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Methodenartikel

Primäre Isolierung, Kultur und phänotypische Verifizierung von Chondrozyten des Rattenkniegelenks

848 Ansichten

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DOI:

10.3791/69509

⸱

7. November 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Orthopedics, Longfu Hospital, 2Department of TCM Rheumatology, China-Japan Friendship Hospital, 3Beijing Key Lab for Immune-Mediated Inflammatory Diseases, China-Japan Friendship Hospital

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung und Kultivierung von primären Chondrozyten aus dem Kniegelenk der Ratte mittels sequentieller enzymatischer Verdauung. Die Methode liefert Chondrozyten mit validierten phänotypischen Merkmalen und bietet den Forschern einen zuverlässigen Ansatz für Anwendungen in der Knorpelforschung.

Zusammenfassung

Knorpelschäden infolge von Traumata, Alterung oder entzündlichen Erkrankungen bleiben aufgrund der von Natur aus begrenzten Regenerationsfähigkeit des Gewebes eine erhebliche klinische Herausforderung. Chondrozyten, die einzige zelluläre Komponente des Knorpels, sind für die Aufrechterhaltung der Struktur und Funktion der extrazellulären Matrix verantwortlich, was sie für das Verständnis der Knorpelphysiologie, -pathologie und -regeneration unerlässlich macht. Die vorliegende Studie stellt ein umfassendes und standardisiertes Protokoll für die Isolierung, Kultivierung und phänotypische Verifizierung von primären Gelenk-Chondrozyten der Ratte aus dem Kniegelenk vor. Bei dem Verfahren werden junge, säugende Ratten verwendet, um eine maximale Zellviabilität zu gewährleisten, und es wird ein sequenzieller enzymatischer Verdau mit Trypsin und Kollagenase Typ II für eine effiziente Zellextraktion verwendet. Der Chondrozyten-Phänotyp wird durch Typ-II-Kollagen-Immunfluoreszenz, durchflusszytometrische Analysen und Interleukin (IL)-1β-Stimulationsassays verifiziert, um die zelluläre Identität und die Entzündungsreaktion zu bestätigen. Dieser optimierte und reproduzierbare Arbeitsablauf ermöglicht die Erzeugung hochreiner Chondrozytenkulturen, die sich für Wirkstoffscreenings, mechanistische Untersuchungen und Tissue-Engineering-Anwendungen eignen und die Forschung in der Knorpelbiologie voranbringen.

Einleitung

Knorpel ist eine spezialisierte Art von Bindegewebe, das mehrere wichtige Funktionen erfüllt, darunter Halt, Dämpfung und Stoßdämpfung1. Es spielt eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der strukturellen Stabilität und der Gewährleistung der Beweglichkeit innerhalb des Skelettsystems 2,3. Mechanische Verletzungen, degenerative Veränderungen, Entzündungen oder Stoffwechselanomalien können zu einer Schädigung des Knorpels führen 4,5,6. Aufgrund des inhärenten Mangels an Blutgefäßen und Nerven in Kombination mit der begrenzten proliferativen Kapazität der Chondrozyten stellt die Reparatur des Knorpels eine große Herausforderung dar. Krankheiten wie Osteoarthritis (verursacht durch degenerative Veränderungen und mechanische Verletzungen) und rheumatoide Arthritis (verursacht durch autoimmune Entzündungsreaktionen) können irreversible Knorpelschäden verursachen, die die Lebensqualität der Patienten stark beeinträchtigen 7,8,9. Als exklusiver Zelltyp im Knorpelgewebe sind Chondrozyten für Schlüsselfunktionen verantwortlich, wie z. B. die Sekretion und Aufrechterhaltung der extrazellulären Matrix, die Unterstützung der Skelettentwicklung, die Beteiligung an der Polsterung und Reparatur der Gelenke und die zentrale Regulierung des Knorpelwachstums und des Knorpelstoffwechsels 10,11,12.

Chondrozyten sind in avaskulären Matrixlakunen eingeschlossen, was zu einer stark eingeschränkten Kapazität für ihre eigene Proliferation und Gewebereparatur führt13,14. Der funktionelle Status der Chondrozyten bestimmt direkt die Gesundheit des Knorpelgewebes15. Eine Dysfunktion der Chondrozyten, die durch Alterung, Entzündungen, Traumata oder genetische Faktoren verursacht wird, führt zu einer verminderten Matrixsynthese und einem erhöhten Abbau16,17. Dieser krankhafte Prozess treibt die Knorpeldegeneration (z. B. bei Arthrose) voran, was zu einer Beeinträchtigung seiner wesentlichen Stütz-, Dämpfungs- und Schmierfunktionen führt. Die eingeschränkte Regenerationsfähigkeit des Knorpels ist der Hauptgrund für die große Herausforderung bei seiner Reparatur und stellt ein zentrales Forschungsgebiet der modernen Orthopädie und regenerativen Medizin dar. Die aktuelle Forschung am Knorpel ist zu einem wichtigen Schwerpunkt auf diesem Gebiet geworden, wobei medikamentöse Interventionen, Tissue Engineering und Gentherapie die Isolierung von Chondrozyten für In-vitro-Studien erfordern 18,19,20,21,22,23,24,25. Folglich stellt die Isolierung und Identifizierung von Chondrozyten einen entscheidenden Schritt in vielen experimentellen Ansätzen dar. Während immortalisierte Chondrozyten-ähnliche Zelllinien wie SW1353 in einigen Studien als geeignete Surrogate verwendet werden, fehlt ihnen die Expression kritischer phänotypischer Marker, insbesondere des Typ-II-Kollagens, das für die authentische Chondrozytenfunktion und Matrixbildung essentiell ist26. Daher bleiben primäre Chondrozyten der Goldstandard für die Forschung, die physiologische Relevanz erfordert. Im Vergleich zu zuvor veröffentlichten Protokollen, die mehrere Enzymkombinationen oder umfangreiche mechanische Manipulation erfordern, reduziert der vereinfachte enzymatische Aufschlussansatz die Komplexität und die Verarbeitungszeit im Vergleich zu Methoden, die mehrere Enzymkombinationen oder umfangreiche mechanische Manipulation erfordern. Darüber hinaus gewährleistet die Einbeziehung umfassender Validierungsschritte eine konsistente Identifizierung funktioneller Chondrozyten und verbessert die Reproduzierbarkeit in Experimenten und Laboren.

Chondrozyten zeichnen sich durch ihre Sekretion von Typ-II-Kollagen aus, während sie unter Stimulation durch Entzündungsfaktoren weitgehend Matrix-Metalloproteinasen (MMPs) synthetisieren und freisetzen27. Daher wurden die Zellen nach der Isolierung der Chondrozyten mittels Typ-II-Kollagen-Immunfluoreszenz identifiziert und die Reinheit der Chondrozyten mittels Durchflusszytometrie beurteilt. Und mit Interleukin (IL)-1β stimuliert, um ihre charakteristische Synthese und Sekretion von Matrix-Metalloproteinasen zu bestätigen. Diese Studie beschreibt den Prozess der Chondrozytenextraktion und -charakterisierung aus neugeborenen Mäusen und bildet damit die Grundlage für nachfolgende Chondrozyten-bezogene Experimente.

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Protokoll

Die Verwendung von Versuchspersonen in dieser Studie wurde von der Ethikkommission für experimentelle Tierpflege und Tierschutz des China-Japan Friendship Hospital genehmigt (Nr. zryhyy21-21-05-16). Die verwendeten Reagenzien und die verwendeten Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Versuchstiere und Vorarbeiten

HINWEIS: Knorpel aus den Gelenken von Ratten, Kaninchen und Menschen nach einer Knie-Totalendoprothetik kann zur Isolierung von Chondrozyten verwendet werden. Aufgrund ihrer höheren Lebensfähigkeit wurden in dieser Studie jedoch Saugratten für die Chondrozytenextraktion verwendet.

  1. Transportieren Sie die Saugratten mit speziellen Transferbehältern von der Versuchstierproduktion zum Labor.
  2. Saugende Ratten durch CO2 -Erstickung einschläfern (nach institutionell anerkannten Protokollen) und ihre Körperoberflächen mit steriler Lösung abspülen.
  3. Tauchen Sie die euthanasierten Spanferkelratten 10 Minuten lang in 75%iges Ethanol, um die Oberflächenverunreinigungen zu desinfizieren.
  4. Bringen Sie die desinfizierten Spanferkelratten in eine Biosicherheitswerkbank und legen Sie sie in sterile Petrischale.
    HINWEIS: Eine gründliche Oberflächenreinigung und das Eintauchen in Ethanol bei saugenden Ratten sind wichtige Schritte, um eine bakterielle oder pilzliche Kontamination zu verhindern, die sich nachteilig auf nachfolgende Experimente auswirken kann.

2. Isolierung von Gelenkknorpelgewebe

HINWEIS: Der neonatale Knorpel erscheint als durchscheinende, bläulich-weiße Schicht, die die knöcherne Epiphyse bedeckt. Bei diesem Schritt müssen strenge aseptische Techniken befolgt werden, um eine Kontamination zu vermeiden, die nachfolgende Experimente beeinträchtigen könnte.

  1. Isolieren Sie das Kniegelenk der Spanferte mit einem Skalpell und einer Augenschere und entfernen Sie dann das darüber liegende Hautgewebe.
  2. Übertragen Sie das präparierte Kniegelenk in eine neue sterile Petrischale und ersetzen Sie das Skalpell und die Augenschere.
  3. Entnehmen Sie mit einem Skalpell Gelenkknorpel aus dem Kniegelenk und schneiden Sie dann das umgebende Bindegewebe mit einer Augenschere gründlich ab.

3. Verdauung des Knorpelgewebes

HINWEIS: Verwenden Sie Trypsin, um das den Knorpel umgebende Bindegewebe zu verdauen, gefolgt von 0,2 % Kollagenase II für die Knorpelmatrixverdauung.

  1. Den geernteten Knorpel in 3 Volumina mit 0,25 % Trypsin geben und in einem 37 °C Thermostatschüttler unter Rühren 30 Minuten inkubieren.
  2. Beenden Sie die Verdauung durch Zugabe von PBS, das 10 % fötales Rinderserum (FBS) enthält. Entfernen Sie anhaftendes Gewebe mit einer Augenschere aus dem Knorpel. Zentrifugieren (4 °C, 500 × g, 5 min) und den Überstand verwerfen.
  3. Das Knorpelgewebe in PBS resuspendieren, zentrifugieren (4 °C, 500 × g, 5 min) und den Überstand verwerfen. Wiederholen Sie diesen Waschschritt 3 Mal.
  4. 0,2% Kollagenase II in das aufbereitete Knorpelgewebe geben und in einem 37 °C Thermostatschüttler unter Rühren 4 h verdauen.

4. Isolierung und Kultur von Chondrozyten

HINWEIS: Alle Eingriffe müssen unter sterilen Bedingungen in einer Biosicherheitswerkbank durchgeführt werden. Bei der mechanischen Dissoziation von Knorpelgewebe sollten sterile Handschuhe mit einem Spritzenkolben auf dem Zellsieb getragen werden, um eine experimentelle Kontamination zu vermeiden. Unter Standardkulturbedingungen benötigen primäre Chondrozyten in der Regel etwa 2-3 Tage, um eine Konfluenz von 80 % bis 90 % für die erste Passage zu erreichen.

  1. Legen Sie ein 200-μm-Zellsieb über eine sterile Kulturschale und filtrieren Sie die vermiaute Knorpelsuspension durch das Netz.
  2. Zerkleinern Sie die restlichen Knorpelfragmente auf dem Sieb mit einem sterilen Spritzenkolben und spülen Sie das Sieb dann mit vollständigem DMEM-Medium aus.
  3. Alle Filtrate auffangen, zentrifugieren (4 °C, 500 × g, 5 min) und den Überstand entsorgen.
  4. Das Pellet in PBS resuspendieren, zentrifugieren (4 °C, 500 × g, 5 min) und den Überstand entsorgen.
  5. Die Zellen werden in vollständigem DMEM-Medium resuspendiert und in einen T25-Kulturkolben überführt.
  6. Der Kolben wird in einem befeuchteten Brutschrank (37 °C, 5 % CO2) inkubiert.
  7. Passagezellen an diesem Zusammenfluss mit Trypsin-EDTA und Subkultur im Verhältnis 1:2.

5. Typ-II-Kollagen-Immunfluoreszenzfärbung zur Identifizierung von Chondrozyten

HINWEIS: Die anhaftenden Chondrozyten zeichnen sich durch eine spindelförmige und polygonale Morphologie aus. Alle in dieser Studie vorgestellten Biomarker-Analysen wurden mit Zellen in Passage 2 durchgeführt. Chondrozyten an Passage 3 beginnen eine ausgeprägtere Dedifferenzierung zu zeigen, die durch eine Verschiebung hin zu einer spindelförmigen, fibroblastenähnlichen Morphologie und eine Verlangsamung der Proliferationsrate gekennzeichnet ist. Diese phänotypische Veränderung wird nach Passage 4 deutlicher. Bei Passage 6 nimmt die überwiegende Mehrheit der Zellen eine längliche, fibroblastenähnliche Form an. Die Antikörperverdünnungen wurden auf der Grundlage der Empfehlung des Herstellers bestimmt und durch unsere Vorversuche validiert, um eine optimale Spezifität und Signalintensität zu gewährleisten.

  1. Chondrozyten in einer 24-Well-Platte säen und 24 Stunden lang kultivieren, um die Zelladhäsion zu ermöglichen.
  2. Entsorgen Sie das Kulturmedium und waschen Sie die Zellen 3 Mal mit PBS (geben Sie PBS in jede Vertiefung, inkubieren Sie es 5 Minuten lang, dann aspirieren).
  3. Fixieren Sie die Zellen 10 min lang mit 4% Paraformaldehyd, waschen Sie sie dann 3 Mal mit PBS.
  4. Permeabilisieren Sie die Zellen mit 0,3% Triton X-100 (hergestellt in PBS) für 10 min.
  5. Waschen Sie die Zellen 3 Mal mit PBS und verstopfen Sie sie dann mit tierversuchsfreier Blockierungslösung (150 μl/Well, 5 × in PBS verdünnt) bei Raumtemperatur für 1 h.
  6. Die Blockierungslösung wird entfernt und über Nacht bei 4 °C mit einem Primärantikörper (Anti-Col II, 1:200 Verdünnung) inkubiert.
  7. Entnehmen Sie den primären Antikörper und waschen Sie die Zellen 3 Mal mit PBS.
  8. Fügen Sie Alexa Fluor 488-konjugierten Anti-Kaninchen-IgG-Sekundärantikörper (1:50 Verdünnung) hinzu und inkubieren Sie bei 37 °C für 1,5 h im Dunkeln.
  9. Entfernen Sie den Sekundärantikörper und waschen Sie die Zellen 3 Mal mit PBS.
  10. Mit DAPI-haltigem Antifading-Medium aufziehen und 10 Min. im Dunkeln trocknen.
  11. Beobachten und erfassen Sie Bilder mit einem inversen Fluoreszenzmikroskop.

6. Durchflusszytometrische Analyse der Chondrozytenreinheit

HINWEIS: Chondrozyten zeichnen sich durch ihre Fähigkeit aus, Typ-II-Kollagen zu synthetisieren und zu sezernieren, was als definitiver Marker für die Identifizierung dient. Die Chondrosarkom-Zelllinie SW1353 weist zwar einige chondrozytäre Eigenschaften auf, verfügt jedoch nicht über eine Typ-II-Kollagensekretionskapazität und dient daher als Negativkontrolle in diesem Experiment.

  1. Verdauen Sie sowohl Chondrozyten als auch SW1353-Zellen mit EDTA-freiem Trypsin.
  2. Neutralisieren Sie die Verdauung mit vollständigem DMEM-Medium und resuspendieren Sie Zellen in PBS.
  3. Inkubieren Sie die Zellen 15 Minuten lang mit Fixierungs-/Permeabilisierungslösung, dann fügen Sie 1 ml Waschpuffer hinzu.
  4. Zentrifugieren (500 × g, 5 min), den Überstand verwerfen und 15 Minuten lang mit 100 μl Anti-Typ-II-Kollagenantikörper (1:100 Verdünnung) lichtgeschützt inkubieren, gefolgt von der Zugabe von 1 ml Waschpuffer.
  5. Zentrifugieren (500 × g, 5 min), den Überstand verwerfen und 30 Minuten lang mit Alexa Fluor 488-konjugiertem Anti-Kaninchen-IgG-Sekundärantikörper lichtgeschützt inkubieren, dann 1 ml Waschpuffer hinzufügen.
  6. Zentrifugieren (500 × g, 5 min), den Überstand verwerfen, jede Probe in 200 μl Waschpuffer resuspendieren und mittels Durchflusszytometrie analysieren.

7. IL-1β-Stimulation von Chondrozyten

HINWEIS: Die Produktion von Matrix-Metalloproteinasen (MMPs) als Reaktion auf IL-1β-Stimulation ist ein charakteristisches Merkmal von Chondrozyten. Daher wird in dieser Studie die IL-1β-Stimulation eingesetzt, um dieses phänotypische Merkmal in isolierten Chondrozyten zu validieren.

  1. Chondrozyten aus Kulturflaschen verdauen und in vollständigem DMEM-Medium resuspendieren.
  2. Zählen Sie die Zellen und stellen Sie die Konzentration auf 5 × 105 Zellen/ml mit vollständigem DMEM ein.
  3. Die Zellen werden in eine 6-Well-Platte (insgesamt 24 Wells) geseedet, wobei 12 Wells als blinde Kontrollgruppe und 12 Wells als IL-1β-Stimulationsgruppe bezeichnet werden.
  4. Inkubieren Sie die Platte 12 Stunden lang in einem Zellkultur-Inkubator.
  5. Geben Sie 10 ng/ml IL-1β nach vollständiger Zelladhäsion in die Stimulationsgruppe.
  6. Entnahme von Zellkulturüberständen nach 24 Stunden für die Analyse mit dem Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA).
  7. Waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS.
  8. Lyse von 6 Kontroll-Wells und 6 IL-1β-stimulierten Wells mit RIPA-Puffer für die anschließende Western-Blot-Analyse.
  9. Extrahieren Sie RNA aus 6 Kontroll-Wells und 6 IL-1β-stimulierten Wells mit TRIzol für die qPCR-Analyse.

8. Quantitative Real-Time-PCR (qRT-PCR)-Analyse

HINWEIS: Alle RNA-bezogenen Experimente wurden mit DEPC-behandelten Verbrauchsmaterialien durchgeführt. Kurz gesagt, die Röhrchen und Spitzen wurden 12 Stunden lang in 0,1 % DEPC eingeweicht, autoklaviert (121 °C, 20 min), um sowohl RNasen als auch RESIDUAL-DEPC zu inaktivieren, und vor der Verwendung im Ofen getrocknet.

  1. Geben Sie 1 mL Trizol zum Zellpellet und homogenisieren Sie es mit einem Homogenisator. 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.
  2. 0,2 mL Chloroform zugeben und 30 s lang kräftig wirbeln. 3 min bei Raumtemperatur inkubieren.
  3. Zentrifugieren Sie bei 4 °C, 12.000 × g für 15 min. Übertragen Sie die farblose wässrige Phase in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen und fügen Sie ein gleiches Volumen Isopropanol hinzu.
  4. Gut mischen und 10 min bei Raumtemperatur inkubieren. Zentrifugieren Sie bei 4 °C, 12.000 × g für 10 min. Entsorgen Sie den Überstand und behalten Sie das RNA-Pellet.
  5. Geben Sie 1 ml vorgekühltes 75%iges Ethanol in das RNA-Pellet. Gründlich vortexen und bei 4 °C, 12.000 × g 5 min zentrifugieren. Entsorgen Sie den Überstand und behalten Sie das RNA-Pellet.
  6. Trocknen Sie das RNA-Pellet in einer Biosicherheitswerkbank an der Luft. Löse die RNA in 20 μl RNase-freiem Wasser auf.
  7. Messen Sie die RNA-Konzentration und -Qualität mit einem Nanodrop-Spektralphotometer.
  8. Transkribieren Sie die Gesamt-RNA mit einem reversen Transkriptionskit in cDNA.
  9. Bereiten Sie das Reaktionsgemisch vor, das 1 μg Gesamt-RNA, 4 μl Magnesiumchloridlösung, 2 μl dNTP-Gemisch, 0,5 μl RNase-Inhibitor, 0,6 μl AMV-reverse Transkriptase, 1 μl zufällige Primer und RNasefreies Wasser enthält, um das endgültige Volumen auf 20 μl einzustellen.
  10. Die Reaktion wird 15 Minuten lang bei 42 °C und anschließend 5 Minuten lang bei 95 °C inkubiert. 5 Minuten auf 4 °C abkühlen lassen, dann die cDNA mit RNase-freiem Wasser verdünnen.
  11. Bereiten Sie das PCR-Reaktionsgemisch vor, das 2 μl cDNA, 10 μl SYBR Green Real-time PCR Master Mix, Vorwärts- und Rückwärtsprimer (Tabelle 1) in einer Endkonzentration von jeweils 0,2 μmol/l und RNase-freies Wasser bis zu einem Endvolumen von 20 μl enthält.
  12. Stellen Sie die PCR-Bedingungen wie folgt ein: Vordenaturierung bei 95 °C für 1 min, gefolgt von 40 Zyklen mit 95 °C für 15 s, 60 °C für 15 s und 72 °C für 45 s. Sammeln Sie Fluoreszenzdaten während des Verlängerungsschritts von 72 °C.
  13. Notieren Sie nach der Reaktion die CT-Werte für jede Probe und die interne Referenz. Berechnen Sie die relativen Expressionsniveaus von Zielgenen mit der 2-ΔΔCT-Methode.

9. ELISA-Assay

HINWEIS: Biotinylierte Antikörper-Arbeitslösung und Enzymkonjugat-Arbeitslösung vor Gebrauch frisch zubereiten.

  1. Nehmen Sie das ELISA-Kit 30 Minuten vorher aus dem Kühlschrank und lassen Sie es auf Raumtemperatur ausgleichen.
  2. Bereiten Sie alle erforderlichen Lösungen gemäß den Anweisungen des Kits vor.
  3. Geben Sie 100 μl Proben oder Standardlösungen (mit unterschiedlichen Konzentrationen) in die dafür vorgesehenen Vertiefungen (Null-Vertiefungen enthalten nur Standard-/Probenverdünnungspuffer). Die Platte mit Klebefolie verschließen und bei 37 °C 90 min inkubieren (ohne Blind-Kontrollvertiefungen).
  4. Entsorgen Sie die Flüssigkeit und waschen Sie jede Vertiefung mit 350 μl Waschpuffer. 30 s inkubieren, die Flüssigkeit entsorgen und auf dickem, saugfähigem Papier trocken tupfen. Wiederholen Sie die Wäsche 4 Mal.
  5. Geben Sie 100 μl biotinylierte Antikörper-Arbeitslösung in jede Vertiefung. Die Platte verschließen und 60 min bei 37 °C inkubieren (leere Kontrollvertiefungen ausgenommen).
  6. Entsorgen Sie die Flüssigkeit und waschen Sie jede Vertiefung 4 Mal, wie in Schritt 4 beschrieben.
  7. Geben Sie 100 μl enzymkonjugierte Arbeitslösung in jede Vertiefung. Verschließen Sie die Platte und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang bei 37 °C (ausgenommen leere Kontrollvertiefungen).
  8. Entsorgen Sie die Flüssigkeit und waschen Sie jede Vertiefung 4 Mal, wie in Schritt 4 beschrieben.
  9. Geben Sie 100 μl Substratlösung in jede Vertiefung. Vor Licht schützen und bei 37 °C 15 min inkubieren.
  10. Geben Sie 100 μl Stopplösung in jede Vertiefung, mischen Sie gründlich und messen Sie sofort die optische Dichte (OD) bei 450 nm.
  11. Generieren Sie mit der CurveExpert-Software eine Standardkurve und berechnen Sie die Probenkonzentrationen.

10. Western-Blot-Analyse

HINWEIS: Bereiten Sie vor dem Experiment Elektrophoresepuffer, Transferpuffer, TBST, 5% Magermilch vor und schneiden Sie die PVDF-Membran im Voraus auf die entsprechende Größe zu. Erfassen Sie anschließend die Chemilumineszenzsignale mit einem Chemilumineszenz-Bildgebungssystem. Stellen Sie das Gerät für die Gradientenbelichtung in den automatischen oder manuellen Modus, der in der Regel zwischen 10 s und 5 min liegt, um sicherzustellen, dass die Signale innerhalb des linearen Dynamikbereichs erfasst werden, und um Pixelsättigung zu vermeiden. Wählen Sie nach der Signalerfassung das Belichtungsbild aus, bei dem die Zielbanden klar und der Hintergrund niedrig ist, um die anschließende quantitative Analyse durchzuführen.

  1. Bereiten Sie RIPA-Lysepuffer (mit 1 % PMSF und 1 % Phosphatase-Inhibitor) vor und fügen Sie RIPA-Lysepuffer in einem Verhältnis von 250 μl pro Vertiefung einer 6-Well-Platte hinzu.
  2. Die Zellen werden mit einem Ultraschall-Disruptor (3 Zyklen à 7-10 s) lysiert und 30 Minuten lang auf Eis inkubiert.
  3. Zentrifugieren Sie das Lysat 10 Minuten lang bei 4 °C, 12.000 × g und sammeln Sie dann den Überstand für die Proteinquantifizierung.
  4. Bestimmen Sie die Proteinkonzentration mit dem Bicinchoninsäure (BCA)-Assay.
  5. Passen Sie die Proteinkonzentrationen mit RIPA-Lysepuffer auf das gleiche Niveau an.
  6. 5× Ladepuffer zu den Proben im Verhältnis 4:1 geben (Probe: Puffer).
  7. Die Proben werden 10 Minuten lang gekocht, dann bei 4 °C und 10 Minuten lang 12.000 × g zentrifugiert und der Überstand für die Elektrophorese gesammelt.
  8. Bauen Sie das SDS-PAGE-Gel in der Elektrophoresekammer ein und füllen Sie es mit Elektrophoresepuffer, bis der Kamm untergetaucht ist.
  9. Entfernen Sie den Kamm, laden Sie die Proben in die Vertiefungen und fügen Sie die Proteinleiter zu den Referenzbahnen hinzu.
  10. Führen Sie die Elektrophorese durch, bis der Bromphenolblau-Farbstoff den Boden des Gels erreicht, zerlegen Sie dann das Gerät und holen Sie das Gel heraus.
  11. Montieren Sie das Transfer-"Sandwich" und führen Sie den Nasstransfer bei konstanter Spannung durch.
  12. Blockieren Sie die PVDF-Membran mit 5 % Magermilch in TBST für 1 h bei Raumtemperatur.
  13. Mit verdünntem Primärantikörper über Nacht bei 4 °C inkubieren.
  14. Gewinnen Sie den primären Antikörper zurück und waschen Sie die Membran mit TBST (5 × 5 min).
  15. Mit HRP-konjugiertem Sekundärantikörper 90 min bei Raumtemperatur inkubieren.
  16. Den Sekundärantikörper zurückgewinnen und die Membran mit TBST waschen (5 × 5 min).
  17. Bereiten Sie die ECL-Substratlösung vor und lagern Sie sie lichtgeschützt.
  18. Bringen Sie das ECL-Substrat auf die Membran auf und erfassen Sie Chemilumineszenzsignale mit einem Bildgebungssystem mit Gradientenbelichtung.
  19. Analysieren Sie Bandenintensitäten mit der ImageJ-Software und berechnen Sie die relativen Proteinexpressionsniveaus für die weitere Analyse.

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Ergebnisse

Die Immunfluoreszenzfärbung für Typ-II-Kollagen zeigte, dass die isolierten Chondrozyten stark positiv waren (Abbildung 1A). Die durchflusszytometrische Analyse zeigte ferner, dass mehr als 98 % der Zellen positiv für Typ-II-Kollagen waren (Abbildung 1B), während die Negativkontrollzellen SW1353 negativ waren (Abbildung 1C). Nach Stimulation mit 10 ng/ml IL-1β für 24 Stunden zeigte Western Blotting einen deutlichen Anstieg der MMP3-...

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Diskussion

Das hier beschriebene Protokoll bietet mehrere entscheidende Vorteile für die Isolierung und Kultivierung von primären Gelenkchondrozyten der Ratte. Die Verwendung von Milchratten ist entscheidend für eine optimale Zellausbeute und Lebensfähigkeit, da Knorpel von Jungtieren im Vergleich zu adultem Knorpel mehr proliferative Chondrozyten und weniger mineralisierte Matrix enthält. Diese Altersselektion verbessert die Effizienz der enzymatischen Verdauung und der anschließenden Zellregenera...

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Offenlegungen

Die Autoren berichten von keinen Interessenkonflikten in dieser Arbeit.

Danksagungen

Diese Studie wurde unterstützt von der National High-Level Hospital Clinical Research Funding and Elite Medical Professionals Initiative des China-Japan Friendship Hospital (NO. ZRJY2025-QM05).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
4 % ParaformaldehydSolarbioP1110
5& Mal; LadepufferSolarbioP1040
Alexa Fluor 488-konjugiertes Anti-Kaninchen-IgGZhongshan Jingqiao BiotechnologieZF-0511
Tierfreie BlockierungslösungZell-Signaltechnik15019
Anti-Kollagen-II-AntikörperAbcamab34712
Bicinconininsäure (BCA) Protein-Assay-KitSolarbioPC0020
Kollagenase IIYeasen Biotechnologie40508ES60
DAPI-haltiges fluoreszierendes MontagemediumZhongshan Jingqiao BiotechnologieZLI-9556
Dulbeccos modifiziertes Eagle MediumSolarbio11995
Fetales Rinderserum (FBS)SolarbioS9010
Meerrettichperoxidase (HRP)-konjugierte Ziegen-Anti-Kaninchen-IgGZhongshan Jingqiao BiotechnologieZB-2301
IL-1βpeprotech400-01B
MMP13 Rabbit MabABklonalA11148
MMP3 Rabbit MAbABklonalA11418
Fettfreie TrockenmilchSolarbioD3840
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)SolarbioP1020
PVDF-MembranThermo Fisher Scientific88518
Rat MMP-13 ELISA KitNouvsNBP3-06931
Rat MMP-3 ELISA KitNouvsNBP3-06894
Rückwärts-Transkriptions-KitPromegaA3500
RIPA Lysis-PufferSolarbioR0010
RNase-freies WasserSolarbioR1600
SDS-PAGE GelEpizymPG112
SYBR Green Real-time PCR Master MixToyoboQPK-201
Triton X-100SolarbioT8200
TRIzolSolarbio15596026
TrypsinSolarbioT1320
Ultrasensitives ECL-Chemilumineszenz-Substrat-KitNCM BiotechP10300
β-Actin Rabbit mAbABklonalAC026

Referenzen

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