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Methodenartikel

Ein neonatales Modell der intravenösen Transplantation zur Bewertung früher Immunaktivitäten gegen Krebszellen

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DOI:

10.3791/69478

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26. Juni 2026

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1Michael Cuccione Childhood Cancer Research Program, BC Children's Hospital Research Institute, 2Department of Pediatrics, University of British Columbia

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll demonstriert eine temporale Veneninjektion zur intravenösen Abgabe von pädiatrischen Krebszellen an Neugeborenenmäuse und ermöglicht so eine präzise, reproduzierbare Modellierung früher Immunantworten gegen Krebs. Die Methode ermöglicht die Bewertung der Wirkung von Interventionen, wie Immunmodulation oder Therapie, wenn sie während der neonatalen Periode angewendet werden.

Zusammenfassung

Mehr als die Hälfte aller pädiatrischen Krebserkrankungen werden im Mutterleib begonnen, wobei sich das Fortschreiten der offensichtlichen Erkrankung bis zur neonatalen Periode fortsetzt. Obwohl Immuntherapien mittlerweile neue Behandlungsmöglichkeiten für viele krebskranke Kinder bieten, ist noch unvollständig verstanden, wie die frühe Immunität den Krebsverlauf und die Therapieansprache beeinflusst. Die Schließung dieser Lücke erfordert eine Bewertung therapeutischer Interventionen während der neonatalen Phase, wenn sich die Immunantworten grundlegend von denen im späteren Kindes- und Erwachsenenalter unterscheiden.

Hier beschreiben wir ein neonatales Transplantationsmodell, das mit biolumineszenten in vivo Bildgebung integriert wird, um die Auswirkungen der Immunmodulation im frühen Leben auf pädiatrische Krebserkrankungen zu untersuchen.

Die temporale Veneninjektion von luciferase-markierten Zellen, die aus zwei Zellen in uteroinitiierten Krebsarten stammen, führte zu reproduzierbaren Tumorentransplantaten bei 1–2 Tage alten syngenen Empfängern, ohne verfahrensbedingte Sterblichkeit und mit hohem prozeduralem Erfolg, wie durch biolumineszente Bildgebung bestätigt. Unter Verwendung der infektionsbedingten Immunmodulation als experimentelle Variable zeigen wir dann, dass eine intraperitoneale Infektion mit dem murinen Cytomegalovirus fünf Tage nach der Transplantation zu einer deutlichen Verringerung der Belastung durch akute lymphoblastische Leukämie (ALL) führt, jedoch nicht zu einem Neuroblastom (NB). Diese Plattform ermöglicht die Untersuchung krebsspezifischer Unterschiede in der Antwort auf die Immunmodulation im frühen Leben und unterstreicht die Bedeutung des Tumorkontexts bei der Modellierung von Immun-Krebs-Interaktionen im frühen Leben.

Gemeinsam bietet diese Methodik eine vielseitige und hochgradig reproduzierbare Plattform zur Untersuchung neonataler Immunmechanismen, die für Krebsimmunüberwachung, infektionsgetriebene Immunmodulation und therapeutische Interventionen relevant sind. Über ALL und NB hinaus kann dieser Ansatz an weitere pädiatrische Malignitäten und immunmodulatorische Strategien angepasst werden, um mechanistische Studien und präklinische Untersuchungen von frühzeitigen Krebsinterventionen zu unterstützen.

Einleitung

Jüngste Fortschritte in der Immuntherapie haben die Ergebnisse bei bestimmten Krebspatienten deutlich verbessert, doch ihre optimale Anwendung bei kleinen Kindern erfordert ein umfassendes Verständnis davon, wie das sich entwickelnde Immunsystem Krebszellen identifiziert und ausrottet. Während etwa 50 % der Kinderkrebserkrankungen im Mutterleib entstehen, einschließlich B-Zell-akuter lymphoblastischer Leukämie (B-ALL) und NB, deuten zunehmend Erkenntnisse darauf hin, dass postnatale Ereignisse die Krankheitsentwicklung und das klinische Ergebnisentscheidend beeinflussen 1,2.

Die neonatalen Immunantworten unterscheiden sich quantitativ und qualitativ von denen bei Erwachsenen3. Mangels vollständig entwickelter adaptiver Immunität beruht der Schutz von Neugeborenen stark auf mütterlichen Antikörpern und angeborenen Immunzellen. Diese angeborenen Effektoren sind jedoch funktionell weniger effizient als ihre erwachsenen Gegenstücke, da sie zellintrinsisch hyporesponsiv sind und die Aktivierung immunsuppressiver Signalwege verstärkt werden, wodurch Neugeborene besonders anfällig für Infektionensind. Die Auswirkungen dieser Eigenschaften auf die Fähigkeit des unreifen Immunsystems, wirksame Krebsbehandlungen zu entwickeln, sind jedoch weiterhin wenig verstanden.

Die Modellierung der krebshemmenden Immunität im frühen Leben erfordert die präzise und reproduzierbare Abgabe von Krebszellen sowie Immunmodulatoren oder Krankheitserregern während des kurzen postnatalen Zeitfensters, wenn die Immunfunktion eingeschränkt ist. Die temporale Veneninjektion ist eine neonatale intravenöse (IV) Verabreichungsmethode, die diese Anforderungen am besten erfüllt und einen hohen prozeduralen Erfolg, geringe Sterblichkeit, minimalen Handhabungsstress sowie Kompatibilität mit sequentiellen Interventionen wie Infektionschallenge- oder therapeutischer Verabreichung 7,8,9,10 bietet.

In dieser Studie bauten wir auf und modifizierten zuvor validierte neonatale intravenöse Verabreichungstechniken sowie die Vielseitigkeit der biolumineszenten in vivo Bildgebung, um ein Transplantationsmodell zu beschreiben, das die Auswirkungen einer frühen Lebensinfektion auf das Fortschreiten von pädiatrischen Krebszellen untersucht. Dieser Ansatz ermöglicht die intravenöse Abgabe von luciferase-markierten B-ALL- oder NB-Zellen an 1–2 Tage alte Jungen, gefolgt von einer Immunmodulation durch intraperitoneale (i.p.) Verabreichung von Mauscytomegalovirus (mCMV) am postnatalen Tag 7 (P7). Der Krebsfortschritt wurde anschließend 10 Tage nach der Infektion untersucht (P17).

Obwohl der Zugang zur Schläfenvene auf ein begrenztes postnatales Fenster (P0–P3) beschränkt ist, verbessert diese Methodik die Reproduzierbarkeit und die experimentelle Kontrolle und bietet eine vielseitige Plattform, um den Einfluss von frühen Immunmechanismen auf Krebs-Immunüberwachung, Infektions-Krebs-Interaktionen und Immuntherapie-Reaktionen zu untersuchen. Darüber hinaus unterstützt dieser Ansatz das effiziente Homing transplantierter Zellen und ermöglicht so die reproproduzierbare Etablierung von Krankheitsmodellen für mechanistische Untersuchungen.

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Protokoll

Alle Verfahren (Abbildung 1) wurden gemäß den Richtlinien des Canadian Council on Animal Care durchgeführt und vom Animal Care Committee der University of British Columbia genehmigt (Protokoll A23-0169).

1. Entstehung von luciferase-markierten leukämischen Zellen

  1. Isolierung leukämischer Zellen aus leukämischen Eμ-Ret-Mäusen
    1. Betäuben Sie Mäuse in einer 1-Liter-Induktionskammer mit 5 % Isofluran und 1 L·min-1 Sauerstoff, bis eine tiefe Operationsebene erreicht ist (Verlust des Aufrichtungsreflexes und langsame, regelmäßige Atmung).
    2. Sobald die Tiefenanästhesie bestätigt ist, wird das Isofluran eingestellt und Kohlendioxid (CO₂) mit hoher Durchflussrate (3–4-facher der üblichen allmählichen Verdrängungsrate; z. B. 6–8 L·min für eine 10-L-Kammer) verabreicht, ohne das Tier zwischen den Kammern zu transportieren. Halten Sie die CO₂-Exposition mindestens 5 Minuten nach Beendigung der Atmung aufrecht, um den Tod zu sichern.
    3. Entlüfte und entschätze die Abgase, bevor du die Kammer öffnest.
    4. Bestätigen Sie den Tod durch Abwesenheit von Herzschlag und Atmung und führen Sie dann eine zervikale Verrenkung als sekundäre körperliche Methode gemäß der Institution durch.
    5. Bringt den Kadaver in einen Biosicherheitsschrank, bestätigt den Tod erneut, erfasst Geschlecht und Körpergewicht und sprüht die Außenseite mit 70 % Ethanol ein.
    6. Mache einen Mittellinienschnitt im Bauch, reflektiere Haut und Peritonealwand und schneide die Milz in 5-mL-sterile PBS.
    7. Schneiden Sie Tibien und Oberschenkelknochen an beiden Beinen auf, entfernen Sie überschüssiges Gewebe und entfernen Sie die Milz unter sterilen Bedingungen. Übertragen Sie die Milz sofort in eine 5-ml-sterile, eiskale Phosphat-Puffer-Kochsalzlösung (PBS), um die Zelllebensfähigkeit zu erhalten.
    8. Behandle die Milz.
      1. Homogenisiere das Milzgewebe in 1 ml 1× roten Blutkörperchen-Lysepuffer (RBC) (verwenden Sie 2 ml für die Milz > 200 mg). Inkubieren Sie 2–3 Minuten bei Zimmertemperatur.
      2. Löschen Sie die Lyse durch Zugabe von 10 mL PBS + 2 % fetalem Rinderserum (FBS) (FACS-Puffer), filtern Sie durch ein 40 μm Sieb und zentrifugieren Sie bei 350 × g für 5 Minuten bei 4 °C.
      3. Die Milzkugel in 5 mL FACS-Puffer wieder aufhängen.
    9. Knochenmark behandeln.
      1. Entfernen Sie beide Epiphysen und spülen Sie jeden Knochen mit 1 ml FACS-Puffer mit einer 1-ml-Spritze mit einer 29-Gauge-Nadel in ein 15-mL-Rohr.
      2. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension, entsorgen Sie das Supernatant und suspendieren Sie die Zellen in 1 mL 1× RBC-Lysepuffer, inkubieren Sie 2 Minuten bei RT, abschrecken Sie die Lyse durch Zugabe von 10 mL FACS-Puffer, filtern Sie durch ein 40 μm Sieb und zentrifugieren Sie bei 350 × g für 5 Minuten bei 4 °C.
      3. Entsorge das Überdachungsmittel und suspendiere das BM-Pellet in einem 1-mL FACS-Puffer durch Pipettieren auf und ab.
      4. Vortex vornehmen und bei Bedarf durch ein 40-μm-Sieb filtern.
      5. Resuspendiere 0,5 × 10^6 leukämische Zellen in 200 μL Zellkulturmedien (z. B. Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM)), ergänzt mit 20 % FBS und Interleukin-7 (IL-7; 250 pg·mL-1).
        Pausenpunkt: Lassen Sie Zellsuspensionen bis zu 2 Stunden vor dem Färben auf Eis aufbewahren.
  2. Lentivirale Transduktion von leukämischen Zellen:
    1. Samen-Maus-Knochenmark-abgeleitete Stromalzellen bei 1 × 10^5 Zellen pro Bohrloch in einer 24-Well-Platte 24 Stunden vor der Transduktion, um die Haftung zu ermöglichen und eine 70–80%ige Konfluenz zu erreichen.
    2. Plattenleukämische Zellen (0,5 × 10^6 Zellen in einem Endvolumen von 200 μL) in einer Nicht-Gewebekultur behandelte 24-Well-Platten.
    3. Fügen Sie einen selbstinaktivierenden (SIN) lentiviralen Vektor hinzu, der einen Doppelfusions-Reporter codiert, bestehend aus Clickbeetle Red (CBR)-Luciferase und einem verbesserten grünen fluoreszierenden Protein (eGFP), angetrieben von einem konstitutiven Ubiquitin-Promotor, mit der Multiplizität der Infektion (MOI): 10–20, viraler Titer: ≥ 1 × 10^8 TU·mL-1 (Transduziereinheiten pro Milliliter) im Endtransduktionsvolumen von 200 μL zusammen mit Polybren (8 μg·mL-1; Sigma, H9268-5G).
      VORSICHT: Polybren ist in hohen Konzentrationen zytotoxisch. Überschreiten Sie 8 μg·mL-1 nicht. Behandle Lentivirus unter Biosicherheitsstufe 2 (BSL-2) Eindämmung.
    4. Versiegeln Sie die Platte mit Parafilm und zentrifugieren Sie bei 1.200 × g für 20 Minuten bei Raumtemperatur (RT).
    5. Nach der Spinokulation wird die transduzierten leukämischen Zellen auf die stromale Monoschicht übertragen und für 24 Stunden bei 37 °C, 5 % CO₂ in DMEM + 20 % FBS + IL-7 (250 pg·mL-1) kultiviert, um das Zellüberleben und die Expression des Reporters zu unterstützen.
      HINWEIS: Antibiotika können nach 24 Stunden hinzugefügt werden, wenn erforderlich, sollten jedoch während der Virustransduktion vermieden werden.
    6. Nach 24 Stunden werden nicht-adhärente leukämische Zellen gesammelt und zweimal mit steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), 350 × g für 20 Minuten bei 4 °C, gewaschen, um das Restvirus und Polybrene zu entfernen.
    7. Zellen in sterilem PBS bei 1 × 10^7 Zellen·mL-1 für die Transplantation wieder suspendieren.
      Pausenpunkt: Nach dem Waschen können die Zellen bei Bedarf bis zu 48 Stunden vor der Transplantation unter derselben Kulturbedingung erhalten bleiben.
  3. Transplantation in adulte NSG-Mäuse (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ)
    1. Verwenden Sie 4–6 Wochen alte NSG-Mäuse als Empfänger.
    2. Erwärme die Maus 5 Minuten lang mit einer Wärmmatte oder einer Wärmelampe, um die Schwanzvenen zu erweitern.
    3. Halten Sie die Maus mit einem Acrylfilter fest.
    4. Injizieren Sie 1 × 10^6 Zellen in 100 μL steriles PBS über die laterale Schwanzvene mit einer 29-Gauge-Insulinspritze. Keine Anästhesie erforderlich (außer durch institutionelle Richtlinien vorgeschrieben)
    5. Üben Sie sanften Druck auf die Injektionsstelle aus, um eine Blutung zu verhindern.
      VORSICHT: Vermeiden Sie Extravasation. Eine erfolgreiche intravenöse Injektion führt zu keiner sichtbaren Schwellung.
    6. Überwachen Sie zweimal wöchentlich die Mäuse auf die Entwicklung der Krankheit.
  4. Sortierung von GFP+- leukämischen Zellen
    1. Nach Krankheitsbeginn entnehmen Sie Stuhlgang oder Milz von leukämischen NSG-Mäusen.
    2. Bereiten Sie eine Einzelzellsuspension wie oben beschrieben vor.
    3. Färbungszellen mit Lebensfähigkeit (7-AAD) färben.
    4. Verwenden Sie Fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) zur Sortierung von GFP+-leukämischen Zellen.
    5. Für die Sortierung verwenden Sie einen Hochgeschwindigkeitszellsortierer und folgen Sie der Gating-Strategie von Vorwärtsstreuung (FSC) vs. Seitenstreuung (SSC) → Schrott ausschließen, FSC-A vs. FSC-H → Singlets auswählen, Viabilitätsfarbstoff negativ → lebende Zellen auswählen, GFP+-Gate → Reporter-positive leukämische Zellen isolieren.
    6. Sammeln Sie sortierte Zellen in Röhren mit DMEM + 20 % FBS. Zielreinheit nach der Sortierung: ≥ 95 % GFP+-Zellen.
      Pausenpunkt: Sortierte Zellen dürfen bis zu 2 Stunden vor der Kryokonservierung auf Eis gehalten werden.
  5. Kryokonservierung sortierter Zellen
    1. Sortierte Zellen bei 5 × 10^6 Zellen/ml in einem Gefriermedium mit 90 % FBS und 10 % Dimethylsulfoxid (DMSO) resuspendieren.
    2. Aliquot 1 ml pro Kryoviale und Fläschchen in einen isopropanolbasierten Gefrierbehälter geben und bei −80 °C über Nacht (12–18 Stunden) lagern.
    3. Phiolen werden in flüssigen Stickstoff (LN₂) zur Langzeitlagerung umgefüllt.
      VORSICHT: DMSO ist giftig und lässt sich leicht über die Haut aufnehmen. Handle mit Handschuhen und arbeite schnell.
      Pausenpunkt: Zellen können langfristig in flüssigem Stickstoff gespeichert werden, bis sie in neonatalen Transplantationsexperimenten verwendet werden.

2. Erzeugung von luciferase-markierten NB-Zellen

HINWEIS: TH-MYCN-transgene Mäuse entwickeln spontane NB-Tumore und wurden unter zugelassenen institutionellen Tierpflegeprotokollen erhalten. Der verwendete lentivirale Vektor ist derselbe wie in Abschnitt 1.2 beschrieben.

  1. Tumorentnahme und Gewebedissoziation
    1. Euthanasiere tumortragende TH-MYCN-Mäuse gemäß den zugelassenen Tierpflegerichtlinien.
    2. Nehmen Sie subkutane oder abdominale NB-Tumore unter sterilen Bedingungen ab.
    3. Das Tumorgewebe wiegen und mit einer sterilen Schere in ~1–2 mm große Fragmente zerkleinern.
    4. Gewebe wird in einen etwa 5 mL Verdauungspuffer pro 0,5 g Tumorgewebe in einem 15 mL konischen Röhrchen übertragen, bestehend aus DMEM, Desoxyribonuklease I (DNase I; 50–100 U·mL-1) und kollagenasebasierter Enzymmischung (10 μg·mL-1 Endkonzentration).
    5. Inkubiere bei 37 °C in einem schüttelnden Inkubator bei 150 U/min für 30 Minuten.
      VORSICHT: Enzymatische Verdauungsreagenzien können Haut- und Augenreizungen verursachen. Trage Handschuhe und Augenschutz.
    6. Nach der Verdauung pipettieren Sie vorsichtig auf und ab, um das Gewebe weiter zu dissoziieren. Filtere die Suspension durch ein 70-μm-Zellsieb in ein frisches Rohr.
    7. Zentrifugiere bei 300 × g für 5 Minuten bei Raumtemperatur (20–22 °C).
    8. Entsorge Supernatant und suspendiere das Pellet in DMEM, ergänzt mit 10 % FBS.
    9. Führen Sie eine RBC-Lyse mit dem RBS-Lysispuffer durch, wie zuvor in Abschnitt 1.1 beschrieben.
    10. Zentrifugiere mit 300 × g für 5 Minuten und suspendiere das Pellet in 10 ml hochglukosehaltigem DMEM, ergänzt mit 10 % FBS und 50 μM 2-Mercapttoethanol.
      VORSICHT: 2-Mercapttoethanol ist giftig und flüchtig. Führen Sie die Handhabung in einem chemischen Abzugshaube durch.
      Pausenpunkt: Zellen können bis zu 1 Stunde vor der Transduktion auf Eis gehalten werden.
  2. Lentivirale Transduktion
    1. Pellet 2 × 10^6 NB-Zellen bei 300 × g für 5 Minuten und Supernatant komplett entfernen.
    2. Zellpellet direkt in 14 μL konzentrierten lentiviralen Vektoren resuspendieren (derselbe Vektor wie in Abschnitt 1.2 beschrieben; viraler Titer ≥ 1 × 10^8 TU·mL-1, ungefähre MOI: 10–20).
    3. Zell-Virus-Mischung für 5 Minuten bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator (% CO₂) inkubieren.
    4. Fügen Sie 200 μL hochglukosehaltiges DMEM + 10 % FBS hinzu und setzen Sie die Inkubation für 2 Stunden bei 37 °C, 5 % CO₂ fort.
      VORSICHT: Lentivirale Vektoren müssen unter BSL-2-Bedingungen behandelt werden.
    5. Waschen Sie transduzierte Zellen viermal mit hochglukosehaltigem DMEM, um das Restvirus zu entfernen.
    6. Zähle lebensfähige Zellen unter Verwendung des Trypan-Blue-Ausschlusses.
      WICHTIG: Halten Sie die Matrix-Vorbereitung jederzeit auf Eis, um eine vorzeitige Gelation zu verhindern.
  3. Subkutane Einnistung in NSG-Mäuse
    1. Stellen Sie die Zellen bei 5 × 10^6 Zellen pro 100 μL in einer kaltbasalen Membranmatrix (wachstumsfaktor-reduzierte extrazelluläre Matrix) wieder auf.
    2. Betäuben Sie 6–8 Wochen alte NSG-Mäuse (siehe Abschnitt 1.1) mit inhaliertem Isofluran (2–3 % Sauerstoff).
    3. Ladungszelle-Matrix-Gemisch in eine vorgekühlte 1-mL-Spritze mit einer 27-Gauge-Nadel.
    4. Injizieren Sie 5 × 10^6 Zellen in 100 μL Gesamtvolumen subkutan in den Flankenbereich.
    5. Überwachen Sie Mäuse bis zur vollständigen Erholung von der Narkose.
      HINWEIS: Injizieren Sie sofort nach dem Mischen mit der Matrix, um eine Erstarrung in der Spritze zu verhindern.
    6. Lass die Tumore bis zu ~1 cm Durchmesser wachsen.
  4. Zellsortierung
    1. Tumore entnehmen und Einzelzell-Suspensionen erzeugen, wie in den Abschnitten 2.1–2.2 beschrieben.
    2. Reiche luciferase-markierte Zellen mit FACS basierend auf GFP-Expression an, nach der in Abschnitt 1.4 beschriebenen Gating-Strategie.
    3. Führen Sie zwei aufeinanderfolgende Sortierrunden durch, um ≥ Reinheit von 95 % GFP-positiv zu erreichen.
  5. Kryokonservierung
    1. Kryokonservierte sortierte Zellen wie in Abschnitt 1.5 beschrieben.
      Pausenpunkt: Zellen können langfristig in flüssigem Stickstoff für zukünftige Transplantationsexperimente gespeichert werden.

3. Bereiten Sie die Zellsuspension für die Injektion der temporalen Vene vor.

  1. Kryokonservierte luciferase-markierte leukämische Zellen oder NB-Zellen in einem 37 °C Wasserbad schnell, bis ein kleiner Eiskristall übrig bleibt.
  2. Desinfizieren Sie sofort die Außenschicht des Fläschchens mit 70 % Ethanol und übertragen Sie den Inhalt dann in 9 ml vorgewärmtes DMEM + 10 % FBS-Medium in einem 15 mL konischen Rohr.
  3. Zentrifugiere bei 300 × g für 5 Minuten bei 4 °C, aspiriere Supernatant und suspendiere das Pellet erneut in steriler, eiskalten PBS.
  4. Bestimmung der Lebensfähigkeit mittels Trypan-Blau-Ausschluss und eines Hämozytometers (oder automatisierten Zellzählers). Verwenden Sie nur Aufhängungen mit ≥ 80 % Wirksamkeit.
  5. Führen Sie die Zellsuspension durch ein 40 μm großes Sieb, um Klumpen zu entfernen.
    VORSICHT: Zellklumpen vermehren fehlgeschlagene Injektionen und Gewebeschäden.
  6. Stellen Sie die Konzentration so an, dass 20 μL pro Neugeborener 1 × 10^4 leukämische Zellen (für leukämische Transplantation) oder 5 × 10^4 NB-Zellen (für NB-Transplantation) enthalten werden.
  7. Lassen Sie die Zellsuspension auf Eis und mischen Sie sie vorsichtig unmittelbar vor dem Laden der Spritze, um die Homogenität zu erhalten.
    Pausenpunkt: Lassen Sie die Zellen bis zu 2 Stunden vor der Injektion auf Eis, sofern die Lebensfähigkeit ≥ 80 % bleibt.

4. Temporalveneninjektion (P1–P2-Welpen)

HINWEIS: Die neonatale Temporalveneninjektion kann ohne Anästhesie durchgeführt werden. Allerdings wird eine kurze Unterkühlung häufig eingesetzt, um Bewegungen zu reduzieren und die Injektionsgenauigkeit zu verbessern. Die Anwendung der unterkühlten Immobilisierung ist von einigen institutionellen Tierpflegekomitees nicht erlaubt – Forscher müssen vor Durchführung dieses Verfahrens mit ihrem zuständigen institutionellen Ausschuss Rücksprache halten. Wenn Sie von Ihrer Institution genehmigt sind, sind die folgenden Schritte wirksam bei der unterkühlten Immobilisierung.

  1. Bereiten Sie einen kleinen Behälter vor, der mit einer sterilen Serviette ausgelegt ist, und kühlen Sie ihn vor, indem Sie ihn auf Eis legen.
  2. Platziere die Welpen (postnataler Tag 1–2; P1–P2) auf der Serviette im Inneren des Behälters zur unterkühlten Immobilisierung für 2–3 Minuten, bis die spontane Bewegung deutlich reduziert ist.
    WICHTIG: Lassen Sie nicht zu, dass die Welpen direkt mit Eis in Kontakt kommen (verwenden Sie jederzeit den Behälter und die Serviettenbarriere).
  3. Laden Sie 60 μL der Zellsuspension in eine 100-μL-Glasspritze ein und befestigen Sie eine 30-Gauge-Nadel. Stoßen Sie die Suspension zurück in den Schlauch, um das tote Volumen von Spritze und Nadel zu füllen. Sobald das Totvolumen geprimt ist, wird 20 μL Zellsuspension zur Injektion abgesaugt, um sicherzustellen, dass keine Luftblasen vorhanden sind. Verwenden Sie BALB/c- und TH-MYCN-Mäuse als Empfänger von leukämischen bzw. NB-Zellen.
  4. Bereiten Sie eine transbeleuchtete Bühne vor, indem Sie eine kalte Lichtquelle unter einer Plexiglasplattform platzieren.
  5. Tragen Sie eine Vergrößerungsbrille (oder verwenden Sie ein Stereomikroskop), um die Injektionsstelle zu visualisieren.
  6. Setzen Sie eine sterile Serviett mit einem zentralen Loch auf die Bühne und positionieren Sie den Welpen so, dass die Schläfenvene sichtbar ist.
  7. Setzen Sie ein kleines Stück Modelliermasse (Knet) neben den Kopf des Welpen, um die Nadel während der Injektion zu stabilisieren.
  8. Führen Sie die Nadelabschrägung nach oben in die sichtbare Schläfenvene ein und injizieren Sie langsam die Zellsuspension, wobei Sie die Gefäßfüllung betrachten, um eine erfolgreiche intravenöse Verabreichung zu bestätigen.
  9. Nach der Injektion üben Sie mit einem sterilen Wattestäbchen sanften Druck auf die Injektionsstelle aus. Legen Sie den Welpen auf eine erwärmte Erholungsfläche (etwa 37 °C, z. B. Heizkisse auf niedriger Stufe mit Handtuchbarriere), bis normale Bewegung und rosa Färbung zurückkehren.
  10. Beobachten Sie den Welpen nach der Erholung 5–10 Minuten und bringen ihn dann zur Mutter zurück.
    VORSICHT: Vermeiden Sie Überhitzung während der Erholung. Verwenden Sie eine Barriereschicht und überwachen Sie kontinuierlich.
  11. Spülen Sie die Spritze sofort mit PBS, dann mit einer Reinigungslösung der Spritze und beenden Sie sie mit 70 % Ethanol.

5. Virenvorbereitung und Infektion

  1. Führen Sie alle Verfahren mit dem Mauscytomegalovirus (mCMV) unter BSL-2-Eindämmung gemäß institutionellen Biosicherheits- und Tierpflegegenehmigungen durch.
  2. Behandle Virenbestände in einem zertifizierten Bio-Sicherheitsschrank der Klasse II und führen Tierinfektionen in ausgewiesenen BSL-2-Verfahrensbereichen durch.
  3. Durchführung der Virusvorbereitung und -handhabung in einem zertifizierten Bio-Sicherheitsschrank der Klasse II und Durchführung der Tierinfektionen in ausgewiesenen BSL-2-Verfahrensbereichen.
  4. Tragen Sie geeignete PSA, einschließlich Laborkittels oder Einwegkittels, Handschuhe und Augenschutz. Behandeln Sie alle virushaltigen Materialien (Spritzen, Einstreu, Käfige und Oberflächen) als potenziell infektiös.
  5. Minimieren Sie den Einsatz von scharfen Gegenständen und entsorgen Sie Nadeln sofort in zugelassenen Biohazard-Behältern. Dekontaminieren Sie Arbeitsflächen und Geräte nach der Benutzung. Entsorgen alle festen und flüssigen Abfälle als biologisch gefährliche Abfälle gemäß institutionellen Verfahren.
  6. Mäuse bei P7 infizieren (5–6 Tage nach Transplantation der leukämischen Zellen).
  7. Einen Virus aliquot auf Eis auftauen, sanft durch Inversion mischen und während der Zubereitung auf Eis lassen. Vermeiden Sie wiederholte Einfrieren-Tau-Zyklen (verwenden Sie Einweg-Aliquoten).
  8. Bereite mCMV mit 2 × 10^5 Plaque-bildenden Einheiten (PFU)/mL in PBS vor und injiziere die Jungen intraperitoneal (i.p.) mit 1 × 10^4 PFU in 50 μL PBS mit einer 30-Gauge-Nadel. Injizieren Sie in den unteren rechten Quadranten des Bauches in einem flachen Winkel, um Bauchorgane zu vermeiden.
    VORSICHT: mCMV ist infektiös (BSL-2). Verwenden Sie geeignete Eindämmung und Dekontamination.
  9. Ertrage Tieridentifikation, Alter, Versuchsgruppe, Virusdosis, Volumen und Injektionsdetails.

6. Biolumineszenzbildgebung (BLI)

HINWEIS: Führen Sie BLI bei P7 (5–6 Tage nach der Zellinjektion und vor der Infektion) und bei P17 (10 Tage nach der Infektion) wie unten beschrieben durch.

  1. Lösen Sie D-Luciferin in PBS bei 10 μg·μL-1 auf. Filtersterilisieren Sie mit einem 0,22 μm-Filter, aliquot, und lagern Sie bei −20 °C, der vor Licht geschützt ist.
    VORSICHT: D-Luziferin ist lichtempfindlich. Minimiere die Lichteinwirkung während der Vorbereitung und Gebrauchszeit.
  2. Injizieren Sie D-Luciferin-I.P. mit 50 μL pro Welpen mit einer 30-Gauge-Nadel.
  3. Betäuben die Jungtiere mit Isofluran (Induktion 3–4 %, Erhaltungskosten 1,5–2 %) in Sauerstoff (0,8–1,0 L·min-1). Körpertemperatur in einer erwärmten Bildgebungsphase (ca. 37 °C) aufrechterhalten.
    VORSICHT: Isofluran ist ein flüchtiges Anästhetikum. Verwenden Sie einen zugelassenen Verdampfer und ein Sammelsystem.
  4. Betäubte Welpen werden in ein Bildgebungssystem für kleine Tiere gelegt (Instrumentdetails sind in der Materialtabelle angegeben).
  5. Biolumineszente und Röntgenaufnahmen werden mit konstanten Belichtungseinstellungen 10 Minuten nach der D-Luziferin-Injektion aufgenommen (BLI-Einstellungen: Belichtungszeit 120 s für P7-Bilder und 30 s für P17, B-Binning B4 für P7 und B4 für P17-Bilder, Sichtfeld (FOV) 25, Blendenblende 1,2, Objekthöhe 1,5 und Röntgeneinstellungen: Auflösung hoch, Leistung hoch).
    Pausenpunkt: Bilddateien sofort nach der Bildaufnahme speichern; Die Analyse kann später abgeschlossen werden.
  6. Analysieren Sie Bilder mit geeigneter BLI-Bildgebungssoftware, indem Sie Interessenbereiche (ROIs) definieren, die den gesamten Körper jeder Maus umfassen, und das emittierte Licht als Photonen·s⁻1·cm⁻2·sr⁻1 quantifizieren.
  7. Exportieren Sie quantifizierte ROI-Werte für die nachgelagerte statistische Analyse.

7. Gewonnene leukämische Zellen von zelltransplantierten Mäusen

  1. Winning von leukämischen Zellen und Erzeugung von Einzelzellsuspensionen wie in Abschnitt 1.1 beschrieben.

8. Färbung und Erwerbung der Flowzytometrie

  1. Zählen Sie Zellen und Zentrifugensuspensionen bei 300 × g für 5 Minuten bei 4 °C und suspendieren Sie sie bei 1 × 10^7 Zellen·mL-1 im FACS-Puffer wieder.
  2. Übertragen Sie 100 μL (1 × 10^6 Zellen) in Polystyrol-Flusszytometrieröhren.
  3. Fügen Sie einen Fc-Rezeptorblockier-Antikörper hinzu (Anti-CD16/32; 1 μL pro Röhre) und inkubieren Sie 5 Minuten bei Zimmertemperatur.
  4. Bereite eine Antikörper-Mastermischung im FACS-Puffer vor und gib zu jeder Röhre CD19-FITC, BP1-PE, B220-APC und Linien-negativen Markern (TER119-PerCP, CD3-PerCP, CD11b-PerCP) 1 μL von jedem Antikörper pro 1 x 10^6 Zellen in einem 100 μL FACS-Puffer hinzu.
  5. Inkubiere 20 Minuten bei Zimmertemperatur im Dunkeln.
  6. Waschen Sie mit 5 mL FACS-Puffer, zentrifugieren und in 200 μL FACS-Puffer mit 7-AAD (3 μL) und zählen Perlen (6 μL; 6.000 Perlen) erneut suspendieren.
  7. Bereiten Sie Einzel-gefärbte Kompensationskontrollen mit Antikörperfangperlen oder -Zellen vor und erhalten Sie Kontrollen zusammen mit experimentellen Proben.
  8. Proben werden auf einem Durchflusszytometer unter Verwendung der Standard-FITC/PE/APC/PerCP-Detektoreinstellungen und einer mittleren Durchflussrate erfasst. Sammeln Sie Events, bis 1.000 Perlen gesammelt sind.
  9. FCS-Dateien exportieren und mit Flow Cytometrie-Analyse-Software (aufgeführt in der Materialtabelle) mit der etablierten Gating-Strategie (Abbildung 2D) analysieren.
  10. Berechnen Sie absolute Zellzahlen pro Milz oder Knochenmark mit Zählperlen, indem Sie die Anzahl der Zielereignisse bei 1.000 Perlen mit einem Skalierungsfaktor von 6 multiplizieren (6.000 Perlen hinzugefügt) und auf die gesamte Zellzellularität des Organs basierend auf dem Anteil der gefärbten Zellen normalisieren (1 × 10^6 Zellen).

9. Darstellung von Diagrammen und statistische Analyse

HINWEIS: Erstellen Sie Diagramme und führen Sie statistische Analysen für BLI- und Durchflusszytometriedaten mit einem statistischen Softwarepaket durch (aufgeführt in der Materialtabelle).

  1. Präsentieren Sie die Daten als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM).
    HINWEIS: Kein Tier wurde aus dieser Studie ausgeschlossen.
  2. Für BLI vergleichen Sie PBS- und mCMV-Gruppen separat bei P7 und P17 mit ungepaarten Mann–Whitney-Tests, wobei die Holm–Šídák-Korrektur angewendet wird, um mehrere Vergleiche über Zeitpunkte hinweg zu korrigieren.
  3. Analysieren Sie die Ergebnisse der Durchflusszytometrie mit einem zweiseitigen, ungepaarten Mann–Whitney-Test.
  4. Definiere die statistische Signifikanz als p < 0,05.

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Ergebnisse

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Diskussion

Zu verstehen, wie die frühe Immunentwicklung das Fortschreiten von Krebs beeinflusst, ist entscheidend für die Entwicklung altersgerechter immunmodulatorischer Strategien. In dieser Studie beschreiben wir eine reproduzierbare neonatale Transplantationsplattform, die eine präzise zeitliche Kontrolle der Krebszellentransplantation und Immunmodulation während eines kritischen Zeitfensters postnataler Immununreife ermöglicht. Durch die Kombination der temporalvene-vermittelten intravenösen V...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch Betriebszuschüsse der Canadian Institutes of Health Research an G.S.D.R. (MOP-126122) unterstützt. A.F. erhielt ein Michael Cuccione Childhood Cancer Research Program (MC3RP) Postdoktorandenstipendium.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
100µL, Mikroliterspritze, Luer-Spitze Hamilton  80601 -
30 G Nadel  BD  305106 -
7-AAD Biolegend 420404 - 
Ami-X-Imagingsystem Spectral Instruments Imaging - - 
anti-Maus B220- APC Biolegend 103212  -
anti-Maus CD19-FITC Biolegend 152404  -
anti-Maus CD3ε- PerCPBiolegend  100326 - 
anti-Maus Ly-51-PEBiolegend  108308 Auch genannt BP1 
anti-Maus TER119- PerCP  Biolegend 116226 - 
anti-Maus/Mensch CD11b- PerCP Biolegend 101230 - 
Aura-Software Spectral Instruments Imaging - Version 4.0.8
BD Accuri C6  BD- - 
BD Fortessa X-20  BD- - 
Reinigungslösung Hamilton 18310  -
CountBright Absolute Counting Beads Invitrogen by Thermo Fisher Scientific 2770930 6 µL enthält 6000 Perlen 
D-Luciferin GoldBioeLUCK-1G- 
DMEMGibco11965092-
DNase ISigma1.13E+10-
Falcon 40µm Zellsieb, Blau, Steril, Einzeln verpackt FALCON 352340 - 
FBSGibcoA5256701- 
FlowJo-Software BD- v10.8
GeltrexTMThermo Fisher Scientific A1413202- 
GraphPad Prism-Software Dotmatics- v10.4.1
LE.5209 Kaltlichtquelle Euromex -- 
Liberase™ TM Research GradeSigma5.4E+09-
NSG-MäuseJackson Labrotary5557NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ
PolybrennSigmaH9268-5G-
Gereinigtes anti-Maus CD16/32-AntikörperBiolegend 101301- 
RBC-Lysis-Puffer (10X)Biolegend 420301- 

Referenzen

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