004
Dessicator Davisil
DG8-PatronenhalterBio-Rad, Watford, Großbritannien1863051
DG8-Patronen für QX200/QX100 TröpfchengeneratorBio-Rad, Watford, Großbritannien1864008
DG8-Dichtungen für QX200/QX100 TropfengeneratorBio-Rad, Watford, GroßbritannienQ33265
DNeasy Power Soil pro kit Qiagen, Deutschland47017
Doppelsträngiges (dsDNA) Breitband-Assay-Kit (BR)Invitrogen, DeutschlandQ33230
FastPrep-24 5G MP Biomedizin, Großbritannien116005500
GridION Oxford Nanopore Technologies, GroßbritannienGRD-MK1CAPX
K2SO4Merck, Großbritannien7778-80-5
Mag-Bind-MagnetperlenOmega Bio-tek, USAM1378-01
MinION-DurchflusszelleOxford Nanopore Technologies, GroßbritannienFLO-MIN114
Gedämpfter OfenCarbolit AAF1100
Natives Barcode-Kit 24Oxford Nanopore Technologies, GroßbritannienSQK-NBD114.24
PCR-Platte Heißwasserdichtung, Folie, Pierceable Bio-Rad, Watford, Großbritannien1814040
PX1 PCR-PlattenversiegelungBio-Rad, Watford, Großbritannien1814000
Qubit-FluorometerInvitrogen, DeutschlandQ33226
QX200 Droplet Digital-PCR-SystemBio-Rad, Watford, Großbritannien1864001
QX200 ddPCR EvaGreen SupermixBio-Rad, Watford, Großbritannien186-4033
QX200 Tröpfchengenerierungsöl für EvaGreen Bio-Rad, Watford, Großbritannien1864005
QXDx Tropfengenerator Bio-Rad, Watford, Großbritannien12001049
SENSOQUEST LABCYCLER Geneflow, Deutschland1120280125

Referenzen

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