Methodenartikel

Fluoreszenzbasierte Kalziumbildgebung in primären menschlichen Atemwegsepithelkulturen mittels automatisierter Zellsegmentierung

DOI:

10.3791/69470

⸱

22. Mai 2026

 ,  , 
1Molecular Medicine, Hospital for Sick Children, 2Department of Biochemistry, University of Toronto, 3Department of Physiology, University of Toronto

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Live-Cell-Bildgebung der Calcium-Signalgebung wird umfangreich eingesetzt, um die Kalziummobilisation in stabilen Zelllinien in Monoschichten zu untersuchen. Dieses Protokoll beschreibt die Fluoreszenzbildgebung von Calcium-Signalgebung in lebenden Zellen mit lebenden Zellfarben auf komplexem, primärem Gewebe und nutzt außerdem maschinelle Lernsoftware, um die Fluoreszenzintensität von Tausenden einzelner Zellen gleichzeitig zu quantifizieren und so die Analysen zu optimieren.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Calcium-Signalübertragung ist in vielen biologischen Prozessen entscheidend und unterstreicht die Notwendigkeit, Methoden zur Untersuchung des Kalziumflusses im primären Gewebe zu entwickeln. Die Untersuchung der Calcium-Signalübertragung in einer Einzelzellauflösung in komplexen primären Epithelkulturen ist herausfordernd und daher weiterhin wenig erforscht. Diese Studie stellt Methoden vor, die zur Überwachung der lebenden Kalziumsignalübertragung in primären Apithelkulturen der Atemwege angepasst sind, sowie neuartige Ansätze für maschinelles Lernen basierende Analysen. Mit von Patienten abgeleiteten primären Atemwegs-Epithelkulturen, die an ALI (Luft-Flüssigkeit-Grenze) differenziert wurden und mit einem extrinsischen fluoreszierenden Indikatorfarbstoff versehen waren, wurde die Kalziummobilisation mit einem Epifluoreszenzmikroskop in Einzelzellauflösung gemessen. Wir entwickelten eine neuartige Software, die maschinelle Lern-basierte Zellsegmentierung nutzt, um Fluoreszenzintensitäten verschiedenen Zellen über die Zeit zuzuweisen. Insgesamt ermöglichen das angepasste Bildgebungssystem und die Software einen schnellen und unvoreingenommenen Ansatz zur Analyse einzelner Zellen innerhalb der primären Epithelkulturen. Das hier vorgestellte Schritt-für-Schritt-Protokoll wird die zukünftige Untersuchung von Kalzium in einzelnen Zellen und Zelltypen, die die primären Epithelkulturen ausmachen, ermöglichen.

Einleitung

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Veränderungen in der intrazellulären Kalziummobilisation bestimmen eine Vielzahl zellulärer Prozesse, darunter Veränderungen in der Genexpression und die Modulation angeborener Immunantworten 1,2. Die intrazellulären Kalziumspiegel können durch Freisetzung aus intrazellulären Kalziumspeichern wie dem endoplasmatischen Retikulum und Mitochondrien 1,2,3 verändert werden. Der extrazelluläre Kalziumzufluss in den intrazellulären Raum kann auch zytosolisches Kalzium durch passiven und aktiven Transportverändern. Die Lebendzellbildgebung der Kalziummobilisation wird hauptsächlich mittels intrazellulärer Farbstoffe oder genetisch kodierten Farbstoffen, GCaMP (Green Calcium-activated Multimer/Protein)4, untersucht. In der Literatur sind AM (Acetoxymethyl) konjugierte Farbstoffe verbreitet, die es dem Farbstoff ermöglichen, die Plasmamembran 5,6,7,8 zu durchdringen. Beim Eintritt in die Zelle wird die AM-Gruppe durch endogene intrazelluläre Esterasen gespalten, und der Farbstoff erhält eine negative Ladung, die ihn im zytosolischen Raum9 einschließt. Durch diese gewonnene Ladung kann der Farbstoff durch organische Anionenkanäle der Plasmamembran ausgepumpt werden. Daher wird Probenecid, ein Inhibitor organischer Anionen-Effluxtransporter, hinzugefügt, um den zellulären Efflux des Farbstoffs zu verhindern und das optimale zytosolische Signal10,11 zu erhalten. Studien verwenden häufig Fura-2 AM, einen ratiometrischen Farbstoff, und Fluo-4AM, einen intensiven Farbstoff, um die Calciumsignalgebung an stabilen Zelllinien zu untersuchen, die in einer Monoschicht kultiviert sind. Diese Studie verwendet ein Protokoll, das für die epifluoreszente Bildgebung von mehrschichtigen Kulturen an der Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche mit dem kürzlich entwickelten intensivitometrischen Kalziumfarbstoff Cal-520 AM angepasst wurde, der eine höhere Empfindlichkeit im Vergleich zu Fluo-4 AM aufweist. Daher eignet es sich, subtile Signale mit einer einzigen Zellauflösung aus komplexen primären Epithelkulturen robust zu visualisieren. Die aktuelle Literatur ist reich an Live-Kalziumbildgebung von Massenreaktionen stabiler Zelllinien. Heute ist jedoch allgemein bekannt, dass in vivo Gewebe eine vielfältige zelluläre Landschaft bilden, die verschiedene zelltypspezifische Rollen bei der Aufrechterhaltung der Gewebehomöostaseunterstützt. Trotz dieses allgemein bekannten Wissens sind die Mechanismen, durch die unterschiedliche Zelltypen Kalziumsignale koordinieren und die Calciumionen-Homöostase regulieren, weiterhin unbekannt. Daher ermöglichen die hier vorgestellten Methoden die einzelzellige Erkennung von Kalziumsignalen und erhöhen den Durchsatz von nachgelagerten Analysen in primären Atemwegsgeweben.

Wir nutzen unsere zuvor veröffentlichten und rigoros validierten primären epithelialen Kulturmodelle des menschlichen Nasenepithels als Werkzeug, um lebendzelliges zytosolisches Kalzium in einem biologisch relevanteren Modell 16,17,18 abzubilden. Kurz gesagt: Epithelzellen werden aus Nasenbürsten der Patienten isoliert und auf einer halbdurchlässigen Membran eines Transwells kultiviert, die in einem Kulturbrunnen suspendiert wird, um eine Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche (ALI) aufrechtzuerhalten. Diese Grenzfläche, gekoppelt mit spezialisierten Medien, wurde rigoros mit orthogonalen Techniken auf das Vorhandensein verschiedener Zelltypengetestet. Außerdem wurde gezeigt, dass die aktuellen Methoden auf primäre Bronchienkulturen übertragbar sind, die ähnlich kultiviert werden wie unsere primären Nasenkulturen19.

Dieser Artikel stellt eine angepasste Methode vor, um lebende Kalziumsignale mit Einzelzellauflösung in diesen primären Apithelkulturen der Atemwege zu messen und zu analysieren. Diese mehrschichtigen Kulturen lassen sich schwer mit Mikroskopie visualisieren; Die derzeitige Einrichtung ermöglicht es uns jedoch, uns zuverlässig auf einzelne Schichten innerhalb der mehrschichtigen Kulturen zu konzentrieren, sodass wir die Kalziummobilisation aus diesen spezifischen Schichten nachweisen können. Dieses Setup hat mehrere Vorteile, da es kein Perfusionssystem benötigt, das oft kostspielig und schwer anzupassen ist, sofern keine speziellen Mikroskope eingesetzt werden. Eine Epifluoreszenzmikroskopie wurde eingesetzt, die eine verbesserte zeitliche Auflösung im Vergleich zur konfokalen Bildgebung bietet. Der Einsatz von Leuchtdioden (LEDs) minimiert die Phototoxizität im Vergleich zu laserbasierten konfokalen Systemen. Im hier vorgestellten Protokoll werden extrinsische intensiviometrische Farbstoffe verwendet, da sie schnelle, relative Veränderungen des Kalziums in der gesamten Zellpopulation ermöglichen und mit den meisten Fluoreszenzmikroskopie-Setups kompatibel sind. Dies ist vorteilhaft gegenüber herkömmlichen ratiometrischen Farbstoffen, die eine tiefe ultraviolette (UV-)Anregung erfordern, die bei vielen Mikroskopen nicht verfügbar ist. Darüber hinaus erfordert GCaMP eine Transfektion oder Transduktion, was die Technik für gezieltere Kalziumbildgebung bei bestimmten Zelltypen stärkt. Aufgrund geringer Transduktions- und Transfektionseffizienz in primären Epithelkulturen ist die Technik schlecht geeignet, um die gesamte Zellpopulation zu überwachen.

Darüber hinaus entwickelte diese Studie neuartige, spezialisierte maschinelles Lernen basierende Software, die Einzelzellsegmentierung auf Basis lebender nuklearer Färbung ermöglicht. Die Software kann dann Fluoreszenzintensitätswerte für jede Zelle über die Zeit aufzeichnen. Eine stabile Epithelzelllinie (Calu-3) wurde zunächst zur Methodenoptimierung eingesetzt. Anschließend wurden diese Methoden zur Untersuchung der Kalziummobilisierung einzelner Zellen in primären Epithelkulturen umgesetzt. Variablen wie die Konzentration des Calciumfarbstoffs und Probenecides, der Zeitpunkt der Inkubationsschritte sowie die Bildgebende Einrichtung wurden optimiert. Hier wird die Calcium-Signalübertragung mit einer Bildrate von 0,2 fps (Bilder pro Sekunde) aufgezeichnet, was zur Überwachung der Calcium-Signalübertragung geeignet ist. Die Bildrate kann erhöht werden, um schnellere Kalziumtransienten20 zu messen. Die optimalen Variablen wurden dann angewendet und in komplizierteren primären Nasenkulturen weiter optimiert.

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Protokoll

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Die Reagenzien und die verwendeten Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Wartung und Kultivierung der Calu-3-Zellen

  1. Halten Sie Calu-3-Zellen in T-25-Kolben in EMEM-Kulturmedien aufrecht, ergänzt mit 20 % FBS und 1 % Penicillin/Streptomycin. Erwärme das Medium vor und wechsle es an wechselnden Tagen (5 ml/Flasche).
  2. Wenn die Zellen zu 70 % im Kolben zusammenfließen, aspiriere das Medium im Kolben.
  3. Waschen Sie die Flasche mit 5 ml 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).
  4. Gib 1 ml TrypLE direkt in die Zellen für 10–15 Minuten bei 37 °C, 5 %CO2. Stellen Sie sicher, dass sich alle Zellen vom Boden des Kolbens gelöst und zu einer einzelligen Suspension dissoziiert sind.
  5. Neutralisieren Sie die Reaktion mit 4 ml frischem Kulturmedium (Schritt 1.1) und mischen Sie die Zellen dann gut mit einer serologischen Pipette, um eine gleichmäßige Aussäung sicherzustellen.
  6. Plattieren Sie die Zellen auf eine 96-Well-Platte bei 90%-100% Konfluenz (etwa 40.000 Zellen pro Well).
    1. Um Bohrungen zu säen, fügen Sie 200 μL/Brunnen gut gemischte Zellsuspension hinzu.
    2. Lassen Sie die Zellen über Nacht an der 96-Well-Platte haften.
  7. Wechsle das Medium jeden Tag (200 μL/Well), bis es für Experimente bereit ist.
  8. Lassen Sie 2–5 Tage nach der Konfluenz innerhalb der Brunnen ein, um mit den Experimenten zu beginnen, bevor Experimente durchgeführt werden, um die Differenzierung zu ermöglichen.

2. Protokoll zum Laden von Calu-3-Zellen mit Cal 520 AM oder Fluo-4 AM

VORSICHT: Fluo-4 AM und Cal-520 AM sind in DMSO aufgelöst, was als gefährlich gilt. Probenecid ist als akute Gefahr eingestuft. Bitte tragen Sie Handschuhe und einen Laborkittel beim Umgang mit Chemikalien, um Hautkontakt zu vermeiden. Entsorgen Sie alle Chemikalien in ausgewiesenen Mülltonnen.

  1. Am Tag des Experiments werden die Medien durch Pipettern entfernt und die Zellen zweimal (200 μL/Bohrloch) in vorgewärmtem Calciumpuffer (140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCl2 und 10 mM Hepes, angepasst auf pH 7,38 (NaOH) 291 mOsm) entfernt, um tote Zellen zu entfernen.
  2. Inkubieren Sie Zellen mit 200 μL/Well eines Cocktails aus 3 μM Cal-520 AM, 2,5 mM Probenecid und 1:5000 Hoechst-Kernfarbe im Kalziumpuffer (Schritt 2.1) für 1 Stunde in einem Inkubator, der bei 37°C und 5 %CO2 eingestellt ist.
    1. Für Fluo-4-AM-Experimente inkubieren Sie Zellen mit 200 μL/Welle eines Cocktails aus 3 μM Fluo-4 AM, 2,5 mM Probenecid und 1:5000 Hoechst-Kernfarbe im Kalziumpuffer (Schritt 2.1) für 1 Stunde bei 37 °C und 5 %CO2.
      HINWEIS: Bewahren Sie die Farbtuben im Dunkeln auf, indem Sie sie mit Alufolie abdecken.
  3. Während der Inkubation bereiten Sie Thapssigargin in einem Kalziumpuffer vor (Schritt 2.1). Passen Sie die Zwischenlagerkonzentrationen an, um die richtigen Endkonzentrationen im Bohrloch sicherzustellen.
    HINWEIS: Hier werden 50 μL Medikament zu 100 μL des vorhandenen Calciumpuffers hinzugefügt. Daher wurde ein dreifacher Zwischenbestand von 6 μM vorbereitet.
  4. Nach 1 Stunde wird der Farbstoff durch Pipettieren abgeaspiriert und der extrazelluläre Farbstoff zweimal mit einem Kalziumpuffer (Schritt 2.1) abgewaschen (200 μL/Well).
  5. Nach den Waschvorgängen wird 100 μL/Brunnen 2,5 mM Probenecid im Calciumpuffer (Schritt 2.1) hinzugefügt, um den Farbstoff im zytoplasmatischen Raum zu erhalten.
  6. Wickle die Platte in Alufolie, um sie vor Licht zu schützen. Die Zellen sind jetzt bereit zum Fotografieren.

3. Einrichtung der Mikroskopie für die Calu-3 stabile Zelllinie

  1. Mit dem Epifluoreszenzmikroskop ausgestattet mit einem SuperFluor-Objektiv, einer stabilen Festkörperlichtquelle und einer CMOS-Fluoreszenzkamera (6,5 μm Pixelgröße). Die Beleuchtungsintensität ist auf 500 mW eingestellt.
  2. Setze die Zellplatte mit dem 96-Well-Plattenadapter auf die Stufe. Mit Brightfield konzentriere dich auf die Zellschicht mit niedriger Vergrößerung, um die Monoschicht der Zellen zu finden (verwende 5-10x Luftobjektiv).
    HINWEIS: Dieser Schritt ist optional, aber hilfreich, um die erste Konzentration auf die Zellschicht effizient zu gewinnen.
  3. Sobald die Zellschicht identifiziert ist, verwenden Sie Brightfield, wechseln Sie zu einer höheren Vergrößerung (20-faches Luftobjektiv) und konzentrieren Sie sich auf die Zellschicht neu.
    HINWEIS: Achten Sie auf die richtige Fokussierung der Monoschicht mit Brightfield; Zellgrenzen sollten klar sein.
  4. Identifizieren Sie das Kalziumfarbstoffsignal mit der GFP (475 nm LED). Stellen Sie sicher, dass die LED-Leistung zwischen 5 % und 10 % liegt, um Photobleaching zu vermeiden, und dass die Belichtungszeit geeignet ist, um das Grünsignal auf der Basis sichtbar zu machen, ohne das Signal zu übersättigen, typischerweise zwischen 300 und 500 ms.
    HINWEIS: Um die Reproduzierbarkeit und die gleichmäßige Farbstoffladung sicherzustellen, analysieren Sie die Zellschicht qualitativ; Die meisten Zellen sollten die gleiche Helligkeit zeigen. Konzentriere dich auf Sichtfelder mit begrenzten toten Zellen, die vor der Zugabe eines Stimulans stark fluoreszieren. Die relative Ausgangs-Fluoreszenzintensität kann mit Fiji gemessen werden (Schritt 7.9). Die Ausgangsvariation der Fluoreszenzvariation zwischen den Zellen sollte bei gleichmäßiger Ladung des Farbstoffs bei etwa 10 % bis 15 % liegen (Schritt 7,9).
  5. Identifizieren Sie die Hoechst-Nuklearfarbe mit der DAPI (405 nm) LED. Die LED-Leistung sollte zwischen 2 % und 5 % liegen, mit einer Belichtungszeit zwischen 50 und 100 ms.
    HINWEIS: Wenn die Zellen fokussiert sind, sollten die Kerne scharfe Konturen haben. Stellen Sie sicher, dass das nukleare Signal nicht die Sättigung erreicht, da die Kerne den grünen Kanal stören können.

4. Aufnahme von Live-Kalziumvideos

  1. Starte ein Live-Video mit einem Intervall von 1 Bild alle 5 Sekunden (0,2 fps) für eine Dauer von 10 Minuten.
    HINWEIS: Erfassen Sie jeden fluoreszierenden Kanal (DAPI 405 nm und GFP 475 nm) bei jedem Bild.
  2. Sobald das Video begonnen hat, lasse eine 5-minütige Basismessung ein, bevor du Agonisten hinzufügst.
  3. Mit einer P200-Pipette wird 50 μL Thapsigargin in einem 3-fachen Zwischenlager in den Brunnen mit 100 μL 2,5 mM Probenecid im Calciumpuffer gegeben (Schritt 2.1). Lassen Sie das Medikament vorsichtig 1-2 Mal im Brunnen wieder aufhängen, um sicherzustellen, dass das Medikament gleichmäßig verteilt wird. Lesen Sie 5 Minuten weiter, nachdem Thapsigargin hinzugefügt wurde.
    HINWEIS: Der Schritt der Medikamentenzugabe ist entscheidend; Die Pipettenspitze darf die Platte nicht berühren, um die Fokussierung zu verschieben. Stattdessen lassen Sie die Pipettenspitze so schwimmen, dass sie nur den Puffer im Brunnen berührt. Wenn Medikamente zu stark gemischt werden, können sich die Zellen von der Platte lösen und das Signal stören.
    HINWEIS: Beachten Sie unbedingt den Rahmen, in den das Medikament für die nachgelagerte Analyse hinzugefügt wird.
  4. Speichere das Video und den Schnappschuss, die vor dem Experiment gemacht wurden. Fahren Sie mit der Datenanalyse fort.

5. Protokoll zum Laden der primären Atemwegszellen mit Cal 520 AM oder Fluo-4 AM

  1. Am Tag des Experiments werden basolaterale Medien aus dem Trans-Well entfernt und die apikalen und basolateralen Seiten des Inserts zweimal mit 750 μL basolateralem und 300 μL apikalem Gewebe des Calciumpuffers gewaschen (Schritt 2.1).
  2. Inkubieren Sie die Zellen mit 600 μL basolateralen und 200 μL apikalen Farbstoffen der Cal-520 AM- oder Fluo-4-AM-Farbstoffe für 1 Stunde bei 37 °C und 5 %CO-2. Bereiten Sie den Farbstoff auf die gleiche Weise wie bei den Calu-3-Zellen vor, für Cal-520 AM, 3 μM Cal-520 AM, 2,5 mM Probenecid und 1:5000 Hoechst im Calciumpuffer (Schritt 2.1). Für Fluo-4 AM, 3 μM Fluo-4 AM, 2,5 mM Probenecid und 1:5000 Hoechst im selben Kalziumpuffer.
  3. Während der Inkubationszeit bereiten Sie Thapssigargin mit einem 3× Zwischenlager für eine Endkonzentration von 2 μM (6 μM Zwischenbestand) vor.
  4. Anschließend wird der Farbstoff aspiriert und die Zellen zweimal mit 300 μL apikalem und 750 μL basolateralem Puffer mit Kalzium gewaschen (Schritt 2.1).
  5. Nach den Waschbehandlungen werden 100 μL apikale und 500 μL basolaterale 2,5 mM Probenecide in den Calciumpuffer gegeben (Schritt 2.1).
  6. Halte das Getriebe gut in der Platte und wickle die Platte in Folie. Die Zellen sind nun für die Bildgebung bereit.

6. Einrichtung der Mikroskopie für die primären Naseneinsätze

  1. Besorgen Sie sich eine Petrischale mit Glasboden, die sich für Bildgebung eignet, Pinzette und dünnes Malerband. Stellen Sie sicher, dass die Petrischale sauber ist, indem Sie sie schnell mit 70 % Ethanol abwischen und vollständig trocknen lassen.
  2. Platziere die Glasboden-Petrischale in den kleinen runden Adapter für das Epifluoreszenzmikroskop.
  3. Mit einer Pinzette steckt man den Einsatz vorsichtig in die Mitte der Glasbodenschale.
    HINWEIS: Achten Sie darauf, den Puffer nicht zu verlaufen, der sich im apikalen Fach des Einsatzes befindet.
  4. Um sicherzustellen, dass sich der Einsatz beim Hinzufügen des Medikaments nicht bewegt, verwenden Sie Klebeband, um die Oberseite des Kunststoffs an den Seiten der Glasbodenschale zu befestigen.
  5. Setzen Sie den Adapter mit dem Einsatz auf die Stufe des Mikroskops und konzentrieren Sie sich zunächst auf die Zellen mit dem 10-fachen Luft-Brightfield-Objektiv.
  6. Identifizieren Sie das Kalziumfarbsignal mit der GFP (475nm-LED). Stellen Sie sicher, dass die LED-Leistung zwischen 5 % und 10 % liegt, um Photobleaching zu vermeiden, und die Belichtungszeit ist geeignet, um das Grundsignal von Grün sichtbar zu machen, ohne es zu übersättigen, typischerweise zwischen 300 und 500 ms.
    HINWEIS: Bitte beachten Sie den Hinweis unter Schritt 3.4, um eine korrekte Kalziumfarbung sicherzustellen.
  7. Identifizieren Sie die Hoechst-Nuklearfarbe mit der DAPI (405 nm) LED. Die LED-Leistung sollte zwischen 2 % und 5 % liegen, mit einer Belichtungszeit zwischen 50 und 100 ms.
    HINWEIS: Wenn die Zellen scharf sind, sollten die Kerne mit klaren, definierten Umrissen erscheinen. Konzentriere dich auf die apikalste Zellschicht. Stellen Sie die Z-Achse des Mikroskops ein, um die höchste Brennebene zu identifizieren, in der die Zellen scharf fokussiert bleiben. Stellen Sie sicher, dass die Kerne keine Signalsättigung erreichen, da das Kernsignal den grünen Kanal stören kann.
  8. Um das Live-Kalziumvideo zu erhalten, folgen Sie den Schritten 5.1-5.4. Während des Medikamentenzusatzschritts in die Mitte des Einsatzes geben und langsam mit einer P200-Pipette wieder suspendieren.
    HINWEIS: Beachten Sie unbedingt den Rahmen, in den das Medikament für die nachgelagerte Analyse hinzugefügt wird.

7. Analyse mit der Fiji-Software

  1. Öffne die Fiji-Anwendung und wähle Datei \ Öffnen, lade die Videodatei hoch und behalte im resultierenden Pop-up-Fenster alle Standardeinstellungen.
  2. Wenn gewünscht, unter Bild \ Anpassen \ Helligkeit/Kontrast verändern Sie Helligkeit und Kontrast der separaten Fluoreszenzkanäle, um die optimalste Sicht auf die Zellen zu erhalten.
  3. Um die Zellverfolgung zu erleichtern, füge die Nuklearflecken- oder Brightfield-Kanäle mit Image \ Colour \ Merge Channels zusammen und wähle für jeden einzelnen Kanal im Pop-up die entsprechenden Dateien aus.
  4. Um spezifische Zellen basierend auf Zellgrenzen und nukleärer Färbung nachzuverfolgen, verwenden Sie Analysieren \ Tools \ ROI Manager und kreuzen Sie sowohl alle als auch Labels im resultierenden Pop-up ab.
  5. Zeichnen Sie sorgfältig Zellen mit dem freihändigen Auswahlwerkzeug nach und drücken Sie t, um eine Zelle hinzuzufügen.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Zellen in allen 4 Ecken und im Zentrum des Videos nachgezogen werden.
  6. Sobald alle Zellen genau nachverfolgt wurden, klicke im offenen Tab mit allen ROIs auf Mehr \ Multi-Maßnahme und drücke OK im resultierenden Pop-up.
  7. Kopieren Sie das gesamte Blatt im resultierenden Pop-up mit dem Titel Ergebnisse in eine Excel-Datei.
    HINWEIS: Das resultierende Blatt enthält für jede ROI 6 Unterüberschriften (Area1, Mean1, Min1, Max1, IntDen1, RawIntDen1) mit einem numerischen Wert nach jedem, der der jeweiligen Zelle entspricht. Der wichtige Wert für die Downstream-Analyse wird der Mittelwert jedes ROI sein.
  8. Um die Variation der Fluoreszenzintensität zu überwachen, berechnen Sie die durchschnittliche Fluoreszenz während des Ausgangswerts für jede Zelle und berechnet die prozentuale Varianz. Experimente weisen typischerweise eine Varianz zwischen 20 % und 30 % auf.
    figure-protocol-1
  9. Normalisieren Sie alle Messwerte, indem Sie die mittleren Intensitätswerte durch die erste Messung des Ausgangswerts für jede der nachgezeichneten Zellen teilen.
  10. Erstelle eine zusätzliche Spalte für die Zeit in Sekunden, wobei der erste Frame dem Bild 0 entspricht und die folgenden Zeitpunkte um 5 steigen, was dem 0,2 fps-Intervall entspricht.
  11. Kopieren Sie die Daten in eine Analyse- und Grafiksoftware und erstellen Sie eine Kurve der Änderung der Fluoreszenz gegenüber der Basislinie über die Zeit.
    HINWEIS: Um Einzelzell-Maxima-Plots zu erstellen, verwenden Sie die =MAX()-Funktion in Excel, um den Rahmen zu finden, bei dem für jede Zelle die maximale Fluoreszenzintensität erreicht wird, und zeichnen Sie mit GraphPad Prism auf.

8. Analyse mit der Calcium-Suite

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    Ergebnisse

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Zur Messung der Kalziummobilisation in lebenden Zellen werden Calu-3-Zellen oder differenzierte primäre Nasenkulturen mit einem intrazellulären Farbstoff inkubiert. Die relative Veränderung des calciumabhängigen Signals wird als Zunahme der Kalziummobilisation entweder aus den intrazellulären Kalziumspeichern oder dem extrazellulären Raum in den Zytosol gemessen. Ein anhaltender Anstieg des Kalziums im Zytosol wird durch eine Zunahme der Fluoreszenz nach der Zugabe von Thapsigargin, eine...

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    Diskussion

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Dieser Artikel stellt Methoden zur Analyse einzelliger Kalzium-Signale in lebenden primären Nasen- und Bronchialkulturen sowie einer stabilen Epithelzelllinie vor. Sowohl die Cal-520 AM als auch die Fluo-4 AM Kalziummelder sind in beiden Setups nützliche Kalziumindikatoren. Cal-520 AM ist empfindlicher, da es eine höhere Quantenausbeute von 0,75 im Vergleich zu Fluo-4 AM von 0,16 und eine etwas höhere Affinität für Kalzium hat (das Kd von Cal-520 AM beträgt 320 nM und Fluo-4 AM 345 nM). ...

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    Offenlegungen

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Die Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.

    Danksagungen

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Die Autoren möchten sich für die Unterstützung der Kultivierung des primären Nasengewebes durch Tarini Gunawardena bedanken. Ebenso Wu Shu von der University of Iowa für großzügige Kultivierung und Versand der primären Bronchienkulturen. Ebenso wie Gabrielle Langeveld und Dian Liu für Hilfe bei der Analyse und Entwicklung von Bildgebungsadaptern. Wir möchten auch der Bildgebenden Einrichtung im Hospital for Sick Children danken. Wir erkennen außerdem die Finanzierung durch Cystic Fibrosis Canada und die US Cystic Fibrosis Foundation an.

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    Materialien

    Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
    NameUnternehmenKatalognummerKommentare
    24-Well-Platten Thermofisher 142475
    24-Well-Transwell-Einsätze Corning CLS3470-48EA
    96-Well-Flat Clear Bottom, schwarzer Polystyrol-TC-behandelte MikroplattenCorning 3603
    Cal-520 AMAAT Bioquest 21130Aliquotiert und bei -20 °F gelagert; C, aufgelöst in DMSO
    Calcium Suite SoftwareDer Code kann angefordert werden, indem Sie unsere Laborgruppe kontaktieren
    EMEM, 1xWisent 320-005-CLGelagert bei 4 °C; C 
    Fetal Bovine Serum Wisent 080-450Aliquotiert und bei -20 °F gelagert; C
    Fluo-4 AM AAT Bioquest 20550Aliquotiert und bei -20 °F gelagert; C, aufgelöst in DMSO
    HEPESBioshopHEP001.5Lagerung bei Raumtemperatur
    Hoechst Thermofisher H3570Gelagert bei 4 °C; C 
    Humane epitiheliale kolorektale Adeonkarzinomzelllinie ATCCHTB-55
    Magnesiumchlorid Sigma 7786-30-3Lagerung bei Raumtemperatur
    Mikroschüssel 35 mm, niedriger GlasbodenIbidi 80137Bei Raumtemperatur gelagert;
    Penicillin-Streptomycin-LösungWisent 450-200-ELGelagert bei 4 °C; C
    Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)Wisent 3111-010-CLBei Raumtemperatur gelagert;
    Kaliumchlorid Sigma 7447-40-7Bei Raumtemperatur gelagert;
    Probenecid ThermofisherP36400Aliquotiert und bei -20 °F gelagert; C, wasserlöslich 
    Natriumchlorid Bioshop SOD004Bei Raumtemperatur gelagert;
    Thapsigargin ThermofisherT7458Aliquotiert und bei -20 °F gelagert; C aufgelöst in DMSO 
    TripLE-Expressenzym (1X), Phenolrot Thermofisher12605010Gelagert bei 4 °C; C

    Referenzen

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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    3. Sammels, E., Parys, J. B., Missiaen, L., De Smedt, H., Bultynck, G. Intracellular Ca2+ storage in health and disease: a dynamic equilibrium. Cell Calcium. 47 (4), 297-314 (2010).
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