Methodenartikel

Multimodaler Ansatz zur Bewertung der Knochenregeneration und der Gerüstleistung

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DOI:

10.3791/69483

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13. Februar 2026

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1Institute of Biomedical Sciences, Federal University of Rio de Janeiro, 2Department of Condensed Matter, Applied Physics and Nanoscience, Brazilian Center for Research in Physics, 3Alberto Luiz Coimbra Institute for Graduate Studies and Research in Engineering (COPPE), Federal University of Rio de Janeiro, 4Brazilian Synchrotron Light Laboratory (LNLS), Brazilian Center for Research in Energy and Materials (CNPEM)

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir schlagen ein Protokoll zur Bewertung der Knochenregeneration auf verschiedenen hierarchischen Ebenen vor. Dieser multimodale Ansatz ermöglicht Strukturanalysen über verschiedene Längenskalen hinweg und adressiert so effektiv Herausforderungen bei der Probenvorbereitung. Es bietet zudem einen zuverlässigen Arbeitsablauf zur Bewertung der Wirksamkeit von Biomaterialien bei der Förderung der Knochenregeneration.

Zusammenfassung

Der klinische Erfolg eines Implantats hängt weitgehend von seiner Fähigkeit ab, Knochenreparation zu fördern und die Osteointegration zu erleichtern. Obwohl bei der Gestaltung neuer Gerüste bedeutende Fortschritte erzielt wurden, wurde eine gründliche Bewertung des Implantaterfolgs auf verschiedenen Knochenlängenskalen nicht ausreichend untersucht. Knochen ist ein hierarchisch organisiertes Gewebe mit einer komplexen Struktur, die von der Organisation von Kollagenfibrillen und deren Mineralisierung auf Nanometer- und Mikrometerebene bis hin zur makroskopischen Anordnung kompakter und cancelloser Knochen reicht. Diese hierarchische Organisation ist entscheidend, um die Knochenfunktion und mechanische Leistungsfähigkeit sicherzustellen. In diesem Zusammenhang ist eine umfassende Bewertung der Auswirkungen von Biomaterialien auf die Knochenreparatur auf mehreren Längenskalen unerlässlich, um die Wirksamkeit und Sicherheit implantierter Materialien zu bewerten. Die Vorbereitung von Proben für integrierte multimodale Analysen stellt jedoch eine technische Herausforderung dar. In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll vor, das die Knochenregeneration auf verschiedenen hierarchischen Ebenen bewertet und die Schnittstelle zwischen neu gebildetem Knochen und dem implantierten Gerüst analysiert. Dieser Ansatz bietet eine robuste Methode zur Bewertung der Wirksamkeit von Gerüsten bei der Einleitung von Knochenreparatur. Die Kombination ausgewählter 3D- und 2D-Bildgebungstechniken ist entscheidend für eine ordnungsgemäße Bewertung des komplexen mineralisierten Gewebes, das sich während des Knochenheilungsprozesses bildet

Einleitung

Knochen ist ein komplexes, hierarchisch organisiertes Gewebe 1,2. Das Verständnis seiner strukturellen Organisation ist unerlässlich, um grundlegende Fragen zu beantworten, wie Zellen zur Gewebearchitektur beitragen und wie strukturelle Veränderungen diemechanische Funktion beeinflussen. In diesem Zusammenhang bleibt die Knochenremodellierung nach einer Verletzung ein zentrales Forschungsthema. Die Bruchheilung ist ein komplexer mehrstufiger Prozess, der mit einer initialen Entzündungsreaktion beginnt, gefolgt von Angiogenese und der Differenzierung der Vorläuferzellen zu Chondrozyten und Osteoblasten 4,5. Viel wurde über die Rolle von Biomaterialien bei der Stimulation der Osteointegration diskutiert, insbesondere über die Biokompatibilität und ihre Fähigkeit, faserige Verkapselung6 zu verhindern.

Eine gängige Methode zur Beurteilung biomaterialstimulierter Osteointegration ist die optische Mikroskopie, die sowohl quantitative als auch qualitative histologische Analysen ermöglicht. Dieser Ansatz hat sich als zuverlässige und effektive Methode erwiesen, um den Erfolg von Knochenimplantatenzu bewerten 7,8. Dennoch können mehrere Fragen der Knochenhierarchik nicht mit einem einzigen Bildgebungsansatz3, insbesondere dem histologischen, untersucht werden, der zumindest teilweise durch die Vergrößerungseinschränkung der Methode begrenzt ist.

Fortschritte in der dreidimensionalen Bildgebung haben sich als wesentlich für das Verständnis der Knochenhierarchie erwiesen. Techniken wie Mikrocomputertomographie (MikroCT; entweder Synchrotronstrahlung oder konventionelle laborbasierte Röntgenquellen)9,10,11, Doppelstrahl-Rasterelektronenmikroskopie (FIB-SEM) im Zusammenhang mit Slice-and-View-Tomographie 12,13,14 und Transmissionselektronentomographie 15,16 lieferten neue Einblicke in die Knochenarchitektur auf mehreren Skalen.

Basierend auf verschiedenen 3D-Bildgebungsmethoden wurde ein Modell der Knochenhierarchie-Organisation vorgeschlagen, das zunächst neun verschiedene Ebenen der Knochenstrukturorganisation1 identifizierte. Dieses Schema wurde kürzlich überarbeitet und erweitert, um etwa 12 hierarchische Ebenen abzudecken und dient als wertvolle Referenz zur Untersuchung der Beziehung zwischen Struktur und Funktion im Knochengewebe 2,17. Wichtig ist, dass dieses vorgeschlagene hierarchische Modell eine Grundlage für die Bewertung des Erfolgs der Knochenreparatur nach einer Verletzung bietet. Die Bewertung, ob das regenerierte Knochengewebe die native hierarchische Struktur reproduziert, ist ein zentraler Maßstab zur Beurteilung der Qualität der Knochenheilung, insbesondere wenn Biomaterialien innerhalb der beschädigten Stelle verwendet werden.

Obwohl der Einsatz mehrerer Bildgebungstechniken zur Untersuchung der Knochenorganisation diskutiert wurde 6,7,18,19,20, wurde wenig untersucht, was einen Workflow betrifft, der verschiedene Bildgebungsmodalitäten integriert, um die Knochenmineralorganisation auf mehreren räumlichen Skalen zu bewerten. Wie erwähnt, ist Knochen ein komplexes zusammengesetztes Gewebe, das aus einer organischen Phase (Zellen, Kollagen und Makromoleküle) und einer mineralisierten Matrix besteht. Aus Sicht der Probenvorbereitung stellt diese Komplexität technische Herausforderungen hinsichtlich der Lösungsmitteldurchdringung durch die Probe, der Sektionierung einer harten Probe und der Integration verschiedener Bildgebensstrategien an derselben Probe mit sich.

Die wichtigste Innovation in dieser Arbeit ist die Etablierung eines reproduzierbaren, korrelativen und multiskaligen Bildgebungsworkflows unter Verwendung dreidimensionaler Bildgebung und ergänzender Techniken. Wie in Abbildung 1A dargestellt, ist der Workflow so gestaltet, dass dieselbe Probe sequentiell mit verschiedenen bildgebenden Modalitäten untersucht werden kann. Da einige dieser Techniken destruktiv sind oder Schnitte erfordern, folgt der Arbeitsablauf einer Reihenfolge, die mit zerstörerfreien Methoden beginnt und zu Ansätzen übergeht, die Schneiden oder Materialentfernung beinhalten.

Dieser Ablauf für die Probenvorbereitung und -analyse ist weitgehend auf harte oder mineralisierte Proben anwendbar, einschließlich kortikalem und trabekulärem Knochen, Präimplantationsgerüsten und der Bewertung der Knochen/Biomaterial-Schnittstelle nach der Einpflanzung. Durch die Kombination von Bildmodalitäten, die unterschiedliche Sichtfelder und Auflösungsbereiche abdecken (Abbildung 1B), ermöglicht der Arbeitsablauf die Analyse von Proben vom Zentimetermaßstab bis hin zu Mikrometer- und Nanometerskala. Während die Sequenz auf die Korrelativanalyse einer einzelnen Probe optimiert ist, kann jede Technik auch unabhängig entsprechend dem experimentellen Ziel angewendet werden. Dieser Ansatz ermöglicht eine detaillierte Bewertung der Osteointegration der Biomaterialien und die Bewertung des regenerierten Knochenwachstums im Heilungsbereich.

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Protokoll

Die in diesem Protokoll präsentierten Ergebnisse stammen aus einem experimentellen Verfahren, das in einer früheren Studie21 durchgeführt wurde. Alle Verfahren wurden gemäß den ethischen Richtlinien des Ethischen Ausschusses für die Verwendung und Pflege von Versuchstieren an der Fluminense Federal University, Brasilien, durchgeführt (CEUA/UFF: 779). Kurz gesagt wurden 20 männliche Wistar-Ratten mit einem Gewicht zwischen 300 und 400 g zufällig zwei Gruppen zugeteilt: Sham- und cHA-Mikrosphärenimplantation. Alle Tiere wurden operiert, bei der ein 2-mm-Defekt in der Tibia-Diaphyse entstand. Die Sham-Gruppe diente als Gerinnselkontrolle zur Bewertung der Knochenregeneration bei einem nicht-kritischen Defekt, während die experimentelle Gruppe CHA37-Mikrosphären in die Defektstelle implantiert erhielt. Nach 7 und 21 Tagen wurden die Tiere mit einer Überdosis Vollnarkose eingeschläfert, und aus jeder Gruppe und jedem Zeitpunkt (7 und 21 Tage) wurden Tibiaknochenblöcke gesammelt. Die Knochenqualität und das Ausmaß des neu gebildeten Knochens wurden mittels optischer Mikroskopie und MikroCT bewertet.

1. Probenfixierung und Harz-Einbettung

  1. Unmittelbar nach der Euthanasie wird das Tibia, das das implantierte Biomaterial enthält, entfernt und in ein Fläschchen mit Karnovsky-Fixationslösung (2,5 % Glutaraldehyd, 4 % Formaldehyd in 0,1 M Kakodylatpuffer) übertragen. Lagern Sie die Probe mindestens einen Tag bei -4 °C.
    HINWEIS: Bereiten Sie das Fixationsmittel unter einer Abzugshaube vor und handhaben Sie, um eine Exposition gegenüber flüchtigen Substanzen zu verhindern. Jeglicher Umgang mit Chemikalien muss mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (PSA) erfolgen, und bei Bedarf sollten zusätzliche technische Sicherheitsmaßnahmen umgesetzt werden.
  2. Übertragen Sie die Probe vom Fixativ in ein Fläschchen mit einem 0,1 M Kakodylatpuffer. Halte die Probe sanft rotiert und ändere den Puffer zweimal in 10-Minuten-Intervallen. In diesem Stadium werden die Probenkanten mit einer kleinen Säge zugeschnitten, um die Harzdurchdringung zu erleichtern. Beim Schneiden der Probe halten Sie sie feucht im 0,1 m großen Kakodylatpuffer, um ein Trocknen zu verhindern.
    HINWEIS: Halten Sie das Sample immer in einem Puffervolumen, das mindestens das doppelte Samplevolumen hat. Dies sollte für alle Lösungen und das in diesem Protokoll verwendete Harz befolgt werden. Beim Umgang mit den oben genannten chemischen Komponenten arbeiten Sie in einer Abzugshaube und tragen Sie geeignete PSA. Sammeln Sie die Fixationslösung und Kakodyliertpufferabfälle in klar gekennzeichneten, chemisch kompatiblen Behältern mit richtig angebrachten Kappen. Befolgen Sie die institutionellen Standard Operating Procedures (SOPs) für die sichere Lagerung und Entsorgung gefährlicher chemischer Abfälle.
  3. Beginnen Sie den Dehydrationsprozess mit steigenden Acetonkonzentrationen (10 %, 30 %, 50 %, 70 %, 90 % und 100 %). Halte die Probe bei jeder Konzentration 30 Minuten in Rotation. Wiederhole den Schritt mit 100% wasserfreiem Aceton dreimal.
    HINWEIS: Beim Umgang mit Aceton arbeiten Sie in einer Abzugshaube und tragen Sie geeignete PSA. Nach der Verwendung sammeln Sie etwaige Restlösungsmittel in klar gekennzeichneten, chemisch kompatiblen Abfallbehältern mit richtig angebrachten Deckeln. Befolgen Sie die institutionellen Verkehrsregeln für die sichere Lagerung und Entsorgung gefährlicher chemischer Abfälle.
  4. Infiltrieren Sie mit Spurharz, indem Sie die Probe durch eine Reihe von graduierten Aceton-Harz-Verhältnissen übertragen: 2:1, 1:1, 1:2 und letztlich reines Harz. Jeder Schritt sollte 12 Stunden dauern und bei Raumtemperatur unter Rotation durchgeführt werden. Nach der graduierten Aceton-zu-Harz-Infiltration das reine Harz zweimal wechseln. Abschließend wird die Probe in eine Form mit reinem Harz übertragen und die Probe bei 70 °C für 24 Stunden polymerisiert.
    HINWEIS: Das Harz wurde gemäß dem Datenblatt vorbereitet, um eine mittlere Härte zu erreichen. Beim Umgang mit Spurharz arbeiten Sie in einer Abzughaube und tragen Sie geeignete PSA. Nach der Verwendung sammeln Sie alle Reste in klar gekennzeichneten, chemisch kompatiblen Abfallbehältern mit richtig angebrachten Deckeln. Befolgen Sie die institutionellen Verkehrsregeln für die sichere Lagerung und Entsorgung gefährlicher chemischer Abfälle.

2. Beispielvisualisierung mittels mikrocomputergestützter Röntgentomographie (microCT)

HINWEIS: MicroCT wird verwendet, um die Positionierung von Implantaten und die Knochenregeneration zu beurteilen. Es hilft auch, potenzielle Interessensgebiete für weitere Analysen zu identifizieren. Dieser Schritt sollte mit der in Harz eingebetteten Probe durchgeführt werden.

  1. Verwenden Sie einen vom Hersteller bereitgestellten Probenhalter als Basis, um sicherzustellen, dass die Probe sicher positioniert ist, um Bewegungen während des Scans zu verhindern. Verwenden Sie Materialien mit niedriger Dichte zur Unterstützung, wie Polystyrol, Mull oder Mikrozentrifugenröhren.
  2. Visualisieren Sie mit den folgenden optimalen Rasterparametern: Röhrenspannung/Strom = 60 kV/133 mA; Winkelschritt = 0,33°; durchschnittliche Frames = 5; Voxelgröße = 5 μm; Rotationsmodus = 180°. Für Proben mit metallischen Implantaten verwenden Sie eine 360°-Drehung und einen 0,5-mm-Aluminiumfilter.
    HINWEIS: Während der Knochenregeneration liegt die Dicke des trabekelähnlichen gewebten Knochens typischerweise innerhalb der Auflösungsgrenzen herkömmlicher Mikro-CT-Bildgebung. Um konventionelle morphometrische Parameter des trabekulären Knochens, wie Trabekeldicke, Abstand und Anzahl, genau zu quantifizieren, wird empfohlen, die kleinste Voxelgröße (5 μm wie angegeben) zu verwenden. Wenn die Region des Interesses (ROI) das Sichtfeld (FOV) bei dieser nominalen Auflösung übersteigt, verwenden Sie zunächst die Multiscan-Funktion zur Kachelung des ROI. Erwägen Sie, die Voxelgröße nur als letztes Mittel zu erhöhen, wenn der ROI nicht per Multiscan erfasst werden kann.
  3. Nach dem Scannen bestehen die Rohaufnahmedaten aus einer Reihe nummerierter Bilddateien. Rekonstruktion wird mit der vom Hersteller bereitgestellten Software durchgeführt, wobei der Fokus darauf liegt, Artefakte im von Interesse der Probe relevanten Region zu minimieren.
    HINWEIS: Es ist üblich, Bildartefakte entlang der Bildränder zu begegnen, insbesondere in Bereichen, die nicht analysiert werden. Das endgültige Volumen kann mit der Software des Herstellers zugeschnitten werden, um diese Bereiche zu eliminieren.
  4. Analysieren Sie das rekonstruierte Volumen mit verschiedenen 3D-Visualisierungssoftwaren wie Avizo, VGStudio Max, CTVox und Dragonfly22. Wenden Sie digitale Bildfilter an, um Artefakte zu entfernen. Verwenden Sie in diesem Fall die Methode der Nicht-lokalen Mittel-Denoising-Methode19.
    HINWEIS: Die Glättungswerte des Non-Local Means Denoiseising-Filters sollten so niedrig wie möglich gehalten werden, um die wichtigen Details der Schnittstelle nicht zu beeinträchtigen.

3. Probenvorbereitung für die optische Mikroskopie

  1. Wählen Sie die Schnittrichtung der Probe entsprechend dem experimentellen Ziel aus. Das Schienbein kann entweder quer oder längs entlang der Längsachse des Knochens durchschnitten werden. Verwenden Sie Querschnitte, um serielle Schnitte zu erzeugen, die das gesamte Defektvolumen abdecken. Längsschnitte sind geeignet, um die Knochenregeneration entlang der Langachse zu bewerten. Dieser Ansatz liefert jedoch nur einen einzigen Abschnitt des Defekts.
    1. Verwenden Sie eine Diamantsägescheibe mit niedriger Geschwindigkeit, um die Probe in 1-mm-Schnitte zu schneiden, entsprechend der experimentellen Strategie.
      HINWEIS: Es wird empfohlen, eine Diamantplatte mit einer Dicke von 0,006 bis 0,012 Zoll zu verwenden. Dünnere Klingen ermöglichen hochpräzise Schnitte mit minimalem Materialverlust aufgrund der Klingendicke.
    2. Fülle den Flüssigkeitsbehälter, bis der Flüssigkeitsstand die untere Kante der Klinge bedeckt.
      HINWEIS: Destilliertes Wasser ist für Knochenproben geeignet. Wenn jedoch eine übermäßige Erhitzung zu erwarten ist, wie bei Proben mit Metallimplantaten, wird das vom Gerätehersteller bereitgestellte Öl verwendet, um das Reservoir zu füllen.
    3. Befestigen Sie die Probe am Probenhalter und befestigen Sie sie am Instrumentenarm. Stellen Sie sicher, dass die Probe stabil und horizontal zur Oberfläche der Scheibe liegt. Verwenden Sie die Positionierknöpfe, um den Schnittbereich des Probestücks an die Scheibe anzupassen.
    4. Beginnen Sie mit dem Schneiden der Probe mit höheren Geschwindigkeiten (210 - 250 U/min) und üben Sie niedrigen Druck aus, bis sich eine Vertiefung in der Probe bildet. Dann wird die Geschwindigkeit (auf 93 - 124 U/min) reduziert, um das Schneiden reibungslos abzuschließen und übermäßige Vibrationen zu vermeiden.
    5. Stoppen Sie die Säge sofort nach Abschluss des Schnitts. Stellen Sie das System richtig ein, um sicherzustellen, dass das Schneiden sofort aufhört, sobald die Probe vom ursprünglichen Block gelöst wird.
  2. Untersuchen Sie die Probe mit einem Stereomikroskop. Beginnen Sie mit einer niedrigen Vergrößerung (z. B. 5x-10x), um das gesamte Exemplar zu inspizieren, und erhöhen Sie dann die Vergrößerung (z. B. 20x-40x), um das relevante Gebiet entsprechend der wissenschaftlichen Fragestellung auszuwählen. Der genaue Vergrößerungsbereich kann je nach verwendetem Instrument variieren. In dieser Arbeit wurden Regionen mit einer höheren Dichte von Schnittstellen zwischen neu gebildetem Knochen und Biomaterial für weitere Analysen ausgewählt.
  3. Probenmontage zum Ausdünnen
    1. Bringen Sie die Probe auf eine Stütze, um die ordnungsgemäße Handhabung während des Polierens zu erleichtern. Wenn die Probe ausschließlich für die Analyse der optischen Mikroskopie gedacht ist, wird sie direkt mit Sekundenkleber auf der zuvor polierten Seite an einem Kunststoff-Deckschicht befestigt.
      HINWEIS: Kunststoff-Objektträger werden aufgrund ihrer verbesserten Haftung empfohlen. Glasscheiben können ebenfalls verwendet werden (nach ausgiebigem Waschen mit neutraler Seife). Glasobjektträger erhöhen jedoch das Risiko einer Ablösung der Probe während des Polierens.
    2. Für Proben, die weiter mit einem korrelativen Ansatz analysiert werden, wird auf einer zweiteiligen Aluminiumrohrbaugruppe montiert. In diesem Protokoll wurde eine selbstgebaute Aluminiumrohrbaugruppe entwickelt, bestehend aus einem inneren massiven Zylinder mit einem Durchmesser von 2,5 cm und einem äußeren Hohlzylinder, der mechanische Unterstützung beim Polieren bietet. Die Probe ist am inneren festen Zylinder befestigt.
    3. Stellen Sie den inneren Aluminiumzylinder auf eine Heizplatte und erhitzen Sie ihn auf eine Temperatur, die zum Schmelzen des Wachs geeignet ist (typischerweise etwa 60–70 °C, je nach verwendetem Wachstyp).
      HINWEIS: Bienenwachs ist ebenfalls geeignet. Beim Umgang mit Montagewachs arbeiten Sie in einer Abzugshaube und tragen Sie geeignete PSA. Nach der Verwendung sammeln Sie die Reste in klar gekennzeichneten, chemisch kompatiblen Abfallbehältern mit richtig angebrachten Kappen. Befolgen Sie die institutionellen Verkehrsregeln für die sichere Lagerung und Entsorgung gefährlicher chemischer Abfälle.
    4. Trage eine kleine Menge Wachs auf die Oberfläche des Zylinders auf und lasse ihn vollständig schmelzen.
    5. Nach dem Schmelzen wird die Probe mit der interessierenden Oberfläche auf die wachs beschichtete Oberfläche gelegt und vorsichtig gedrückt, um vollständigen Kontakt sicherzustellen.
      HINWEIS: Die interessante Oberfläche sollte zur Zylinderoberfläche zeigen, sodass die Verdünnung auf der gegenüberliegenden Seite erfolgt. Vermeiden Sie übermäßige Verwendung von Wachs, da dies zu ungleichmäßiger Montage führen und die Polierqualität beeinträchtigen kann.
    6. Nimm den Zylinder von der Heizplatte und lasse das Wachs bei Raumtemperatur fest werden.
  4. Überwachung der Probendicke während des Polierens
    1. Um die Probendicke während des Polierens zu überwachen, wird eine Reflexionsmikroskopie mit niedriger bis mittlerer Vergrößerung (z. B. 10x-20x) verwendet. Ein Diagramm, das die Mikroskopkalibrierung und die Messung der Probendicke veranschaulicht, ist in Abbildung 2 dargestellt.
    2. Kalibrieren Sie die Z-Achse des Mikroskops mit einer Standardabdeckung, die typischerweise etwa 150 μm dick ist. Markiere eine Seite des Deckzettels mit einem roten Permanentmarker und einen angrenzenden Bereich auf der gegenüberliegenden Seite mit einem blauen Marker. Befestige den Deckdeckel auf einer Glasrutsche.
    3. Mit dem Feinfokus-Knopf und der Mikrometerskala fokussieren Sie zuerst auf die untere Fläche des Deckmantels und dann auf die obere Oberfläche.
    4. Notieren Sie den Z-Verdrängungswert. Dieser Wert entspricht der Deckungsschlupddicke (etwa 150 μm) und dient als Referenz.
    5. Während des Polierens der Probe wird diese Z-Achsen-Kalibrierung periodisch verwendet, um die Probendicke zu schätzen, ohne sie aus dem Aluminiumzylinder zu entfernen.
      HINWEIS: Diese Technik ermöglicht eine schnelle und zerstörungsfreie Dickenabschätzung während des Polierens. Alternativ kann die Probe aus der Halterung genommen und mit einem digitalen Bremssättel oder Mikrometer gemessen werden.
  5. Ausdünnen und Polieren
    1. Beginnen Sie mit dem groben und mittleren Polieren mit Schleifpapier und den Körnungsgrößen 1200, 2500 und 4100. Ziel dieses Schrittes ist es, die Probendicke auf etwa 0,15 mm zu reduzieren und dabei erhebliche Oberflächenunregelmäßigkeiten zu entfernen.
    2. Beginne mit Schleifpapier mit 1200 Körnung und gehe dann zu 2500er Körnung vor. Üben Sie während dieses Vorgangs leichten Druck aus. Überwachen Sie regelmäßig die Probendicke mittels Reflexionsmikroskopie beim Polieren.
    3. Sobald die gewünschte Dicke erreicht ist, polieren Sie beide Seiten der Probe mit Schleifpapier der Körnung 4100. Das Polieren kann manuell oder mit einer halbautomatischen Poliermaschine auf niedrige Drehzahl durchgeführt werden. Reinigen Sie die Probe bei jedem Polierungsschritt kontinuierlich mit destilliertem Wasser.
      HINWEIS: Das nassen Halten der Proben und des Schleifpapiers während des Polierens hilft, die Hitze zu reduzieren und Oberflächenverunreinigungen durch die raueren Schleifpapiere zu verhindern.
    4. Für das Endpolieren wird eine kleine Menge Diamantpaste (z. B. 6 μm oder 3 μm) auf ein auf einer Polierplatte montiertes Filzpoliertuch aufgetragen. Wählen Sie die Partikelgröße der Diamantpaste entsprechend der Oberflächenrauheit der Probe aus.
      HINWEIS: Eine 6-μm-Paste eignet sich für das vorläufige Feinpolieren, während eine 3-μm-Paste für das Endpolieren des Spiegels empfohlen wird. Wenn möglich, erzielt die nachfolgende Verwendung beider Pasten die besten Ergebnisse. Dennoch kann ein zufriedenstellendes Polieren nur mit der 6-μm-Paste erreicht werden.
    5. Polieren Sie beide Seiten der Probe vorsichtig mit minimalem Druck. Verwenden Sie Druckluft oder Baumwolle, um die polierte Oberfläche der Probe vor der Mikroskopieuntersuchung zu trocknen.
    6. Um die Probe vom Zylinder zu lösen, erwärmen Sie das Wachs mit einer Heizplatte und entfernen Sie eventuelle Restwachs mit wasserfreiem Aceton von der Probe.
      HINWEIS: Beim Umgang mit Montagewachs und wasserfreiem Aceton arbeiten Sie in einer Abzugshaube und verwenden Sie geeignete PSA. Nach der Verwendung sammeln Sie die Reste in klar gekennzeichneten, chemisch kompatiblen Abfallbehältern mit richtig angebrachten Kappen. Befolgen Sie die institutionellen Verkehrsregeln für die sichere Lagerung und Entsorgung gefährlicher chemischer Abfälle.
    7. Die Probe wird zwischen Glasobjektträger und Deckschicht montiert, wobei Immersionsöl als Montagemedium dient, und die Kollagenfaserorientierung mittels Polarisationsmikroskopie bewertet wird. Beginnen Sie mit niedriger Vergrößerung (z. B. 5x-10x), um die Probe zu verfassen, und erhöhen Sie auf eine mittlere Vergrößerung (z. B. 20x-40x), um potenzielle Bereiche für weitere Erkundungen mittels Elektronenmikroskopie zu identifizieren.
      HINWEIS: Um mit dem korrelativen Arbeitsablauf und der anschließenden Analyse der Probe mittels Rasterelektronenmikroskopie fortzufahren, ist es ratsam, die Probe nicht zu versiegeln.

4. Probenvorbereitung für die Rasterelektronenmikroskopie

  1. Nehmen Sie die Probe vorsichtig vom Glasobjekt. Schieben Sie den Deckdeckel vorsichtig mit einer Pipettspitze vom Glasrutscher. Verwenden Sie Filterpapier, um das überschüssige Tauchöl zu entfernen. Wasche die Probe mit neutraler Seife. Führen Sie die Wäsche in einem kleinen Behälter durch, um versehentlichen Probenverlust zu vermeiden.
    HINWEIS: Wenn noch Restöl auf der Probe vorhanden ist, reinigen Sie die Oberfläche vorsichtig mit einem Wattestäbchen, das leicht mit 70 % Ethanol befeuchtet wurde.
  2. Lassen Sie die Probe an der Luft auf einem Filterpapier trocknen. Druckluft oder Baumwolle kann ebenfalls zum Trocknen der Probe verwendet werden. Sobald sie vollständig getrocknet ist, befestigen Sie die Probe mit Kohleband auf einen Stummel. Sputter-überziehen Sie die Probe mit einer 10-nm-Goldschicht, um das Aufladen während der Bildgebung zu verhindern.
  3. Verwenden Sie das Dualbeam-FIB-SEM-Mikroskop, um die Probe mit verschiedenen Methoden zu untersuchen.
    1. Im SEM-Modus (Rasterelektronenmikroskopie) wird entweder mit Sekundärelektronen oder rückgestreuten Elektronen die Probenmorphologie, das Biomaterial und die neu entstandene Knochenschnittstelle in zuvor durch die optische Mikroskopie ausgewählten Bereichen bewertet.
    2. Im fokussierten Ionenstrahl-Rasterelektronenmikroskopie-Modus (FIB-SEM) wird eine Slice-and-View-Tomographie durchgeführt.
  4. Im SEM-Modus mit dem sekundären Elektronendetektor werden Bereiche ausgewählt, die zuvor mittels Polarisationsmikroskopie und SEM analysiert wurden, um mit der Slice-and-View-Tomographie fortzufahren.
  5. Passen Sie die Parameter für Grabenvolumen, Pixelgröße und Schnittdicke basierend auf den interessanten Merkmalen an. In unserem Setup wurde eine Slice-and-View-Tomographie mit einem Graben-Volumen von 15 μm x 10 μm x 10 μm, einer Pixelgröße von 20 nm und einer Schnittdicke von 60 nm durchgeführt. Es wird empfohlen, wann immer möglich eine isometrische Voxelgröße zu verwenden, um die Bildqualität in allen drei Dimensionen zu verbessern (XYZ).
    HINWEIS: Diese Parameter können je nach spezifischem FIB-SEM-System variieren. Konsultieren Sie den Gerätebediener, um die optimalen Bedingungen basierend auf Ihren analytischen Anforderungen und den Fähigkeiten des Systems zu bestimmen.

5. Ausrichtung, Filterverarbeitung und Segmentierung der FIB-SEM-Slice-and-View-Tomographie

  1. Die Slice-and-View-Tomographie erzeugt eine Reihe von Bildern, die nacheinander nummeriert sind. Um mit der Ausrichtung fortzufahren, wandeln Sie die Serie in eine MRC-Datei um, die allgemein als Stack bezeichnet wird.
  2. Führen Sie MRC-Dateigenerierung und Bild-Stack-Ausrichtung mit der IMOD-Software durch.
    HINWEIS: Andere Software, wie Avizo und FIJI/ImageJ, bieten ebenfalls Stack-Ausrichtungs-Plugins an. Für ausführliche Hinweise siehe jede softwarespezifische Dokumentation. Zusätzlich die Arbeit von Peddie et al.23. bietet einen Überblick über die während der Stack-Ausrichtung angewandten Ansätze.
  3. Um die MRC-Datei zu generieren, öffnen Sie das Terminal oder die Eingabeaufforderung, navigieren Sie zum Ordner mit der Bildsequenz und führen Sie folgenden Befehl aus: tif2mrc imagerootfile*.tif stackname.mrc
    1. Für Bilder, die nicht im TIFF-Format sind, verwenden Sie stattdessen raw2mrc. Fügen Sie -g hinzu (z. B. tif2mrc -g), um 24-Bit-RGB-Bilder in 8-Bit-Graustufen umzuwandeln. Dies wird die Berechnungszeit erheblich verkürzen.
  4. Starte Etomo vom Terminal und wähle die Option Serial Sections ausrichten. Folgen Sie der Sequenz, um den Stack auszurichten: (1) Laden Sie den nicht ausgerichteten Stack in einen einzelnen Frame. (2) Algin-Tab mit initialer automatischer Ausrichtung. (3) Erstellen Sie mit "Make aligned stack" einen Stack-Stack erstellen und öffnen Sie dann den ausgerichteten Stack.
    HINWEIS: Dieser Vorgang kann je nach Stackgröße und Systemleistung mehrere Minuten dauern.
  5. Nach Abschluss prüfen Sie das Ergebnis. Die ausgerichtete Stack-Datei wird stackname_ali.mrc genannt.
    HINWEIS: Dieses Verfahren verwendet die Standardeinstellungen des Systems für die Stack-Ausrichtung. Allerdings können Parameter im Zusammenhang mit der anfänglichen Ausrichtung und der endgültigen Stapelerzeugung je nach Vorlieben des Nutzers angepasst werden. Für ausführliche Hinweise siehe die IMOD-Dokumentation: https://bio3d.colorado.edu/imod/doc/serialalign.html.https://bio3d.colorado.edu/imod/doc/serialalign.html.
  6. Führen Sie zusätzliche Bildfilterung mit der Avizo-Software durch. Öffnen Sie den ausgerichteten Stapel und wenden Sie nacheinander folgende Filter an: Fast Fourier Transform (FFT) Filter, verfügbar im Sandbox Filter Plugin (wählen Sie die Option vertikale Streifenorientierung, Toleranzwert: 2), Schattierungskorrektur-Assistent (Maskenauswahl anpassen, um den gesamten Schattenbereich des Bildes abzudecken, Normalisierungsfaktor 100 verwenden), Histogrammequalizierung (Standardkonfiguration) und Nicht-lokale Mittel (Werte auf 5; 0,1; 10; 3 anpassen).
    HINWEIS: Äquivalente Filter sind in anderen Bildanalyse-Programmen verfügbar. In FIJI/ImageJ empfehlen wir folgende Reihenfolge: FFT-Filter, Subtract Background, Enhance Local Contrast (CLAHE) und Non-Local Means Filter.
  7. Fahren Sie mit der Software mit Bildsegmentierung und 3D-Rendering fort. Verschiedene Segmentierungsstrategien stehen zur Verfügung, darunter manuelle Segmentierung und Schwellenwert-basierte Segmentierung. Zusätzliche Werkzeuge, wie der Watershed-Algorithmus, können helfen, den Prozess zu automatisieren und die Zeit für die Segmentierung zu reduzieren.

6. Probenvorbereitung für die Transmissionselektronenmikroskopie

  1. Herstellen Sie Lamellen mittels fokussierter Ionenstrahl-Rasterelektronenmikroskopie (FIB-SEM) zur Bewertung der Knochen-Biomaterial-Grenzfläche.
    HINWEIS: Wenn das implantierte Biomaterial nicht keramisch oder metallisch ist, wie in dieser Studie, können ultradünne Schnitte, die für die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) geeignet sind, mit einem Ultramikrotom hergestellt werden. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass das Schneiden mineralisierter Materialien die Lebensdauer des Diamantmessers erheblich verkürzen kann.
  2. Nach der Färbung der ultradünnen Abschnitte 20 Minuten in einer wässrigen Lösung aus 5% Uranylacetat.
    HINWEIS: Bei der Handhabung von Uranylacetat arbeiten Sie in einer Abzugshaube und tragen Sie geeignete PSA. Nach der Verwendung sammeln Sie eventuelle Restlösungsmittel in klar gekennzeichneten, chemisch kompatiblen Abfallbehältern mit richtig angebrachten Deckeln. Befolgen Sie die institutionellen Verkehrsregeln für die sichere Lagerung und Entsorgung gefährlicher chemischer Abfälle.
  3. Analysiere die Abschnitte mit TEM. Für eine umfassende Analyse kombinieren Sie Bildgebung mit ausgewählter Flächenelektronenbeugung (SAED), energiedispersiver Röntgenspektroskopie (EDS) und Elektronentomographie.

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Ergebnisse

Die erste Analyse von harzeingebetteten Proben erfolgt mittels Mikrocomputertomographie (microCT). Diese nicht-destruktive Technik ermöglicht die 3D-Visualisierung des gesamten Defektbereichs und ermöglicht sowohl quantitative als auch qualitative Analysen der Probe. Der Kontrast bei der MikroCT-Bildgebung resultiert hauptsächlich aus den Dichteunterschieden der in der Probe vorhandenen Materialien. Abbildung 1 zeigt die MikroCT-Analyse eines nicht-kritische...

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Diskussion

Verschiedene Bildgebungstechniken wurden eingesetzt, um die Knochenarchitektur zu untersuchen und die Wirksamkeit von Biomaterialien bei der Osteointegration zu bewerten 7,21,22,23,24. In diesem Protokoll haben wir einen Arbeitsablauf etabliert, der Röntgenmikrotomographie, optische Mikroskopie und Elektronenmikroskopie umfass...

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Offenlegungen

Die Autoren geben an, dass sie keine bekannten konkurrierenden finanziellen Interessen oder persönlichen Beziehungen haben, die die in diesem Artikel berichtete Arbeit beeinflusst haben könnten.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch Stipendien an die Autoren folgender brasilianischer Behörden unterstützt: Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq/Brasilien) und Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ). Wir danken LABNANO/CBPF und CENABIO/UFRJ für die Einrichtungen zur Elektronenmikroskopie. Sprachverfeinerungen und Grammatiküberarbeitungen wurden mit ChatGPT durchgeführt (OpenAI, GPT-5.1, 2025). Alle Änderungen wurden von den Autoren überprüft und überprüft.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Aceton Merck67-64-1
Aluminiumzylinderselbstgemachtn/a
Avizo-Version 2022.1ThermoFishern/aSoftware für Bildfilterung, Segmentierung und 3D-Visualisierung
Kakodylsäure, Natriumsalz, TrihydratTed Pella18851Pulver für Cacodylate Buffer. Bereite eine Lagerlösung von 0,2 M vor
Diamantpolier-Compound 3 & Mikro; M-GrößeTed Pella895-8
Diamantpolier-Compound 6 & Mikro; M-GrößeTed Pella895-9
Diamond Wheel x.006South Bay TechnologieDWH 3063
Diamantrad x.012South Bay TechnologieDWH 4122
FilzpoliertuchTed Pella816-20
Flache EinbettkapselnEMS70021
GlasabdeckungsverschlupfKnitteln/a
GlasrutscheKnitteln/a
Glutaraldehyd, 25 % EM-QualitätTed Pella18426/18427
Gold-Sputter K550XEMITECHn/a
ImageJNationale Gesundheitsinstitute (NIH)Software für Bildausrichtung, Filterung, Segmentierung und 3D-Visualisierung
IMOD Version 5.1Universität von ColoradoSoftware für Bildausrichtung, Segmentierung und 3D-Visualisierung
Lapping-e-PoliermaschineSouth Bay TechnologieModell 910
Niedriggeschwindigkeits-Diamantradsäge South Bay TechnologieModell 650
Einbettungsset mit niedriger ViskositätEMS14300Kit für SPURR-Harz. Bereiten Sie gemäß den Datenblattspezifikationen vor;
Micro-CT Skyscan 1273 Brukern/a
Mikroskop Jeol 2100F 200kV Jeoln/a
Mikroskop Olympus BX51Olympusn/a
Mikroskop Tescan Lyra3Tescann/a
Mikroskop Zeiss AxioplanZeissn/aausgestattet mit einer Lambda-Platte erster Ordnung
Paraformaldehyd, EM-GradSigmaP6148Pulver für Formaldehydlösung. Bereiten Sie eine Lagerlösung mit 16 % vor.
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QuickStick 135 MontagewachsSouth Bay Technologien/a
Sandpapiere  Körnungsgrößen 1200n/an/a
Sandpapiere  Körnungsgrößen 2500n/an/a
Sandpapiere  Körnungsgrößen 4100n/an/a
SekundenkleberLoctiten/a
Wasserlösliches Kühlmittel South Bay Technologien/a
Whatmann-Filterpapier der Stufe 1SigmaWHA1001150

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