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Einzelplatten-Durchläufe von Mito-Stress- und Glykolyse-Belastungstests mit haftenden oder nicht-adhärenten Zellen

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DOI:

10.3791/69504

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22. Mai 2026

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1Department of Biochemistry, Cancer Biology, Neuroscience and Pharmacology, School of Medicine, Meharry Medical College, 2Department of Biomedical Sciences, School of Graduate Studies, Meharry Medical College, 3Host-Tumor Interactions Research Program, Vanderbilt-Ingram Comprehensive Cancer Center, Vanderbilt University School of Medicine, 4Vanderbilt Institute for Infection, Immunology and Inflammation, Vanderbilt University School of Medicine

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Diese Studie präsentiert optimierte Protokolle zur gleichzeitigen Durchführung von Echtzeit-Stoffwechselanalysen von Mito-Stress- und Glykolyse-Stresstests auf derselben Platte. Die Verfahren sind sowohl auf adhärente (BMDMs) als auch auf nichtadhärente (Lymphozyten) Zellen zugeschnitten und ermöglichen eine genaue, reproduzierbare und parallele Beurteilung der mitochondrialen und glykolytischen Funktion der interessierten Zellen.

Zusammenfassung

Die Echtzeit-Stoffwechselanalyse liefert labelfreie Messungen der mitochondrialen Atmung und Glykolyse, was es Forschern ermöglicht, den zellulären Energiestoffwechsel mit Krankheitsmechanismen und therapeutischen Reaktionen in verschiedenen Bereichen zu verknüpfen. Beim Vergleich des Energiestoffwechsels zwischen verschiedenen Mäusen, anderen Tieren, Menschen oder Zellen unter unterschiedlichen Behandlungen ist es entscheidend, innerhalb eines einzigen Durchgangs Messungen durchzuführen, um genaue und zuverlässige Ergebnisse sicherzustellen. Darüber hinaus muss das experimentelle Design den analysierten Zelltyp berücksichtigen, zum Beispiel ob er adhärent ist, wie Knochenmark-abgeleitete Makrophagen (BMDMs), oder nicht-adhärent wie Lymphozyten. Daher wurde ein Protokoll entwickelt, das die gleichzeitige Durchführung von Mito-Stress- und Glykolyse-Stresstests auf derselben Platte ermöglicht, obwohl die Tests unterschiedliche Medikamenteninjektionen und Analyseprogramme erfordern. Separate Handhabungsprotokolle wurden für die Analyse sowohl stark adhärenter Zellen (z. B. BMDMs) als auch nicht-adhärenter "schwimmender" Zellen (z. B. T-Zellen und andere Lymphozyten) optimiert. Hier werden detaillierte Protokolle zur effizienten und reproduzierbaren Durchführung dieser Assays präsentiert.

Einleitung

Der Seahorse XF Analyzer ist ein einzigartiges Instrument, das eine Echtzeitmessung der mitochondrialen Atmung und Glykolyse in vielen Zelltypen ermöglicht. Durch die gleichzeitige Quantifizierung der Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) und der extrazellulären Versauerungsrate (ECAR) ermöglicht diese Technologie eine präzise Analyse bioenergetischer Bahnen unter physiologischen oder Stressbedingungen. Ihre Vielseitigkeit hat sie in verschiedenen Forschungsbereichen unentbehrlich gemacht, darunter Krebs1, Neurowissenschaften2, Immunologie3, Alterung3, 4, 5 und Arzneimittelforschung6, wo die metabolische Umprogrammierung ein Markenzeichen für Krankheitsprogression und therapeutische Reaktion ist. Durch die Verknüpfung funktioneller Bioenergetik mit zellulären Phänotypen 7,8 bietet die Analyse eine leistungsstarke Plattform, um Mechanismen aufzudecken, metabolische Verwundbarkeiten zu identifizieren und die Auswirkungen genetischer oder pharmakologischer Interventionen zu bewerten.

In vielen Disziplinen ist der Vergleich der unmittelbaren Wirkungen von Medikamenten, kleinen Molekülen, Zytokinen oder natürlichen Verbindungen auf den zellulären Stoffwechsel am besten unter identischen experimentellen Bedingungen – derselben Platte, derselben Inkubationszeit, Umweltparameter und Tageszeit. Dementsprechend besteht dieser Ansatz darin, Zellen mit unterschiedlichen Behandlungen oder genetischen Hintergründen auf derselben Platte zu platten und mehrere metabolische Parameter gleichzeitig zu analysieren. Diese Strategie gewährleistet den genauesten Vergleich von arzneimittel- oder genetisch bedingten Veränderungen im zellulären Energiestoffwechsel.

Viele Zelltypen verhalten sich in der Kultur unterschiedlich. Lymphozyten bleiben in der Suspension und haften nie an der Platte9, Makrophagen haften stark, was ihre Übertragung erschwert, und Krebszellen vermehren sich schnell, aber je nach Linie unterschiedlich. Diese Unterschiede stellen Herausforderungen für die Echtzeit-Stoffwechselanalyse dar; Daher erfordert jeder Zelltyp im Experiment ein maßgeschneidertes Protokoll.

Dieser Artikel bietet Schritt-für-Schritt-Protokolle zur Durchführung dieser Assays mittels Echtzeit-Stoffwechselanalysen, um Effizienz und Reproduzierbarkeit sicherzustellen. Diese Protokolle können auf alle auf dem Markt verfügbaren Versionen von Analysatoren angewendet werden.

Protokoll

Mäuse wurden gemäß den Verfahren des Protokolls der National Institutes of Health and Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) am Meharry Medical College behandelt. Diese Institution ist von der Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International akkreditiert und entspricht der Richtlinie des Public Health Service für die Behandlung und Nutzung von Labortieren unter krankheitserregerfreien Bedingungen. Die Details der Reagenzien und der verwendeten Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Optimierung der Zelldichte

HINWEIS: Jeder Zelltyp weist einzigartige metabolische Eigenschaften und erhebliche Größenunterschiede auf. Beide Faktoren sind entscheidend, um die passende Anzahl von Zellen pro Bohrloch zu bestimmen, um optimale Ergebnisse zu erzielen. Bevor ein erster experimenteller Test durchgeführt wird, bereiten Sie eine Testplatte vor und führen Sie sie durch, bei der die ausgewählten Zellen, die in unterschiedlichen Dichten verschichtet sind.

  1. Für adhärente Zellen (z. B. Krebszellen) wird die Samendichte zwischen 20.000 und 100.000 Zellen pro Brunnen getestet. Bei hochmetabolischen und/oder großen Zellen (z. B. menschlichen Krebszellen oder Fibroblasten) beginnt die Dichteoptimierung bei 10.000 Zellen oder weniger pro Brunnen.
  2. Für nicht-haftende Zellen (z. B. Lymphozyten) wird die Aussaatdichte im Bereich von 100.000–500.000 Zellen pro Bohrloch optimiert. Für alle Zelltypen sollte man eine einheitliche Einzelzell-Monoschicht anstreben, um optimale Ergebnisse zu erzielen (siehe Abbildung 1 zum Beispiel die Plattenanordnung der Proben).
  3. Führe den Mito-Stress-Assay durch (wie unten). Daten aus diesem vorläufigen Test können verwendet werden, um die optimale Zelldichte für das Hauptexperiment zu bestimmen. Wählen Sie die Dichte, die den größten Unterschied zwischen den Assay-Bedingungen zeigt.
    HINWEIS: Dieses Protokoll gilt nicht für die Analyse von 3D-Proben (z. B. Zellsphäroide, Organoide). Sie kann jedoch modifiziert werden, um die Probendicke und die unebene Oberfläche zu berücksichtigen.

2. Vorbereitung auf den Assay

  1. Am Tag vor dem Durchführen des Tests heben Sie die Sensorpatrone vorsichtig aus der Versorgungsplatte und geben Sie 200 μL RNAase/DNAse-freies Wasser in jede Öffnung der Versorgungsplatte und lassen Sie die Sensorpatrone in die Nutzplatte hinein, bis die Sensoren vollständig unter Wasser sind.
    HINWEIS: Der Wasserstand muss hoch genug sein, um sicherzustellen, dass die Sensoren über Nacht vollständig untergetaucht sind, da die Fluorophore der Sensorpatrone nicht funktionieren, wenn sie nicht ausreichend hydriert sind. Wenn man einen XF Hydrobooster verwendet, um die Kartusche zu hydratisieren, kann die Kartusche direkt in Kaliberlösung gegeben und der Wasserhydrationsschritt ausgeschlossen werden.
  2. Stellen Sie die hydratisierte Sensorkartusche/Utility-Platte über Nacht in einen 37 °CCO2-freien Brutkasten. Um eine Verdunstung von der Platte zu verhindern, sollten Sie außerdem einen Behälter mit doppelt destilliertem Wasser in den Inkubator legen.
  3. Am Tag des Tests entferne die Sensorkartusche/Utility-Platte aus demCO-2-freien Inkubator und entferne vorsichtig die Sensorkartusche von der Utility-Platte, wobei du die Patronensensorseite nach oben auf die Bank legst.
  4. Entsorge das Wasser von der Versorgungsplatte und schüttle alle losen Tröpfchen trocken und gib jedem Brunnen 200 μL XF Calibrant-Lösung hinzu.
  5. Setzen Sie die Sensorkartusche vorsichtig zurück in die Versorgungsplatte, sodass die Sensoren vollständig in Kaliberlösung eingetaucht sind, und setzen Sie sie zurück in den 37 °CCO2-freien Brutkasten.

3. Vorbereitung des Assay-Mediums

  1. Medienvorbereitung für Mito Stress:
    1. In einem 50-mL-Rohr fügen Sie Folgendes zu 45 mL XF-RPMI-Medium hinzu: 500 μL 100x Natriumpyruvat (Endkonzentration: 1 mM), 500 μL 100x L-Glutamin (Endkonzentration: 2 mM) und 550 μL 45% Glukoselösung (Endkonzentration: 25 mM)
  2. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,4 ein. Lade mit XF RPMI Medium auf eine Endlautstärke von 50 mL auf. Bewahren Sie das vorbereitete Medium vor der Verwendung in einem 37 °C Wasserbad oder Trockenbad auf.
  3. Glycolyse-Testmedien-Vorbereitung:
    1. In einer 50-mL-Röhre geben Sie 250 μL 100x L-Glutamin zu 45 mL XF RPM-Medium.
  4. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,4 ein und füllen Sie dann mit XF RPMI Medium auf ein Endvolumen von 50 mL auf. Bewahren Sie das zubereitete Medium vor der Verwendung in einem 37 °C starken Wasser oder einem trockenen Bad auf.
    HINWEIS: Der pH-Wert sowohl des Mito-Stress- als auch des Glycolyse-Testmediums muss nach der Zugabe von Nahrungsergänzungsmitteln, die den pH-Wert verändern, wieder auf 7,4 eingestellt werden, da selbst kleine Abweichungen die Testergebnisse erheblich beeinflussen können.

4. Zellreinigung und Veränderung von Medien vor der Analyse

HINWEIS: Der Waschschritt der XFe96/XF Pro Cell Culture Microplates variiert je nach Verwendung von adhärenten oder nicht-adhärenten Zelltypen. Bitte siehe Schritt 9, Adhärent (Krebszellen, primäre BMDM-Zellen) und nicht-adhärente Zellen (T-Zellen und andere Lymphozyten), um die beste Waschmethode für den verwendeten Zelltyp zu bestimmen.

  1. Entfernen Sie 160–180 μL Wachstumsmedium aus jedem Bohrloch mit einem Multipipettor und arbeiten Sie jeweils eine Reihe oder Säule, um das Austrocknen der Zellen zu verhindern. Vermeiden Sie es, den Boden der Brunnen zu berühren.
  2. Mit einem einspitzigen Pipetman werden die restlichen 20–30 μL aus den Brunnen entfernt und dabei die Zellschicht am Boden des Brunnens nicht berührt.
  3. Fügen Sie jedem Bohrloch 180 μL Glykolyse- oder Mito-Stress-Assay-Medien (siehe Schritt 3) hinzu, entsprechend dem Layout in Abbildung 1. Um die Zellschicht nicht zu stören, geben Sie das Medium vorsichtig entlang der Seitenwand jedes Brunnens ab, bis alle Brunnen gefüllt sind. Beide Assays befinden sich auf derselben Platte.
    HINWEIS: Die Bohrungen, die keine Zellen und Kontrollbrunnen enthalten, müssen ebenfalls mit Prüfmitteln gefüllt werden.
  4. Setzen Sie die Mikroplatte für 40–45 Minuten vor Beginn des Tests in einen 37 °CCO2-freien Brutkasten und beginnen Sie mit der Vorbereitung der Medikamente.

5. Medikamentenvorbereitung und Laden der Patrone

VORSICHT: Einige Medikamente (FCCP, Antimycin A/ Rotenon, Oligomycin) sind gefährlich und sollten mit Vorsicht behandelt werden. Geeignete Maßnahmen sind erforderlich, um das Personal zu schützen; dazu gehören die Verwendung von Handschuhen und anderer persönlicher Schutzausrüstung (PSA) sowie die Entsorgung von Materialien in einem von der Institution zugelassenen chemischen Abfallbehälter oder -behälter.

HINWEIS: Die optimale FCCP/Oligomycin-Konzentration ist zelltypabhängig und vor dem Test empirisch getitriert, wenn mit besonders empfindlichen Zellen gearbeitet wird. Die Endkonzentrationen können je nach Zelltyp variieren. Bereiten Sie Medikamente und Testmedien am Tag der Anwendung frisch vor. Nicht einfrieren oder wiederverwenden. Die Vorbereitung des Assay-Medikaments kann innerhalb dieser 45-minütigen Zeit abgeschlossen werden, um optimale Ergebnisse zu erzielen.

  1. Mit dem vorgewärmten Mito-Stress- und Glykolyse-Assay-Medien aus Schritt 3 werden die Verbindungen gemäß Tabelle 1 und/oder Tabelle 2 auf die für jeden Zelltyp geeigneten Konzentrationen verdünnt. Bereite jede Verbindung in einem separaten 15-mL-Rohr vor (bei Verwendung aller sechs Verbindungen werden sechs Röhren benötigt).
  2. Entfernen Sie die Sensorpatrone/Utilitätsplatte vom 37 °CCO2-losen Inkubator und entfernen Sie den Deckel, wobei Sie vorsichtig die mit dem Kit mitgelieferte XF-Ladeführung sowie die XF-Ladeführung mit dem Einspritzeranschluss (Führung A für Port A) sicher über der Oberseite der Sensorpatrone anbringen (siehe Abbildung 2).
  3. Verwenden Sie für jedes Medikament einen Mehrkanalpipettor und ein Reagenzienreservoir und fügen Sie langsam das benötigte Volumen an den entsprechenden Port hinzu (siehe Tabelle 1 und Tabelle 2 für das Volumen). Halten Sie den Pipettor beim Laden der Medikamente strikt aufrecht (siehe Abbildung 2).
  4. Wechseln oder wiederverwenden, nachdem Sie die Ladeanleitung bei Bedarf gründlich gespült und getrocknet haben (Port A, B, C und D) und nach jeder Ladung die Pipettenspitzen entsorgen.
    HINWEIS: Die Pipettenspitzen sollen fest im Führungsschacht sitzen, aber nicht zu fest, da die Pipettenspitzen in der Führung stecken bleiben können! Es wird empfohlen, die Pipettenspitzen/Pipettoren, die an den Führungen verwendet werden, vor dem Laden der Verbindungen zu testen, um ein falsches Laden der Proben zu vermeiden.
  5. Nachdem alle Verbindungen in die jeweiligen Anschlüsse geladen wurden, entferne die Führung, vergewissere visuell, dass alle Anschlüsse gefüllt sind, und sichere die Patrone mit ihrem Deckel. Die Medikamente sollten dem Test in jedem Teil derselben Platte entsprechen (Abbildung 1).
    HINWEIS: Die endgültigen Brunnenkonzentrationen für Mito-Stress sind 1 μM Oligomycin, 1 μM FCCP und 0,5 μM Rotenon/Antimycin; für Glykolyse: 10 mM Glukose, 1 μM Oligomycin und 50 mM 2-DG.

6. Einrichtung des Seahorse XFe96 Analyzers

  1. Schalten Sie den Analysator ein und öffnen Sie die WAVE-Software (siehe Abbildung 3).
  2. Wählen Sie XF Mito Stresstest.
    HINWEIS: Solange das geeignete Prüfmedium und die entsprechenden Verbindungen verwendet werden, kann der Analysator gleichzeitig mitochondriale und glykolyseartige Tests auf derselben Platte mit dem XF Mito Stress Test durchführen.
  3. Wählen Sie die Anzahl der 'Gruppen' basierend auf der Plattenanordnung aus und beschriften Sie jede Gruppe. Fahren Sie zum nächsten Tab fort, um Bohrlöcher für die Plattenkarte zuzuweisen (siehe Abbildung 3). Beide Assays werden auf derselben Platte durchgeführt.
  4. Markiere die Brunnen für jede Gruppe basierend darauf, wie die Platte geladen ist.
  5. Passe das Programm je nach Zelltyp und experimentellem Zweck an. Wenn das Setup beispielsweise eine voraktivierte Gruppe vor der Analyse enthält oder während des Laufs ein Aktivator hinzugefügt wird, verlängern Sie die Inkubationszeit in jedem Zyklus, um eine Aktivierung zu ermöglichen.
  6. Wählen Sie den nächsten Tab, 'Assay durchführen', und füllen Sie die Informationen nach Bedarf ein, um die Datendatei zu speichern.
  7. Füllen Sie die vorhydrierte Kartusche mit Medikamenten (ab Schritt 5) in die Maschine, wenn es zur Initialisierung vorgesehen ist. Der Initialisierungsschritt zeigt an, ob die Sensoren ausreichend hydriert und funktionsfähig sind.
  8. Starten Sie den Assay und laden und entladen Sie die Platten wie in den Eingabeaufforderungen während des Programms angegeben.
    HINWEIS: Wenn du die Kartusche oder Mikroplatte in den Analysator einlegst, achte darauf, dass alle Deckel entfernt sind! Während einige Analysator-Modelle eine Sicherheitsfunktion haben, die Deckel erkennen kann, haben frühere Modelle das nicht. Dies kann die Maschine beschädigen, wenn der Deckel während eines Plattenlaufs intakt bleibt.

7. Normalisierungsmethoden: (SRB) und Kernzählung (DAPI-Färbung und Bildgebung)

VORSICHT: Einige Reagenzien im SRB-Testkit sind ätzend und verbrennen, wenn sie mit Haut in Kontakt kommen. DAPI kann eine allergische Hautreaktion auslösen. Die Verwendung von Handschuhen und anderer PSA wird empfohlen, ebenso wie die Entsorgung von Materialien in einem von der Institution zugelassenen chemischen Abfallbehälter oder -behälter.

HINWEIS: Wählen Sie die Normalisierungsmethode basierend auf den Eigenschaften und Vorbehandlungen der analysierten Zellen. Beide Methoden sind geeignet, um Zellen mit unterschiedlichen Proliferationsraten zu vergleichen, da beide solche Variationen berücksichtigen. Wenn jedoch medikamentöse Behandlungen die Seneszenz induzieren, die Proliferation stoppen und gleichzeitig die Zellgröße erhöhen, ist die DAPI-Färbung der bevorzugte Normalisierungsansatz. DAPI ist möglicherweise nicht für Zelltypen geeignet, bei denen die Kernfärbung schwer sichtbar ist (z. B. Adipozyten, Erythrozyten) oder Zellen multinukleär sind (d. h. Parenchymhepatozyten, Myozyten).

  1. Um die Zellen mit dem SRB-Assay (Sulfohohodamin B Cell Cytoxicity Assay Kit) nach Echtzeit-Stoffwechselanalyse zu normalisieren, entnehmen Sie die Platte aus der Maschine und fügen Sie jedem Bohrloch ein Viertel des Medienvolumens (z. B. 50 μL in 200 μL Kulturmedium) der Fixationslösung hinzu.
    1. Inkubieren Sie bei Zimmertemperatur für 1 Stunde oder über Nacht bei 4 °C.
    2. Entfernen Sie die Lösung und waschen Sie die Brunnen vorsichtig dreimal mit 200 μL RNase/DNase-freiem Wasser, wobei Sie darauf achten, die Zellschicht nicht zu stören. Für die kurzfristige Lagerung (falls nötig) ersetzen Sie die Endwäsche durch PBS und lagern Sie sie bei 4 °C.
    3. Zur sofortigen Normalisierung mit dem SRB-Test entferne die Waschlösung und lass die Platte bei Zimmertemperatur vollständig an der Luft trocknen.
    4. Fügen Sie jedem Brunnen 25 μL SRB-Lösung hinzu und färben Sie 15 Minuten bei Zimmertemperatur im Dunkeln oder wickeln Sie die Platte während der Inkubationszeit in Alufolie.
      HINWEIS: Die SRB-Lösung ist lichtempfindlich, und dieser Teil des Experiments muss in einem Bereich mit wenig Licht durchgeführt werden.
    5. Entferne die Flecklösung und gib 100 μL 1x Waschlösung hinzu, um jeden Brunnen 2–3 Mal zu waschen.
    6. Waschen Sie so schnell wie möglich, um Bleichen zu vermeiden, und entfernen Sie Waschmittel so weit wie möglich durch Vakuumabsaugung.
    7. Gib 100 μL 1x Lösungslösung zu jedem Brunnen und lege die Platte für 10 Minuten bei Raumtemperatur auf einen Shaker.
    8. Messen Sie die optische Dichte (O.D.) bei 565 nm auf einem Plattenleser, um die Bohrlochdichte anhand der Farbsättigung zu bestimmen (siehe Abbildung 3 für visuelle Referenz).
    9. Exportiere die OD-Werte-Daten als Excel-Datei. Diese Tabelle wird zur Normalisierung in die WAVE-Software eingefügt (Schritt 8).
      HINWEIS: Wenn aufgrund von Zellüberlastung intensive Farben (> O.D. 3,5) beobachtet wird, kann eine suboptimale Wellenlänge (z. B. 490–530 nm) verwendet werden, um die Messwerte wieder in den linearen Bereich des Instruments zu senken. Korrigieren Sie den Hintergrund, indem Sie die Überdosis der Kontrollgruppe, die nur das Kulturmedium (Hintergrundkontrollbrunnen) enthält, von allen Probenwerten abzieht.
  2. Für die DAPI-Färbung verdünne die DAPI-Serienlösung auf 300 nM in 1x PBS.
    1. Wasche jede Öffnung der Zellplatte dreimal vorsichtig mit 200 μL 1x PBS.
      HINWEIS: Wenn nicht haftende Zellen vorhanden sind, zentrifugiere die Platte bei 200 x g für 3 Minuten ohne Bremsen, um sicherzustellen, dass die Zellen nach jedem Waschschritt am Boden jedes Bohrlochs suspendiert sind.
    2. Zellen in 2%–4% PFA fixieren, verdünnt in 1x PBS für 10–15 Minuten bei Raumtemperatur.
    3. Wasche jede Öffnung der Zellplatte dreimal vorsichtig mit 200 μL 1x PBS.
    4. Fügen Sie jeder etwa 150 μL dieser verdünnten DAPI-Färbelösung hinzu, um sicherzustellen, dass die Zellen in jedem Brunnen vollständig bedeckt sind.
    5. Inkubieren Sie 1–5 Minuten bei Raumtemperatur in einem Bereich mit wenig Licht (oder decken Sie die Platte mit Alufolie ab).
    6. Entferne die DAPI-Flecklösung aus jedem Brunnen.
    7. Wasche jede Öffnung der Zellplatte dreimal vorsichtig mit 200 μL 1x PBS.
    8. Entfernen Sie alle verbleibenden PBS.
    9. Bilde die Zellen bei jeder Anregung/Emission zwischen 358–461 nm oder unter einer beliebigen DAPI-Filtereinstellung auf einem Mikroskop.
    10. Exportiere die Emissionswerte als Excel-Datei. Diese Tabelle wird zur Normalisierung in die WAVE-Software eingefügt (Schritt 8).

8. Analyse und Normalisierung der Daten

HINWEIS: Für die Datenanalyse können "Wave" oder andere Software verwendet werden. Das bereitgestellte Protokoll ist auf die Wave-Software anwendbar.

  1. Öffnen Sie die Ergebnisse der Analyse in Wave (siehe Abbildung 3). Die Normalisierung erfolgt mit Werten, die aus der Excel-Datei stammen, die vom Mikroplattenleser nach der SRB-Färbung (Schritt 7) erzeugt werden.
  2. Klicken Sie auf "Normalisieren".
  3. Im geöffneten Fenster wählen Sie "alle auswählen" gefolgt von "einfügen", um die Daten einzufügen, die aus der Excel-Tabelle kopiert wurden, die während des Normalisierungsschritts generiert wurden. Klicken Sie auf "Bewerben". Dieses Verfahren normalisierte automatisch alle experimentellen Daten.
  4. Um einen Bericht zu erstellen, klicken Sie im rechten geöffneten Panel auf "XF Cell Mito Stress Test Report Generator". Speichere die generierte Datei. Während der Analyse werden nur die Brunnen ausgewählt, die dem Mito-Stresstest zugewiesen sind (siehe Abbildung 3).
  5. Um einen Bericht zu erstellen, klicken Sie im rechten geöffneten Panel auf "Exportieren" und wählen Sie "XF Cell Glycolysis Stress Test" Report Generator. Speichere die generierte Datei. Während der Analyse wählen Sie nur die Bohrungen aus, die dem Glycolysis Stress Test zugewiesen sind (siehe Abbildung 3).

9. Adhärente vs. nicht-adhärente Zellen

HINWEIS: Adhärente und Nicht-adhärente Zellen unterscheiden sich in ihrem Wachstumsverhalten, Oberflächenbefestigung und Handhabungsanforderungen. Haftende Zellen (z. B. Krebszellen, BMDMs) haften an der Kulturoberfläche, sodass Plattieren und Waschen keine besonderen Vorsichtsmaßnahmen erfordern. Nicht haftende Zellen (z. B. T-Zellen, andere Lymphozyten) bleiben in der Suspension und benötigen unterschiedliche Zentrifugations-, Resuspension- und Beschichtungsmethoden. Das Verständnis dieser Unterschiede ist entscheidend für eine genaue Zellbesetzung, medikamentöse Behandlung und Konsistenz des Assays.

  1. Stellen Sie sicher, dass alle für das Experiment verwendeten Zellen in einem Medium und einem Zellkulturgefäß ihrer Wahl kurz vor dem Assay kultiviert werden, dann auf die Mikroplatte übertragen werden, um den Test durchzuführen.
    HINWEIS: Während XF RPMI Medium für die in diesem Protokoll beschriebenen Zelltypen empfohlen wird, sollten Sie für andere Zelltypen den Hersteller konsultieren, um sicherzustellen, dass das passende Medium verwendet wird.
  2. Für adhärente Zellen (Krebszellen, BMDM-Zellen) werden die Zellen 4–5 Stunden vor dem Test mit optimierter Zelldichte (siehe Schritt 1) im Medienvolumen 200 μL in die XFe96/XF Pro Cell Culture Microplate eingebettet und in einen 37 °C CO2-Inkubator gegeben.
    HINWEIS: BMDM-Zellen können bis zu 24 Stunden vor dem Test plattiert werden, da sie nicht vermehren und die gleiche Zelldichte beibehalten. Bei schnell wachsenden adhärenten Zellen, wie Krebszelllinien, wird empfohlen, am Tag des Tests zu platieren, falls keine weitere Behandlung erforderlich ist, und sie sofort nach der Zellanbindung zu analysieren, um weiteres Zellwachstum zu vermeiden. Wenn dieses Design nicht möglich ist, ist eine Normalisierung auf Proteinmenge/-brunnen oder Kernanzahl/-brunnen ein notwendiger Schritt.
  3. Stellen Sie sicher, dass die Ecköffnungen für alle vier Ecken der Mikroplatte frei von Zellen sind, aber mit Medien gefüllt sind, da dies als Blank-Kontrollbohrlöcher gemessen wird.
  4. Nach 3–5 Stunden Inkubation beobachten Sie die Mikroplatte, um sicherzustellen, dass die Zellen am Boden jedes Brunnens gleichmäßig an der Platte befestigt sind.
  5. Wenn die Zellen noch nicht angebracht sind, kann die Platte für zusätzliche Zeit in den 37 °C CO2-Inkubator gelegt werden, bis die Zellen vollständig befestigt sind.
  6. Anschließend bereiten Sie die Mikroplatte mit haftenden Zellen zum Waschen vor, wie in Schritt 4 erwähnt, um mit dem Test fortzufahren.
  7. Bei nicht anhaftenden Zellen (T-Zellen und andere Lymphozyten) wird die Mikroplatte vor dem Hinzufügen von Zellen zur Platte mit Poly-D-Lysin beschichtet.
    HINWEIS: Während in diesem Protokoll eine Poly-D-Lysin-Beschichtung empfohlen wird, kann je nach Zelltyp eine andere Plattenbeschichtung (z. B. Kollagen, Fibronectin, Gelatine) geeigneter sein. Wenn Sie eine alternative Beschichtung verwenden, befolgen Sie bitte die Anweisung des Herstellers.
  8. Um die Mikroplatte zu beschichten, bereiten Sie 2,5 mL einer 20 μg/mL Poly-D-Lysin-Lösung (50-fache Verdünnung von 1 mg/1 mL Wasserlösung) in 0,1 M Natriumbicarbonat, pH 8,0 (Bicarbonat liefert den optimalen pH-Wert für die Adsorption von Adhesisions) her. Dieser Schritt kann vor dem Assay oder am Tag des Tests durchgeführt werden.
  9. Man sollte 25 μL der Lösung auf jede Bohrung der Platte auftragen und 20–30 Minuten auf der Werkbank oder auf einer Plattenkippe bei Raumtemperatur inkubieren.
  10. Aspirieren oder pipettieren Sie die verbleibende Lösung und waschen Sie jeden Brunnen zweimal mit 200 μL RNAase/DNAse-freiem Wasser.
  11. Warten Sie, bis die Brunnen trocken sind (1–2 Stunden), bevor Sie die Zellen auf die Mikroplatte aussäen.
  12. Anschließend bereiten Sie die Mikroplatte mit nicht haftenden Zellen für den Waschschritt vor, indem Sie die Platte bei 200 x g für 3 Minuten ohne Bremsen zentrifugieren, um sicherzustellen, dass die Zellen am Boden jedes Brunnens suspendiert sind.
  13. Fahren Sie mit Schritt 4 fort und setzen Sie den Rest des Tests wie in den Schritten 5–7 beschrieben fort.

Ergebnisse

Dieses kombinierte Protokoll wurde entwickelt, um beide Tests auf derselben Platte durchzuführen. Beispielsweise wurde diese Methode verwendet, um mGluR1−TCR-Crosstalk-Signale auf die metabolische Kompetenz von CD8+-T-Zellen während der Aktivierung10 zu klären. Dies sollte die Auswirkungen der mGluR1-Hemmung auf den Übergang zur Glykolyse und die Veränderungen der mitochondrialen Atmung bewerten – Prozesse, die für die optimale Funktion der T-Zellen unerlässlich sind – und gleichzeitig die Anzahl der in jedem Experiment verwendeten T-Zellen minimieren. Die gleiche Einzelplattentechnik wurde auch effektiv auf andere Zelltypen angewandt, wie z. B. adhärente Knochenmark-abgeleitete Makrophagen (BMDMs; Abbildung 4 und Abbildung 5), sowie auf nicht anheftende Zellen, wie etwa humane periphere mononukleare Blutzellen (PMBC; Abbildung 3). Es wurde gezeigt, dass die mGluR1-Signalblockade auf aktivierten CD8+-T-Zellen die Energieproduktion der mitochondrialen und nicht-mitochondrialen Zellen beeinflusst. Im Gegensatz dazu zeigten naive Zellen keine signifikanten Veränderungen in ihren metabolischen Energieprofilen (Abbildung 6A, B). Der Mito-Stresstest der aktivierten CD8+-T-Zellen zeigte eine hohe basale und maximale Atmung sowie eine hohe Atemreservekapazität (Abbildung 6C). T-Zellen, die mit CPCCOEt behandelt wurden, einem nicht-kompetitiven Antagonisten, der die nachgeschaltete Signalübertragung bei der Bindung von Glutamat an mGluR1 blockiert, hatten wie die naiven Zellen eine geringere Sauerstoffaufnahme (OCR) und führten zu einer verminderten ATP-Produktion (Abbildung 6C). Der Glykolyse-Test zeigte außerdem, dass nur unbehandelte aktivierte CD8+-T-Zellen ATP über Glykolyse produzierten, und die CPCCOE-Behandlung zeigte eine metabolische Aktivität, die mit der naiven Erkrankung vergleichbar war (Abbildung 6D). Diese Ergebnisse bestätigen, dass die mGluR1-Signalübertragung für die korrekte Funktion der CD8⁺ T-Zellen bei Aktivierung unerlässlich ist.

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Abbildung 1: Diese Abbildung veranschaulicht den Überblick über die Plattenanordnung der Mikroplatte, die den Mito-Stress- und Glykolyse-Assay in derselben Platte umfasst. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 2: Laden der Medikamentenpatrone. (A) Eine detaillierte Karte der Sensoren und Anschlüsse an der Rück- und Vorderseite der Patrone, mit der Beschriftung, welches Medikament in welchen Port geladen werden muss. (B) Die empfohlene Ausrichtung der Führungen oben auf der Kartusche zum Laden der entsprechenden Anschlüsse und die empfohlene Positionierung für die Verwendung des Mehrkanalpipettors über den Führungen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 3: Verwendung des WAVE-Programms, um den Test durchzuführen und zu analysieren. (A) Der Ablauf der Programmeinrichtung umfasst die Auswahl des Assay-Typs, die Zuweisung von Gruppen, das Erstellen der Plattenkarte und die Programmierung der Arzneimittelports. (B) Die Reihenfolge der Medikamente, die in die entsprechenden Ports geladen werden, hängt davon ab, ob die Probe Mito-Stress oder Glykolyse ist. (C) Eine Nahaufnahme der SRB-Färbung während des letzten Normalisierungsschritts. (D) Nach der Normalisierung können die Plattendaten separat als Glykolyse- und Mito-Stresstest für dieselbe Platte exportiert werden. (E) Die Daten für Mito-Stress können ausgewählt werden, indem die aktuelle Auswahl nur für Mito-Stress-Proben bearbeitet wird. (F) Die Daten für Glycolyse können ausgewählt werden, indem die aktuelle Auswahl nur für Glykolyseproben bearbeitet wird. Die in dieser Abbildung verwendeten Beispieldaten stammen aus einer Analyse menschlicher peripherer Blut-Mononuklearzellen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 4: Gleichzeitige Ausführung des Mito-Stress-Laufs auf derselben Platte. Knochenmark-abgeleitete Makrophagen, die von zwei Monate alten WT- und Tusc2-KO-Mäusen stammten, wurden beiden Arten von Analysen unterzogen. Die Zellen wurden entweder unbehandelt (Schein) oder mit LPS (100 ng/mL) für 5 Stunden vor der Plattierung stimuliert (30.000 Zellen/Well). Mito-Stress- und Glykolyse-Stresstests wurden parallel durchgeführt, um einen genauen Vergleich zu ermöglichen, wie in Abbildung 1 gezeigt. (A) Mito-Stressprofile für verschiedene Zelltypen (WT und KO) und Bedingungen (naiv und aktiviert), erzeugt mit Wave-Software. Die Normalisierung erfolgte mittels SRB-Färbung wie in Schritt 7 beschrieben. (B) Vergleichende Balkendiagramme der in jedem Test analysierten Parameter. ∗ ≤ 0,05, ∗∗ ≤ 0,005, T-Test des Schülers. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 5: Gleichzeitige Durchführung von Glycolyse-Stresstests auf derselben Platte. Knochenmark-abgeleitete Makrophagen, die von zwei Monate alten WT- und Tusc2-KO-Mäusen stammten, wurden beiden Arten von Analysen unterzogen. Die Zellen wurden entweder unbehandelt (Schein) oder mit LPS (100 ng/mL) für 5 Stunden vor der Plattierung stimuliert (30.000 Zellen/Well). Mito-Stress- und Glykolyse-Stresstests wurden parallel durchgeführt, um einen genauen Vergleich zu ermöglichen, wie in Abbildung 1 gezeigt. (A) Glykolyse-Stressprofile für verschiedene Zelltypen (WT und KO) und Zustände (naiv und aktiviert), erzeugt mit Wellensoftware. Die Normalisierung erfolgte mittels SRB-Färbung wie in Schritt 7 beschrieben. (B) Vergleichende Balkendiagramme der in jedem Test analysierten Parameter. ∗ ≤ 0,05, ∗∗ ≤ 0,005, T-Test des Schülers. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 6: Mito-Stress- und Glykolyse-Stresstests auf einer einzelnen Platte mit CD8⁺-T-Zellen, die aus Maus-Splenozyten gereinigt wurden. (A) Repräsentative Profile des mitochondrialen Stresstests, die arzneimittelabhängige Veränderungen der Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) von CD8+ T-Zellen vergleichen, durchgeführt mit naiven, aktivierten und aktivierten + mGluR1-Inhibitoren T-Zellgruppen. (B) Repräsentative Profile des Glycolyse-Tests, die arzneimittelabhängige Veränderungen der extrazellulären Versauerungsrate (ECAR) von CD8+ T-Zellen vergleichen, durchgeführt an naiven, aktivierten und aktivierten + mGluR1-Inhibitorgruppen. (C) Balkendiagramme, die quantitative Veränderungen verschiedener Parameter der mitochondrialen Atmung von CD8+ T-Zellen in naiven, aktivierten und aktivierten + mGluR1-Inhibitorgruppen zeigen. Balken stehen für den Mittelwert ± SEM (n = 4). (D) Balkendiagramme, die quantitative Veränderungen verschiedener Glykolyseparameter in naiven, aktivierten und aktivierten + mGluR1-Inhibitoren CD8+ T-Zellen zeigen. Balken repräsentieren den Mittelwert ± SEM (n = 4). ∗ ≤ 0,05, ∗∗ ≤ 0,005, T-Test des Schülers. Diese Abbildung stammt aus Aquino et al.10. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Endbrunnen (μM)Lagerlösungsvolumen (μL)Medienvolumen (uL)10x Port (μM)Volumen am Port hinzugefügt (μL)
Port A Oligomycin0.51502850520
1.545025501520
2.563018902520
Port B FCCP0.12537.52962.51.2522
0.257529252.522
0.51502850522
130027001022
260024002022
Port C Rotenon/Antimycin0.53002700524

Tabelle 1: Zusammengesetzte Vorbereitung zum Laden von XFe96-Sensorpatronen für Mito-Spannung.

Letzter BrunnenLagerlösungsvolumen (μL)Medienvolumen (μL)10x-PortVolumen am Port hinzugefügt (μL)
Portiert A Glukose250 mM100240020
Port B Oligomycin0,5 μM15028505 uM22
1,5 μM450255015 uM22
2,5 μM630189025 uM22
Port C 2-DG50 mM30000500 mM24

Tabelle 2: Compound-Vorbereitung zum Laden von XFe96-Sensorpatronen für Glykolyse.

Diskussion

Das hier vorgestellte Protokoll ermöglicht genaue und zuverlässige Vergleiche von zwei wichtigsten energieproduzierenden Wegen, der oxidativen Phosphorylierung (mitochondriale ATP-Produktion) und der anaeroben Glykolyse (ATP-Produktion außerhalb der Mitochondrien, ohne Sauerstoff), sowie zwei verschiedene Belastungstests innerhalb eines einzigen Durchgangs. Darüber hinaus berücksichtigt das experimentelle Design den zu analysierenden Zelltyp, was ein breiteres Verständnis der Zellstoffwechselanalyse ermöglicht und gleichzeitig die Menge an verwendeten Probeproben und Reagenzien minimiert.

Die Unterschiede zwischen den Mito Stress- und Glycolysis-Stresstests, die auf Echtzeit-Metabolikanalyse-Instrumenten, die von Agilent, Inc. entwickelt und verkauft wurden, durchgeführt werden, sind erheblich. Diese beiden Assays erfordern unterschiedliche Testmedien, spezifische Medikamente und unterschiedliche Instrumentenprogramme. Der Mito Stress Test verwendet Prüfmedien mit Glukose, L-Glutamin und Pyruvat, während der Glycolyse Stress Test glukosefreie Medien verwendet, die nur mit L-Glutamin ergänzt werden. Die Tests werden mit verschiedenen Verbindungen untersucht: Oligomycin → FCCP → Antimycin A + Rotenon für den Mito-Stresstest und Oligomycin → Glukose → 2-DG für den Glycolyse-Stresstest. Daher werden diese Tests normalerweise zu unterschiedlichen Zeiten auf getrennten Platten durchgeführt, da der Echtzeit-Metabolikanalysator jeweils nur eine Platte aufnimmt.

Um diese Einschränkungen zu beheben, wurde ein kombiniertes Protokoll entwickelt, das es ermöglicht, beide Assays auf derselben Platte unter Verwendung des Mito Stress Test-Setups in einem früheren Artikel10 durchzuführen. Empfohlen werden Empfehlungen zur Analyse verschiedener Zelltypen, darunter Immunzellen, Krebszellen, adhärente Zellen und Suspensionszellen. Diese Richtlinien können einzeln oder in Kombination angewendet werden und bieten Flexibilität je nach Zielen und verfügbaren Ressourcen des Experimentators.

Die Normalisierung der Zellen durch SRB Assay oder DAPI ermöglicht ebenfalls mehr Flexibilität, im Fall mehrerer Zelltypen mit unterschiedlichen Wachstumsraten/Größe 9,11. Außerdem erfordert diese Technik nur eine Platte für zwei Assays, sodass sie mit verschiedenen Probentypen kombiniert werden kann, um Stoffwechselprozesse zu messen.

Faktoren, die den Erfolg der Methode beeinflussen: (1) optimale Zellanzahl pro Bohrloch; (2) effiziente Zellbindung; und (3) sorgfältiges Laden der Patrone, da zwei verschiedene Medikamentensets in getrennte Bereiche der Patrone geladen werden müssen.

Wissenschaftliche und experimentelle Vorteile der Methode umfassen den direkten Vergleich innerhalb desselben biologischen Kontexts. Die Verwendung derselben Zellen unter identischen Kulturbedingungen eliminiert die Variabilität zwischen den Platten oder Durchläufen und ermöglicht einen genaueren Vergleich der mitochondrialen und glykolytischen Funktionen in derselben Probe. Es beinhaltet außerdem eine integrierte Sicht auf den zellulären Stoffwechsel. Die parallele Messung sowohl der oxidativen Phosphorylierung (OXPHOS) als auch der Glykolyse liefert einen umfassenden Überblick über den gesamten Energiestoffwechsel einer Zelle und ihre Flexibilität beim Wechseln zwischen den Wegen. Dieser parallele Test verringert auch die biologische Variabilität. Unterschiede in der Zellbeschichtungsdichte, der Anzahl der Durchgänge oder den Umweltbedingungen werden minimiert, da beide Tests an derselben Zellpopulation durchgeführt werden, was zu einer verbesserten Reproduzierbarkeit führt. Die gleichzeitige Durchführung beider Tests verringert die Variabilität von Lauf zu Lauf, die durch Kalibrierung der Sensorpatronen, Temperaturänderungen oder Reagenzienpräparation verursacht wird.

Technische Vorteile dieser Technik sind eine erhöhte Effizienz durch die Kombination von Assays, was Zeit, Reagenzien und Plattenverbrauchsmaterialien spart und sie für großflächige oder hochdurchsatzfähige Studien wichtig macht. Dies ermöglicht geringere Sample-Anforderungen. Es wird nur eine Zellplatte benötigt, was bei der Arbeit mit begrenzten oder seltenen Primärzellen (z. B. Lymphozyten, gehirnabgeleitete Zellen) von Vorteil ist. Eine bessere Normalisierung über Assays hinweg tritt auf, da beide Tests dieselbe Platte verwenden, Normalisierung (z. B. Proteingehalt oder Zellanzahl), und ist konsistenter und zuverlässiger. Mit dieser Konsistenz wird die Datenkorrelation verbessert. Die direkte Paarung mitochondrialer und glykolytischer Parameter aus derselben Probe erleichtert metabolische Profilierung und statistische Analysen.

Die einzige bekannte Einschränkung dieser Technik ist, dass die Kombination zweier Protokolle auf einer einzigen Platte die Anzahl der verfügbaren Brunnenreplikationen reduziert. Es wird empfohlen, die Anzahl der Bedingungen pro Platte zu begrenzen, um mindestens 8 Brunnenreplikationen pro Bedingung sicherzustellen.

Danksagungen

Diese Forschung wurde vom National Institute on Minority Health and Health Disparities (NIMHD) finanziert, Fördernummer 5U54MD007586-37, Pilotprojekt an A. Ivanova; NHGRI Diversity Center for Genome Research Fördermittel UG3HG013248, Forschungsprojekt 2, PI-Ivanova, außerdem wurde einige Unterstützung von Genprex Inc. bereitgestellt.  Darüber hinaus wurde diese Forschung in den Kerneinrichtungen des Meharry Medical College durchgeführt, die durch NIH-Stipendien MD007586, CA163069 und S10RR025497 unterstützt werden.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
15 mL Zentrifugenröhren, mit Schraubverschluss verpackt, steril, 500 Röhren/EinheitGenesee Scientific21-408B
Biologix Pipet Tips-200 μ l Erweitert (Pack, steril)Biologix USASKU 21-0200
BioTek Synergy H1BIOSPX
BZ-X700 FluoreszenzmikroskopSchlüssel
Corning  Costar sterile Einwegreagenz-ReservoirsFisher4873
D-(+)-Glukoselösung 45 % in H20SigmaG9769
DAPI, Hydrochlorid Thermofisher ScientificD1306
Eppendorfer Zentrifuge 5810 REppendorf
GenClone Fetal Bovine Serum Hitze inaktiviertGenesee Scientific25-514H
L-Glutamin 200 mM (100x)Gibco25030-081
Olympus Plastics 22-284, Olympus 1,7 ml Mikroröhren, klar, steril Polypropylen, kochfest, Ster, 50 pro Beutel, 250 Tuben pro EinheitGenesee Scientific22-284
Olympus Plastics 28-108, 50ml konische Zentrifugenröhren, Polypropylen Bulk, steril, 20 Säcke à 25 Röhren, 500 pro EinheitGenesee Scientific28-108
Paraformaldehyd 16% Lösung EM-QualitätElektronenmikroskopie-Wissenschaft15710
Poly-D-Lysinhydrobromid lyophilisiertSigmaP6407
Precision 180 WasserbadPräzisionswissenschaft51221060
Präzisionswissenschaftlicher GCA Modell 26 InkubatorThelco51221091
QBI 120-095-671 Penicillin/Streptomycin-Mischung, 100x Pen/Streptokokken-Mischung, 10 x 10 mL/EinheitGenesee Scientific25-827
QBI PBS, 1x, ohne Ca, Mg, Phenolrot, 0,1 μm steril gefiltertGenesee Scientific25-507B
RPMI 1640, mit L-GlutaminGenesee Scientific25-506
Seahorse XF Drehzahl mittler, pH 7,4, 500 mLAgilent103576-100
Seahorse XFe96 AnalysatorAgilent
Seahorse XFe96/XF Pro FluxPakAgilent103792-100enthält 18 XFe96/XF Pro Sensorpatronen, 18 XFe96/XF Pro Zellkultur-Mikroplatten, 1 Flasche Seahorse XF Calibrant Solution 500mL und 3 Paare XF Ladeführer
NatriumbicarbonatSigmaS6014
Natriumpyruvat (100mM) 100XGibco11360-070
SRB-Test (Sulfurhodamin B Assay Kit)Abcamab235935
VWR Signature ergonomischer Hochleistungs-Mehrkanal-PipettorAvantor89079-956
XF Cell Mito Stresstest-KitAgilent103015-100
XF Glykolytisches Raten-Assay-KitAgilent103344-100

Referenzen

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  2. Marinangeli, C., Kluza, J., Marchetti, P., Buee, L., Vingtdeux, V. Study of ampk-regulated metabolic fluxes in neurons using the Seahorse XF Analyzer. Methods Mol Biol. 1732, 289-305 (2018).
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  5. Hammoud, S., et al. Tubular CPT1a deletion minimally affects aging and chronic kidney injury. JCI Insight. 9 (6), e171961(2024).
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  7. Zhu, Y., et al. The role of PKM2-mediated metabolic reprogramming in the osteogenic differentiation of BMSCs under diabetic periodontitis conditions. Stem Cell Res Ther. 16 (1), 186(2025).
  8. Liu, J., Zhang, X., Fan, X. Liensinine reshapes the immune microenvironment and enhances immunotherapy by reprogramming metabolism through the AMPK-HIF-1α axis in hepatocellular carcinoma. J Exp Clin Cancer Res. 44 (1), 208(2025).
  9. Van Der Windt, G. J. W., Chang, C. H., Pearce, E. L. Measuring bioenergetics in T cells using a Seahorse extracellular flux analyzer. Curr Protoc Immunol. 113 (3), 3.16B.1-3.16B.14 (2016).
  10. Teresa P de Aquino, M., et al. Glutamate receptor–TCR signaling potentiates full CD8+ T cell activation and effector function in tumor immunity. iScience. 28 (10), 112772(2025).
  11. Hammoud, S., Kern, J., Mukherjee, S. Assays to enhance metabolic phenotyping in the kidney. Am J Physiol Renal Physiol. 328 (4), 563-577 (2025).

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