Dieses Protokoll wurde vom Tierschutz- und Ethikausschuss der Abteilung für Tierwissenschaften an der Fudan-Universität genehmigt (Genehmigungsnummer: 2019 Huashan Hospital JS-008).
Etablierung des Rattenmodells
Verletzung eines Oberkörperrisses auf der linken Seite
Die Raumtemperatur wurde bei 23–25 °C gehalten. Sprague-Dawley-Ratten wurden mit intraperitonealem 1 % Natriumpentobarbital (0,4 ml/100 g Körpergewicht) betäubt. Nach der Einleitung der Anästhesie wurde die Ratte in Rückenposition auf dem Operationsbrett gelegt, wobei die Vordergliedmaßen um 90° vom Trunk abgeführt wurden. Hals, Brust, Achselhöhle und, nur bei NG-Tieren, beide Hintergliedmaßen wurden rasiert. Die Haut wurde mit Povidonjod desinfiziert. Ein 3 cm großer Mittellinienschnitt in der Zervix wurde vom Cricoid-Knorpel bis zum oberen Rand des Manubrium sterni gemacht. Unter einem operativen Mikroskop wurden das subkutane Gewebe und die tiefe Faszie Schicht für Schicht seziert, um die Muskulatur sternohyoidus, sternomastoidus, pectoralis major und pectoralis minor freizulegen. Diese vier Muskeln wurden mit sterilen, maßgefertigten Büroklammer-Retraktoren zurückgezogen. Die distalen Enden der Retraktoren wurden mit Gummibändern am Bedienfeld befestigt, und die Spannung wurde so eingestellt, dass eine optimale Belichtung erreicht und gleichzeitig die innere Halsvene geschützt wurde. Die vorderen und mittleren skalenen Muskeln wurden identifiziert, und der supraklavikuläre Teil des Plexus brachialis im interskalenen Raum war freigelegt (Abbildung 1A). Die C5- und C6-Wurzeln wurden 5 mm distal zu ihren jeweiligen intervertebralen Foramina durchschnitten, dann wurde ein 5 mm breites Segment entfernt, um eine definierte Lücke zu schaffen (Abbildung 1B). In der NT-Gruppe wurden die proximalen Stümpfe von C5 und C6 an benachbartes Weichgewebe genäht, um zu verhindern, dass regenerierende Axone in den distalen Weg gelangen.
Einführung des NG-Modells
Ein L-förmiger Schnitt wurde entlang der dorsolateralen Seite der Hinterpfote, über den lateralen Malleolus und entlang der lateralen Seite des Unterschenkels gemacht. Unter einem Operationsmikroskop wurden das subkutane Gewebe und die tiefe Faszie Schicht für Schicht szeniert, wobei darauf geachtet wurde, die kleine Vene saphena zu schützen, dann wurde der Nervus suralis freigelegt und entnommen. Die beidseitigen Suralnerven ergaben eine Gesamtlänge von 8 cm. Nach dem Kürzen des perineuralen Bindegewebes wurde jeder Nerv in acht 1-cm-Segmente unterteilt. Der Nervus supraskapularis wurde an seinem Ursprung vom oberen Stamm durchschnitten. Ein Transplantat wurde verwendet, um von C5 zum Nervus suprascapularis zu überbrücken; drei Transplantate aus C5 und vier Transplantate von C6 am oberen Stamm (Abbildung 1C).
Etablierung des NT-Modells
Der mittlere zervikale Schnitt wurde etwa 2,5 cm distal zum Oberarm hin verlängert. An der Stelle, an der der seitliche kutane Brustzweig heraustritt, wurde der Musculus pectoralis major entlang der Faserrichtung zwischen pectoralis major und Bizeps eingeschnitten. Der tiefere pectoralis minor wurde stumpf seziert, um die unter dem Pectoralis major verlaufenden Plexusbänder brachialis freizulegen. Der Ulnarisnerv entspringt aus dem medialen Strang und verläuft am meisten medial innerhalb des Nabelschnursegments (Abbildung 1D). Der muskulocutane Nerv entspringt im lateralen Strang, verläuft unter dem unteren Rand des teres major in den Arm und tritt schließlich in den Bauch des Bizeps brachii ein, wobei er am seitlichsten im Nabelschnursegment verläuft (Abbildung 1D). Der Radialnerv entspringt im hinteren Strang, verläuft unter dem unteren Rand der Latissimus dorsi Sehne in den hinteren Arm und gibt drei Äste ab, die die langen, medialen und lateralen Köpfe des Trizeps versorgen. Der Axillarnerv entspringt ebenfalls aus dem hinteren Strang, durchquert den viereckigen Raum und teilt sich in vordere und hintere Äste, die den Deltamuskel innervieren.
Spinaler Accessornervtransfer zum Nervus suprascapularis
Der Musculus sternocleidomastoideus wurde innerhalb des mittleren Halsschnitts zurückgezogen, um den spinalen Accessornerv freizulegen. Der Nerv tritt unter dem Musculus digastricus hervor, erreicht das mittlere Drittel des medialen Randes sternocleidomastoideus, gibt den Ast sternocleidomastoideus ab, setzt sich entlang des hinteren Rand dieses Muskels fort und verläuft seitlich im Hals, um den Trapezmuskel zu innervieren. Der sternocleidomastoideus Ast wurde durchschnitten, um die Kraft am Nebennerv zu beseitigen, die die Koaptationsstelle nach dem Transfer stören könnte. Der Trapezzweig wurde an seinem Eintrittspunkt in den Muskel aufgeteilt. Der Nerv supraskapularis wurde an seinem Ursprung distal vom oberen Stamm durchschnitten. Der Trapezzweig des Accessoriusnervs wurde mit einer einzigen 10-0 synthetischen Polypropylennaht an den Nervus supraskapulär angebracht (Abbildung 1E).
Ulnarnerv-Faszikeltransfer zum Bizeps-motorischen Ast des Musculocutanus-Nervs (Oberlin-Verfahren)
Der Hauptstamm des muskulocutanen Nervs wurde distal mobilisiert, bis der gesamte Bizeps-Motorast vollständig freigelegt war. Auf Höhe des mittleren Drittels des Bizeps-motorischen Zweigs wurde ein 6 mm breites Büschel von der lateralen Seite des Ulnarisnervs entnommen, und sein distales Ende wurde scharf durchschnitten. Der motorische Zweig des Bizeps wurde an seinem Ursprung vom muskulocutanen Nervenstamm durchschnitten. Die mobilisierte ulnare Faszie wurde mit einer einzigen 10-0 synthetischen Polypropylennaht an den Bizepsmotorzweig angebracht. Die vollständige Exposition des Bizeps-motorischen Zweigs dient zwei Zwecken: (1) die genaue Stelle für die Faszikelentnahme aus dem Ulnarnerv zu identifizieren und (2) eine spannungsfreie Koaptation nach dem Transfer sicherzustellen (Abbildung 1F).
Übertragung des radialen Langkopf-Trizepszweigs zum vorderen Ast des Axillaris (Leechavengvongs-Verfahren)
Die Ratte wurde in die Bauchlage versetzt, wobei das Vordergliedmaß um 90° zum Stamm entführt wurde. Die dorsale Seite des linken Oberarms wurde rasiert und desinfiziert. An der dorsalen Seite des linken Oberarms wurde ein 3,5 cm langer Längsschnitt gemacht, der sich vom Schultergelenk bis zur mittleren Oberarmhöhe erstreckt. Unter dem Operationsmikroskop wurden das subkutane Gewebe und die tiefe Faszie Schicht für Schicht seziert. Der Deltamuskel wurde zurückgezogen, um den darunterliegenden viereckigen Raum freizulegen, wo der Hauptstamm des Axillarnervs und die begleitenden hinteren zirkumflexen Humeralgefäße den Raum verließen. Der Axillarnerv wurde distal mobilisiert, bis die gesamten vorderen und hinteren Bereiche vollständig freigelegt waren, kurz bevor sie in den Deltamuskelbauch eintraten. Im selben Schnitt wurde der Hauptstamm des Nervus radialis zwischen dem langen und dem lateralen Kopf des Trizeps identifiziert. Der Radialnerv wurde distal mobilisiert, bis der gesamte motorische Zweig zum langen Kopf des Trizeps klar sichtbar war (Abbildung 1G). Der Langkopf-Trizepszweig wurde an seinem Eintritt in den Muskel durchschnitten und wurde proximal reflektiert, um den vorderen Ast des Axillarnervs zu approximieren. Der vordere Ast des Axillarnervs wurde an seinem Ursprung vom Hauptstamm durchschnitten und reflektiert distal. Der Langkopf-Trizepszweig zum vorderen Ast des Axillarnervs wurde mit einer einzelnen 10-0 synthetischen Polypropylennaht versehen (Abbildung 1H).
Nach Abschluss aller Nervenrekonstruktionen wurde jedes Operationsfeld mit steriler Kochsalzlösung bewässert und jede Koaptationsstelle sorgfältig inspiziert, um die Integrität zu bestätigen. Alle Schnitte wurden schichtweise geschlossen: Der Musculus pectoralis major wurde mit 5-0 nicht resorbierbaren Seidennähten (nur im cervikalen Schnitt der NT-Gruppe benötigt) angenähert, gefolgt von der subkutanen Faszie und der Haut. Da jede Nervenkoaptation ohne Spannung durchgeführt wurde, war eine postoperative Immobilisierung der oberen Gliedmaßen nicht notwendig.
Verhaltensbewertung
Ochiai Punkt:13
Die Ratte wurde am Schwanz angehoben, sodass ihr Körper 30 cm über dem Tisch schwebte, und die Haltung beider Vordergliedmaßen wurde beobachtet. Die Ratte wurde auf eine geschlossene Startbahn (50 cm lang × 10 cm breit) auf dem Tisch platziert, um ihre Vordergliedmaßen beim Gehen zu beobachten. Der gesamte Startsteg war mit weißem Papier bedeckt, und das Startende wurde mit schwarzer Tinte befeuchtet. Während die Ratte vorwärts geht, werden deutliche Fußspuren gefunden. 0 Punkte – im Hang hängen beide Vordergliedmaßen entspannt gerade zum Boden hin (Abbildung 2A-1); beim Gehen wird keines der Vordergliedmaßen geschleift (Abbildung 2A-2). 1 Punkt – im Hängen ist das betroffene Vordergliedmaß leicht adduktiert und gebogen (Abbildung 2B-1); beim Gehen ist leichtes Schleifen aufgrund begrenzter Ellbogenbeugung zu sehen (Abbildung 2B-2). 2 Punkte – im Hängen ist das betroffene Vordergliedmaß vollständig gebeugt und adduktiert (Abbildung 2C-1); beim Gehen ist starkes Schleifen erkennbar (Abbildung 2C-2).
Barth-Fußfehlertest13
Ein horizontales Metallgitter (50 cm × 38 cm) wurde 11 cm über dem Tisch erhöht vorbereitet; Jedes Gitterquadrat misst 1,5 cm. Die Ratte wurde auf dem Raster platziert; Immer wenn das betroffene Vordergliedmaß durch eine Gitteröffnung glitt, wird dies als "Fußfehler" (Abbildung 3) verzeichnet. Die Anzahl der Fußfehler, die das betroffene Glied in 2 Minuten verursachte, wurde gezählt.
Terzis Grooming-Test14
Die Ratte wurde in eine offene, transparente Beobachtungsbox gelegt. Ungefähr 1–3 ml Kochsalzlösung wurden auf die Schnauze und das Gesicht der Ratte gesprüht, und ihre Versuche, die Wassertropfen zu entfernen, wurden beobachtet.
Grad 0 – keine Reaktion von der betroffenen Gliedmaße.
Grad 1 – das betroffene Gliedmaß beugt sich am Ellbogen und erreicht den Mund, kann aber die Nase nicht erreichen (Abbildung 4A).
Grad 2 – das betroffene Gliedmaß erreicht die Nase (Abbildung 4B).
Grad 3 – das betroffene Gliedmaß reicht über die Nase, kann aber das Auge nicht erreichen (Abbildung 4C).
Grad 4 – die betroffene Gliedmaße erreicht das Auge, kann aber nicht das Ohr erreichen (Abbildung 4D).
Grad 5 – die betroffene Gliedmaße erreicht das Ohr oder dahinter (Abbildung 4E).
Zusammengesetztes Muskelaktionspotenzial (CMAP)
Die Ratte wurde betäubt, immobilisiert und wie zuvor im Protokoll beschrieben vorbereitet, und der supraklavikuläre Teil sowie das Nabelschnursegment des Plexus brachialis wurden freigelegt. Die schwarze Aufnahmenadel-Elektrode wurde in den Bauch des Zielmuskels (Bizeps brachii, Deltamuskel oder Infraspinatus) eingeführt. Die rote Messelektrode wurde in die Sehnen-Muskel-Verbindung desselben Muskels eingeführt. Die grüne Referenzelektrode wurde zwischen der schwarzen und der roten Elektrode platziert (Abbildung 5). Alle Elektroden werden bis zu einer Tiefe von 2 mm eingesetzt, und auf beiden Seiten werden identische Einstichstellen verwendet. Der Nerv wurde mit der stimulierenden Elektrode sanft erhöht, um zu testen. Ein einzelner Rechteckwellenimpuls mit 0,5 mA-Intensität und 0,2 ms Dauer wurde abgegeben; Die CMAP-Latenz und -Amplitude wurden aufgezeichnet. Die kontralaterale (gesunde) Seite wurde als Referenz verwendet (mit einem Wert von 1). Die Latenzverzögerungsrate ([Latenz auf der betroffenen Seite/Latenz auf der gesunden Seite] × 100 %) und die Amplituden-Erholungsrate ([Amplitude auf der betroffenen Seite/Amplitude auf der gesunden Seite] × 100 %) wurden berechnet.
Immunfluoreszenzfärbung
Myelinierte Fasern wurden mit Anti-Neurofilament 200 (NF200) markiert; darunter wurden motorisch myelinisierte Fasern durch die Ko-Markierung mit der Anticholin-Acetyltransferase (ChAT) unterschieden. Fasern, die positiv für NF200, aber negativ für ChAT sind, wurden daher als sensorisch myelinisierte Fasern15 klassifiziert.
Für die Nerventransplantatgruppe wurde der Hauptstamm des muskulocutanenen, axillären und supraskapulären Nervs distal zur zweiten Nahtstelle des betroffenen Gliedmaßes entnommen. Für die Nerventransfergruppe wurden der Bizepszweig des Musculocutanusnervs, der vordere Ast des Axillarnervs und der Nervus suprascapularis distal zu ihren jeweiligen Koaptationsstellen geführt. Ein 3-mm-Segment jedes Nervs wurde in 4 % Paraformaldehyd eingetaucht und 24 Stunden lang bei 4 °C fixiert.
Die Proben waren senkrecht zur Längsachse ausgerichtet, in Paraffin eingebettet und in einer Länge von 3 μm seriell durchschnitten. Nach der Deparaffinisierung wurde die Antigengewinnung in einem 0,01 M EDTA-Puffer (pH 8,0) mit einem Mikrowellenofen durchgeführt. Die Abschnitte wurden über Nacht bei 4 °C inkubiert, wobei primäre Antikörper in PBS verdünnt wurden (ChAT, 1:200; NF200, 1:500), gefolgt von PBS-Waschen und 50-minütiger Inkubation bei Raumtemperatur mit sekundären Antikörpern (Cy3-konjugierte Ziegen-Antikaninchen, 1:300; Alexa Fluor 488-konjugierte Ziegen-Anti-Maus, 1:400) vor Licht geschützt. Die Kerne wurden mit DAPI kontrafärbt. Ganze Querschnitte jedes Nervs wurden unter einem Fluoreszenzmikroskop mit einem Objektträger abgebildet.
NF200 wurde mit grüner Fluoreszenz und ChAT mit roter Fluoreszenz visualisiert; NF200-positive/ChAT-negative Profile wurden als sensorisch myelinisierte Fasern gezählt. Fünf zufällig ausgewählte Abschnitte aus jedem Nerv wurden mit ImageJ analysiert. Die Gesamtzahl der sensorisch myelinisierten Fasern im gesamten Querschnitt wurde für jeden Schnitt gezählt, und der Mittelwert der fünf Schnitte wurde als endgültige Zählung für diese Nervenprobe gewertet.
Statistische Analyse
Die Stichprobengröße (n = 8 pro Gruppe) wurde prospektiv mit G*Power unter Verwendung der sensory-axon-count Piloteffektgröße (Cohens d = 2,31) berechnet, um ≥ 80 % Leistung bei α = 0,05 zu ergeben. Alle statistischen Analysen wurden mit GraphPad Prism durchgeführt. Die Daten werden als Median (Interquartilbereich) [M (p25–s75)] dargestellt. Gruppenvergleiche wurden mit dem Mann-Whitney-U-Test durchgeführt. Ein P-Wert < 0,05 galt als statistisch signifikant.