Ein modularer Arbeitsablauf für quantitative, strukturelle und funktionale Analyse von Leptospira-Biofilmen

Summary

Dieses Protokoll liefert einen modularen BSL-2-Workflow, der Kristall-Violett-Biomasse-Assays, Zeitraffer-Phasenkontrastkinetik, konfokale 3D/Matrix-Kartierung, SEM-Ultrastruktur und ein Modul zur Hamsterinfektion in vivo kombiniert, um die funktionelle Rolle des Leptospira-Biofilms zu kultivieren, quantifizieren, charakterisieren und untersuchen und so eine standardisierte Bewertung von Mutanten und Anti-Biofilm-Interventionen in Laboren ermöglicht.

Abstract

Hier präsentieren wir eine integrierte Suite von Protokollen für die Kultivierung, quantitative Überwachung sowie strukturelle und funktionelle Charakterisierung von Leptospira-Arten Biofilme im Zeitverlauf. Dieser Workflow kombiniert kristallviolette Mikrotiter-Assays, um Biofilmbiomasse an mehreren Zeitpunkten zu messen, mit einem zeitaufgelösten Fraktionierungsansatz, der angeheftete (Biofilm-) und nicht angeheftete (flüssigphasen) Bakterienpopulationen unterscheidet, Zeitraffer-Phasenkontrastbildgebung für nicht-destruktive kinetische Beobachtung, konfokale Laserscannmikroskopie zur Erstellung vollständiger 3D-Rekonstruktionen mit Matrix-Sonden-Auswertungen sowie membrangestützter Rasterelektronenmikroskopie für ultrastrukturelle Analysen. Parallel dazu erläutern wir ein standardisiertes Verfahren zur Entnahme intakter Biofilmaggregate und deren Vorbereitung für die intraperitoneale Injektion in das anfällige goldene syrische Hamstermodell, was eine direkte Bewertung der biofilmassoziierten Virulenz in vivo zusammen mit passenden planktonischen Kontrollen ermöglicht.

Optimiert für den pathogenen Stamm Leptospira interrogans Manilae L495, ist jedes Modul leicht auf andere Leptospira-Arten und Mutantenbibliotheken übertragbar, um die Biofilmbildungskapazität zu vergleichen. Zusammen bieten diese koordinierten Module eine solide Grundlage zur Überprüfung von Antibiofilm-Strategien, zur Untersuchung genetischer Determinanten und zur Klärung des Beitrags von Biofilmen zur Persistenz und Pathogenese von Leptospira .

Introduction

Biofilme sind strukturierte mikrobielle Gemeinschaften, in denen Zellen in eine selbstsekretierte extrazelluläre polymere Substanzmatrix (EPS) eingebettet sind, die aus Polysacchariden, Proteinen, Nukleinsäuren und Lipiden^{besteht 1}. Diese Matrix sorgt für mechanische Stabilität, vermittelt Haftung an Oberflächen und verbessert das Überleben der Mikrobien, indem sie Toleranz gegenüber Umweltbelastungen wie Austrocknung, oxidativem Stress und antimikrobiellen Stoffen^{gewährt 2,3}. Bei pathogenen Bakterien fördern Biofilme Persistenz, Immunumgehung und chronische Infektionen ^4,5.

Im Vergleich zu planktonischen Zellen, die frei schwebend und metabolisch homogener sind, zeigen biofilmassoziierte Zellen veränderte Genexpression, Wachstumsraten und metabolische Aktivität⁶. Diese Unterschiede verleihen eine erhöhte Toleranz gegenüber Umweltherausforderungen, Antibiotika und Abwehrmechanismen des Wirts, während sie koordinierte Verhaltensweisen wie Quorum-Sensing, Nährstoffretention und räumliche Organisation^{ermöglichen 7,8}.

Die Biofilmbildung wurde umfassend in Modellorganismen wie Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus und Vibrio cholerae charakterisiert, die gemeinsam unser Verständnis der genetischen, strukturellen und physiologischen Grundlagen des Biofilmlebensstils geprägt haben. Studien zu Pseudomonas haben gezeigt, dass Exopolysaccharide und Quorum-Sensing zusammenwirken, um komplexe dreidimensionale Biofilm-Architekturen zu formen ^9,10. Die Forschung an Staphylokokken hat die Rolle von Oberflächenproteinen und extrazellulärer DNA bei der Verbesserung der Biofilmkohäsion und der Antibiotikatoleranz^{betont 11,12}. Untersuchungen zu Vibrio-Arten hoben die bemerkenswerte Vielfalt der Biofilmmorphologien und deren ökologische Bedeutung in aquatischen Umgebungen hervor. Zusammen haben diese Systeme einen robusten konzeptionellen und methodischen Rahmen für die Biofilmforschung geschaffen, verstärkt durch standardisierte Protokolle¹⁴ und kritische Bewertungen bestehender Techniken ^15,16, die zusammen die Notwendigkeit harmonisierter Ansätze bei der Untersuchung der Biofilmbildung bei weniger erforschten Bakterien wie Leptospira hervorheben.

Mitglieder der Spirochetengattung Leptospira, den Auslösern der Leptospirose, galten lange Zeit als überwiegend planktonisch. Neuere Studien haben experimentell eine robuste Biofilmbildung über mehrere Arten^{hinweg gezeigt 17}. Während einige Studien auf die Bildung von Biofilmen in^Umwelt-18- und wirtsassoziierten^19-Kontexten hindeuten, haben andere experimentell die Fähigkeit von Leptostürmen demonstriert, Biofilm in den Nierentubuli von Rattus norvegicus²⁰ und im Glaskörper von Pferden²¹ zu bilden sowie Leptospiralarten in Umweltbiofilmen^22,23 nachzuweisen. Die Entschlüsselung der Bedingungen und Mechanismen, die Leptospira-Biofilme steuern, ist daher entscheidend für das Verständnis der Umweltübertragung, der Reservoirpersistenz und der Krankheitspathogenese^24,25.

Bestehende Leptospira-Biofilm-Assays sind fragmentiert und reichen von qualitativen mikroskopischen Beobachtungen^17,26 bis hin zu kolorimetrischen Endpunkten oder kristallvioletten Färbungen^27,28. Obwohl diese Studien wertvolle Erkenntnisse zur Biofilmbildung geliefert haben, fehlt ihnen oft sowohl die kinetische Auflösung, die zur Überwachung der Biofilmreifung und -dispersion in Echtzeit erforderlich ist, als auch der ultrastrukturelle Kontext durch Konfokal- oder Elektronenmikroskopie. Kontinuierliche Überwachung und 3D-Strukturanalyse gelten als unerlässlich, um die dynamische Natur der Biofilmbildung und -verteilung zu erfassen^14,15. Diese Einschränkungen erschweren die Vergleichbarkeit zwischen Studien und beschränken die systematische Bewertung von Faktoren oder Interventionen, die die Bildung und Verbreitung von Biofilmen beeinflussen, was die Notwendigkeit eines standardisierten, mehrlesbaren Workflows unterstreicht, der sowohl strukturelle als auch funktionale Dynamiken von Leptospir-a-Biofilmenauf reproduzierbare und umfassende Weise erfasst.

Um diese Lücken zu schließen, haben wir einen integrierten, modularen Arbeitsablauf entwickelt, der sechs komplementäre Auslesungen aus derselben Kulturserie vereint. Erstens quantifiziert ein hochdurchsatzfähiger CV-Mikrotiter-Assay die angebundene Biomasse an mehreren Zeitpunkten. Zweitens ein zeitaufgelöster Fraktionierungsassay in 96-Bohrlochplatten-Partitionen total, flüssigphasenbasiert (nicht gebunden oder teilweise abgetrennt) und angehefteten (Biofilm-)Populationen durch OD₄₀₅, um deren Entwicklung während Bildung und Dispersion zu verfolgen. Der Begriff flüssige Phase wird hier verwendet, um sowohl planktonisch-ähnliche als auch abgetrennte Zellen zu umfassen und das dynamische Kontinuum zwischen frei lebenden und oberflächenassoziierten Phänotypen^29,30 anzuerkennen. Drittens bietet die Zeitraffer-Phasenkontrastbildgebung eine nicht-destruktive Kinetik von Adhäsion, aggregierter Beweglichkeit und Koaleszenz. Viertens liefert die konfokale Laserscanning-Mikroskopie (CLSM) vollständige 3D-Rekonstruktionen mit Live/Dead- und Matrix-Probe-Auslesungen, was eine tiefenabhängige Viabilität und Matrixkartierung ermöglicht. Fünftens löst membran- oder abdeckungsgestützte Rasterelektronenmikroskopie (SEM) die extrazelluläre Architektur und die basal-apikale Polarität bei hoher Auflösung auf. Zusätzlich wurde ein in-vivo-Modul integriert, um die Virulenz mittels intraperitonealer Injektion von Biofilmaggregaten in das anfällige Modell des goldenen Syrischen Hamsters zu bewerten, ein empfindliches und gut etabliertes Modell für Leptospirose 31,32,33. Dieser Ansatz verknüpft Biofilm-Phänotypen mit pathogenem Potenzial und liefert einen funktionalen Kontext, der In-vitro-Analysen ergänzt.

Im Vergleich zu Einmodalitätsansätzen bietet diese Plattform mehrere Vorteile: (i) synchronisierte quantitative (CV und fraktionierte OD) und strukturelle (CLSM/SEM) Lesungen; (ii) nicht-destruktive kinetische Überwachung von früher Adhäsion, Wachstum, Reifung und Dispersion; (iii) 3D-Viabilität und Matrixcharakterisierung mittels gezielter Sonden; (iv) ultrastrukturelle Visualisierung der extrazellulären Matrixarchitektur; und (v) direkte funktionelle Bewertung der biofilmassoziierten versus planktonischen Virulenz in einem anfälligen Hamstermodell, die jeweils mit der Standard-BSL-2-Infrastruktur erreichbar sind. Durch die Nutzung von Multiwell-Formaten und abnehmbaren Glas- oder Polycarbonatsubstraten unterstützt der Workflow die Replikation von Screens von Umweltvariablen, antimikrobiellen Verbindungen oder mutierten Bibliotheken, während gleichzeitig Sterilität, Durchsatz und Kreuzvalidierung über Module hinweg erhalten bleiben.

Labore, die sich auf Ökologie, Persistenz, Wirt-Pathogen-Interaktionen oder Anti-Biofilm-Entdeckung konzentrieren, können einzelne Module oder die gesamte Pipeline übernehmen. Benötigte Ressourcen sind auf einen Kennzeichenleser, ein umgekehrtes Mikroskop mit Umweltkontrolle für Zeitraffer, Zugang zu einem konfokalen Mikroskop und einer SEM-Einrichtung sowie Standard-Tieranlagen für das Hamstermodell beschränkt, was eine breite Einführung und reproduzierbare Vergleiche zwischen Studien ermöglicht.

Protocol

Ethik-Erklärung:
Diese Forschung wurde vom Ausschuss für Tierpflege und -nutzung des Institut Pasteur in Neukaledonien genehmigt und gemäß den Richtlinien des Ausschusses für Tierpflege und -nutzung des Institut Pasteur in Paris sowie der Europäischen Empfehlung 2007/526/EG durchgeführt. Registrierungsnummer für Tierversuche: IPNC-2018-ARE-001

HINWEIS: Alle Verfahren mit lebenden Leptospira-Kulturen müssen in einem Biosicherheitslabor der Stufe 2 (BSL-2) gemäß den institutionellen Biosicherheitsrichtlinien durchgeführt werden. Alle Kulturmanipulationen müssen unter einem biologischen Sicherheitsschrank durchgeführt werden, um die Sicherheit des Bedieners zu gewährleisten und Umweltkontaminationen zu verhindern.

Der in dieser Studie verwendete Leptospira interrogans serovar Manilae-Stamm L495 stammt ursprünglich aus der Sammlung des Institut Pasteur (Paris, Frankreich) und wird am Institut Pasteur in Neukaledonien aufbewahrt. Um die Virulenz zu erhalten, wird der Stamm regelmäßig aus infizierten Hamstern wieder isoliert. Bei allen In-vitro-Experimenten wurden Kulturen nach der Bergung vom tierischen Wirt nicht über sechs Subkulturen hinaus erhalten.

Alle Tierverfahren müssen gemäß institutionellen Richtlinien durchgeführt und von den zuständigen Animal Care and Use Committees genehmigt werden. Experimente sollten den europäischen Vorschriften zum Tierschutz (EU-Richtlinie 2010/63) und den Empfehlungen des öffentlichen Gesundheitsdienstes entsprechen, um sicherzustellen, dass der Einsatz von Tieren sowohl gerechtfertigt als auch ethisch geregelt ist.

1. Herstellung des bakteriellen Inokulums

1. Wachsen Sie Leptospira-spp.-Zellen bei 30 °C in EMJH-Medien³⁴ unter aeroben Bedingungen und ohne Schütteln in flachbodenförmigen, schraubförmigen Glasröhren, bis die Kultur die mittlere Logaritma-Phase erreicht. Unter diesen Bedingungen erreicht der L. interrogans serovar Manilae-Stamm L495, ein Niedrigpassage-Stamm, der regelmäßig in vivo durch Hamster gehalten wird, typischerweise innerhalb von 3–5 Tagen die passende Zelldichte. Stellen Sie sicher, dass Kulturen einen Überdosis von 0,2–0,4 bei 405 nm (2 bis 5 x 10^{8 Zellen} /mL) vor der Verdünnung in frischem EMJH-Medium erreichen, und überprüfen Sie Beweglichkeit und das Fehlen von Klumpungen mittels Dunkelfeldmikroskopie bei 20-facher Vergrößerung.
   HINWEIS: EMJH hat eine intrinsische Absorption. Blende das Spektrophotometer mit sterilem EMJH aus und subtrahiere diesen Wert von allen Messwerten. Das Inokulum kann entweder durch Messung der optischen Dichte oder durch direkte Zellzählung mit einer Petroff-Hausser-Kammer standardisiert werden. Eine 1:100-Verdünnung einer verifizierten Mid-Log-Kultur ergibt typischerweise OD₄₀₅ = 0,02 (≈ 1 x 10⁶ Zellen/mL). Sanft durch Inversion mischen; Nicht vortexen.
2. Untersuchen Sie ein 10 μL Aliquot unter Dunkelfeldmikroskopie mit 20-facher Vergrößerung. Stellen Sie sicher, dass ≥ 90 % der Zellen sehr beweglich sind und keine sichtbaren Klumpen vorhanden sind. Verdünnen Sie die verifizierte Mid-Log-Kultur 1:100 in frischem EMJH, um OD₄₀₅ = 0,02 (≈ 1 x 10^{6 Zellen} /mL) zu erhalten. Sanft durch Inversion mischen; Nicht vortexen.
   HINWEIS: Ein funktionierendes Inokulum unterstützt alle nachgelagerten Assays in diesem Protokoll (Abbildung 1). Bereiten Sie 36 ml vor, um eine 24-Well-Platte (1 mL/Well) oder 20 mL für eine 96-Well-Platte (200 μL/Well) zu säen. Stellen Sie die Volumen so an, dass sie an die Anzahl der benötigten Platten passen.

Abbildung 1. Globaler Arbeitsablauf für Leptospira-Biofilmanalyse . Exponentiell wachsende Leptospira-Kulturen werden zunächst auf Wachstum geprüft und anhand der optischen Dichte standardisiert. Kulturen werden dann in glas- oder membranhaltige Platten, mikroskopische Mikroschüsseln oder 96-Well-Platten verteilt. Der Arbeitsablauf umfasst sieben Module: (1) Inokulumpräparation; (2) Kristallviolettfärbung zur Quantifizierung von Biomasse; (3) ultrastrukturelle Bildgebung mittels SEM; (4) dynamische Biofilmüberwachung mittels Zeitraffer-Phasenkontrastmikroskopie; (5) 3D-Visualisierung durch CLSM mit Live/Tot-Färbung; (6) zeitaufgelöste Quantifizierung von gebundenen und nicht-gebundenen Fraktionen während der Biofilmbildung mittels optischer Dichte; und (7) Untersuchung der funktionellen Rolle des Biofilms während der Infektion bei syrischen Hamstern. Dieser integrierte Ansatz ermöglicht eine multimodale Analyse der Biofilmentwicklung, Struktur und Pathogenität. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

2. Crystal Violet – Quantifizierung von Biofilmen auf Deckblättern oder Membranen

1. Im Inneren einer BSL2-Biosicherheitshaube verwenden Sie eine sterile Pinzette, um einen 12 mm sterilen Glasdeckmantel oder eine 0,1 μm sterile hydrophile Polycarbonatmembran flach auf den Boden jedes Lochs in einer sterilen 24-Bohrloch-Platte mit Deckel zu legen. Voreinweichen Sie die Membran/Glasdeckschicht für 2 Stunden bei 30 °C mit 1 ml sterilem EMJH.
   HINWEIS: Obwohl nicht unbedingt erforderlich, verbessert das Voreinweichen des Substrats in EMJH die Befeuchtung und verbessert die bakterielle Haftung leicht.
2. Entfernen Sie die Einweichlösung und geben Sie 1,5 ml der verdünnten bakteriellen Suspension (OD₄₀₅ = 0,02 ≈ 1 x 10^{6 Zellen} /mL) zu jedem Brunnen. Stellen Sie sicher, dass der Deckmantel oder die Membran am unteren Rand fest sitzt.
3. Inkubieren Sie die Platte bei 30 °C unter statischen Bedingungen in einer feuchten Atmosphäre, wobei ein mit Wasser gefülltes Tablett in den Inkubator gelegt wird, um die Verdunstung des Kulturmediums zu verhindern. Für langsam wachsende Stämme wird eine 3-wöchige Brutzeit empfohlen, um die Bildung eines ausgewachsenen, haftenden Biofilms zu ermöglichen.
4. Entfernen Sie zum gewünschten Zeitpunkt sorgfältig so viel Kulturmedium wie möglich aus jedem Brunnen, ohne den Biofilm zu stören. Spülen Sie jeden Brunnen vorsichtig mit 1 ml steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), um nicht haftende Zellen zu entfernen, wobei der Deckmantel flach am Brunnenboden bleibt, um eine Ablösung empfindlicher Biofilmzellen zu vermeiden. Unter diesen Bedingungen findet das Biofilmwachstum überwiegend auf der Oberseite des Deckschichts statt, mit minimalem Wachstum an der Unterseite, sodass das Spülen ohne Heben ausreicht, um die oberflächengebundenen Zellen für nachgelagerte Analysen zu bereichern.
   HINWEIS: Biofilme sind in diesem Stadium extrem empfindlich und können leicht versehentlich aspiriert werden. Das Pipettern sollte langsam und präzise entlang der Wand des Brunnens erfolgen, um eine Störung des Biofilms zu vermeiden.
5. Biofilmproben fixieren, indem Sie 1 ml 4%-Paraformaldehyd (PFA) in PBS bei 37 °C für 30 Minuten hinzufügen. Entfernen Sie das Fixativ und spülen Sie vorsichtig zweimal mit 1 ml PBS.
   HINWEIS: Zur Fixierung wurde eine 4%ige Formaldehydlösung frisch vorbereitet (16% methanolfreier Bestand, verdünnt 1:4 in PBS) und nach Gebrauch entsorgt, da die Polymerisation zu Paraformaldehyd die Vernetzungsaktivität reduziert.
6. Geben Sie 1 ml 0,1 % (w/v) Crystal Violet (CV)-Lösung zu jedem Brunnen und inkubieren Sie 15 Minuten bei Raumtemperatur, wobei sichergestellt wird, dass die Membran oder der Deckdeckel vollständig abgedeckt ist.
7. Entsorge den Farbstoff und spüle zweimal mit 1 ml PBS.
   HINWEIS: Kristallviolett und Paraformaldehyd (PFA) sind giftig und können Haut und Augen reizen. Trage immer Handschuhe und behandle beide Chemikalien mit Vorsicht, vorzugsweise in einer Abzugshaube. Entsorgen Sie Abfälle in ausgewiesenen Behältern mit gefährlichen Farbstoffen oder chemischen Abfällen gemäß den institutionellen Sicherheitsrichtlinien.
8. Neigen Sie die Platte und lassen Sie die Restflüssigkeit ablaufen. Lufttrocknen Sie die Brunnen bei Zimmertemperatur, bis das Substrat vollständig trocken erscheint (≥ 4 Stunden, vorzugsweise über Nacht).
   HINWEIS: In diesem Stadium können punktartige oder retikulierte Strukturen auf der Deckungs- oder Membranoberfläche sichtbar sein (Abbildung 2A).
9. Fügen Sie jedem Bohrloch einen 500 μL Elutionspuffer (50 % Ethanol, 50 % Gletscheressigsäure (Vol/Vol)) hinzu. Inkubiere den Teller 15 Minuten lang. Pipette auf und ab, um das Kristallviolett, das an den Biofilm gebunden ist, vollständig aufzulösen.
10. Transferiere 200 μL jeder Probe in eine optisch klare 96-Well-Mikroplatte und messe die Absorption bei 570 nm. Subtrahieren Sie einen reinen Substrat-Blank, der durch Bearbeitung eines uninokulierten Deckmantels oder einer Membran durch Fixierung, CV-Färbung, Washes und Eluation hergestellt wird, um die intrinsische Bindung/Hintergrund zu entfernen. Notieren Sie den Mittelwert ± Standardabweichung für mindestens drei technische Replikate. Verdünnen Sie Proben mit Elutionspuffer, wenn die Absorptionsfähigkeit den linearen Bereich des Spektrophotometers überschreitet.

3. Biofilmvisualisierung mittels Rasterelektronenmikroskopie (SEM)

1. Im Inneren einer BSL2-Biosicherheitshaube verwenden Sie eine sterile Pinzette, um einen 12 mm sterilen Glasdeckmantel oder eine 0,1 μm sterile hydrophile Polycarbonatmembran flach auf den Boden jedes Lochs in einer sterilen 24-Bohrloch-Platte mit Deckel zu legen. Voreinweichen Sie die Membran/Glasdeckschicht für 2 Stunden bei 30 °C mit 1 ml sterilem EMJH.
2. Entfernen Sie die Einweichlösung und geben Sie 1,5 ml der verdünnten bakteriellen Suspension (OD₄₀₅ = 0,02 ≈ 1 x 10^{6 Zellen} /mL) zu jedem Brunnen. Stellen Sie sicher, dass der Deckmantel oder die Membran am unteren Rand fest sitzt.
3. Inkubieren Sie die Platte bei 30 °C unter statischen Bedingungen in einem Feuchtigkeitsinkubator, um eine Verdunstung des Kulturmediums zu verhindern. Für langsam wachsende Stämme wird eine 3-wöchige Brutzeit empfohlen, um die Bildung eines reifen, haftenden Biofilms zu ermöglichen.
4. Entfernen Sie zum gewünschten Zeitpunkt sorgfältig so viel Kulturmedium wie möglich aus jedem Brunnen, ohne den Biofilm zu stören.
5. Anschließend spülen Sie jeden Brunnen vorsichtig mit 1 ml sterilem PBS, um verbleibende nicht haftende Zellen zu entfernen, wobei der Deckmantel flach am Brunnenboden bleibt, um empfindliche Biofilmzellen nicht abzutrennen. Unter diesen Bedingungen findet das Biofilmwachstum überwiegend auf der Oberseite des Deckschichts statt, mit minimalem Wachstum an der Unterseite, sodass das Spülen ohne Heben ausreicht, um die oberflächengebundenen Zellen für nachgelagerte Analysen zu bereichern.
   HINWEIS: Biofilme sind in diesem Stadium extrem empfindlich und können leicht versehentlich aspiriert werden. Das Pipettern sollte langsam und präzise entlang der Wand des Brunnens erfolgen, um eine Störung des Biofilms zu vermeiden.
6. Geben Sie eine Lösung aus 4 % Paraformaldehyd (PFA) und 1 % Glutaraldehyd im Natriumkakodylpuffer (0,2 M, pH 7,4) direkt in den Brunnen, um den Biofilm zu fixieren.
7. Inkubieren Sie 30 Minuten bei 37 °C, entfernen Sie dann das Fixativ und spülen Sie den Deckmantel oder die Membran zweimal mit PBS. Dieser Ansatz bewahrt den an der Oberfläche angehefteten Biofilm und minimiert die Ablösung, da das meiste Biofilmwachstum unter unseren Bedingungen auf der Oberseite des Deckschichts stattfindet.
   HINWEIS: Für die Fixierung wurde eine 4%ige Formaldehyd- und 1%ige Glutaraldehydlösung frisch hergestellt (16% methanolfreier Bestand, 1:4 im Natriumkacodylatpuffer verdünnt) und nach der Verwendung entsorgt, da die Polymerisation zu Paraformaldehyd die Vernetzungsaktivität reduziert.
8. Tauchen Sie das Substrat 1 Stunde lang in 1 % Osmiumtetroxid (OsO₄), verdünnt in PBS, um den SEM-Kontrast zu verbessern. Zweimal mit PBS abspülen.
9. Dehydrieren Sie die Proben, indem Sie sie nacheinander in graduierte Ethanolserien mit zunehmender Konzentration eintauchen: 25 %, 50 %, 70 %, 90 % und 100 % (v/v), jeweils für 10 Minuten.
10. Fügen Sie 500 μL Hexamethyldisilazan hinzu und inkubieren Sie 5 Minuten, ersetzen Sie dann durch frisches HMDS und inkubieren Sie weitere 5 Minuten. Entfernen Sie überschüssiges HMDS und lassen Sie die Probe vollständig unter der Dampfhaube an der Luft trocknen.
    HINWEIS: Glutaraldehyd, PFA, Natriumcacodylat, Osmiumtetroxid und Hexamethyldisilazan sind giftig und müssen unter einer chemischen Abzugshaube mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung behandelt werden.
11. Die getrockneten Proben werden auf SEM-Stubs mit doppelseitigem leitfähigem Kohleband montiert. Sputter-überziehen Sie die Proben mit einer dünnen Schicht (~10 nm) aus Gold oder Platin, um ausreichend Elektronenkontrast für die SEM-Bildgebung zu gewährleisten. Dies ermöglicht eine hochauflösende Visualisierung der Biofilmarchitektur, einschließlich Zell-Zell-Kontakte, extrazellulärer Matrixmorphologie, Dichte und Heterogenität, ohne zusätzliche Farbstoffe oder Färbungen zu benötigen.
12. Laden Sie die Stubs mit dem passenden Probenhalter in das SEM ein. Evakuieren Sie die Kammer über Nacht, wenn möglich, um die Bildgebungsqualität zu verbessern, und nehmen Sie dann Sekundärelektronenbilder mit 5 - 15 kV und geeigneten Vergrößerungen auf, um die Ultrastruktur des Biofilms sichtbar zu machen (Abbildung 2).

4. Zeitraffer-Phasenkontrastabbildung von wachsendem Biofilm

1. Pipette 500 μL des Arbeitsinokulums (OD₄₀₅ = 0,02 ≈ 1 x 10⁶ Zellen/mL; siehe Abschnitt 1) in eine sterile Hi-Q4-Schale mit 35 mm Glasboden, ausgestattet mit einem ebenen parallelen Deckel zur Beseitigung von Meniskusverzerrungen. Vermeiden Sie es, Blasen einzuführen, und schließen Sie die Schale sofort.
   HINWEIS: Die 35-mm-Glasboden-Hi-Q4-Schüssel enthält 4 verschiedene Kulturbereiche, die zur gleichzeitigen Abbildung von vier verschiedenen Bedingungen genutzt werden können. Weisen Sie ein Kompartiment dem sterilen EMJH-Medium als Negativkontrolle zu, und die drei anderen für technische Replikationen oder verschiedene Stämme/Mutanten.
2. Stellen Sie die Schale auf die Umweltstufe eines umgekehrten Mikroskops mit Phasenkontrastoptik, einem motorisierten Fokusantrieb (Biostation IMQ) und einem befeuchteten Gehäuse, das auf 30 °C und 95 % relative Luftfeuchtigkeit eingestellt ist. Diese Bedingungen helfen, die Verdunstung während der längeren Bildgebung (bis zu 8 Tage) zu minimieren.
3. Starten Sie die BioStation IMQ-Anwendung und öffnen Sie in der Hauptschnittstelle das Fenster Neue Zeitraffereinstellungen , um auf das Konfigurationspanel zuzugreifen. Überprüfen Sie vor Beginn des Experiments die Umweltparameter im Statusdisplay und stellen Sie sicher, dass sowohl die Kammer- als auch die Wassertemperaturanzeigen stabil anzeigen, um Frame-Drift während der Erfassung zu verhindern.
4. Auf dem Bildschirm Neue Zeitraffereinstellungen wählen Sie den Reiter Live aus und konfigurieren Sie die Bildparameter im Beobachtungsbedingungen-Panel , indem Sie Phasenkontrast (Ph) als Filter auswählen und die Vergrößerung auf 20x stellen.
5. Im Manuellen Modus passen Sie die Lichtintensität und Belichtungszeit ein, um den Kontrast zu optimieren und gleichzeitig Sättigung zu vermeiden. Überprüfen Sie dies mit dem Sättigungsprüf-Button . Definieren Sie vier Erfassungspunkte, die den Zentren der vier Kompartimente entsprechen.
6. Positionieren Sie die Bühne nacheinander über jedem Abteil mit dem Jog Dial oder indem Sie direkt im Live Observation Image Display klicken.
7. Verfeinere den Fokus mit den Fokus-Tasten und notiere jede Position, indem du auf den Time-lapse-Experiment-Punktregistrierungs-Button klickst. Die registrierten Punkte erscheinen als nummerierte blaue Rahmen im Beobachtungspunkt-Verifizierungsdisplay und werden im Punkte-Tab bestätigt.
8. Programmieren Sie den Erwerbsplan, indem Sie den Zeit-Tab öffnen und auf Neu klicken, um auf das Zeitraffer-Dialogfeld zuzugreifen, wo der Erwerbszyklus auf 30 Minuten und die Gesamtzeit auf 7 Tage gesetzt ist.
9. Nach dem Klicken auf Anwenden berechnet die Software automatisch die Anzahl der Erwerbsrunden. Aktivieren Sie den Autofokus, indem Sie mit der rechten Maustaste auf die Titelleiste klicken, die Einstellungen auswählen und den AF-Modus aktivieren, um sicherzustellen, dass Sie an jeder Bühnenposition neu fokussieren. Überprüfe die Konsistenz der Belichtungseinstellungen, des Gewinns und der Lichtintensität über alle Punkte hinweg und speichere dann die gesamte Konfiguration mit dem Speichern-Button .
10. Starten Sie die Erwerbung, indem Sie auf Zeitraffer starten. Die Software wechselt automatisch zu den Zeitrafferbildern, was eine kontinuierliche Überwachung des Aufnahmefortschritts und der Kammerstabilität während des gesamten 7-tägigen Experiments ermöglicht. Alle Bilder werden automatisch im TIFF-Format im von der Software erstellten Experimentordner gespeichert.
11. Verarbeiten und quantifizieren Sie die Bildreihen, indem Sie die Bildstapel in FIJI importieren (Abbildung 3A, B, C).
12. Öffnen Sie die Bildstapel, die zu jeder Position gehören, über File > Import > Image Sequence und stellen Sie sicher, dass die Bilder chronologisch geladen werden.
13. Konvertiere die ausgerichteten Stacks in 8-Bit-Graustufen mit Image > Type > 8-Bit, um die Pixelintensität zu standardisieren.
14. Wenden Sie Schwellenwerte mit Image > Adjust > Threshold an, um bakterielle Biofilmregionen zu isolieren. Wende konsistente Schwellenwerte über alle Frames an, indem du Apply auswählst, und speichere dann das Ergebnis als binäre Maske mit Process > Binary > Make Binary.
15. Quantifizieren Sie mit Analysieren > Analysieren von Teilchen, wobei Parameter wie Fläche, Flächenprozent und mittlere Intensität erfasst werden.
16. Exportiere die Ergebnisse aus jedem Bild automatisch in eine Tabelle über das Ergebnisfenster (Datei > Als > .csv speichern) zur kinetischen Analyse. Alle Messungen werden als Anteil der vom Biofilm (Oberflächenabdeckung) abgedeckten Feldfläche ausgedrückt.

5. Biofilmvisualisierung mittels Konfokaler Rasterlasermikroskopie (CLSM)

1. Inokulieren Sie 1,5 ml des Arbeitsinokulums (OD₄₀₅ = 0,02 ≈ 1 x 10⁶ Zellen/mL; siehe Abschnitt 1) in eine sterile 35-mm-Glasbodenschale. Statisch in einer befeuchteten Box mit Wasserreservoir in einem Inkubator bei 30 °C inkubieren, bis das gewünschte Entwicklungsstadium erreicht ist (bis zu 21 Tage).
2. Zum gewählten Zeitpunkt aspirieren Sie das Medium vorsichtig langsam entlang der Schüsselwand, ohne den Biofilm zu stören. Spülen Sie einmal mit 2 ml sterilem PBS, um planktonische Zellen zu entfernen, wobei Sie äußerst vorsichtig sind, um den Biofilm nicht abzulösen oder zu stören.
3. Bereiten Sie Färbungslösungen vor, die mit unfixierten (lebenden) Biofilmen inkubiert werden müssen (vor der Fixierung durchführen).
   1. Für die lebende/tote Färbung fügen Sie 3 μL SYTO9 grüne fluoreszierende Nukleinsäurefärbung (1,67 mM) und 3 μL Propidiumiodid (18,3 mM) zu 10 mL PBS hinzu, um eine Färbungslösung zu erzeugen. Gib 200 μL der Färbungslösung direkt auf die biofilmbildenden Bakterien, inkubiere dann 30 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln und spüle einmal in PBS.
   2. Lebende Zelltracer kann auch verwendet werden, um die Zellen vor der Fixierung zu färben. Inkubieren Sie lebende Zellen mit einem 10 μM CFDA/SE-Tracer für 30 Minuten. Alternativ kann auch eine Beschriftung der Membranen mit FM4-64 bei einer Konzentration von 5 μg/mL verwendet werden. Einmal in PBS abspülen.
4. Fixieren Sie den Biofilm, indem Sie 2 ml einer 4%igen Paraformaldehydlösung in PBS hinzufügen und 30 Minuten bei 37 °C inkubieren. Entferne das Fixativ und spüle zweimal mit PBS.
5. Fügen Sie einen Tropfen Antifade-Montagemedium hinzu, um den Biofilm zu bedecken und Blasen zu vermeiden.
6. Z-Stacks auf einem invertierten konfokalen Mikroskop mit einem abstimmbaren Weißlichtlaser (WLL) und einem HC PL APO CS2 63×/1,4 NA Ölimmersionsobjektiv. Für CFDA/SE stellen Sie die Anregung auf 488 nm ein und sammeln Sie Emissionen zwischen 500 und 550 nm, wobei ein Loch von 1 Airy-Einheit (AU) verwendet wird. Für FM4-64 stellen Sie die Anregung auf 561 nm ein und detektieren Sie Emission zwischen 630-700 nm, ebenfalls mit einem 1 AE kleinen Nadelloch.
7. Erfassen Sie Z-Stacks in Abständen von 0,5 bis 1,0 μm über die gesamte Biofilmdicke. Passen Sie die Laserleistung und den Detektorgewinn an, um den Dynamikumfang zu maximieren und gleichzeitig Sättigung zu vermeiden (<1 % gesättigte Pixel).
8. Verwenden Sie Linienmittelung (2-4×), um das Signal-Rausch-Verhältnis zu verbessern und alle Bildparametern (Laserleistung, Detektorbandbreite, Lochgröße, Scangeschwindigkeit) über die Proben hinweg konstant zu halten.
9. Speichere Bildstacks als 12-Bit-Dateien und exportiere sie im .lif-Format für quantitative Analyse in FIJI (ImageJ).
   HINWEIS: Vor der Bildgebung sollten Mikroskopeinstellungen (z. B. Laserleistung, Detektorverstärkung, Nadellochgröße) mit Kontrollproben standardisiert werden, die mit denselben Farbstoffen gefärbt sind. Dieser Kalibrierungsschritt ist unerlässlich, um die Variabilität zwischen den Erwerbungen zu minimieren und einen zuverlässigen Vergleich zwischen Experimenten zu ermöglichen.
10. Verarbeiten und quantifizieren Sie konfokale Bildstapel mit FIJI, das mit dem COMSTAT-Plugin (oder einer gleichwertigen 3D-Analysesoftware) ausgestattet ^ist10. Misse Biovolumen, Mittel- und Maximaldicke, Oberflächenabdeckung sowie das Verhältnis von lebenden zu toten Flächen (oder andere vordefinierte Kennzahlen). Exportrepräsentative orthogonale Ansichten und Maximum-Intensitätsprojektionen zu illustrativen Zwecken (Abbildung 3D, E).

6. Zeitaufgelöste Quantifizierung von angehefteten und nicht-gebundenen Fraktionen während der Biofilmbildung in 96-Well-Mikrotiter-Assays

1. Inokulieren Sie 200 μL des Arbeitsinokulums (OD₄₀₅ = 0,02 ≈ 1 x 10⁶ Zellen/mL; siehe Abschnitt 1) in die Brunnen einer 96-Well-Platte. Inkubieren Sie statisch bei 30 °C bis zum gewünschten Zeitpunkt (Tag 3, 5, 7, 10, 12, 14, 17 oder 21).
   HINWEIS: Randeffekte und Verdunstung sind bei Verwendung von 96-Well-Platten häufig, insbesondere wenn der Inkubator keine Feuchtigkeitsregelung hat. Um diese Auswirkungen zu minimieren, geben Sie 200 μL steriles destilliertes Wasser zu allen peripheren Bohrlöchern. Zusätzlich wurden Platten in eine befeuchtete Box mit einem Wasserreservoir platziert, das dann im Inkubator platziert wird, um die Verdunstung weiter zu reduzieren und eine gleichmäßige Luftfeuchtigkeit in den Brunnen zu gewährleisten.
2. Zu jedem Zeitpunkt bereiten Sie drei Beispielarten vor:
   1. Totale Suspension – Homogenisieren Sie den gesamten Inhalt eines Brunnens mit dem Biofilm, indem Sie sanft mehrmals auf und ab pipettieren, um Blasenbildung zu vermeiden. Dieser Anteil repräsentiert die gesamte bakterielle Population, einschließlich sowohl nicht gebundener Leptostürme als auch solcher innerhalb des semi-adhärenten Biofilms. Dieser Homogenisierungsschritt hilft, Zellaggregate zu zerstreuen, die nachfolgende Absorptionsmessungen beeinträchtigen könnten.
   2. Flüssigphase – Aus einem zweiten Brunnen werden vorsichtig 180 μL des Supernatanten entfernt, ohne die Biofilmschicht zu stören. Übertragen Sie in ein leeres Bohrloch und fügen Sie 20 μL frisches EMJH-Medium hinzu. Sanft mehrmals auf und ab pipetieren, um Zellaggregate zu verteilen. Dieser Anteil repräsentiert die nicht gebundenen Zellen in der flüssigen Phase, die sowohl frei schwebende Leptostürme als auch abgetrennte Biofilmaggregate umfassen kann.
   3. Biofilm – Im selben Brunnen, der für Schritt 2.2 verwendet wurde, wird der verbleibende Biofilm wieder suspendiert, indem man 180 μL frisches EMJH-Medium hinzufügt und mehrmals sanft auf und ab pipettiert. Dieser Anteil entspricht Leptostürmen innerhalb des Biofilms.
3. Missen Sie die Absorption jeder Suspension bei 405 nm mit einem Spektrophotometer, nachdem sichergestellt wurde, dass jedes Bohrloch vollständig homogenisiert wurde, und zeichnen Sie die Werte auf, um ein repräsentatives Diagramm zu erstellen (Abbildung 4A).

7. Untersuchung der funktionellen Rolle des Biofilms während der Wirtsinfektion

1. Inokulieren Sie 200 μL des Arbeitsinokulums (OD₄₀₅ = 0,02 ≈ 1 x 10⁶ Zellen/mL; siehe Abschnitt 1) in die Brunnen einer 96-Well-Platte. Inkubieren Sie statisch bei 30 °C, bis das gewünschte Entwicklungsstadium erreicht ist (bis zu 21 Tage).
2. Um die Inokulumkonzentration zu bestimmen, werden spezielle "Biofilm-Kontrollbrunnen" vorgesehen, die ausschließlich zur Wachstumsüberwachung und nicht zur Tierinjektion verwendet werden. Sobald der Biofilm makroskopisch sichtbar ist, entfernen Sie vorsichtig 180 μL Supernatant aus einem Kontrollbrunnen, ohne den Biofilm zu stören. Ersetzen Sie durch 180 μL frisches EMJH-Medium, suspendieren Sie die Biofilmaggregate vorsichtig wieder, ohne Blasen zu erzeugen, und messen Sie den OD₄₀₅ , um die bakterielle Konzentration zu schätzen.
   HINWEIS: Grundsätzlich könnte das Reinigen der Brunnen vor der Quantifizierung helfen, nicht haftende Zellen zu entfernen. Da Leptospira-Biofilme jedoch eine schwache Haftung in 96-Well-Platten aufweisen, würde das Waschen zu einem unkontrollierten Verlust von Biofilmmaterial führen. Aus diesem Grund wurde der Resuspensionsschritt ohne vorherige Wäsche durchgeführt, um die Reproduzierbarkeit zwischen den Brunnen und konstante Bakterienkonzentrationen sicherzustellen.
   Biofilm-Kontrollbrunnen enthalten typischerweise ~2 x 10^{× 8} Leptospires, die als Standardinokulum für Hamsterinfektionsexperimente ausgewählt wurden. Diese Konzentration definiert auch die Zielzahl der planktonischen Leptospires, die als Kontrolle verwendet werden. Wenn sie einbezogen werden, werden planktonische Kontrollen durch frisches Subkultivieren von Leptospira im EMJH-Medium unter Schüttelbedingungen bei 30 °C für bis zu 5 Tage vorbereitet, entsprechend der mittleren bis spätexponentiellen Wachstumsphase, die eine ähnliche Zelldichte ergibt.
3. Für die Impfung von Tieren verwenden Sie separate Biofilm-Brunnen (nicht die Kontrollbrunnen). Entfernen Sie vorsichtig 180 μL Supernatant aus den Bohrungen, um die meisten Flüssigkeitsphasen-Leptostürme zu eliminieren.
4. Sammeln Sie die verbleibenden 20 μL enthaltenden Biofilmaggregate mit einer 200 μL Pipettenspitze auf, um eine Störung der Struktur zu vermeiden.
   HINWEIS: Der Biofilm ist zerbrechlich. Stellen Sie sicher, dass die Aggregate vor und nach der Sammlung sichtbar sind. Bereiten Sie zusätzliche Brunnen vor, falls Wiederholungen erforderlich sind.
5. Übertragen Sie die Aggregate in eine vorgefüllte Spritze mit 300 μL frischem EMJH-Medium. Lass die Aggregate durch die Schwerkraft absinken.
6. Setzen Sie eine 21-G-Nadel an und stoßen Sie vorsichtig überschüssiges EMJH aus, bis ein Endvolumen von 200 μL erreicht ist. Stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen zurückbleiben und Biofilmaggregate sichtbar bleiben.
   HINWEIS: Das Warten auf Aggregate minimiert den Verlust während der Volumenanpassung. Vor der Anwendung in vivo sollten die Aggregate nach dem Durchgang durch eine 21-G-Nadel intakt bleiben (Abbildung 4C, D).
7. Führen Sie eine intraperitoneale Injektion von 2 x 10⁸ Leptostürmen in einem 200 μL EMJH-Medium durch.
   HINWEIS: Verwenden Sie 7-8 Wochen alte goldene syrische Hamster (beide Geschlechter), die unter normalen Unterbringungsbedingungen gehalten werden. Bei negativen Kontrollen injizieren Sie nur 200 μL EMJH-Medium (ein Tier pro Replikat).
8. Überwachen Sie die Tiere zweimal täglich bis zu 21 Tage lang auf klinische Anzeichen einer Leptospirose (zerzaustes Fell, Niederlage und verminderte Reaktion auf Stimulation). Euthanasiere sofort durch Kohlendioxidinhalation, wenn Leiden beobachtet wird, und notiere die Zeit der Euthanasie als Todeszeitpunkt.
9. Am 21. Tag werden alle überlebenden Tiere eingeschläfert.
   HINWEIS: Führen Sie drei unabhängige biologische Replikationen mit Kulturen durch, die an verschiedenen Daten erstellt werden. Jede Replikation umfasst zwei Tiere pro Erkrankung und ein Kontrolltier.

Results

Wenn das Inokulum korrekt vorbereitet ist, treten die Kulturen innerhalb von 3–5 Tagen in die mittlere Logaritmart-Phase ein und zeigen_OD-405-Werte von ~ 0,2–0,4 mit hellen, stark beweglichen Feldern unter Dunkelfeldmikroskopie (≥ 90 % der beweglichen Zellen) und ohne sichtbare Klumpen. Suboptimale Präparate zeigen sich als träge Bakterien und heterogene Beweglichkeit im gesamten Feld; solche Kulturen liefern häufig schwache Biofilme und sollten verworfen werden. In der Praxis minimiert das gleichzeitige Überprüfen von Motilität und OD direkt vor der Aussaatung misslungene Durchläufe. Die Einrichtung dieser Qualitätskontrolltore in der Inokulumphase ist der beste Prädiktor für den Erfolg in nachgelagerten Anwendungen. Obwohl die Methodik für L. interrogans serovar Manilae L495 optimiert war, wurden dieselben Verfahren auch auf den Stamm Leptospira biflexa Patoc angewandt, um die artübergreifende Anwendbarkeit zu demonstrieren. L. biflexa bildet im Allgemeinen weniger kohäsive und dünnere Biofilme als L. interrogans, dennoch bleiben die charakteristische Entwicklungssequenz und strukturellen Merkmale mit geeigneten Parameteranpassungen nachweisbar. Die Einbeziehung beider Arten unterstreicht somit die Anpassungsfähigkeit des Arbeitsablaufs an pathogene und saprophytische Leptospira gleichermaßen .

Nach 21 Tagen statischer Brutzeit bei 30 °C in einer befeuchteten Kammer (bzw. der entsprechenden Dauer für die verwendete Leptospira-Art ) werden Biofilme sowohl auf Glasdeckfolien als auch auf hydrophilen Polycarbonatmembranen mit bloßem Auge sichtbar. Ein erfolgreiches Wachstum erzeugt nach 2–3 Wochen charakteristische CV-Muster, wie punktartige, verzweigte oder netzförmige Fußabdrücke, die an der Oberfläche befestigt sind (Abbildung 2A).

In einem typischen Durchlauf erreicht Wildtyp-L.-Interrogans Manilae L495 bis Woche 3 ~ 50 % Oberflächenabdeckung, während das Plateau der Mutanten mit niedrigem Biofilm bei etwa ~ 20 % und die Phenotypen mit hohem Biofilm auf ~70–80 % heranreichen und so einen praktischen Dynamikbereich für das Screening schaffen. Das Ausmaß der Biofilmbildung kann ebenfalls je nach Leptospira-Art und -stamm variieren; zum Beispiel entwickelt der L. biflexa Patoc-Stamm sichtbare Biofilme schneller, wobei frühere Studien bereits 120 Stunden nach der Impfung Strukturen als reife Biofilme³⁵ betrachteten.

Die Kristallviolettfärbung bietet eine zuverlässige und reproduzierbare Methode zur Quantifizierung der Biofilmbiomasse. In gut entwickelten Biofilmen führt die Färbung zu einer tiefvioletten Färbung, die auf den Bereich der Deckschicht oder Membran lokalisiert ist und auf hohe Mengen an angehefteter Biomasse hinweist (Abbildung 2A). Visuelle Hinweise während der Färbungs- und Lösungsschritte liefern ebenfalls nützliche Indikatoren für den Erfolg des Protokolls. Beispielsweise kann eine ungleichmäßige Verteilung des CV oder blasse Verfärbungen durch Untersäung, Verdunstung oder aggressives Waschen verursacht werden, das frühe Biofilme löst.

Absorptionswerte bei 570 nm spiegeln die Menge der zurückgehaltenen Färbung wider und damit die relative Biofilmdichte (Abbildung 2B). In repräsentativen Experimenten zeigen L. interrogans-Kulturen , die unter optimalen Bedingungen gezüchtet wurden, konsistente und reproduzierbare OD₅₇₀-Werte über Replikate hinweg, was eine stabile Biofilmbildung widerspiegelt. Im Gegensatz dazu werden häufig große Unterschiede zwischen Replikaten beobachtet, wenn Proben während der Mediumwechsel übermäßig pipettiert werden, was auf eine schlechte Haftung oder eine partielle Biofilmablösung hinweist. Eine solche Variabilität sollte als Zeichen technischer Probleme betrachtet werden, und die betroffenen Proben sollten ausgeschlossen oder das Protokoll sorgfältig überprüft werden. Bemerkenswert ist, dass L. biflexa Patoc unter ähnlichen Bedingungen umfangreichere Biofilme sowohl auf Glasdeckfolien als auch auf Polycarbonatmembranen bildet, was sich in höheren CV-Absorptionswerten widerspiegelt und zeigt, dass das Protokoll anpassungsfähig und wirksam bei Leptospira-Arten ist.

Eine erfolgreiche SEM-Vorbereitung kann bereits ab Tag 3 extrazelluläre Matrixablagerungen aufdecken, gefolgt von einer auffällig polarisierten Architektur in reifen Biofilmen: eine raue, kanalisierte Basalfläche (oft mit > 5 μm Kanälen), die eine poröse innere Struktur verankert, und eine glattere apikale Fläche, in der Spirocheten in dichter Matrix eingegliedert sind (Abbildung 2C, D, E, F). Hochvergrößerungsfelder erfassen häufig verzweigte extrazelluläre Filamente und gelegentlich pilzähnliche Vorsprünge; Merkmale, die den Koaleszenzdynamiken im Zeitraffer entsprechen (Ergänzungsvideo 1). In suboptimalen Präparaten können kollabierte Matrizen, Ladung und undeutliche Zellumrisse beobachtet werden, die meist auf unzureichende Nachfixierung, unzureichende leitfähige Beschichtung oder schlechte Trocknung hinweisen. Wenn basal-apikale Polarität und durchdringende Kanäle sichtbar sind, stimmen SEM-Anzeigen eng mit konfokalen Schätzungen von Dicke und Porosität überein, was die erfolgreiche Durchführung sowohl der Präparation als auch der Bildgebung bestätigt.

In effektiven Zeitrafferreihen erscheinen isolierte Puncta innerhalb von 24–72 Stunden und verschmelzen schrittweise zu größeren Aggregaten, die über die Oberfläche schwingen, bevor Platzbeschränkungen ihre Bewegung verlangsamen (Abbildung 3A, B, C). Quantitative Segmentierung führt zu einer monotonen Zunahme der insgesamt abgedeckten Fläche, während die Gesamtzahlen steigen, ihren Höhepunkt nehmen und dann abnehmen, wenn Kollisionen und Fusionen zwischen ~12 und 216 Stunden dominieren. Diese Kinetik (Fläche nach oben, Anzahl der Aggregate nach unten) deuten auf aktive Akkretion und nicht auf einfache Sedimentation hin. Fehlgeschlagene oder grenzwertige Runs fehlen frühe Puncta, zeigen flache Flächen-über-Zeit-Kurven oder leiden unter Fokus-Drift, die durch instabile Temperatur/Luftfeuchtigkeit zusammenhängt. Die Aufrechterhaltung einer stabilisierten 30 °C-Umgebung mit 95 % Luftfeuchtigkeit und der Einsatz von Autofokus zu jedem Zeitpunkt stellen in der Regel klare Flugbahnen wieder, die sich für den Vergleich von Mutanten oder Behandlungen eignen.

Repräsentative Z-Stacks aus reifen Biofilmen zeigen schaumartige, mehrschichtige Architektur, typischerweise über 50 μm Dicke, wobei die meisten Zellen lebend färben (SYTO 9-positiv) und gelegentlich zentrale Hohlräume auf kollektive Umlagerungen während des Wachstums hinweisen (Abbildung 3D). Matrixproben können zur Untersuchung der Matrixzusammensetzung verwendet werden: WGA hebt Polysaccharid-Epitope hervor, BOBO-3-Markierungen reichlich extrazelluläre DNA und proteinselektive Färbungen liefern wenig externe zellassoziierte Signale (Abbildung 3E). Suboptimale Ergebnisse umfassen dünne oder diskontinuierliche Stacks, die von Propidiumiodid, starker Photobleaching oder inkonsistenten Verstärkungseinstellungen dominiert werden, was die quantitative Vergleichbarkeit untergräbt. Die gemeinsame Interpretation von Dicke, Biovolumen und Live/Tot-Verhältnissen (unter Berücksichtigung von Laserleistung, Detektorverstärkung und Pinhole-Konstanten unter den Bedingungen) bestätigt den Reifestatus und unterstützt direkte Vergleiche mit SEM-Ultrastruktur und CV-Biomasse.

Der Biofilm-Entstehungsprozess von Leptospira folgt typischerweise unterschiedlichen Phasen, wobei die genauen Zeitpunkte und Werte je nach Art oder Stamm variieren können. Unter Verwendung des L. interrogans-Stamms Manilae L495 als Referenz beinhaltet der erwartete Verlauf über 21 Tage eine Anfangsphase (Tage 0–3), in der die Bakterien überwiegend planktonisch bleiben und nur minimale Biofilme haben (Abbildung 4A). Darauf folgt eine exponentielle Wachstumsphase (Tage 3–7), in der sowohl planktonische als auch biofilmassoziierte Bakterien zunehmen und etwa 9 x 10⁸ Zellen/mL erreichen, begleitet von der Bildung und Expansion von Biofilmaggregaten. Zwischen Tag 7 und 12 nehmen planktonische Bakterien deutlich ab, während biofilmassoziierte Zellen ihren Höhepunkt erreichen und etwa 80 % der Population ausmachen. Schließlich nimmt während der Reifungsphase (Tage 12–21) die Anzahl der Biofilmbakterien ab, ohne dass die Planktonzellen zunimmt, doch die Größe und Komplexität des Biofilms wachsen weiter. Die Beobachtung dieser Abfolge von Veränderungen zeigt, dass das Protokoll die dynamische Entwicklung und Reifung von Leptospira-Biofilmen effektiv erfasst.

Bei richtiger Ausführung verwendet das Infektionsprotokoll Inokula mit ~2 x 10⁸ Leptostürmen in 200 μL EMJH, die aus gut definierten planktonischen (5-Tage-) oder Biofilmkulturen (21-Tage) hergestellt werden. Obwohl diese beiden Kulturtypen unterschiedliche physiologische Zustände darstellen, ist dieser Unterschied beabsichtigt, da das Experiment bestimmen soll, ob Leptospira-Biofilme – gekennzeichnet durch verminderte metabolische Aktivität und strukturelle Differenzierung – die Fähigkeit behalten, eine Infektion zu initiieren. Dieser Kontrast wird durch transkriptomische Studien gestützt, die bedeutende Veränderungen in der Genexpression zwischen planktonischer und Biofilm Leptospira^35,36 zeigen. Biofilmaggregate werden sorgfältig entnommen, um ihre Struktur zu erhalten und nach dem Durchgang durch eine 21-G-Nadel intakt zu bleiben, wie vor der Injektion bestätigt (Abbildung 4C, D). Nach der intraperitonealen Injektion zeigen Goldene Syrische Hamster typischerweise klinische Anzeichen von Leptospirose innerhalb von 3 bis 5 Tagen (z. B. Lethargie, zerzaustes Fell, Prostration). Negative Kontrollen, die allein mit EMJH-Medium injiziert wurden, zeigen keine Anzeichen einer Erkrankung. Der Verlauf und die Schwere der klinischen Symptome sowie die Zeit bis zur Euthanasie variieren je nach Inokulum: Planktonische Bakterien verursachen oft frühere und akutere Symptome, während biofilmbasierte Aggregate eine verzögerte, aber anhaltende Infektion verursachen können (Abbildung 4B). Die zweimalige tägliche Überwachung von bis zu 21 Tagen ermöglicht es, den vollständigen Krankheitsverlauf festzustellen.

Abbildung 2. Kristallviolette Färbung, Quantifizierung und ultrastrukturelle Bildgebung von Leptospira-Biofilmen . (A) Kristallviolett (CV) Färbung von Biofilmen, die auf verschiedenen Substraten wachsen. CV-Färbung ermöglicht die Visualisierung der Biofilmarchitektur und der anfänglichen Ansatzmuster für verschiedene Arten und Substrate. i. L. Interrogans am Polycarbonatfilter; ii. L. biflexa am Polycarbonatfilter; iii. L. Verhöre auf Glasdeckel; iv. L. biflexa auf dem Glasdeckzettel. (B) Beispiel für quantitative Biofilmbildung, bewertet durch CV-Absorption (OD570 nm) über die Zeit für L. interrogans und L. biflexa. Diese kinetische Anzeige erfasst sowohl die frühe Adhäsion als auch die Dynamik der Biomassakkumulation und hebt Unterschiede im Biofilmwachstum zwischen pathogenen und saprophytischen Arten hervor. Diese Zahl wurde von²⁷ geändert. (C-E) Rasterelektronenmikroskopie (SEM) von L. interrogans-Biofilmen : (c) 3 Tage alter Biofilm, der frühe Mikrokolonienbildung und anfängliche extrazelluläre Matrixablagerung zeigt; (d) 14 Tage alter Biofilm, der eine ausgereifte Architektur mit umfangreicher Matrix und dreidimensionaler Organisation zeigt; (e-f) 3 Wochen alter Biofilm, der strukturelle Konsolidierung und Matrixreifung über längere Kultur zeigt. Diese Kombination aus CV-Färbung, quantitativen OD-Messungen und SEM-Bildgebung bietet einen umfassenden Überblick über die Entwicklung von Biofilmen – von der frühen Anhaftung bis zur reifen ultrastrukturellen Organisation – und ermöglicht einen direkten Vergleich zwischen Arten und Kulturdauern. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 3. Visualisierung der Leptospira-Biofilmbildung . Phasenkontrastbilder, die mit einer BioStation aufgenommen wurden, zeigen die Entwicklung von Biofilmen bei (A) 48 Stunden, (B) 96 Stunden und (C) 144 Stunden. (D) CLSM-Rekonstruktion eines Leptospira-Biofilms , der das Gesamtvolumen mit orthogonalen Schnitten für 3D-Visualisierung darstellt. (E) Konfokale Färbung eines reifen Biofilms mit DAPI (grün) und WGA (rot), wobei bakterielle Gewebe und extrazelluläre Matrixkomponenten hervorgehoben werden. Diese Zahl wurde von³⁷ geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 4. Zeitaufgelöste Quantifizierung planktonischer und Biofilmfraktionen sowie funktionelle Bewertung von Leptospira-Biofilmen . (A) Kinetik der Biofilmbildung, gemessen durch Absorption bei 405 nm. Für jeden Zeitpunkt wurden Messungen aus dem Gesamtbrunnen, dem Biofilmanteil und dem Überstandsstoff mit planktonischen Leptostürmen entnommen, was eine Unterscheidung zwischen angehefteten und frei schwimmenden Bakterien ermöglichte. (B) Beispiel-Überlebenskurven von Hamstern, die mit Biofilmaggregaten, planktonischen Leptostürmen oder EMJH-Kontrolle injiziert wurden. Biofilm-injizierte Tiere zeigen eine verminderte Virulenz, einige überleben 21 Tage, während planktonische Leptostürme eine schnelle Sterblichkeit verursachen. (C-D) Vorläufige Validierung der Biofilm-Integrität: Aggregate sind vor der Injektion (C) in der Spritze sichtbar und bleiben nach Durchgang durch eine 21-G-Nadel (D, weiße Pfeile) intakt, was bestätigt, dass die Biofilmstruktur während der Handhabung erhalten bleibt. Diese Zahl wurde von³⁶ geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Discussion

Dieses Protokoll bietet einen modularen und integrativen Arbeitsablauf zur Untersuchung von Leptospira-Biofilmen, der quantitative Biomasse (Kristallviolett)^9,27, Dynamik (Zeitraffer-Phasenkontrast), dreidimensionale Zusammensetzung (konfokale Laserscanningmikroskopie mit gezielten Sonden)³⁸, Ultrastruktur (Rasterelektronenmikroskopie) und funktionelle Bewertung (Hamsterinfektion) integriert. Durch die Verwendung derselben Kulturreihe über Module hinweg werden Batch-Effekte minimiert und die Kreuzvalidierung innerhalb des Experiments ermöglicht, was besonders für langsam wachsende, empfindliche Spirocheten wichtig ist. Jedes Modul ergänzt die anderen: CV quantifiziert "wie viel", Zeitraffer zeigt "wie schnell", CLSM zeigt "was sich darin befindet", SEM erkennt "wie es gebaut ist" und In-vivo-Tests liefern einen "Funktionsnachweis". Die Aufnahme von L. biflexa zeigt die Anpassungsfähigkeit zwischen den Arten, hebt eine schnellere und dichtere Biofilmbildung hervor und betont methodische Flexibilität³⁵.

Der Erfolg jedes Moduls hängt von der Qualität des Inokulums und dem physiologischen Zustand ab. Planktonkulturen in der Mitte des Logements (3–5 Tage), hochbeweglich und frei von Aggregaten, liefern reproduzierbare Haftung und Biofilmentwicklung. Es sollten nur Isolate mit niedrigem Durchgang verwendet werden, um eine robuste Biofilmbildung und Reproduzierbarkeit zu gewährleisten.

Der CV-Test verankert den Arbeitsablauf durch seine Geschwindigkeit, Skalierbarkeit und^{Durchsatz von 9,27}. Es ermöglicht eine schnelle Screening von Mutanten, Medien oder Antibiofilmverbindungen. Da Leptospira-Biofilme jedoch fragil und heterogen sind, sind sanfte Manipulation und Replikationsvalidierung unerlässlich. CV kann kompakte von porösen Architekturen nicht unterscheiden oder Matrixzusammensetzung erkennen – daher seine Rolle als Screening-Gate für tiefere strukturelle Analysen.

Zeitrafferbildgebung überbrückt diese Lücke, indem Biofilm-Kinetik in Echtzeit sichtbar wird. Es erfasst das Entstehen, die Koaleszenz und die Immobilisierung von beweglichen Aggregaten und legt so vorübergehende Phänomene frei, die Endpunkt-Assays übersehen. Umweltstabilität (Temperatur, Luftfeuchtigkeit, Autofokus) ist entscheidend. Diese Aufzeichnungen haben gezeigt, dass selbst wenn die CV-Biomasse stabil erscheint, die Dynamik sich abweichen kann – was auf strukturelle Umlagerungen oder Lebensfähigkeitsverluste in tieferen Schichten hindeutet.

CLSM liefert volumetrische und chemische Einblicke ohne Dehydrationsartefakte³⁹. Die Färbung von Leben/Toten zeigt Zellviabilitätsgradienten im Biofilm, was mit Berichten über begrenzte Sauerstoffdiffusion und metabolische Stratifizierung ^6,40 übereinstimmt. Lektine und Nukleinsäurefarben legen reichlich an extrazellulärer DNA und spezifischen Glykanmotiven frei, was die Quantifizierung und Charakterisierung der Matrixkomponenten ^41,42 ermöglicht. CLSM-Daten zeigen häufig interne Lücken, die an die kollektiven Umstrukturierungen aus Zeitraffer³⁸ erinnern. Dennoch sind Einschränkungen die Spezifität der Sonden, das Photobleaching und die beugungsbegrenzte axiale Auflösung; Daher sollten Mikroskopeinstellungen und Farbstoffleistung im Voraus standardisiert und getestet werden, um zuverlässige, vergleichbare Ergebnisse zwischen den Experimenten sicherzustellen.

SEM bietet komplementäre ultrastrukturelle Resolution⁴³. In den frühen Stadien werden entstehende Aggregate aufgelöst; Bei der Reife (≈ 15–21 Tagen) zeigt sie eine polarisierte Architektur: eine raue, kanalisierte Basalschicht für Anker und Austausch sowie eine glattere, apikalmatrixreiche^{Oberfläche 37}. Sorgfältige Fixierung, HMDS-Trocknung und Korrelation mit konfokalen Daten mindern Artefakte durch Dehydrierung oder Kollaps⁴⁴.

Zusammen ermöglichen diese vier Module interne Kreuzvalidierung: Wenn CV, CLSM und SEM konvergieren, sind die Schlussfolgerungen robust; Wenn sie auseinandergehen, sind die Diskrepanzen selbst informativ – sie zeigen zum Beispiel eine erhöhte Biomasse mit verminderter Lebensfähigkeit oder eine unveränderte Biomasse mit veränderter Matrixzusammensetzung.

Mehrere intrinsische Einschränkungen bleiben bestehen. Leptospira-Biofilme sind heterogen und empfindlich, was sie empfindlich gegenüber Handhabung und Dehydrierung macht. CV integriert die Gesamtbiomasse, aber nicht die Lebensfähigkeit¹⁶; CLSM darf die optischen Grenzen^{von 38} nicht überschreiten; SEM birgt das Risiko von Vorbereitungsartefakten. Die Sterblichkeit in tieferen Schichten wird aufgrund von Sauerstoffgradienten⁶ erwartet, aber diese Verzerrung ist systematisch und unter allen Bedingungen vergleichbar. Die Reifung des Biofilms erreicht ein Plateau bei etwa 15–21 Tagen, was mit transkriptionellen Signaturen der Nährstoffbegrenzung³⁶ assoziiert ist. Spätere Phasen sind weiterhin schlecht charakterisiert.

In-vivo-Assays liefern funktionalen Kontext. Die intraperitoneale Injektion von Aggregaten testet, ob biofilmabgeleitete Zellen sich in Virulenz oder Persistenz von planktonischen Gegenstücken unterscheiden. Obwohl die intraperitoneale Impfung kein natürlicher Weg ist, bietet sie ein kontrolliertes Vergleichsmodell³⁶. Die aggregierte Heterogenität führt zu gewisser Varianz, aber eine konsequente Handhabung und die angepasste Inokulumgröße mildern dies. Wichtig ist, dass Biofilm-Persistenzmerkmale (z. B. ECM-vermittelte Stresstoleranz) nicht zwangsläufig zu einer verstärkten akuten Virulenz führen, was die ökologische statt pathogene Rolle der Biofilmbildung^hervorhebt.

Das modulare Design ermöglicht eine skalierbare Nutzung. Für ein schnelles Screening reichen Lebenslauf und Zeitraffer aus. Für mechanistische Einsichten fügen CLSM und SEM eine kompositorische und architektonische Auflösung hinzu. Module können enzymatische oder chemische Störungen (DNase, Glykosidase), alternative Sonden für Glykane oder Nukleinsäuren oder mikrofluidische Systeme zur Messung von Flussreaktionen integrieren. Dasselbe Inokulum kann transkriptomische oder proteomische Analysen liefern und direkt den Biofilm-Phänotyp mit der Regulation verknüpfen (z. B. c-di-GMP-Signalisierung, Hungerantwort). Dieses Rahmenwerk berücksichtigt außerdem Mutantenscreening, Umweltstörungstests sowie die Bewertung von Antibiofilm- oder Antivirulenzverbindungen.

Dieser integrierte Arbeitsablauf verwandelt isolierte Beobachtungen in ein kohärentes, multidimensionales Verständnis von Leptospira-Biofilmen. Durch die Kombination von Durchsatz (CV), Dynamik (Zeitraffer), Chemie und Tiefe (CLSM) sowie Ultrastruktur (SEM) erfasst der Ansatz die mobile, poröse und polarisierte Natur der Leptospira-Gemeinschaften mit Genauigkeit. Ausgehend von früheren Studien^{17, 35, 36} zeigt sie, dass koordinierte, modulare Experimente Phänomene offenbaren, die für Einzelmethodenstudien unsichtbar sind – wie etwa steigende Biomasse trotz sinkender Lebensfähigkeit oder divergente Kinetik zwischen Arten. Letztlich unterstützt dieser Ansatz vergleichende, reproduzierbare und funktional relevante Analysen über Arten, Mutanten und Bedingungen hinweg und bildet die Grundlage für mechanistische Mikrobiologie, ökologische Resilienz und Anti-Biofilm-Strategie.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1 &mikro; Sterile hydrophile Polycarbonatmembran	it4ip	1000M25/861N101/13
12 mm sterile Glasdeckfolie	SPL	330164
16% Paraformaldehyd (PFA)	Thermowissenschaftlich	28908
21G-Nadel	BD Medical	304432
24-Bohrloch-Mikroplatten	NUNC	143982
35 mm Glasboden-Schüssel	Ibidi	81218-200
35-mm-Glasboden-Hi-Q4-Schüssel	Ibidi	81156
96-Bohrloch-Mikroplatten	NEST	701001
Antifade-Montagemedium	Biorad	29410
Carbonbeschichter	Leica Microsystem	Em ACE600
CFDA/SE-Tracer	Biolegende	423801
Leitfähiger Kohlenstoffklebstoff	Elektronenmikroskopie-Wissenschaft	77816
Kristallviolett (CV)	Sigma	C3886
Dunkelfeldmikroskop	Leica Microsystem	11888846	Leica DM4000 B ausgestattet mit einem Dark Fiel Kondensator (Cat N&Deg; 11505142)
Ethanol	VWR Chemicals	83813.36
FM4-64	Invitrogen	T3166
Gletscheressigsäure	Supelco	1.00063
Glutaraldehydlösung	Sigma-Aldrich	G5882
Hexamethyldisilazan	Acros Organics	120581000
Inkubator	Memmert	IN30
Invertiertes konfokales Mikroskop	Leica Microsystem	Leica DMI6000 TCS SP8 X	Konfokalmikroskop SP8
Invertiertes Mikroskop mit Phasenkontrastoptik	Nikon	CELL-S2	BioStation IM-Q
Leptospira Medium Base EMJH	Becton Dickinson	BD  279410	EMJH-Medium für Leptospira
Osmiumtetroxid (OsO4)	Sigma	BCCG9181
Propidiumiodid	Biotium	40017
Rasterelektronenmikroskop	JEOL	JSM-IT300
Natriumkacodylatpuffer	Thermowissenschaftliche Chemikalien	15453149
Spektrophotometer Varioskan Lux	Thermowissenschaftlich	VLBL00GD0
Sterile phosphatgepufferte Kochsalzlösung	Biosolve	0016232301BS
Spritze (1 ml)	Chirana	CH03002L
SYTO9 grüne fluoreszierende Nukleinsäurefärbung	Invitrogen	S34854