Methodenartikel

Reproduzierbare Einrichtung für die in vivo Zwei-Photonen-Bildgebung der Kontraktilität der zervikalen Lymphgefäße und des Lymphflusses bei Mäusen

DOI:

10.3791/69482

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10. April 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, Saratov State University, 2Institute of Physics, Department of Optics and Biophotonics, Saratov State University, 3Department of Computer Science and Information Technology, Saratov State University, 4, Res Inst Intelligent Complex Syst, Fudan University, 5Potsdam Institute for Climate Impact Research

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Das Manuskript demonstriert eine innovative Methode zur in-vivo-Untersuchung der Kontraktilität zervikaler lymphatischer Gefäße und des Lymphflusses bei Mäusen zur Untersuchung verschiedener physiologischer Funktionen zervikaler lymphatischer Gefäße (cLVs) sowie der therapeutischen Strategien zur Modulation der lymphatischen Regulationsmechanismen des Hirnabflusses und der Clearance.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Kontraktilität der cLVs ist die treibende Kraft für den Lymphfluss und ein Schlüsselmechanismus hinter der Reinigung von Gehirntoxinen. Hier präsentieren wir eine innovative Methode zur in vivo zweiphotonenbildenden Bildgebung der Kontraktilität von cLVs und der Langzeitbeobachtung der Entfernung roter Blutkörperchen mit Lymphfluss in cLVs bei Mäusen. Die Komponenten des Setups umfassen ein Mini-Heizkissen, das an den Hals der Maus angepasst ist und es ermöglicht, das Bildgebungsfenster auf bis zu 5 Stunden zu verlängern, während die cLV-Kontraktilität und der Lymphfluss erhalten bleiben; Feuchtigkeitskontrolle; eine Schutzhülle; und ein Positionierungssystem, das eine stabile optische Visualisierung von cLVs ermöglicht. Die Methode gewährleistet Reproduzierbarkeit und Kompatibilität mit anderen Typen von Zweiphotonenmikroskopen und einer Vielzahl von Objekten und erhält hochwertige Bilder mit einer Tiefe von bis zu 500 μm. Das Protokoll umfasst detaillierte Phasen der chirurgischen Vorbereitung von cLVs zur Erhaltung der physiologischen Umgebung und zur Gewährung der normalen cLV-Kontraktilität.

Einleitung

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Die Kontraktilität der zervikalen lymphatischen Gefäße (cLVs) spielt eine Schlüsselrolle beim Hirnabfluss und bei der lymphatischen Entfernung ihrer Gewebe von Metaboliten und Toxinen 1,2,3. Die Reduzierung dieser Hauptfunktion der cLVs führt zur Unterdrückung der Hirntoxinreinigung, die von vielen Hirnerkrankungen begleitet wird, darunter Alzheimer, traumatische Hirnverletzungen und Hirnkrebs 4,5,6,7,8,9. Daher ist die Untersuchung der cLV-Kontraktilität ein wichtiger Ansatz bei der Entwicklung neuer therapeutischer Strategien zur Modulation der lymphatischen regulatorischen Mechanismen des Hirnabflusses und der Clearance 10,11,12.

Diese Studie präsentiert eine innovative Methode zur Echtzeit-Zweiphotonenbildgebung der cLV-Kontraktilität und des Lymphflusses bei Mäusen unterschiedlichen Alters. Zu den wichtigen Bestandteilen des Aufbaus gehört ein Mikroheizpad, das, wenn es am Hals des Tieres befestigt wird, eine längere Bildgebungszeit von bis zu 5 Stunden ermöglicht, während die kontraktile Aktivität der Kollektorlymphgefäße und die Stabilität des Lymphflusses erhalten bleiben.

Es sei darauf hingewiesen, dass im Gegensatz zum Blutkreislauf, das mit Blut gefüllt ist und mit einer bestimmten Geschwindigkeit (von 10 mm/s in den Arteriolen bis 13 cm/s im Sinus sagittalis beim Menschen) durch verschiedene Blutgefäßtypen fließt, die Befüllung der Lymphgefäße mit Lymphe vom zunehmenden Druckgradient zwischen leeren Lymphgefäßen und dem während des Stoffwechsel gebildeten Volumen an interstitieller Flüssigkeit abhängt. 14,15,16,17,18,19. Gleichzeitig ist der Lymphfluss in den Lymphgefäßen intermittierend und reicht von 0 bis 1 mm/s 20,21,22. Jüngste MRT-Studien am Menschen haben gezeigt, dass der Lymphfluss in den meningealen lymphatischen Gefäßen (MLVs) 1–3 mm23 beträgt. Es sollte jedoch beachtet werden, dass selbst bei einer einzelnen Person der Lymphfluss bei MLVs zu verschiedenen Tageszeiten variiert und auf 0 sinken kann. Daher ist der Lymphfluss in den Lymphgefäßen inkonsistent, da er von der Geschwindigkeit der Stoffwechselprozesse abhängt, die wiederum vonder Temperatur 24 abhängt. Tatsächlich wird die Geschwindigkeit einer biochemischen Reaktion tief und direkt von der Temperatur beeinflusst, die daher auch einen erheblichen Einfluss auf spontane Kontraktionen lymphatischer Gefäße haben und somit den Lymphabfluss und den Transportverändern könnte 24,25,26.

Daher ist die Aufrechterhaltung der Körpertemperatur eine wichtige Voraussetzung, um das physiologische Umfeld der Lymphgefäße zu erhalten, um die normale Kontraktilität und den Lymphfluss zu unterstützen. Die Verwendung kommerziell erhältlicher Heizplatten gewährleistet jedoch nicht die notwendige Temperatur in den tiefen und optisch zugänglichen Bereichen des Halses, in denen sich cLVs befinden. Dies ist besonders wichtig für die Zweiphotonenbildgebung der cLV-Kontraktilität und des Lymphflusses, da dies in kalten Versuchsräumen mit einer Umgebungstemperatur von 19 °C durchgeführt wird, was für diese optischeTechnik erforderlich ist.

In diesem Zusammenhang ist in der überwiegenden Mehrheit der in vivo Studien die Kontraktilität von lymphatischen Sammelgefäßen mit kommerziellen Heizplatten auf 3–5 Minuten begrenzt (der maximale Effekt wird üblicherweise innerhalb weniger Sekunden beobachtet: 3,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37),38, woraufhin die lymphatische Füllung und Kontraktilität abnehmen. Dieser Ansatz begrenzt die Beobachtungszeit der lymphatischen Gefäßphysiologie erheblich und macht es unmöglich, langfristige Auswirkungen auf deren Kontraktilität und Lymphfluss zu bewerten, was uns dazu motivierte, ein Mini-Heizkissen zu entwickeln, das an den Hals der Maus angepasst ist, mit dem Ziel, das Zeitfenster für die Bildgebung auf bis zu 5 Stunden zu verlängern, wobei die cLV-Kontraktilität und der stabile Lymphfluss erhalten bleiben.

Ein weiterer Bestandteil des Aufbaus ist das Schutzgehäuse mit Feuchtigkeitskontroll- und Positionierungssystem, das eine stabile Visualisierung von cLVs ohne Wasserimmersion ermöglicht und die Erhaltung hochauflösender Bilder ermöglicht, wenn Langstrecken-Luftimmersionsobjektive korrigiert für 0,17 mm Abdeckungsglas (z. B. CFI Plan Apochromat Lambda D 10x (MRD70170) und CFI Plan Apochromat Lambda D 20x (MRD70270)) verwendet werden.

Die vorgeschlagene Methode gewährleistet Reproduzierbarkeit und Kompatibilität mit anderen Typen von Zwei-Photonen-Mikroskopen sowie verschiedene objektive Bereiche, die mit dem Gehäuse kompatibel sind, unter Berücksichtigung der Umweltmerkmale wie Temperatur-/Feuchtigkeitskontrolle und Arbeitsabstand zur Linse, während hochwertige Bilder mit einer Tiefe von bis zu 500 μm und einem Zeitfenster (bis zu 5 Stunden) erhalten bleiben, was eine Langzeitanalyse der Kontraktilität von cLVs und des Lymphflusses mit hoher Qualität bei Mäusen ermöglicht.

Es ist wichtig, die anatomische Lage der cLVs in der Nähe der Bifurkation der Halsschlagader zu berücksichtigen, wo sich Barorezeptoren befinden. Der mechanische Einfluss auf die Barorezeptoren führt zu einer Destabilisierung von Blutdruck und Herzfrequenz. Dies kann erhebliche Veränderungen des hydrostatischen Drucks verursachen und infolgedessen die Störung des Lymphflusses39. Daher enthält die vorgeschlagene Methode eine detaillierte Beschreibung des chirurgischen Protokolls zur sanften Isolierung von cLVs im tiefen Halsbereich, um mechanische Beeinträchtigungen der Bifurkation der nahegelegenen Halsschlagader und Blutdruckänderungen zu vermeiden, was zu einer beeinträchtigten Lymphströmung im Gehirn und folglich zu einer beeinträchtigten Lymphzufuhr in cLVs und deren Kontraktilität führen kann.

Die Ergebnisse zeigen die altersbedingte Abnahme der cLV-Kontraktilität und deren Empfindlichkeit gegenüber therapeutischen photostimulierenden Effekten bei Mäusen. Darüber hinaus zeigen wir erstmals bei Langzeitbeobachtung (über 5 Stunden) deutlich, dass cLVs als Tunnel zur Entfernung roter Blutkörperchen aus dem rechten Seitenventrikel wirken, der ein wichtiger lymphatischer Weg für die Reinigung von Gehirntoxinen 1,2,3 ist. Insgesamt ist die Methode für die in vivo zweiphotonige Bildgebung der cLV-Kontraktilität und des Lymphflusses für präklinische Studien verschiedener physiologischer Funktionen von cLVs vorgesehen, einschließlich der Regulation des Hirnabflusses und -befreiungs, der Entfernung von Metaboliten und Toxinen aus dem Gehirn sowie für die Erprobung neuer therapeutischer Technologien zur Modulation der cLV-Physiologie.

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Protokoll

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Alle Verfahren wurden gemäß dem Leitfaden zur Pflege und Nutzung von Labortieren, der Richtlinie 2010/63/EU zum Schutz von zu wissenschaftlichen Zwecken verwendeten Tieren sowie den Richtlinien des Ministeriums für Wissenschaft und Hochschulbildung der Russischen Föderation (Nr. 742 vom 13.11.1984), die von der Bioethikkommission der Staatlichen Universität Saratow genehmigt wurden (Protokoll Nr. 7, 22.09.2022).

HINWEIS: Siehe die Materialtabelle für Details zu allen in diesem Protokoll verwendeten Materialien.

1. Technisches Gerät zur Reparatur der Maus

  1. Verwenden Sie eine Stahl-Optikschiene (SOR, Länge 270 mm, Breite 43 mm; Abbildung 1A) als Basis der Installation.
  2. Installieren Sie zwei Pfostenhalter (3PH-25) auf dem SOR in einem Abstand von 175 mm voneinander (Abbildung 1B). Setzen Sie die Befestigungspfosten (3MP, Durchmesser 12 mm) in den 3PH-25 und befestigen Sie sie dann fest mit der M6-Schraube (Abbildung 1C).
  3. Befestigen Sie den Pfostenkragen (3PC) an beiden Befestigungspfosten (3MP; Abbildung 1D). Ein Post-Collar ist für die anschließende Fixierung des Katheters mit konstanter Zufuhr von Kochsalzlösung während der optischen Überwachung des zervikalen Lymphgefäßes notwendig.
    HINWEIS: Dies ist notwendig, um den Untersuchungsbereich regelmäßig zu spülen, um nach chirurgischen Eingriffen ansammelndes Blut zu entfernen, was die optische Überwachung erschweren kann.
  4. Befestigen Sie die rechtwinklige feste Pfostenklemme (3RPC-12) an einem der 3MP-Befestigungspfosten und fixieren Sie sie fest mit der M6-Schraube (Abbildung 1H).
    1. Setzen Sie den Montagepfosten (Durchmesser 12 mm) in das Seitenloch des 3RPC-12 ein (Abbildung 2B).
      HINWEIS: Der Montagepfosten ist für die anschließende Befestigung der Schutzabdeckung für eine nicht-wasserimmersionsbasierte Zweiphotonenlinse notwendig.
    2. Befestigen Sie den auf einem 3D-Drucker gedruckten Halter am seitlichen Befestigungspfosten und fixieren Sie ihn fest mit zwei Paar M3-Schrauben (Abbildung 2C).
    3. Mit UV-aushärtendem Kleber wird ein Deckglas mit einem Durchmesser von 12 mm an der Unterseite des auf einem 3D-Drucker gedruckten Schutzgehäuse befestigt (Abbildung 2D,F). Danach verwenden Sie das M4-Schrauben-Mutter-Paar, um die Schutzabdeckung am Halter zu befestigen (Abbildung 2).
  5. Installieren Sie den Präzisionsstromabnehmertisch für vertikale Bewegung 02TV004 (Abbildung 1E) auf der SOR-Basis mit zwei Tischklammern (3TC5) und Schrauben, Muttern und Unterlegscheiben M6 (Abbildung 1F).
  6. Stellen Sie ein 3D-gedrucktes Gehäuse (155 mm lang, 110 mm breit) auf die Tischplatte, das als Reservoir zur Ansammlung von Kochsalzlösung dient (Abbildung 1G).

2. Heizelement

  1. Montage von Peripheriegeräten.
    1. Decken Sie die Verbindungsstelle der Drähte zum Heizelement 1 mit einer dünnen Silikonschicht ab (Abbildung 3). Befestige den Temperatursensor 1 an der Matte und versiegele ihn mit Silikon (Abbildung 3B).
    2. Löten Sie die Drähte des Heizelements und der Temperatursensoren an ein Mehrdrahtkabel, füllen Sie die Anschlussstelle mit Silikon und schließen Sie sie mit Schrumpffolie (Abbildung 3).
    3. Setzen Sie das Heizelement 2 und den Temperatursensor 2 in die Schaumstoffrolle (Abbildung 4).
  2. Montage der Steuereinheit
    HINWEIS: Link zum Herunterladen von Dateien zum Drucken des Gehäuses der Steuerung https://disk.yandex.ru/d/06BURfMlQpl0Jg.
    1. Drucken Sie das Gehäuse der Steuereinheit auf einem 3D-Drucker (Abbildung 5B).
    2. Befestigen Sie die Stecker zum Anschließen des Stromkabels und des Netzschalters an den Wänden des Gehäuses, wie in Abbildung 5C,D gezeigt).
  3. Installieren Sie eine 24-V-Gleichstromversorgung, einen DC-Step-down-Wandler und 2 MOSFET-Module im Gehäuse (Abbildung 5A, G, H, I).
  4. Um die Schaltung zusammenzusetzen, folgen Sie diesen Schritten (Abbildung 6).
    1. Schließen Sie den Step-down-Konverter an die Quelle an und stellen Sie die Spannung auf 9 V ein (Abbildung 6).
    2. Verbinden Sie den VIN-Pin des Arduino UNO mit dem OUT+-Anschluss am Konverter und GND mit dem OUT-Anschluss (Abbildung 6).
    3. Verbinden Sie den V+-Pin am Netzteil mit den VIN+-Pins der MOSFET-Module und den V-Pin jeweils mit den VIN-Pins (Abbildung 6).
    4. Verbinden Sie den V-Pin+ am Heizelement 1 mit VOUT+ am MOSFET 1-Modul bzw. V- mit VOUT (Abbildung 6).
    5. Wiederholen Sie die Schritte für Heizelement 2 und MOSFET 2 (Abbildung 6).
    6. Verbinden Sie den GND-Pin des MOSFET 1 und 2 Moduls mit dem GND des Arduino UNO und den PWM MOSFET 1 mit dem D11-Anschluss des Arduino UNO und dem PWM MOSFET 2 mit dem D10-Stecker (Abbildung 6).
    7. Verbinden Sie den VIN-Pin des Temperatursensors 1 mit dem GND-Anschluss des Arduino UNO, VIN+ mit dem 5-V-Anschluss des Arduino UNO und SIG mit D3 (Abbildung 6).
    8. Verbinden Sie den SIG-Kontakt des Temperatursensors 2 mit A1 am Arduino UNO, verbinden Sie den GND-Sensor mit dem GND des Arduino UNO und schließen Sie außerdem den 100 kΩ Pull-up-Widerstand an (Abbildung 6).
  5. Repariere das Arduino UNO und den Tastaturbildschirm im Deckelgehäuse (Abbildung 7I).

3. Leitfaden zur Temperaturregelungssoftware

  1. Laden Sie die Arduino-Skizze (.ino-Datei) herunter und öffnen Sie sie in der Arduino-Entwicklungsumgebung (IDE-Version: 2.3.5-nightly-20241212).
  2. Wähle den richtigen COM-Port aus und lade die Firmware herunter. Die Benutzeroberfläche enthält zwei Tasten. Um zwischen ihnen zu wechseln, verwenden Sie die linke und rechte Taste (Abbildung 7B, D). Der Auswahlindikator befindet sich links in der Spalte (Abbildung 7F).
  3. Das Temperaturauswahlfeld befindet sich in der linken Spalte des Bildschirms (Abbildung 7H). Benutze die Auf- und Ab-Tasten zum Einstellen (Abbildung 7C).
  4. Das START-/Abschaltfeld befindet sich in der rechten Spalte des Bildschirms (Abbildung 7G). Um diese Spalte auszuwählen, drücken Sie die rechte Taste auf der Tastatur und dann Select (Abbildung 7A). Während der Prozess läuft, blinkt die Aktivitätsanzeige und das Label auf der AUSFÜHREN-Taste wechselt auf AUS.

4. Das Tier in der technischen Vorrichtung zu fixieren

HINWEIS: Die Experimente wurden an männlichen BALB/c-Mäusen (25–28 g, 2, 18 und 24 Monate alt) durchgeführt; In jeder Gruppe gab es 7 Tiere.

  1. Bereiten Sie eine Mischung aus Ketamin und Xylazin (100 mg/kg; 10-156 mg/kg) vor und injizieren Sie sie per peritonealer Injektion entsprechend dem Mausgewicht.
  2. Tragen Sie Augensalbe auf die Augenlider auf, um zu verhindern, dass die Augäpfel während der Operation austrocknen. Wiederholen Sie dieses Verfahren bei Bedarf wieder.
  3. Wenn die Reflexe des Zurückziehens der Hinterbeine und das Einziehen des Schwanzes aufhören, stellen Sie die Maus auf das Heizelement am Rücken, um Zugang zum Bauchbereich zu erhalten.
  4. Stecken Sie die Steuereinheit an eine Steckdose (Eingangsspannungsbereich 175-240 V AC, Frequenzbereich 50-60 Hz, AC-Strom 1,8A/230 V AC). Stellen Sie die Betriebstemperatur des Geräts auf 37–38 °C ein.
  5. Mit medizinischem Klebeband fixieren Sie das Tier so, dass der Körper parallel zur Tischoberfläche ist, und positionieren Sie den Kopf in einem Winkel relativ zur sagittalen Achse des Körpers, sodass die rechte oder linke Seite des Halses auf der Rolle liegt (Abbildung 8A).
    HINWEIS: Diese Fixierung des Mauskopfes ist notwendig, damit die rechte oder linke Seite des Halses (je nach experimentellen Bedingungen) auf eine Höhe von etwa 5 mm zur Mikroskoplinse angehoben wird. Daher liegt die Fläche von dcLN und cLV fast auf derselben Höhe wie die Luftröhre.
  6. Wickeln Sie die Ligatur um die oberen Schneidezähne und befestigen Sie sie auf der Rückseite des Geräts, um die Körpertemperatur des Tieres mit medizinischem Klebeband zu halten.
  7. Mit einer Rasiermaschine rasieren Sie den Bereich des Haaransatzes im Nackenbereich. Entfernen Sie nach der Rasur restliche Haare und decken Sie das Tier ab, um das sterile Feld zu schützen. Für chirurgische Eingriffe und anschließende optische Kontrolle wird 0,5 - 1 ml Lidocain/Bupivacain (1 mg/mL bzw. 0,25 mg/mL) subkutan in die Schnittstelle injiziert.
    1. Zur primären Desinfektion entfetten und teilweise desinfizieren Sie die Haut mit einem Alkoholabstrich und tragen dann zur antiseptischen Behandlung eine Lösung aus Chlorhexidin 0,5 % oder Jod 2 % auf die Haut auf. Wiederhole alle Sterilisationsschritte noch zweimal.
  8. Mit einer geraden, dissektionierenden Schere wird eine Dermatotomie der Halshaut mit einem Längsschnitt vom Unterkiefer bis zum Schlüsselbeinbereich von etwa 2 cm Länge durchgeführt (Abbildung 8B).
  9. Bei der Durchführung einer Fasziotomie mit mikrochirurgischer gebogener Schere wird mit einer gebogenen Pinzette die Speicheldrüsen und oberflächlichen Muskeln des Halses auseinandergedrückt, wodurch der Musculus sternocleidomastoideus freigelegt wird. Vermeiden Sie es, sichtbare Blutgefäße zu schädigen, um Blutungen zu verhindern. Befeuchten Sie den Operationsbereich ständig mit Kochsalzlösung, um übermäßige Gewebeschäden zu vermeiden.
  10. Mit einer mikrochirurgischen Schere wird eine Myotomie des Musculus sternocleidomastoideus durchgeführt, um Zugang zum Bereich zwischen Luftröhre und Halsschlagader des Tieres zu ermöglichen.
  11. Bei weiterer Streuung der Muskeln und Faszien sowie der Durchführung von Myo- und Fasziotomie lokalisieren Sie den tiefen zervikalen Lymphknoten sowie die afferenten und efferenten Lymphgefäße in einer Tiefe von 5–7 mm (Abbildung 8C).

5. Die Maus unter dem Mikroskop fixieren

  1. Stellen Sie das Gerät mit dem festen Tier auf den beweglichen Tisch des Mikroskops und verbinden Sie sie fest mit der M6-Schraube. Dies ist notwendig, um eine dauerhafte Montageposition auf dem beweglichen Tisch sicherzustellen.
  2. Stecken Sie die Steuereinheit an eine Steckdose (Eingangsspannungsbereich 175-240 V AC, Frequenzbereich 50-60 Hz, AC-Strom 1,8A/230 V AC). Stellen Sie die Betriebstemperatur des Geräts auf 36–37 °C ein.
  3. Befestigen Sie den mit Kochsalzlösung gefüllten Katheter mit medizinischem Klebeband am Befestigungsposten.
  4. Platzieren Sie eine 1 cm große Walze unter dem Heizelement an der Seite des Tierkopfes, um einen Neigungswinkel von 45° relativ zum beweglichen Mikroskoptisch zu gewährleisten. Dies ist notwendig, um das Halswirbellymphgefäß in horizontale Position zu bringen und den anschließenden Druck auf die Luftröhre zu verringern.
  5. Setzen Sie den fixierten Katheter nach dem chirurgischen Eingriff im offenen Halsbereich an, sodass er an der Seite der Schlüsselbeine des Tieres liegt.
    1. Schalte die Kochsalzlösung ein und warte, bis der offene Halsbereich vollständig mit Kochsalzlösung gefüllt ist.
    2. Senken Sie das Schutzgehäuse über den mit Kochsalzlösung gefüllten Halsbereich, sodass der Bereich des Lymphgefäßes im Zentrum liegt und die Luftröhre des Tieres nicht zusammengedrückt wird (Abbildung 9A).
    3. Zur Installation des Schutzgehäuses wird empfohlen, ein Fernglas zu verwenden, das mit einem Zweiphotonenmikroskop verbunden ist. Setzen Sie die Schutzhülle auf die Luftröhre, damit sie nicht darauf drückt. Achten Sie darauf, dass sich keine Luftblasen unter dem Schutzgehäuse ansammeln, wenn es abgesenkt wird. Achten Sie darauf, dass die Schutzplatte an den oberen Halsmuskeln sitzt und nicht auf cLVs drückt, sodass die erhitzte Kochsalzlösung in das Gefäß fließen kann und eine mechanische Verformung der cLVs verhindert wird.
  6. Senken Sie die nicht-wasser-immersionsbasierte Zweiphotonenlinse in die Schutzhülle auf eine Tiefe, die der Arbeitsdistanz dieser Linse entspricht, und führen Sie dann eine Zweiphotonenvisualisierung des zervikalen lymphatischen Gefäßes durch (Abbildung 9B).
    HINWEIS: Beim ersten Scan ist es notwendig sicherzustellen, dass das Lymphgefäß über seine gesamte Länge eine vollständige Struktur hat und sich beweglich beweglich fühlt, wenn die Maus atmet. Das bedeutet, dass sie nicht verformt oder von einer Schutzhülle eingeklemmt wird.

6. Zweiphotonen-in-vivo-Überwachung der cLV-Kontraktilität

HINWEIS: Die 2-Photonen-Bilder wurden mit einem Multiphotonenmikroskop (gepulster Laser, Anregungswellenlänge 970 nm) aufgenommen. Das Bild wurde mit einer Auflösung von 20x (f/0,75) aufgenommen. Jedes Bild bestand aus einem Sichtfeld-Zoom x 3,0 (212,13 × 212,13 μm), bestehend aus 512 x 512 Punkten. Die Bilder von cLVs wurden durch Aufnahme eines Videos mit 30 Bildern pro Sekunde und einer Dauer von 1 Minute aufgenommen. Die 2-Photonen-Bilder wurden in einem Kanal mit einer Anregung von fluoreszierendem LYVE-1 in cLVs bei einer Wellenlänge von 488 nm und dessen Emission bei einer Wellenlänge von 525 nm erhalten.

  1. cLV-Durchmesseranalyse und automatisierte Kontraktilitätsbewertung
    1. Missen Sie den Durchmesser von cLVs im interessierenden Bereich (ROI) mit 30-minütigen Filmen bei 30 Bildern pro Sekunde und 3-facher Vergrößerung. Mit einem benutzerdefinierten Python-Code misst man das Zeitprofil des cLV-Durchmessers für dieselben Segmente, die für die Berechnung des Lymphflusses verwendet werden.
    2. Wählen Sie manuell zwei Punkte aus, die den gegenüberliegenden Wänden der сLVs entsprechen. Bestimmen Sie ihre Position in nachfolgenden Bildern mit dem Lucas-Kanade optischen Flussalgorithmus (calcOpticalFlowPyrLK-Funktion in OpenCV), der eine Subpixelgenauigkeit für die Messungen ermöglicht. Berechnen Sie den Durchmesser als Abstand zwischen den verfolgten Punkten, umgerechnet von Pixeln auf Mikrometer. Verwenden Sie einen Schiebefenster-Mittelfilter, um Bewegungsartefakte zu eliminieren. Es sollten mindestens 20 Durchmessermessungen in einem ROI sein.
    3. Um die innere Pulsationsfrequenz zu bestimmen, verwendet man die geglättete Zeitreihe des Durchmessers. Erkennen Sie automatisch die Maxima und Minima des Signals mit der find_peaks-Funktion aus der SciPy-Bibliothek, die lokale Extreme des Zeitsignals anhand von Amplitudenschwellen und dem minimalen Abstand zwischen den Spitzen identifiziert.
    4. Aus der Analyse werden die cLV-Kontraktionen mit einer Amplitude von weniger als 3 % des durchschnittlichen Durchmessers und einem Intervall von weniger als 2 s ausgeschlossen. Berechnen Sie die durchschnittliche Frequenz über 30-Minuten-Intervalle als Frequenz der Kontraktionen pro Minute.

7. Zweiphotonenanalyse des Lymphflusses in cLVs

HINWEIS: Die Lymphflussanalyse wurde anhand der Bewegung roter Blutkörperchen in cLVs innerhalb von 5 Stunden nach der Einführung autologen Blutes in den rechten Seitenventrikel über den chronischen Katheter bewertet.

  1. Betäuben Sie die Maus mit 1 % Isofluran (siehe Protokoll veröffentlicht in40). Implantieren Sie den Katheter gemäß dem in40 beschriebenen Protokoll in den rechten Seitenventrikel.
  2. Bereiten Sie die Maus auf die Zwei-Photon-in-vivo-Bildgebung von cLVs gemäß den Schritten 7.1, 7.3-7.5 vor.
  3. Sammeln Sie Blut aus der Schwanzvene durch Nadelstich in einer Menge von 10 μL in einem sterilen Mikrozentrifugenrohr, das mit Heparin vorgespült wurde, um Gerinnung während der Blutentnahme und Injektion zu vermeiden.
  4. Blut in den rechten Seitenventrikel injizieren (AP = −0,5 mm; ML= −1,06 mm; DV = 2,5 mm) mit einer Mikroinjektionspumpe mit einer Geschwindigkeit von 0,1 μL/min.
  5. Führen Sie eine Zwei-Photonen-Analyse der Bewegung roter Blutkörperchen in cLVs durch. Berechnen Sie die Lymphflussrate mit Protokollen, die in41,22 veröffentlicht wurden.

8. Photobiomodulation der cLV-Kontraktilität

  1. Für das PBM der cLVs verwenden Sie die zuvor veröffentlichte Technologie und Protokolle in40.

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Ergebnisse

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Der Einsatz von Schutzgehäuse bietet die wichtigsten Vorteile für die langfristige Überwachung der zervikalen lymphatischen Gefäße in vivo, wie etwa die Isolierung des Operationsbereichs von der äußeren Umgebung, was die Aufrechterhaltung der Eintauchung des Lymphgefäßes und des umliegenden Gewebes in Kochsalzlösung mit einer konstanten Zufuhr von Kochsalzlösung durch einen am Körper angebrachten Katheter ermöglicht. Zusätzlich sorgt die Schutzabdeckung aufgrund ihrer Befestigun...

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Diskussion

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Die Untersuchung der Physiologie lymphatischer Gefäße erfordert den Einsatz nicht-invasiver Methoden bei der Aufrechterhaltung besonderer Umweltbedingungen, die eine normale Kontraktilität und einen stabilen Lymphfluss ermöglichen. Die überwiegende Mehrheit der Methoden zur Untersuchung der Funktionen lymphatischer Gefäße basiert auf optischer Überwachung ihrer Kontraktilität und der Beurteilung der Lymphflussgeschwindigkeit 3,28,29,30,31,32,33,34,35,3...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Forschung wurde durch einen Zuschuss der Russischen Wissenschaftsstiftung (Nr. 23-75-30001) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
3D-DruckerBambu Lab, ChinaP1S
5-Pin-SteckerConnfly electronic (Zhenqin), ChinaDS1110-01
Ein Satz hitzeschrumpfender SchläucheJupiter, ChinaJP7230-01
Arduino IDEArduino LLC2.3.5-nightly-20241212
BALB/c Mäuse"Andreevka" Zweigstelle FSBIS SCBT FMBA, Russland3-15-16Männlich, 6 Monate alt
Chlorhixedin BIOPHARMAZEUTISCHES WERKE, RusslandN/A
Dumont-Pinzette Stoelting, USA52100-07 
Evans Blue-Farbstoff Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USAN/A
FeinpinzetteStoelting, USA52102-02P
HamiltonHamilton Bonaduz AG, Schweiz29 G Nadel
HeizelementChinaLFH-9415sg
Insulin-NadelINSUPEN, Italien31G, 0,25mm*6mm
Ketamine MOSKAU ENDOKRINOLOGISCHES WERKE, FSUE, RusslandAllgemeine Anästhesie 
Tastatur-Schilddiymore, China1602 LCD-Tastatur-Schild
Lidocain ORGANICA, RusslandN/A Analgetikum
Verriegelbarer SchalterknopfChinaN/A
MetallfilmwiderständeTZT, ChinaN/A
Mikro-Sezier-Vannas-FederschereStoelting, USA52130-00P
MOSFET-ModulChinaMOSFET-Modul D4184
MontagepfostenStanda, Litauen3MP, Durchmesser 12 mm
MontagedrahtAB Einzelhandel, RusslandHB-1
Nicht scharfe PinzetteStoelting, USA52108-83P 
Kunststoff für 3D-DruckerBambu Lab, ChinaA00-D0-1.75-1000-SPL.
Pfostenkragen Standa, Litauen3PC
PfostenhalterStanda, Litauen3PH-25
StromanschlussRUICHI, ChinaAC-015
NetzteilSANPU, ChinaPS200-H1V24
Präzisions-Pantografentisch für vertikale Bewegung"Laserkomponenten", Russland02TV004 
Rechtwinklige feste Pfostenklemme Standa, Litauen3RPC-12
Schraube M3Standa, LitauenN/A
Schraube M4Standa, LitauenN/A
Schraube M6Standa, LitauenN/A
Rasierer Braun, figure-materials-1Serie 3310s
NatriumchloridKraspharma, RusslandN/A
Löten Produktion von Metallpulvern, RusslandZinn-Blei-Löt 61
LötflussmittelSolins, RusslandLTI-120 22 ml mit Pinsel
LötstationAOYUE, ChinaN/A
Lötstation AOYUE, ChinaN/A
Stahl-Optikschienen (SOR)Standa, LitauenN/A
AbwärtsspannungswandlerRUICHI, ChinaEM-825
Gerade Sezierschere Stoelting, USA52132-10P 
TemperatursensorLiludin, ChinaDS1820
TetracyclinJSC Tatkhimfarmpreparaty, RusslandAugensalbe 
Der ControllerArduino, ChinaUNO R3
PinzetteStoelting, USA52100-03 
Zwei-Photonen  MikroskopNikon, JapanA1R MP
DrahtPartner-Electro, RusslandP020G-0305-C050
Xylazin "Alfasan International B.V.", NiederlandeMuskelrelaxans
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Referenzen

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