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Methodenartikel

Neonatale Maus-Ovarialkultur und Quantifizierung ganzer Follikel: Ein effizienter in-vitro-Ansatz zur Untersuchung der primordialen Follikelregulation

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DOI:

10.3791/69498

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19. Dezember 2025

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1Department of Obstetrics, Gynecology, and Women's Health, University of Missouri School of Medicine, 2Division of Biological Sciences, University of Missouri

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Diese Studie präsentiert Protokolle zur Kultivierung postnataler Maus-Eierstöcke an Membraneinsätzen sowie zur Quantifizierung ganzer Follikel in einem gesamten Eierstock. Die Ergebnisse zeigten, dass die technische Handhabung während der Eierstockkultur die Zahl der primordialen Follikel signifikant beeinflusst, was die Bedeutung der Konsistenz zur Minimierung nichtbiologischer Variation unterstreicht.

Zusammenfassung

Bei weiblichen Säugetieren bilden sich während der Entwicklung der fetalen Eierstocke primordiale Follikel und dienen als einzige Quelle zur Aufrechterhaltung der erwachsenen Ovarialfunktion. Mechanismen, die zugrunde liegen, wie sich primordiale Follikel zusammenstellen, die Ruhe aufrechterhalten, sich für die Follikelentwicklung aktivieren und Zelltod durchlaufen, sind wichtig für das Verständnis der Ovarialphysiologie und pathologischer Zustände. Diese Studie präsentiert ein Protokoll zur Kultivierung postnataler Maus-Eierstöcke auf Membraneinsätzen, ein Ansatz, der die Kultur und pharmazeutische Behandlung intakter Eierstöcke für bis zu 10 Tage ermöglicht, abhängig vom Entwicklungsstadium des Eierstocks. Veränderungen der Kulturbedingungen können erreicht werden, indem Einsätze mit kultivierten Eierstöcken zwischen Brunnen auf einer Platte übertragen werden, wodurch physische Beeinträchtigungen mit dem Gewebe während der Kultur vermieden werden. P5-Eierstöcke wurden isoliert und auf einem 12-mm-Einsatz in einer 24-Well-Platte kultiviert. Jeder Eierstock wurde in einem Tröpfchen DMEM/F12-Mediums getrennt, der mit 10 % FBS, 3 mg/mL BSA, 10 mIU/mL FSH und Antibiotikum-Antimykotika ergänzt wurde, und sanft auf dem Membraneinsatz stabilisiert wurde. Das Medium wurde alle zwei Tage gewechselt, und die Kultur wurde insgesamt fünf Tage aufrechterhalten. Nach der Kultur wurden die Eierstöcke 2 Stunden lang in 4 % Paraformaldehyd fixiert und zur Ganzmontage-Antikörperfärbung des Oocytenmarkers DDX4 verarbeitet. Die Follikel wurden stufenweise und quantifiziert anhand der Eizellgröße und der Kernmorphologie somatischer Follikelzellen. Die Ergebnisse zeigten, dass die Anzahl der primordialen Follikel in jedem Eierstock signifikant durch die korrekte Platzierung der Gewebe auf dem Membraneinsatz beeinflusst wurde. Außerdem können Unterschiede in der Anzahl der Eierstöcke auf jedem Einsatz nicht-biologische Unterschiede verursachen und sollten vermieden werden.

Einleitung

Die Oogenese ist ein hochregulierter und komplexer Prozess, der zur Bildung reifer Eizellen führt. Bei Säugetieren beginnt die Oogenese in den fetalen Eierstöcken, wo primordiale Keimzellen (PGCs) zu primären Oozyten differenzieren. Jede primäre Oozyte ist von einer Schicht von plattenepitheligen Prägranulosenzellen umschlossen, die ein urzeitliches Follikel bilden. Die meisten dieser urzeitlichen Follikel werden nach der Bildung ruhend und dienen als Ovarialreserve 1,2,3. Im adulten Eierstock ist die periodische Aktivierung primordialer Follikel für die Follikelentwicklung, bekannt als Follikogenese, entscheidend für die Aufrechterhaltung der Produktion reifer Eizellen und ovarialer Steroidhormone 4,5. Ohne Aktivierungssignale können menschliche Primordialfollikel bis zu 50 Jahre ruhend bleiben. Die verlängerte Ruhephase kann zu einer verminderten Eizellqualität beitragen sowie zu einer erhöhten Rate des primordialen Follikelverlusts in alternden Eierstöcken6. Die Mechanismen, wie ein bestimmter Follikelpool aktiviert wird, während andere ruhig bleiben und periodischen Zelltod erleiden, bleiben offene Fragen.

Der Prozess der Oogenese ist bei Säugetieren hochgradig konserviert, was Mäuse zu einem idealen Modell zur Untersuchung der Oogenese von Säugetieren7 macht. Bei Mäusen ist die urzeitliche Follikelbildung bis zum postnatalen Tag 4 (P4) abgeschlossen. Ein kleiner Anteil der primordialen Follikel durchläuft unmittelbar nach ihrer Bildung eine follikelare Entwicklung. Während der Follikelentwicklung vergrößert sich die Eizelle aufgrund verstärkter Organogenese sowie der mRNA- und Proteinsynthese4. Plattenepithel-Granulosazellen wandeln sich in kuboidale Granulosenzellen und werden proliferativ8. Diese sich entwickelnden Follikel erreichen etwa am 21. Tag die ovulative Phase, zu der weibliche Mäuse die Pubertät erreichen. Diese Phase der Follikelentwicklung in postnatalen Eierstöcken wird allgemein als 'Erstwellenfollikulogenese' bezeichnet. Da die Follikogenese der ersten Welle stark dem Prozess der Follikelentwicklung entspricht, bieten postnatale Maus-Eierstöcke ein ideales Modell zur Untersuchung der primordialen Follikelregulation und der ovarialen Follikogenese9.

Die Klassifikation der Ovarialfollikel basiert hauptsächlich auf der Kernmorphologie der somatischen Follikelzellen und der Größe der Eizelle. Bei Maus-Eierstöcken wird der ruhende Primordialfollikel durch eine einzelne Schicht von plattenepitheligen Pregranulosa-Zellen identifiziert, die eine primäre Eizelle mit einem Durchmesser von etwa 20 μm umschließen. Sich entwickelnde Follikel lassen sich in primäre, sekundäre, tertiäre und antrale Follikel einteilen. Das primäre Follikel enthält eine Eizelle, die typischerweise über 25 μm im Durchmesser ist und von einer einzelnen Schicht kuboider Granulosenzellen umgeben ist (ergänzende Abbildung 1). Der sekundäre Follikel besteht aus zwei Schichten von Granulosazellen, während der tertiäre Follikel aus drei oder mehr Schichten von Granulosazellen besteht. Der antrale Follikel ist größer als der tertiäre Follikel, enthält mehrere Schichten von Granulosenzellen und besitzt eine flüssigkeitsgefüllte Höhle, die als Antrum bekannt ist. Mit der Entwicklung der Follikel nimmt die Eierzelle an Größe zu und erreicht bis zum Zeitpunkt des Eisprungs etwa 80 μm. Zusätzlich sind die sich entwickelnden Follikel von mehreren Schichten dünner Thecazellen umgeben, die sich außerhalb der Granulosazellenbefinden.

Die relativ geringe Größe der postnatalen Maus-Eierstöcke macht die gesamte Eierstockkultur zu einem praktischen Forschungsansatz. Diese Methode ermöglicht effektiv die Untersuchung der Eierstock- und Follikelentwicklung in einem intakten Eierstock, da sie die physischen und physiologischen Mikroumgebungen erhält und gleichzeitig Interferenzen durch das umliegende Gewebe minimiert12. Dieser Ansatz ermöglicht Experimente, die in vivo Modelle schwer durchzuführen wären. Beispiele sind Live-Imaging der Ovarialentwicklung, zeitgesteuerte Multi-Medikamenten-Behandlungen und die Analyse der ovarialen sekretorischen Aktivität mittels Proteinprofilierung des Kulturmediums13,14. Darüber hinaus kann dieser Ansatz angewendet werden, um die Wirkung sekretorischer Faktoren ohne direkte Zell-Zell-Interaktion durch Kokultivierungsexperimente zu untersuchen. In diesen Experimenten können verschiedene Gewebetypen auf separate Membraneinsätze innerhalb eines gemeinsamen Mediums15 platziert werden. Darüber hinaus könnte der Einsatz bedingter Gen-Knockout-Maus-Eierstöcke in vitro helfen, wichtige Mechanismen zu erläutern, die an der Aktivierung und dem Wachstum der primordialen Follikel beteiligt sind.

In diesem Artikel stellen wir Methoden zur Kultivierung postnataler Maus-Eierstöcke mittels Membraneinsätze und zur Quantifizierung ganzer Follikel in einem gesamten Eierstock vor (Abbildung 1). Zu den hier beschriebenen Techniken gehören 1) Dissektion neonataler Maus-Eierstöcke, 2) Kultur neonataler Maus-Eierstöcke, 3) Medienwechsel während der Kultur, 4) Gewebefixierung und Ganzmontage-Antikörperfärbung sowie 5) Gewebebildgebung und Follikelquantifizierung. Zusätzlich verwendete diese Studie Doxorubicin, um experimentell den Verlust des primordialen Follikels zu induzieren und so ein Modell zur Untersuchung der Mechanismen der Erschöpfung der Ovarialreserven zu erforschen. Die Ergebnisse zeigten, dass die Anzahl der Eierstöcke pro Einsatz und ihre Positionierung innerhalb des Einsatzes während der Kultur die Zahl der primordialen Follikelzählungen beeinflusste. Dies unterstreicht die Bedeutung eines konsistenten Kulturaufbaus, um nicht-biologische Variationen der experimentellen Ergebnisse zu verhindern.

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Protokoll

CD-1 männliche und weibliche Mäuse wurden im Verhältnis 1:1 als Brutpaare zusammengehalten. Das Geburtsdatum neuer Welpen wurde als postnataler Tag 0 festgelegt. Alle Tierversuche wurden vom Institutional Animal Care & Use Committee (IACUC) der University of Missouri genehmigt (Protokollnummer: 36647).

1. Reagenzien und Kulturmedien

  1. Alle in dieser Studie verwendeten Reagenzien sind in der Materialtabelle aufgeführt. Bereiten Sie alle Materialien und Medien vor der Eierstockkultur vor.
  2. Kulturmedium: Produzieren Sie ~5 mL DMEM/F-12-Medien, ergänzt mit 3 mg/mL Bovines Serumalbumin (BSA), 10 % fetalem Rinderserum (FBS) und 10 mIU/mL follikelstimulierendem Hormon (FSH).
    HINWEIS: Die Medien sollten frisch vorbereitet werden, indem die BSA-Aktien (30 mg/mL), FBS und FSH (10 IU/mL) zu DMEM/F-12-Medien hinzugefügt werden. Das Medium in einer Petrischale etwa 30 Minuten lang in einem 5%igen CO2-Inkubator bei 37 °C ausgleichen. Lagern Sie die Brühe bei -20 °C und tauen Sie sie sofort vor der Verwendung auf. Aliquot lagert in angemessenen Mengen, um wiederholtes Einfrieren und Auftauen der Bestände zu vermeiden.

2. Eierstockkultur

  1. P5-weibliche Mäuse durch Enthauptung einschläfern. Entfernen Sie die Eierstöcke und das angesetzte Bursagewebe mit chirurgischer Schere und Pinzette. Setzen Sie die Eierstöcke in eine 60 mm große Petrischale mit vorgekühltem Dulbeccos phosphatgepuffertem Kochsalzlösungslösungsmittel (DPBS), das Antibiotikum-Antimykotikum enthält (Abbildung 2A, B).
  2. Mit einem Paar Insulinspritzen (1 ml) wird das Bursagewebe aus dem Eierstock unter einem Stereoskop zerlegt und entfernt (Abbildung 2C,D). Übertragen Sie die Eierstöcke mit einer 1-ml-Pipette in eine 30 mm große Petrischale mit 3 ml Kulturmedium und setzen Sie die Schale in einenCO2-Inkubator.
    HINWEIS: Vermeiden Sie es, die Eierstöcke zu stechen oder zu drücken. Machen Sie saubere und gleichmäßige Schnitte durch die Ovarialbursa mit den Insulinspritzen, um den Eierstock freizugeben. Füllen Sie die Pipettenspitze mit etwa 50 μL Medium vor, legen Sie die Pipettenspitze neben den Eierstock und saugen Sie sie zur Übertragung in die Spitze ein.
  3. Unter der laminaren Flusshaube bereiten Sie die Platte vor, indem Sie 400 μL Medium und einen Einsatz in jedes Bohrloch legen (Abbildung 2E,E'). Das Medium befindet sich außerhalb des Inserts, und die Membran des Inserts wird undurchsichtig, sobald sie vom Medium eingeweicht wird.
  4. Für die Kultur mit 24-stündiger Dox-Behandlung bereiten Sie ein Medium mit einer Konzentration von 0,1 mg/mL frisch vor, indem Sie den Dox-Bestand (10 mg/mL) mit dem Medium verdünnen.
    HINWEIS: Medien, die Dox enthalten, sollten gemäß den Richtlinien der institutionellen Ausschüsse für Biosicherheit sowie Umwelt, Gesundheit und Sicherheit ordnungsgemäß entsorgt werden.
  5. Unter einem Stereoskop werden bis zu drei Eierstöcke mit einer 1-mL-Pipette in ein Insert übertragen (Abbildung 2F,G). Minimiere die Menge des in den Insert übertragenen Medien und entferne überschüssige Medien sofort nach dem Transfer. Sobald die Eierstöcke vorsichtig in den Einsatz gelegt sind, verwenden Sie eine 200-μL-Pipette, um etwa 200 μL Medium vom Brunnen in den Einsatz zu übertragen, und stellen Sie sicher, dass die Membran vollständig von dem Medium bedeckt ist. Übertragen Sie das Medium zurück in den Brunnen und zentrieren Sie die Eierstöcke auf der Membran. Füllen Sie die Pipettenspitze mit Kulturmedium, um zu verhindern, dass der Eierstock beim Zentrieren in die Spitze eingesogen wird. Achten Sie darauf, ausreichend Abstand zwischen den Eierstöcken zu lassen und sie auf dem Membraneinsatz stabilisiert zu werden (Abbildung 2H), anstatt im Medium zu bleiben (Abbildung 2I). Achte darauf, die Eierstöcke und die Membran nicht zu stechen.
  6. In einer 5-Tage-Kultur wird das Medium alle zwei Tage gewechselt, indem 200 μL Medium (die Hälfte der Gesamtmenge) aus dem Brunnen entfernt und 200 μL frisches Kulturmedium wieder in den Brunnen gegeben werden (Abbildung 2J).
  7. Für die Kultur mit 24-stündiger Arzneimittelbehandlung wird der Einsatz mit den Eierstöcken nach den ersten 24 Stunden in einen neuen Brunnen mit 400 μL frischem Kulturmedium übertragen, wobei folgende Schritte verwendet werden:
    1. Entfernen Sie den Einsatz mit den Eierstöcken aus dem Brunnen mit einer Pinzette.
    2. Spülen Sie den Boden des Einsatzes kurz ab, indem Sie ihn in eine 60-mm-Schale mit frischem Kulturmedium tauchen.
    3. Klopfen Sie vorsichtig mit dem Boden des Einsatzes auf eine leere 60-mm-Schüssel, um überschüssiges Material vom Einsatz zu entfernen. Lege das Insert zusammen mit frischem Kulturmedium in den Brunnen.
      HINWEIS: Entfernen Sie überschüssige Medien aus dem Einsatz, um sicherzustellen, dass die Eierstöcke auf der Membran stabilisiert sind, unmittelbar nach dem Wechsel des Mediums oder dem Überlegen des Einsatzes.

3. Fixierung und Ganzmontage-Immunfärbung

  1. Um die kultivierten Eierstöcke zu fixieren, nehmen Sie den Einsatz mit einer Pinzette von der Platte und legen Sie ihn in eine 60 mm große Petrischale mit 5 ml DPBS. Übertragen Sie etwa 100 μL DPBS neben die Eierstöcke und setzen Sie sie mit einer 1-mL-Pipette wieder auf.
  2. Mit einer 1-mL-Pipette werden die Eierstöcke vom Einsatz in ein 1,5-mL Eppendorf-Rohr übertragen. Entfernen Sie DPBS aus dem Röhrchen und fügen Sie 500 μL 4% Paraformaldehyd hinzu. Fixiere die Eierstöcke auf 4°C für 2 Stunden.
    HINWEIS: Das Ende der Pipettenspitze muss möglicherweise weiter abgeschnitten werden, um Schäden am Gewebe zu verhindern, falls die Eierstöcke zu groß sind, um hindurchzugehen.
  3. Waschen Sie die fixierten Eierstöcke in 1 ml PBST2 (PBS, 0,1 % Tween [v/v], 0,5 % Triton [v/v])) mindestens dreimal, jeweils 1 H auf einem rotierenden Shaker. Es wird empfohlen, das Gewebe über Nacht (12–16 Stunden) in PBST2 bei 4 °C zu lassen, um die Antikörperpenetration zu verbessern.
    HINWEIS: Dies kann ein Zwischenstopp sein; das Gewebe kann bis zu drei Tage vor der primären Antikörperinkubation in PBST2 gelagert werden.
  4. Inkubieren Sie die Eierstöcke mit Anti-Deadbox-Helikase 4 (DDX4) in 100 μL Antikörper-Verdünnungspuffer (1 % BSA [w/v], 10 % Donkey Serum [v/v], 0,1 M Glycin, 0,1 % Tween und 0,5 % Triton in PBS) bei einer Verdünnung von 1/400 (2,3 μg/mL) bei 4 °C für 12–16 Stunden.
  5. Am nächsten Tag entferne ich den primären Antikörper und gib 1 ml PBST2 in die Tube. Waschen Sie das Gewebe mindestens dreimal, jeweils 1 Stunde auf einem rotierenden Shaker.
    HINWEIS: Dies kann ein Zwischenstopp sein; das Gewebe kann bis zu drei Tage nach der primären Antikörperinkubation in PBST2 verbleiben.
  6. Verdünnen Sie den sekundären Antikörper-Antikörper-Antikaninchen-Anti-Rabbit AF488 bei 1/500 Verdünnung (1,5 μg/mL) in PBST2. Inkubieren Sie das Gewebe mit mindestens 100 μL des verdünnten sekundären Antikörpers bei 4 °C für 12–16 Stunden.
  7. Am nächsten Tag sollten Sie die Gewebe mindestens dreimal in PBST2 ausgiebig waschen, jeweils 1 Stunde auf einem rotierenden Shaker. Es wird empfohlen, die Taschentücher bis zu 8 Stunden zu waschen, um den Hintergrund zu reduzieren. Achten Sie darauf, die Schläuche mit Folie abzudecken, um sie vor Licht zu schützen, wenn dieser Schritt vorwärts kommt.
  8. Entfernen Sie PBST2 und geben Sie 100 μL DAPI bei einer Verdünnung von 1/1000 (1 μg/mL) in PBS in die Röhre. Inkubiere die Gewebe in DAPI 30 Minuten bei Zimmertemperatur.
  9. Waschen Sie die Eierstöcke in PBST2 einmal für 30 Minuten und montieren Sie sie mit einem Bildabstand auf einem mikroskopischen Objektträger. Übertragen Sie die Eierstöcke mit einer 1-ml-Pipette in die Mitte des Abstandshalters und entfernen Sie überschüssiges PBST2. Fügen Sie etwa 5 μL des Antifade-Montagemediums hinzu und setzen Sie einen Mikroskopverschluss oben auf den Abstandshalter. Versiegeln Sie die Ränder des Abstandshalters mit klarem Nagellack für eine längere Aufbewahrung.
    HINWEIS: Bevor Sie die Objektträger fotografieren, stellen Sie sicher, dass der Nagellack vollständig trocken ist und kein Befestigungsmedium außen am Deckdeckel liegt. Diese Reagenzien können die Ziele des Mikroskops beschädigen. Vermeiden Sie außerdem übermäßige Montagemedien, da die Eierstöcke während der Bildgebung stationär bleiben müssen.
  10. Bilde die Eierstöcke mit einem konfokalen Mikroskop bei 10-facher Vergrößerung und einer Z-Schritt-Größe von 10 μm. Einstellungen anpassen und mit der Z-Kompensation (Anregungsverstärkung) den gesamten Eierstock abbilden. Dies kann mit den folgenden Schritten durchgeführt werden:
    1. Passen Sie die Anregungsleistung und den Detektorverstärkung an, indem Sie die Signalsättigung mit dem Histogramm überwachen, da diese je nach Gewebe variieren kann. Beginne mit niedriger Laserleistung und erhöhe bei Bedarf schrittweise.
    2. Für die Abbildung tieferer Bereiche aktivieren Sie die Z-Kompensation für den Verstärkungsdetektor, da die Signalintensität mit der Tiefe abnehmen kann. Verwenden Sie einen Frame-Mittelwert von mindestens 10 und aktivieren Sie bidirektionales X-Scannen mit einer Geschwindigkeit von 600 Hz.
      HINWEIS: Mit diesen Einstellungen sollte die Bildgebung 10 Minuten pro Eierstock (~200 μm) nicht überschreiten. Die ganzmontierte immunfluoreszierende Färbung der Eierstöcke mit Anti-DDX4 ist typischerweise robust und bleicht selten.

4. Follikelquantifizierung

  1. Um die Follikel in jedem Eierstock zu quantifizieren, öffnen Sie die Bilder mit der Software ImageJ. Beim Öffnen stellen Sie sicher, dass der Farbmodus als koloriert ausgewählt ist und dass Split-Kanäle im Kästchen unter " In separate Fenster aufgeteilt" markiert ist. Wählen Sie das gewünschte Bild aus und verwenden Sie dann das Bild-/Transformations-/Drehwerkzeug , um den Eierstock symmetrisch im Bild zu platzieren.
    HINWEIS: Die von Konfokal aufgenommenen Bilder können in 3D mit der Imaris-Software (Abbildung 3A, B) oder der ImageJ-Software16 angesehen und analysiert werden.
  2. Verwenden Sie das Analyse-/Werkzeug-/Gitter-Werkzeug , um den Eierstock in Gitter zu unterteilen (Abbildung 3C, C').
  3. Verwenden Sie das Plugins-/Analyse-/Zellzähler-Tool , um alle Raster zu markieren, die den Eierstock bedecken (Abbildung 3D, D, Raster mit 4 markiert). Von diesen Gittern markieren Sie jedes zweite Gitter in jeder Zeile zur Follikelquantifizierung (Abbildung 3E,E', Gitter mit 8 markiert). Gitter am Rand des Eierstocks mit weniger als 10 Eierzellen werden für die Follikelquantifizierung nicht berücksichtigt.
    HINWEIS: Initialisieren Sie den Zellzähler und wählen Sie die Zählertypen aus, die Sie für leicht lesbar halten.
  4. Oocyten können durch das Vorhandensein einer DDX4-positiven ringförmigen Struktur identifiziert werden, die einen Kern umgibt, der positiv für DAPI ist. Primordiale Follikel besitzen Oocyten mit einer Größe von etwa 20 μm im Durchmesser, umgeben von plattenepitlemen somatischen Zellen. Sich entwickelnde Follikel besitzen Oocyten, die größer als 25 μm im Durchmesser sind und von einer oder mehreren Schichten kuboidaler Granulosenzellen umgeben sind (ergänzende Abbildung 1).
  5. Zähle die Primordialfollikel in jedem markierten Gitter (wie in Abbildung 3E,E' mit Zähler Typ 8 zu sehen). Gehen Sie die Follikel mit optischen Abschnitten/Stapeln im Raster durch und markieren Sie sie mit dem Werkzeug zum Zellzähler. Achten Sie darauf, die primordialen Follikel an zwei aufeinanderfolgenden optischen Abschnitten/Stacks nicht doppelt zu zählen. Zähle die sich entwickelnden Follikel in allen Rastern, die mit Zähler Typ 4 markiert sind.
    HINWEIS: Nutzen Sie die Zoom-Option , um die Eizellen durch die Stapel zu visualisieren und zu zählen.
  6. Berechnen Sie die Anzahl der Urfollikel im gesamten Eierstock (nf), indem Sie die durchschnittliche Anzahl der Primordialfollikel pro Gitter (nfgrid) mit der Anzahl der Gitter des Eierstocks multiplizieren (ngrids). nf = nf gitter × ngrids.
    HINWEIS: Statistische Analysen wurden durchgeführt und Diagramme wurden mit der Prism 10.2.0-Software (GraphPad Software, Version 10, Inc., CA) erstellt. Unterschiede zwischen den Gruppen wurden mittels Einweg-Varianzanalyse (ANOVA) bewertet, gefolgt vom Tukey-Mehrfachvergleichstest. Die statistische Signifikanz wurde bei p < 0,05 betrachtet. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardfehler (SE) dargestellt.

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Ergebnisse

In diesem Artikel demonstrieren wir die Methoden der neonatalen Ovarialkultur, der Ganzmontage-Antikörperfärbung, der konfokalen Bildgebung und der Follikelquantifizierung, um zu beurteilen, ob die Anzahl und Position der Eierstöcke im Einsatz während der Kultur das experimentelle Ergebnis beeinflussen, insbesondere die Follikelzahlen im Eierstock. Wir kultivierten Eierstöcke mit folgenden Aufbauten: ein, zwei oder drei Eierstöcke pro Einsatz für stabilisierte Kultur und drei Eierstöcke pro Einsatz für die schwimmende Ku...

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Diskussion

In dieser Studie demonstrierten wir Methoden zur neonatalen Maus-Ovarialkultur und zur Quantifizierung ganzer Ovarialfollikels. Der Kulturansatz kann primordiale und früh entwickelnde Follikel in vitro erhalten. Die Quantifizierungsmethode der Ganzmontage-Follikel erfordert minimale Gewebeverarbeitung, was Zeit spart und die Gewebeintegrität bewahrt, wodurch eine genaue Follikelquantifizierung gewährleistet ist.

Die Anzahl der in der Kontrollgruppe beobachtete...

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Offenlegungen

Es gibt keine Interessenkonflikte, die offengelegt werden müssen.

Danksagungen

Die in dieser Publikation berichtete Forschung wurde vom National Institute of General Medical Sciences der National Institutes of Health unter der Award Number R35GM158131 unterstützt. Die EADM wurde von der Lalor Foundation unterstützt. Die Autoren danken der University of Missouri Advanced Light Microscopy Core für ihre Unterstützung und Unterstützung bei dieser Arbeit

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
24-Well-ZellkulturplattenFisher scientific 09-761-146 
Alexa Fluor 488 Esel-Anti-KaninchenJackson ImmunoResearch Laboratories711-546-152
Anti-Anti (100X)Gibco15240-062
Rinderserum-AlbuminSigma-AldrichA1470-25G
CD-1 IGS MausCharles River Laboratories 022Mäuse
Zellkultur-EinsätzeMilliporePICM01250
Comfort Point Insulinspritze mit Nadel 1cc 28G x 1/2Exel26027
DAPIThermowissenschaftlich62248
DDX4 Rabbit mAbabcamab13840
DMEM/F12 (1:1) (1X)Gibco11320-033
Doxorubicinhydrochlorid Sigma-AldrichPHR1789
DPBS (1X)Gibco14190-144
Fetales RinderserumSigma-AldrichF0926-500ML
Fiji-ImageJNIH, USA (https://imagej.net/ij/)ImageJ 1,52p
Fisherbrand Nutating Mixer – Variable GeschwindigkeitFisher scientific 88-861-043Shaker
Follikelstimulierendes HormonSigma-AldrichF4021-10UG
Forma Steri-Zyklus i160Thermowissenschaft und Handel;i160CO2-Inkubator
GlycinFisher scientific BP381-500
Imaris Oxford Instruments (https://imaris.oxinst.com/)Imaris 10.2
Leica TCS SP8Leica MicrosystemsSN 8100001409Konfokal
Normales EselserumJackson ImmunoResearch Laboratories017-000-121
Olympus SZ61Olympus-MikroskopeSZ61Stereoskop
Paraformaldehyd Fisher scientific 15714
SecureSeal-BildabstandshalterGrace Bio-Labs654002
Triton X-100Sigma-AldrichX100-500ML
ZZEHN 20Sigma-AldrichP1379-500ML
VECTASHIELD Antifade-MontagemediumVektorlaboreH-1000

Referenzen

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