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Ganzzell-Superauflösungsbildgebung mittels DNA-PAINT auf einer rotierenden Scheibe konfokal mit optischer Photonenumzuweisung

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DOI:

10.3791/69531

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6. Januar 2026

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1London Centre for Nanotechnology, University College London, 2Department of Chemistry, University College London

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt das Verfahren zur Durchführung der tiefen, ganzzelligen Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie (SMLM) mit einem rotierenden Scheibenkonfokalmikroskop mit optischer Photonenzuordnung, wodurch DNA-PAINT-Bildgebung ohne individuelle Optik oder komplexe Beleuchtung erforderlich ist.

Zusammenfassung

Die Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie (SMLM) ermöglicht nanoskalige Bildgebung zellulärer Strukturen, ist jedoch typischerweise auf Bildgebung in der Nähe des Coverslips beschränkt, da die totale interne Reflexionsfluoreszenz (TIRF) und die hochgeneigte und optische Blattbeleuchtung (HILO) eingeschränkt sind. Hier wird ein Protokoll präsentiert, das ein rotierendes Scheiben-konfokales Mikroskop mit optischer Photonen-Neuzuweisung (SDC-OPR) nutzt, um SMLM in ganzen Zellen durchzuführen. Diese Methode ermöglicht eine hochpräzise Einzelmolekülbildgebung im gesamten Zellvolumen unter Verwendung von DNA-Punkten für die Bildgebung in der nanoskaligen Topographie (DNA-PAINT), ohne dass spezielle Optiken oder komplexe Beleuchtungsschemata erforderlich sind. Das Protokoll bietet eine stufenweise Anleitung zur Konfiguration eines kommerziell erhältlichen Spinning-Disk-Mikroskops (z. B. CSU-W1 SoRA) für SMLM-Bildgebung, einschließlich für Tiefenbildgebung optimierter Erfassungsparameter. Probenvorbereitungsschritte sind beschrieben, um intrazelluläre Ziele mit DNA-konjugierten Sonden zu kennzeichnen, um DNA-PAINT-Bildgebung durchzuführen, einschließlich Strategien zur mehrfarbigen Bildgebung mehrerer Ziele. Auf die Bildaufnahme folgt eine Einzelmoleküllokalisierung und Rekonstruktion mit Standardsoftwarepaketen. Wichtige Überlegungen zur Minimierung des Hintergrunds, zur Optimierung der seitlichen Auflösung und zur Sicherstellung der Bildqualität über die gesamte Zelltiefe werden ebenfalls diskutiert. Dieses zugängliche Protokoll ermöglicht es Forschern, tiefe, ganzzellige SMLM mit Standard-Konfokalgeräten durchzuführen und erweitert so das Spektrum biologischer Fragestellungen, die durch Einzelmolekülbildgebung beantwortet werden können, über die nahen Membranregionen hinaus.

Einleitung

Die Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie (SMLM)1 ist eine Familie von Superauflösungstechniken, die eine nanoskalige Auflösung erreichen, indem sie die Emission einzelner Fluorophore zeitlich trennt und sie mit hoher Präzision lokalisiert. Ein erfolgreiches SMLM erfordert ein hohes Signal-Rausch-Verhältnis (SNR) zur Erkennung von Einzelmolekülereignissen, was seine Anwendung traditionell auf optische Setups mit intensiver, lokaler Anregung beschränkt hat. Die gebräuchlichsten Konfigurationen sind die Mikroskopie mit totaler innerer Reflexionsfluoreszenz (TIRF)2 und die hochgeneigte laminierte optische Beschichtung (HILO) 3. TIRF reduziert die Hintergrundfluoreszenz, indem ein evaneszentes Feld erzeugt wird, das selektiv Fluorophore innerhalb weniger Nanometer um den Deckmantel anregt und so unscharfe Beleuchtung unterdrückt. Diese Einschränkung macht TIRF jedoch ungeeignet für die Abbildung tieferer biologischer Strukturen, wie etwa Organellen, die in den extrazellulären Bereich reichen. Die HILO-Mikroskopie bietet größere Durchschlagstiefen und ermöglicht eine Bildgebung mehrere hundert Nanometer über dem Glassubstrat. Dies geht auf Kosten eines reduzierten Sichtfelds (FOV)4 und ungleichmäßiger Beleuchtung mit zunehmend höheren Ebenen, was seine Anwendbarkeit für größere zelluläre Strukturen einschränkt. In jüngerer Zeit haben Lightsheet-Mikroskopietechniken (LSM) wie Lattice Lightsheet 5,6,7 und Single Objective Single Plane Illumination Microscopy (soSPIM)8 SMLM auf volumetrische und gewebeskalige Bildgebung ausgeweitet. Durch die Formung des Anregungsstrahls in dünne, strukturierte Lichtschichten erreicht LSM eine optische Schnittung mit reduzierter Hintergrund- und Fototoxizität. SoSPIM erfasst in einer einzigen Belichtung Fokalebenen, die orthogonal zur Detektionsachse sind, was eine schnelle volumetrische Bildgebung mit nahezu isotroper Auflösung ermöglicht. Die soSPIM-Anwendung hat 3D-SMLM in ganzen Zellen und kleinen Organellen (>20 μm Tiefe) mit bis zu 40 nm isotroper Auflösung und minimalem unscharfem Hintergrund9 demonstriert. Trotz ihrer Stärken erfordern diese Methoden typischerweise transparente Proben, spezialisierte Optik und komplexe Ausrichtung und bleiben in dickeren Proben empfindlich gegenüber optischen Aberrationen und Streuung.

Konfokale Mikroskopie bietet eine Alternative, indem sie unscharfes Licht mittels eines Nadellochs vor dem Detektor unterdrückt, kombiniert mit strahlabtastenden Spiegeln10. Diese optische Schnittfähigkeit ermöglicht eine tiefe volumetrische Bildgebung mit hohem SNR. Insbesondere verbindet die Spinning-Disc-Konfokalmikroskopie (SDC) die Geschwindigkeit und Weitfelderkennung der herkömmlichen Bildgebung mit der Schnittkapazität von Punktabtastsystemen. Dies wird im herkömmlichen SDC durch die Einbindung einer rotierenden Scheibe mit parallelen Nadellöchern erreicht, oft kombiniert mit einem ausgerichteten Mikrolinsenarray. Die Mikrolinsen sammeln einen erheblichen Teil der emittierten Fluoreszenz und fokussieren ihn durch die Nadellöcher, was das Hintergrundsignal reduziert. Diese Konfiguration ermöglicht eine schnelle optische Schnittung ohne spezielle Optik oder zusätzliche Probenmontagevorbereitung, was sie zu einer robusten Wahl macht, die leicht implementiert und optimiert werden kann für die tiefe volumetrische SMLM-Bildaufnahme11.

In dieser Studie wird die CSU-W1-Spinning-Scheiben-Konfokalscanner-Einheit mit optischer Photonen-Neuzuweisung (SDC-OPR) eingesetzt. Im Gegensatz zum Standard-SDC führt SDC-OPR ein zweites Mikrolinsenarray ein, das die emittierten Photonen auf ein komplementäres Lochmuster12 projiziert, um Streuung zu verringern und Photonen zurückzugewinnen, die sonst verworfen würden. Diese Photonen-Neuzuweisung schärft effektiv die Punktstreufunktion (PSF) und verbessert die laterale Auflösung über die herkömmliche SDC hinaus, während weiterhin unscharfes Licht13 abgelehnt wird. Konkret lenkt das SDC-OPR-Mikrolinsenarray Photonen außerhalb der Achse zu ihren nächstgelegenen Ursprungspunkten um und erhöht damit effektiv die detektierte Fluoreszenzhelligkeit im Vergleich zu Standard-SDC. Darüber hinaus können die Auflösungsvorteile von SDC-OPR durch Bilddekonvolution verstärkt werden. Iterative Dekonvolutionsalgorithmen verfeinern die PSF rechnerisch, reduzieren den Hintergrund und verbessern das Signal-Hintergrund-Verhältnis, ohne Änderungen an der optischen Konfiguration erforderlich zu machen. Dieser kombinierte Ansatz bietet einen erheblichen Vorteil hinsichtlich der Lokalisierungspräzision gegenüber Standard-SDC für Einzelmolekül-Lokalisierungsexperimente14.

Hier wird ein robustes und reproduzierbares Protokoll zur Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie mit einem rotierenden Scheibenkonfokalmikroskop mit optischer Photonen-Neuzuweisung (SDC-OPR) präsentiert. Dieser Ansatz kombiniert die nanoskalige Präzision von DNA-PAINT mit der Geschwindigkeit, dem Sichtfeld und der Tiefendurchdringung der rotierenden Scheibenbildgebung. DNA-PAINT, eine Anpassung der Punktakkumulation zur Bildgebung der nanoskaligen Topographie (PAINT)15, basiert auf der vorübergehenden Hybridisierung fluoreszenzmarkierter "Imager"-Stränge mit komplementären "Docking"-Strängen, die an molekularen Zielen verankert sind. Diese reversiblen Bindungsereignisse erzeugen stochastische Fluoreszenzsignale, die präzise lokalisiert werden können, was eine hochauflösende Rekonstruktion der zellulären Ultrastruktur ermöglicht. DNA-PAINT ermöglicht die Verwendung hoch photostabiler Fluorophore, bietet abstimmbare Bindungskinetik zur präzisen Kontrolle von Bildgebungsbedingungen und mindert das Photobleaching durch die kontinuierliche Auffüllung der fluoreszierenden Imagerstränge16.

Um Reproduzierbarkeit und Spezifität sicherzustellen, setzt der Ansatz auf individuelle DNA-Antikörperkonjugate, die Andockstränge mit sekundären Antikörpern verbinden. Detaillierte Probenvorbereitungsschritte, einschließlich Antikörper-DNA-Konjugation, werden präsentiert, um robuste experimentelle Ergebnisse zu unterstützen. Das Protokoll wird an gut charakterisierten zellulären Strukturen wie Kernporenkomplexen (NPCs)17 und Mikrotubuli in festen Proben validiert und bietet einen Referenzpunkt zur Abschätzung der Rekonstruktionsgenauigkeit. Variationen in der Auflösung, quantifiziert durch Lokalisierungspräzision als Proxy, werden weiter als Funktion von Sichtfeld und Bildtiefe bewertet.

Darüber hinaus wird die Effizienz dieses Workflows für multiplexierte Bildgebung mit Exchange-PAINT18 demonstriert, einer Strategie, die eine sequentielle Visualisierung mehrerer Ziele mit demselben Farbstoff und einer einzigen Laserquelle auf Basis von DNA-PAINT ermöglicht. Der Exchange-PAINT-Workflow wird auf mehrfarbige Superauflösungsabbildung von Mitochondrien, Mikrotubuli und NPCs innerhalb derselben Probe angewendet.

Zusammen bietet dieses Protokoll umfassende Anleitung und wichtige Anpassungshinweise zur Antikörper-DNA-Konjugation, Probenvorbereitung, Bildgebungsbedingungen und Datenanalyse, sodass Forscher reproduzierbare DNA-PAINT-Bildgebung auf SDC-OPR durchführen können. Durch die Erweiterung der hochauflösenden Bildgebung über die Tiefen- und FOV-Begrenzungen von TIRF-basierten Ansätzen hinaus erweitert diese Methode die Anwendbarkeit von SMLM auf eine Vielzahl biologischer Kontexte.

Protokoll

Die Reagenzien und die verwendeten Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Vorbereitung von Puffern

  1. Zytoskelettpuffer (CB)-Präparation:
    1. Bereiten Sie 10 mM MES (pH 6,1) mit 150 mM NaCl, 5 mM EGTA, 5 mM D-Glukose und 5 mM MgCl2 in 1x gefilterter Phosphatpufferlösung (PBS) vor.
    2. Lagern Sie bei 4 °C und filtern Sie vor der Benutzung.
  2. 40-fache Protokatechuinsäure (PCA) Zubereitung:
    1. 154 mg PCA in 10 ml destilliertes, gefiltertes Wasser auflösen.
    2. Stellen Sie den pH-Wert mit NaOH auf 9,0 ein.
    3. Aliquot und maximal 6 Monate bei -20°C lagern.
      HINWEIS: Wenn ein Aliquot braun erscheint, werfen Sie ihn weg, da dies auf Oxidation hinweist.
  3. 100-fache Protocatechuat-3,4-Dioxygenase (PCD) Serienpräparation:
    1. Bereite eine 50%ige Glycerollösung mit 50 mM KCl, 1 mM EDTA und 100 mM Tris Puffer vor.
    2. Lösen Sie 2,2 mg PCD in 3,4 ml der Glycerollösung auf.
    3. Aliquot und bei maximal 6 Monaten bei -20 °C lagern.
  4. 100x Trolox-Schaft vorbereitet:
    1. Lösen Sie 50 mg Trolox (6-Hydroxy-2,5,7,8-Tetramethylchroman-2-Carboxylsäure) in 215 μL Methanol auf, bis die Lösung grün wird, in einer chemischen Abzugshaube mit geeigneter Schutzausrüstung (PSA).
    2. Gib 1,6 ml destilliertes, gefiltertes Wasser dazu. Lass die Lösung weiß werden und beginne zu erstarren.
    3. Fügen Sie 175 μL 1M NaOH 1M hinzu. Lass die Lösung wieder flüssig werden.
    4. In 10 μL-Volumina wird weiterhin 1 M NaOH hinzugefügt, bis die Lösung vollständig geklärt ist (etwa 40 μL).
    5. Aliquot und bei maximal 6 Monaten bei -20 °C lagern. Die erscheint gelblich.
      HINWEIS: Die endgültige 100x-Lösung hat einen pH-Wert von 11, aber die Verdünnung auf 1x führt zu einem pH-Wert von 7-8.
  5. Puffer C+
    1. Bereite 1 mM EDTA, 500 mM NaCl und 0,02% Tween-20-Lösung in 1x PBS vor.
    2. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,4 mit HCl und/oder NaOH nach Bedarf an.
    3. Optionale Trolox-Ergänzung: Fügen Sie die erforderlichen Mengen an PCA (40x), PCD (100x) und Trolox (100x) Lagern hinzu, um zu einer 1x-Verdünnung zu führen, lassen Sie die Lösung 1 Stunde bei Raumtemperatur (23 °C) ausgleichen, bevor Sie sie verwenden.
      HINWEIS: Bereiten Sie wöchentlich frisch vor. Wenn du Trolox verwendest, verwende es innerhalb von 4 Stunden nach dem Mischen.
  6. Immunfärbungspuffer (Paraformaldehyd PFA, Glycin und Triton):
    1. Für 4 % PFA-Vorbereitung aus einer 10 ml 16 % PFA-Ampulle:
      1. Innerhalb einer chemischen Abzugshaube öffnen Sie die Ampulle vorsichtig.
      2. Dekantieren Sie 10 ml 16 % PFA in ein 50 mL konisches Zentrifugalrohr.
      3. Führen Sie eine 1:4-Verdünnung in 1x PBS durch, um 4 % PFA zu erhalten, wobei sorgfältig ~30 ml 1x gefiltertes PBS zum dekantierten 16 % PFA hinzugefügt werden, sodass das Endvolumen ~40 ml beträgt.
      4. Aliquot in 1-mL Mikrozentrifugenröhren und bis zum Bedarf bei -20 °C lagern.
    2. Für 60 mM Glycin in PBS-Präparation:
      1. Wiegen Sie 225 mg Glycin in ein 50 ml konisches Zentrifugalrohr.
      2. Füge 50 ml 1x gefiltertes PBS hinzu.
      3. Vortex, bis es vollständig vermischt ist, und filtern.
      4. Lagern Sie bei 4 °C, bis sie benötigt werden.
    3. Für 0,1 % Triton X-100 Zubereitung:
      1. Zuerst bereiten Sie eine Arbeitsbrühe mit 10 % Triton X-100 vor, indem Sie 1 ml 100 % Triton X-100 in 9 ml 1x gefiltertes PBS (Endvolumen = 10 ml) verdünnen, pipettieren und langsam mischen, um Überblasen zu vermeiden. Lagern Sie bei 4 °C, bis sie benötigt werden.
      2. Von den 10 % Arbeitsmaterial fügen Sie 0,1 ml 10 % Triton X-100 auf 9,9 ml 1x gefiltertes PBS für den 0,1 % Endbestand hinzu, erneut langsam mischen. Lagern Sie bei 4 °C, bis sie benötigt werden.

2. Antikörper-DNA-Konjugation

  1. Konzentrieren Sie den Antikörper mit einer 100-kDa-Ultrafiltrations-Zentrifugalfilteranlage:
    1. Waschen Sie eine 100 kDa Ultrafiltrations-Zentrifugalfiltereinheit mit 100 μL 1x gefiltertem PBS für 30 Minuten bei 14.000 x g, 4 °C.
    2. Fügen Sie 100 μL Antikörper mit 200 μL 1x gefiltertem PBS zur zuvor gewaschenen 100 kDa Ultrafiltrations-Zentrifugalfiltereinheit hinzu, drehen Sie 30 Minuten bei 14.000 x g, 4°C. Stellen Sie sicher, dass die Antikörperkonzentration nach der Konzentration mit dem Ultrafiltrationszentrifugalfilter über 1,5 mg/mL liegt. Bei dieser Methode konzentriert der Ultrafiltrationszentrifugalfilter den Antikörper üblicherweise um ~3-fach.
    3. Invertiere die 100-kDa-Ultrafiltrations-Zentrifugalfiltereinheit in ein sauberes Rohr, drehe 6 Minuten bei 1000 x g, 4 °C. Das ist der konzentrierte Antikörper im PBS.
    4. Messen Sie das Volumen des konzentrierten Antikörpers (1 oder 2 μL), um die neue Konzentration zu berechnen, und führen Sie UV-Vis-Absorptionsspektren mit einem Mikrovolumen-UV-Vis-Spektrophotometer durch. Stellen Sie den Hintergrund auf 1x PBS ein und speichern Sie die Spektren.
  2. Reduzieren Sie den thiolierten DNA-Dockingstrang:
    1. 7,7 mg vorgewogenes DTT in 100 μL gefiltertes Wasser auflösen und in ein frisches Rohr übergeben.
    2. Fügen Sie 100 μL 3 mM EDTA in 1x PBS in die ursprüngliche Röhre DTT, Vortex, hinzu und übertragen Sie sie in dieselbe Röhre wie Schritt 2.2.1, was zu 200 μL 250 mM DTT in 1,5 mM EDTA in 1x PBS führt.
    3. Lösen Sie den thiolierten DNA-Dockingstrang in 1x gefiltertes PBS auf, um eine Endkonzentration von 1 mM zu erreichen. Nehmen Sie ein UV-Vis-Spektra der DNA-Andockstranglösung auf (verdünnt auf 10 μM in 1x PBS) auf und speichern Sie es mit dem Mikrovolumen-UV-Vis-Spektrophotometer.
    4. Mischen Sie 13 μL thiolierte DNA (1 mM) mit 30 μL DTT (250 mM) und schütteln Sie 2 Stunden bei Raumtemperatur (23 °C).
      HINWEIS: Lagern Sie alle verbleibenden ungenutzten DNA-Dockingstränge in 13 μL-Aliquoten bei -20 °C für zukünftige Reaktionen.
  3. Antikörperkonjugation zum Vernetzer:
    1. Lösen Sie den Malimid-PEG2-Succinimidylester-Crosslinker in DMSO auf 10 mg/mL (23,5 mM) auf. In 10 μL Aliquots bei -20 °C lagern, bis sie benötigt werden.
    2. Mische den konzentrierten Antikörper aus Schritt 2.1 mit 20-fachem molaren Überschuss des Querverbinders. Bebrüte 90 Minuten unter Schütteln bei 4 °C.
  4. Reinigen Sie Antikörper-Crosslinker-Filterung mit einer 7,0 KDa Spin-Entsalzungssäule, die Größenausschlussharz enthält (7 kDa Molekulargewichtsgrenze):
    1. Entferne den unteren Verschluss der 7,0 kDa Spin-Entsalzsäule und lockere den Deckel. Setze es in ein Protein-Mikrozentrifugenrohr mit niedriger Bindung. Zentrifugiere für 1 Minute bei 1500 x g, 4 °C.
      HINWEIS: Markiere nach dem ersten Dreh die Neigung des Harz. Für alle weiteren Anwendungen der Säule wird die Schräglage direkt nach außen auf die Zentrifuge gelegt. Tragen Sie Proben und Washes auf die Mitte auf und vermeiden Sie den Kontakt mit dem Harzbett.
    2. Fügen Sie 300 μL 1x gefiltertes PBS zum 7,0 kDa Spin-Entsalzungsfilter hinzu, lockern Sie die Kappe, zentrifugieren Sie 1 Minute bei 1500 x g, 4 °C. Wiederhole das noch zweimal.
      HINWEIS: Die 7,0 KDa Spin-Entsalzungssäule mit 300 μL 1x PBS lassen, bis die Antikörper-Crosslinker-Reaktion bereit ist; Lass die Säule nicht austrocknen.
    3. Entfernen Sie die letzten 300 μL PBS-Wasch, indem Sie erneut 1 Minute bei 1500 x g, 4 °C zentrifugieren.
    4. Tragen Sie die Antikörper-Crosslinker-Lösung tropfweise auf das Zentrum des Harzbetts auf. Setzen Sie die 7,0 kDa starke Spin-Entsalzungssäule in ein sauberes Mikrozentrifugenrohr und zentrifugieren Sie 2 Minuten bei 1500 x g, 4 °C. Das Antikörper-Quervernetzerprodukt befindet sich nun im Mikrozentrifugenrohr; Bleib bei 4 °C oder auf Eis.
  5. Reinigen Sie die DNA-DTT-Mischung mit Entsalzungs-Spin-Säulen mit Sephadex G-25 (Größenausschlussharz zur DNA-Reinigung):
    1. Wirbel die Entsalzungs-Spin-Säulen (DNA-Reinigung), sodass das Harz gleichmäßig verteilt ist. Entfernen Sie den unteren Verschluss, lösen Sie die Kappe und legen Sie ihn in ein sauberes Mikrozentrifugenrohr.
    2. Zentrifugieren entsalzte Spin-Säulen (DNA-Reinigung) bei 735 x g für 1 Minute, um den Speicherpuffer zu entfernen.
    3. Setzen Sie Entsalzungs-Spin-Säulen (DNA-Reinigung) in ein frisches Mikrozentrifugenrohr ein und geben Sie die DNA/DTT-Mischung langsam in die Mitte des Harzes ein. Zentrifugiere mit 735 x g für 2 Minuten. Die gereinigte, reduzierte DNA befindet sich nun im Mikrozentrifugenrohr.
  6. Kombinieren Sie DNA und Antikörper-Crosslinker-Produkte:
    1. Fügen Sie die reduzierte DNA dem Antikörper-Crosslinker-Produkt mit einem 10-fachen molaren Überschuss an DNA:Antikörper hinzu. Mische die gereinigte DNA unmittelbar nach der Reinigung mit dem Antikörper-Crosslinker-Produkt. Dies verhindert, dass sich die DNA wieder bindet.
    2. Über Nacht brüten, schüttelnd, bei 4 °C.
      HINWEIS: Man mischt DNA und Antikörper am späten Nachmittag und reinigt sie am nächsten Morgen sofort. Eine längere Inkubation von DNA und Antikörper kann zu hohen DNA:Antikörper-Verhältnissen führen.
  7. Entfernen Sie überschüssige DNA am nächsten Morgen mit einer 100-kDa-Ultrafiltrations-Zentrifugalfilteranlage:
    1. Waschen Sie die 100 kDa Ultrafiltrations-Zentrifugalfiltereinheit mit 300 μL 1x gefiltertem PBS für 30 Minuten bei 14.000 x g, 4 °C.
    2. Fügen Sie die DNA-Antikörper-Mischung mit 300 μL 1x gefiltertem PBS dem 100 kDa starken Ultrafiltrations-Zentrifugalfilter hinzu und drehen Sie 30 Minuten bei 14.000 x g, 4 °C.
    3. Wenden Sie die Ultrafiltrations-Zentrifugalfiltereinheit in ein sauberes Rohr, drehen Sie 6 Minuten bei 1000 x g, 4 °C. Dies ist das konzentrierte Produkt in PBS.
    4. Verdünne das Produkt auf 100 μL in 1x gefiltertem PBS.
    5. Zeichnen Sie ein UV-Vis-Spektrum des Produkts (1 oder 2 μL) mit dem Mikrovolumen-UV-Vis-Spektrophotometer mit einem Hintergrund von 1x PBS auf und speichern Sie die Spektren.
    6. Misse die Endkonzentration und das DNA:Antikörper-Verhältnis aus den Spektren. Beobachten Sie eine Verschiebung des Absorptionspeaks des Antikörpers von 280 nm auf 260 nm, bedingt durch die zusätzliche Absorption durch die DNA. Verwenden Sie Schritt 2.8, um die Konzentration und das DNA:Antikörper-Verhältnis zu bestimmen.
    7. Lagern Sie das Produkt unter den ursprünglichen Lagerbedingungen des verwendeten Antikörpers. Bei Einfrieren vermeiden Sie Frost-Tau-Zyklen.
  8. Berechnen Sie das DNA:Antikörper-Verhältnis aus den UV-Vis-Spektren:
    1. Aus den Spektren reiner DNA (10 μM in 1x PBS) werden die Absorptionswerte bei 260 nm (Gleichung 1) und 280 nm (Gleichung 2) gemessen. Teilen Sie diese durch die DNA-Konzentration (10 μM), um die molaren Absorptionskoeffizienten der DNA zu finden (Gleichung 3 Gleichung 4und ).
    2. Wiederholen Sie das, damit der Antikörper findet Gleichung 5 und Gleichung 6, wobei Sie daran denken, durch die Konzentration des für das Spektrum verwendeten Antikörpers zu teilen.
    3. Aus den Produktspektren hängt die Absorption bei 260 nm und 280 nm sowohl von der Absorption der DNA als auch des Antikörpers ab:
      Gleichung 7
      Gleichung 8
      Dabei sind cDNA und cAb die Konzentrationen von DNA bzw. Antikörper im Endprodukt. Lösen Sie diese Gleichungen gleichzeitig, um die molare Konzentration sowohl von DNA als auch von Antikörpern im Produkt zu bestimmen. Berechnen Sie das Verhältnis von DNA zu Antikörper anhand dieser Konzentrationen.
      HINWEIS: Die Konzentration des Antikörpers für die ersten Spektren kann berechnet werden, indem das nach der Filtration verbleibende Antikörpervolumen mit einer Ultrafiltrations-Zentrifugalfiltereinheit 100 kDa gemessen und mit dem ursprünglichen Volumen (mit bekannter Konzentration) des verwendeten Antikörpers verglichen wird.

3. Zellkultur

  1. HeLa Kyoto mEGFP-Nup107-Zellen.
    1. Bereiten Sie einen Vorrat des Zellkulturmediums, Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM), vor, ergänzt mit 10 % fetalem Rinderserum (FBS) und 1 % Penicillin/Streptomycin (P/S), und lagern Sie es bei 4 °C. Das Medium 30 Minuten vor der Verwendung in einem 37 °C Wasserbad vorwärmen. Je nach Arbeitsbedingungen wird empfohlen, die nötige Menge zu aliquotieren und zu filtern, um eine Verunreinigung zu verhindern.
    2. Samenzellen mit 2 x 105 Zellen/mL in 7 mL vorgewärmtem, ergänztem DMEM-Medium in T25-Kolben. Stellen Sie die Zellkolben in einen geeigneten Inkubator bei 37 °C und 5 % CO2-Umgebung.
    3. Sorgen Sie für eine Durchfahrt alle 48-72 Stunden, um Überfüllung zu vermeiden.
      1. Nehmen wir die T25-Kolben mit der Confluent-Kultur und dem Aspirationsmedium aus dem Kolben.
      2. Pipett 1 ml Trypsin EDTA (TE) und gewährleisten Sie eine vollständige Abdeckung, indem Sie die Flasche sanft kippen. Inkubieren Sie bei 37 °C für 7 Minuten, um die Zellablösung vom Kolben zu ermöglichen.
      3. Fügen Sie 2 ml ergänzendes DMEM-Medium hinzu und triturieren.
      4. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein 15 mL konisches Zentrifugalrohr mit zusätzlichen 7 mL ergänzendem DMEM-Medien.
      5. Zentrifugiere mit 400 x g für 5 Minuten. Überprüfen Sie sorgfältig die Pelletbildung am Boden des Rohrs, ohne es zu stören.
      6. Aspirieren Sie das Medium und suspendieren Sie das Zellpellet in ergänzendem DMEM-Medien.
      7. Säe 2 x 105 Zellen /mL in eine neue T25-Flasche mit 7 ml vorgewärmtem Medium. Inkubieren Sie bei 37 °C und 5 %CO2.
        HINWEIS: Wenn man sich über die Zelldichte nicht sicher ist, kann man ein Hämozytometer verwenden, um die Zellzahl zu bestimmen. Es wird empfohlen, vor dem Zählen mit einer 1-ml-Pellet-Resuspension zu beginnen.
  2. U2OS CRISPR mEGFP-Nup96-Zellen
    1. Bereiten Sie ein 10%iges FBS und 1% P/S-ergänzendes McCoy's 5A-Medium vor, gemäß Schritt 3.1.1.
    2. Samenzellen mit 2 x 105 Zellen /mL in 7 mL ergänzten McCoys 5A-Medien in T25-Kolben. Inkubieren Sie bei 37 °C und 5 %CO2.
    3. Durchgang alle 48 Stunden, um das Kulturwachstum unter 80 % Konfluenz zu halten:
      1. Aspirieren Sie das Medium aus der Flasche und waschen Sie die anhaftende Kultur vorsichtig mit 2 ml gefiltertem, vorgewärmtem (37 °C) 1x PBS.
      2. Aspiratiere PBS und gib 2 ml Accutase hinzu, kippe den Kolben langsam, um eine vollständige Abdeckung zu gewährleisten, und inkubiere dann bei 37 °C für 7 Minuten.
      3. Fügen Sie 2 ml ergänzendes McCoy's 5A-Medium hinzu und triturieren.
      4. Gib 7 ml Medium zur Zellsuspension und übertrage es in ein 15 mL oder 50 mL konisches Zentrifugalrohr zur Zentrifugation. Zentrifugiere bei 400 x g für 5 Minuten und prüfe die Pelletbildung am Boden des Rohrs.
      5. Die Zellkugel wird in McCoys 5A-Medien wieder suspendiert.
      6. Säe bei 2 x 10 mm5 Zellen/mL in einer neuen T25-Flasche mit 7 ml vorgewärmtem Medium. Inkubieren Sie bei 37 °C und 5 %CO2.
        HINWEIS: Erwärmen Sie alle in die Zellen gegebenen Lösungen auf 37 °C in einem Wasser- oder Perlenbad. Für Accutase sollte man nur 2 mL Aliquots nicht länger als 5 Minuten erwärmen, um einen Abbau zu vermeiden.

4. Immunfärbung von Nup96, Mitochondrien und Mikrotubuli

  1. Vorbereitung von U2OS mEGFP-Nup96-Zellen
    1. Folgen Sie den in Schritt 3.2 beschriebenen Schritten: Aspirieren Sie das Medium aus dem T25-Kolben und waschen Sie die haftenden Zellen vorsichtig mit 2 ml 1x gefiltertem PBS.
    2. Aspirieren Sie PBS und fügen Sie 2 ml Accutase hinzu, kippen Sie den Kolben langsam auf und ab und inkubieren Sie bei 37 °C für 7 Minuten, um die Zellablösung zu fördern.
    3. Fügen Sie 2 ml ergänzendes McCoy's 5A-Medium hinzu und triturieren.
    4. Oberzellige Suspension mit 7 mL ergänztem McCoy's 5A-Medium und Übergabe in ein 15 mL oder 50 mL konisches Zentrifugalrohr vor der Zentrifugation mit 400 x g für 5 Minuten. Überprüfen Sie erneut die Pelletbildung am Boden des Rohrs.
    5. Die Zellkugel wird in McCoys 5A-Medien wieder suspendiert.
    6. Samenzellen mit 1 x 105 Zellen /ml in 8-Well-Mikroslides und inkubieren über Nacht im Zellinkubator (37 °C, 5 %CO2).
      HINWEIS: Samen Zellen 24 Stunden vor Fixierung und Immunfärbung einsetzen, um die Haftung zu gewährleisten.
  2. Immunfärbung von U2OS mEGFP-Nup96-Zellen für die Nup96-Bildgebung
    1. Nach der nächtlichen Inkubation sollte das McCoy's 5A-Medium in den 8-Well-Mikroslides durch 1x gefiltertes PBS ersetzt werden. In schneller Folge aspirieren Sie das PBS und geben Sie die vorgewärmte (37 °C) 4%ige PFA-Fixierungslösung in einer chemischen Abzughaube hinzu.
    2. Lassen Sie die Zellen 30 Minuten bei Raumtemperatur (23 °C) fixieren, vorzugsweise im chemischen Abzugshaube, bevor das PFA gewaschen und Abfall entsorgt wird. Alle Schritte können jetzt bei Raumtemperatur ausgeführt werden, sofern nicht anders angegeben.
    3. Entferne die 4%ige PFA-Fixierungslösung und wasche den Folie 3x 3 Minuten mit 1x PBS.
      VORSICHT: Verwenden Sie PFA in einer chemischen Abzugshaube und tragen Sie geeignete PSA.
    4. Nach der Fixierung wird die Zellmembran permeabilisiert, indem 0,1 % Triton X-100 in 1x PBS-Lösung hinzugefügt werden. Lass es 5 Minuten einwirken, dann 3 x 3 Minuten mit 60 mM Glycin in 1x PBS waschen, um die Autofluoreszenz des restlichen PFA zu dämpfen.
      HINWEIS: Die Triton-Permeabilisierungslösung ist extrem zeitkritisch und könnte die Zellstruktur verändern, wenn sie zu lange einwirken lässt.
    5. Fügen Sie 5 % BSA in 1x PBS für eine Stunde im Dunkeln hinzu, um die Zellen vor der Immunfärbung zu blockieren.
    6. Bereiten Sie 20 nM des DNA-konjugierten Anti-GFP-Nano in Blocklösung vor (5 % BSA in 1x PBS), um unspezifische Bindungsblockierung zu verhindern. Inkubiere den Objektträger mit der Nanobody-Mischung 1 Stunde bei Raumtemperatur (23 °C), dann wasche du die ungebundenen DNA-Stränge 3 x 3 Minuten mit 1x gefiltertem PBS.
      HINWEIS: Pausenpunkt: Nach Fixierung, Blockieren und Zugabe von Antikörpern können die Proben über Nacht bei 4 °C gelagert werden. Dieser Pausenpunkt wird hauptsächlich wegen der Zeit für die Probenvorbereitung einbezogen und nicht als strikte Notwendigkeit des Protokolls. Die Bildgebung kann unmittelbar nach diesen Schritten erfolgen, wenn dies gewünscht ist.
  3. Immunfärbung von U2OS mEGFP-Nup96-Zellen für Mitochondrien und Mikrotubuli-Bildgebung
    1. Nach der nächtlichen Inkubation wird das DMEM-Medium in den 8-Well-Mikroslides gleichzeitig durch 200 μL 0,3 % Glutaraldehyd und 0,25 % Triton X-100 im Zytoskelettpuffer (CB) ersetzt und für 2 Minuten zur Vorfixierung gelassen.
    2. Ersetzen Sie die Präfixierungslösung durch einen Zytoskelettpuffer (CB), der mit 2 % Glutaraldehyd ergänzt wird. Lass es 10 Minuten einwirken, um die Zellen zu fixieren, dann wasche du den Objektträger 3 x 3 Minuten mit 60 mM Glycin in PBS, wie in Schritt 4.2.4.
      VORSICHT: Verwenden Sie Glutaraldehyd in einer chemischen Abzugshaube und tragen Sie geeignete PSA.
    3. Fügen Sie geschorene Lachsspermien-DNA in 3 % BSA in 1x PBS für 1 Stunde im Dunkeln hinzu, um die Zellen vor der Immunfärbung zu blockieren.
    4. Fügen Sie 5 μg/mL DNA-konjugiertes Antitubulin (wie oben beschrieben) für die Mikrotubulibildgebung und/oder einen 1:200 TOM20-Antikörper für die Mitochondrienbildgebung in 2 % BSA für 2 Stunden bei Raumtemperatur (23 °C) hinzu. Wasche 3 x 3 Minuten mit 1x PBS.
    5. Fügen Sie 25 nM DNA-konjugiertes sdAb Anti-Rabbit IgG hinzu und inkubieren Sie 1 Stunde bei Raumtemperatur (23 °C). Wasche 3 x 3 Minuten mit 1x PBS.
      HINWEIS: Pausenpunkt: Nach Fixierung, Blockieren und Zugabe von Antikörpern können die Proben über Nacht bei 4 °C gelagert werden. Dieser Pausenpunkt wird hauptsächlich wegen der Zeit für die Probenvorbereitung einbezogen und nicht als strikte Notwendigkeit des Protokolls. Die Bildgebung kann unmittelbar nach diesen Schritten erfolgen, wenn dies gewünscht ist.
  4. Herstellung von HeLa Kyoto mEGFP-Nup107-Zellen
    1. Saugen Sie das Medium aus dem T25-Kolben der HeLa Kyoto mEGFP-Nup107-Zellen ab und waschen Sie den Kolben vorsichtig mit 2 ml 1x gefiltertem PBS.
    2. Aspiratiere PBS, gib 2 ml Trypsin EDTA (TE) hinzu und kippe den Kolben langsam auf und ab, inkubiere bei 37 °C für 7 Minuten.
    3. Fügen Sie 2 ml ergänzendes DMEM-Medium hinzu und triturieren.
    4. Zelllösung zu einem 15 mL konischen Zentrifugalrohr mit zusätzlichem 7 ml ergänzendem DMEM-Medium hinzufügen und eine Zentrifuge bei 400 x g für 5 Minuten. Überprüfe die Pelletbildung am Boden des Rohrs.
    5. Suspendieren Sie das Zellpellet in ergänzendem DMEM-Medien.
    6. Samenzellen mit 1 x 105 Zellen /mL in 8-Well-Mikroslides.
      HINWEIS: Same cells 24 Stunden vor der Bildnahme.
  5. Immunfärbung von HeLa Kyoto mEGFP-Nup107 für Mikrotubuli
    1. Nach der nächtlichen Inkubation wird das DMEM-Medium in den 8-Well-Mikroslides gleichzeitig durch 200 μL 0,3 % Glutaraldehyd und 0,25 % Triton X-100 im Zytoskelettpuffer (CB) ersetzt und für 2 Minuten zur Vorfixierung gelassen.
    2. Ersetze die Vorfixierungslösung durch 2 % Glutaraldehyd in CB und lasse sie 10 Minuten für die Zellfixierung stehen. Wasche 3 x 3 Minuten mit 60 mM Glycin in 1x PBS.
      VORSICHT: Verwenden Sie Glutaraldehyd in einer chemischen Abzugshaube und tragen Sie geeignete PSA.
    3. Fügen Sie 5 % BSA in 1x PBS für eine Stunde im Dunkeln hinzu, um die Zellen vor der Immunfärbung zu blockieren.
    4. Fügen Sie 5 μg/mL DNA-konjugiertes Antitubulin (wie oben beschrieben konjugiert) für die Mikrotubuli-Bildgebung in 5 % BSA in 1x PBS für 2 Stunden bei Raumtemperatur (23 °C) hinzu. Wasche 3 x 3 Minuten mit 1x PBS.
      HINWEIS: Pausenpunkt: Nach Fixierung, Blockieren und Zugabe von Antikörpern können die Proben über Nacht bei 4 °C gelagert werden. Dieser Pausenpunkt wird hauptsächlich wegen der Zeit für die Probenvorbereitung einbezogen und nicht als strikte Notwendigkeit des Protokolls. Die Bildgebung kann unmittelbar nach diesen Schritten erfolgen, wenn dies gewünscht ist.
    5. HINWEIS: Bei der Arbeit mit alternativen Antikörpern oder Zelllinien passen Sie die Verdünnungsfaktoren für den DNA-gekoppelten Antikörper oder Nanobody gemäß den Empfehlungen des Herstellers an.
  6. Bildgebende Vorbereitung
    HINWEIS: Dieser Schritt ist bei allen Immunfärbungsprotokollen üblich.
    1. Fügen Sie 90 nm Goldnanopartikel, die 1:2 in deionisiertem Wasser verdünnt sind, direkt zu jedem Brunnen und nutzen dabei das gesamte Bohrlochvolumen. Inkubieren Sie 5 Minuten, um eine zukünftige Driftkorrektur während der Bildgebung zu ermöglichen. Wasche Brunnen 3x mit 1x PBS.
    2. Für die Nup96-Bildgebung fügen Sie den gewünschten Imager-Strang mit 1 nM in C+-Puffer hinzu, ergänzt durch 1x Trolox, 1x PCA und 1x PCD.
    3. Für Exchange-PAINT von Mitochondrien und/oder Mikrotubuli wird der erste gewünschte Imager-Strang nur bei 1 nM im C+-Puffer hinzugefügt. Nach der ersten Bildaufnahme wird die Probe gründlich, aber sorgfältig nach der ersten Bildaufnahmerunde gewaschen, um alle verbliebenen Imager-Stränge zu entfernen, ohne die Probe zu bewegen. Normalerweise reichen 5 Waschgänge und eine Wartezeit von 30 Sekunden aus. Dann fügen Sie den zweiten Imager-Strang mit 1 nM in C+-Puffer nur für die zweite Bildaufnahmerunde hinzu.

5. Bildgebende Einrichtung und Parameter: Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie

HINWEIS: Die in diesem Protokoll gezeigten Bilder wurden in der LMCB-Superauflösungs-Mikroskopieanlage am University College London, Großbritannien, aufgenommen, wobei ein kommerziell erhältliches rotierendes Scheibenkonfokalmikroskop mit einer sCMOS-Kamera verwendet und über NIS-Elements-Software betrieben wurde.

  1. Verwenden Sie ein rotierendes Scheibenkonfokalsystem mit multifokaler Anregung und eine sCMOS-Kamera.
  2. Starte das System 30 Minuten vor der Bildgebung: Schalte Mikroskop, Kamera und Laser ein und starte dann den Computer. Warte, bis die NIS-Elements-Software vollständig geladen ist.
  3. Wählen Sie den passenden Bildgebungsmodus in NIS-Elements: Standard-rotierende Scheibenkonfokal- oder SDC-OPR-SoRA-Superauflösung, bevor Sie die Erfassungsparameter einstellen.
  4. Wählen Sie das 60× Apo NA 1,49 Ölimmersionsobjektiv für entweder SDC- oder SDC-OPR-Bildgebung, um den Nachweis einzelner Molekülereignisse für eine verbesserte Nachbearbeitung zu maximieren.
  5. Wählen Sie die passende Vergrößerung (1×, 2,8× oder 4×) basierend auf dem Objektiv, den Kameraeinstellungen und der zu untersuchenden Probe aus. Passen Sie das Kamera-Binning entsprechend an: 1× binning für 1× Vergrößerung, 2× binning für 2,8× und 4× binning für 4×. Für diese Anordnung entspricht dies effektiven Pixelgrößen von 108 nm für 1× (kein Binning) oder 4× (4× binning) und 78 nm für 2,8× (2× binning). Binning ist erforderlich, um für SMLM geeignete Pixelgrößen zu erhalten, die ungefähr der PSF-Standardabweichung (typischerweise 100–150 nm) 19,20 entsprechen.
    HINWEIS: Höhere Vergrößerungen (2,8× oder 4×) erhöhen die Laserleistungsdichte und verbessern die Beleuchtungsgleichmäßigkeit. Dies reduziert das Sichtfeld, sodass das Binning proportional angepasst werden muss (z. B. 2× für 2,8× Vergrößerung; 4× Binning für 4× Vergrößerung), um die Pixelgröße zu erhalten.
  6. Stellen Sie die Belichtungszeit für die DNA-PAINT-Aufnahme ein und synchronisieren Sie sie mit der Drehgeschwindigkeit der Drehscheibe (einstellbar über das CSU-W1-Pad). Stellen Sie sicher, dass die Rotationsgeschwindigkeit ein Vielfaches der Belichtungszeit ist, oder drücken Sie die Sync-Taste, um automatisch die nächstgelegene kompatible Drehzahl anzugleichen. Überprüfen Sie den Bildschirm auf Striping-Artefakte, da dies auf unsynchronisierte Einstellungen hinweist. Für die hier vorgestellten Experimente wurde eine Belichtungszeit von 300 ms verwendet.
    HINWEIS: Die Rotationsgeschwindigkeit der SDC-Einheit dreht und synchronisiert mikrolinsenverstärkte SoRa-Scheiben beeinflusst das Strahlanregungsprofil und beeinflusst die durchschnittliche Leistungsdichteverteilung über die beleuchtete Fläche. Aus diesem Grund könnten höhere Belichtungszeiten erforderlich sein als bei TIRF-Setups.
  7. Konfigurieren Sie die Laserwellenlänge, Leistung und das Filterrad (NIS-Elements schlägt einen passenden Filter vor). Die Laserwellenlänge wird durch das Spektrum des Imager-Farbstoffs bestimmt.
    HINWEIS: In dieser Arbeit wurde Cy3B verwendet, das optimal mit einem 561-nm-Laser angeregt wird. Cy3B bietet das beste Signal-Hintergrund-Verhältnis für DNA-PAINT und ist damit die bevorzugte Wahl für diese Anwendung.
  8. Laserleistung über das Laserpad anpassen (0%-100%). Für die DNA-PAINT-Bildgebung stellen Sie den Laser auf maximale Leistung (100 %). Für dieses System entspricht dies 1,75 mW (≈ 65 W/cm2), gemessen nach dem Objektiv für die 4× Vergrößerung, 3 mW (≈ 50 W/cm2) für 2× und 5 mW (≈ 15 W/cm2) für 1×.
    1. Um die Leistung nach dem Objektiv aufzuzeichnen, verwenden Sie ein kalibriertes Laserleistungsmessgerät und platzieren Sie den Sensor so nah wie möglich an der Stelle, an der die Probefläche sein sollte. Achten Sie darauf, den Kontakt mit der Objektivlinse zu vermeiden. Zeichnen Sie die Leistung für jede verwendete Konfiguration auf.
  9. Trage einen Tropfen Tauchöl auf das saubere 60× Apo NA 1.49 Ölobjektiv auf.
  10. Sichern Sie die vorbereitete Probe (von den Schritten 4.2 bis 4.5) mit einem Stufenadapter an der Stufe. Dies ist wichtig, um Drift während der Bildaufnahme zu minimieren und Bewegungen während Pufferaustauschen, insbesondere bei Mehrfarb-Experimenten, zu verhindern.
  11. Schalten Sie innerhalb der gewählten Bildabbildungsmethode in den Hellfeldmodus um und konzentrieren Sie sich auf die Glasebene mit Nanopartikeln als Referenz. Aktiviere das Perfect Focus System (PFS). Das PFS oder ein ähnliches System zur Aufrechterhaltung des Fokus während der gesamten Aufnahmezeit ist entscheidend, da der Drift in axialer Richtung nicht durch Nachbearbeitung korrigiert werden kann.
    HINWEIS: Die Nikon PFS hält die Probe scharf scharf, indem sie kontinuierlich den Abstand zwischen einer festen Referenzebene und der Brennebene des Probens mit einem Offsetobjektiv und einem Linien-CCD-Detektor überwacht und anpasst. Indem es unabhängig von der Bildaufnahme arbeitet, korrigiert das System in Echtzeit die Fokusdrift (~Millisekunden).
  12. Mit aktiviertem PFS wählen Sie die interessierende Bildfläche aus. Für U2OS mEGFP-Nup96-Zellen oder HeLa Kyoto mEGFP-Nup107-Zellen verwenden Sie das 488-GFP-Signal von GFP-markierten NPCs, um die flachste Zelle zu identifizieren und die optimale Brennebene zu bestimmen. Verwenden Sie in diesem Schritt eine geringe Laserleistung (~10 % der maximalen Laserleistung), um Photobleaching zu vermeiden.
  13. Definieren Sie den Namen und den Speicherweg des Experiments. Kreuzen Sie das Zeitkästchen an, um das Intervall, die Dauer und die Anzahl der Schleifen einzustellen. Für kontinuierliche Erfassung setzen Sie das Intervall auf Keine Verzögerung und geben Sie nur die Anzahl der Schleifen ein, die der Gesamtzahl der Frames entspricht.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass das PFS-Feld unten ausgewählt ist, und drücken Sie dann Run. Die Software liefert automatisch eine geschätzte Experimentdauer und speichert die Daten nach Abschluss. Um das Experiment vor Abschluss zu stoppen, drücken Sie Beenden, um den aktuellen Fortschritt zu speichern, oder abbrechen, um das Experiment ohne Speichern zu beenden.
  14. Für das erste Protein werden 17.000–20.000 Frames mit einer Integrationszeit von 300 ms aufgenommen.
    HINWEIS: Die Konzentration des Imager-Strangs muss in diesem Schritt optimiert werden, um sicherzustellen, dass sich einzelne Molekülsignale nicht überlappen und dennoch ausreichende Lokalisierungen für die Rekonstruktion bereitgestellt werden. Dieser Prozess ähnelt einer typischen SMLM-Aufnahme, bei der die Imager-Konzentration so angepasst wird, dass eine ausreichende Anzahl von Ereignissen für die Rekonstruktion erreicht wird und Überlappungen minimiert werden. Die optimale Konzentration hängt von der abgebildeten Struktur ab. Zum Beispiel benötigen stark markierte Strukturen wie Mikrotubuli typischerweise niedrigere Imager-Konzentrationen (weniger als 1 nM).
  15. Entfernen Sie vorsichtig den Bildpuffer für das nächste Protein mit einer Pipette und achten Sie darauf, die Probe nicht zu stören. Während Sie die Probe mit der Mikroskopkamera überwachen, fügen Sie vorsichtig 200 μL C+-Puffer ohne den Bildsensor hinzu, um die erste Farbe zu reinigen.
  16. Wiederholen Sie diesen Schritt, bis kein Fluoreszenzsignal von der ersten DNA-Imager-Lösung nachweisbar ist (typischerweise 5 Washes).
  17. Fügen Sie eine zweite Imager-Lösung hinzu und prüfen Sie, ob einzelne Molekülereignisse erneut detektiert werden.
  18. Erziele 17.000–20.000 Frames mit 300 ms Integrationszeit für das zweite Protein.
  19. Wiederholen Sie die Schritte 5.14-5.18 für jedes zusätzliche Protein, das abgebildet werden soll.
  20. Für 3D-Bildgebung werden Z-Stacks mit 0,5–1 μm Abstand über die gesamte Zellgröße erfasst. Dies geschah mit einem speziellen JOB-Protokoll21 , das für die Erfassungssoftware (NIS-Elemente) entwickelt wurde und ein Video einer vordefinierten Anzahl von Frames an bestimmten Z-Positionen aufnimmt und die PSF während der gesamten Aufnahmezeit aufrechterhält.
    HINWEIS: Das Softwarepaket ist zusammen mit detaillierten Benutzeranweisungen im JOB-Protokoll21 enthalten. Eine vollständige Beschreibung des JOBS ist ebenfalls enthalten. Die Software mit dem Namen "MultiZ_DNAPaint.bin" kann über den Reiter Materialien der Veröffentlichung heruntergeladen werden. Um den JOB auszuführen, laden Sie diese Datei herunter und importieren Sie sie in den NIS-Elements JOBS Explorer, wobei Sie den bereitgestellten Schritt-für-Schritt-Anweisungen folgen.

6. Bildverarbeitung und -analyse

HINWEIS: Die Bilder wurden zunächst durch Dekonvolution mit einer kompatiblen Software verarbeitet, gefolgt von einer Einzelmolekül-Lokalisierungsanalyse mit Picasso-Software, die vom Jungmann-Labor16 entwickelt wurde.

  1. Öffnen Sie die ND2-Bildstacks in der NIS-Elements AR-Software.
  2. Für 2D-Bilder wählen Sie 2D-Dekonvolution. Für 3D-Bilder wiederholen Sie dieses Verfahren für jeden einzelnen Z-Stack.
  3. Wählen Sie blinde Dekonvolution, ein effektives Lochloch von 0,01, und stellen Sie den Rauschpegel auf Lautstärke ein. Dann gibt man die Laseranregung und Emissionsrate ein, hier 560 nm bzw. 571 nm. Weitere Parameter werden automatisch aus den ND2-Metadaten gewonnen, um eine grobe Schätzung der Quellbild-Punktstreufunktion (PSF) zu liefern.
  4. Geben Sie die Anzahl der Iterationen an (hier, 12), wählen Sie Neues Dokument erstellen und drücken Sie Dekonvolvieren. Speichere die resultierende Datei nach der Verarbeitung.
    HINWEIS: Der Algorithmus verbessert iterativ die Bildqualität, indem er Faltungsoperationen durchführt, die das PSF verfeinern, bis die Konvergenz oder die angegebene Anzahl von Iterationen erreicht ist. Eine visuelle Inspektion des dekonvertierten Bildes wird empfohlen. Es ist eine Anpassung der Anzahl der Iterationen erforderlich, abhängig von Rechenbedingungen und Bildqualität.
  5. Laden Sie den deconvolutierten Bildstapel in das Picasso-Localize-Modul.
  6. Wählen Sie in der Menüleiste Analysieren → Parameter aus und geben Sie die kameraspezifischen Parameter gemäß den Herstellerspezifikationen ein. Für die in dieser Studie verwendete sCMOS-Kamera (Hamamatsu ORCA-Fusion BT): EM-Verstärkung: 1, Basiswert: 100, Empfindlichkeit: 0,23 (Umwandlungsfaktor, Elektronen/Zähler), Quanteneffizienz: 0,95 (abhängig von der verwendeten Anregungswellenlänge).
    HINWEIS: Quanteneffizienz wird seit Picasso Version 0.6.0 nicht mehr verwendet und nur für Abwärtskompatibilität beibehalten.
  7. Stelle die Länge der Boxseite auf 7 ein. Die Boxlänge wird mit der Formel [6 × σPSF + 1] bestimmt, wobei σPSF die Standardabweichung der PSF ist. Diese Optimierung verbessert die Lokalisierungspräzision und verbessert die Auflösung des rekonstruierten Bildes.
  8. Wählen Sie die passende Pixelgröße für die Bildkonfiguration gemäß Abschnitt Schritt 5.5 aus.
  9. Wählen Sie anschließend einen geeigneten Min. Net Gradient (z. B. ~1000, je nach Stichprobe) und aktivieren Sie die Vorschau, um die erkannten Lokalisierungen zu visualisieren. Inspizieren Sie die Ergebnisse und passen Sie die Gradientenschwelle bei Bedarf an, um Hintergrunderkennungen zu minimieren und eine genaue Lokalisierung sicherzustellen.
  10. Wähle in der Menüleiste Analysieren → Lokalisieren (Identifizieren & anpassen), um mit der Spot-Identifikation und dem Einfügen aller Filmframes zu beginnen. Nach dem Wettbewerb speichert dieser Prozess automatisch eine .hdf5- und .yaml-Datei.
    HINWEIS: Die .hdf5-Datei speichert die Lokalisierungsposition jeder Gaussian-Passung und weitere Parameter. Die .yaml-Datei speichert Informationen über das Video und das Analyseverfahren und kann mit einem Texteditor überprüft werden.
  11. Laden Sie die .hdf5-Datei im Picasso Render-Modul, um die rekonstruierte Lokalisierungskarte zu visualisieren und eine Driftkorrektur durchzuführen.
  12. In Picasso Render wählen Sie Nachbearbeitung → Undrift by RCC. Geben Sie einen Segmentierungswert ein, beginnend bei 1000. Nach Abschluss erscheint das berechnete xy-Drift-Diagramm. Wiederholen Sie den Prozess sequentiell mit niedrigeren Segmentierungswerten (z. B. 500, dann 250) und beobachten Sie allmähliche Verbesserungen der zeitlichen Drift.
    HINWEIS: Die Driftkorrektur kann ebenfalls mit Nanopartikeln als treuhänderischen Markern durchgeführt werden; bei der Abbildung erhöhter Ebenen ist das Nanopartikelsignal jedoch möglicherweise nicht sichtbar. In diesen Fällen wird nur eine redundante Kreuzkorrelations-(RCC)-Driftkorrektur angewendet.
  13. Stellen Sie sicher, dass Sie die abdriftkorrigierte Datei speichern, indem Sie File → Save Localizations auswählen, bevor Sie das Picasso-Renderfenster schließen.
  14. Laden Sie die driftkorrigierte Datei aus Schritt 6.13 in das Picasso-Filtermodul für zusätzliche Nachbearbeitungsschritte, indem Sie Schwellenwerte auf die Qualitätsmetriken der Einzelmoleküllokalisierung festlegen, wie zum Beispiel: (i) Lokalisierungspräzision (lpx, lpy); (ii) PSF-Breiten (sx, sy); (iii) Photonenzählungen; und (iv) alle zusätzlichen Kriterien zur Entfernung von Rauschen, Ausreißern oder schlecht gelösten Stellen.
    HINWEIS: lpx und lpy (Lokalisationsgenauigkeit in x und y) schätzen die Unsicherheit in der lokalisierten Spotposition entlang der x- und y-Achsen und basieren auf der Cramér-Rao-Untergrenze (CRLB).
  15. Um eine Eigenschaft zu filtern, wählen Sie die jeweilige Spalte in der Kopfzeile der Tabelle und wählen Sie im Menü Diagramm → Histogramm aufzeichnen .
    HINWEIS: Das Auswählen von zwei Spalten ergibt ein 2D-Histogramm.
  16. Um nach einem bestimmten Eigenschaftsbereich zu filtern, klicken und ziehen Sie den gewünschten Bereich innerhalb eines 1D- oder 2D-Histogramms. Der ausgewählte Bereich wird grün schattiert, und alle Lokalisierungsereignisse mit Werten außerhalb dieses Bereichs werden sofort aus der Lokalisierungsliste ausgeschlossen.
  17. Filtern Sie die Daten nach Photonen, sx, sy, lpx und lpy, wobei nur der zentrale Teilbereich der Verteilung jedes Parameters erhalten bleibt, um die zuverlässigsten Lokalisierungen zu erhalten.
    HINWEIS: Der zentrale Teil der PSF-Breitenverteilung liegt typischerweise zwischen 0,4 und 1,2 × Pixelgröße. Sekundärverteilungen ausschließen, die oft durch überlappende Signale oder schlecht aufgelöste Spots verursacht werden.
  18. Speichern Sie die gefilterten Daten, indem Sie im Menü Datei → Speichern auswählen.
  19. Wiederholen Sie den Vorgang von Schritt 6.1 bis 6.18 für alle für jede Imager-Lösung aufgenommenen Videos.
  20. Öffnen Sie die gefilterte Datei im Picasso Render-Modul. Die Intensität in diesem superaufgelösten Bild stellt die Anzahl der Lokalisierungen dar. Der Kontrast kann geändert werden, indem man Ansicht → Anzeigeeinstellungen auswählt und den Wert der maximalen Dichte ändert.
  21. Um das Superauflösungsbild eines einzelnen Kanals zu speichern, wählen Sie im Bereich Unschärfe "Individuelle Lokalisierungspräzision". Ein Tonleiterbalken kann auch aus dem Tonleiter-Balken hinzugefügt werden.
  22. Um das Super-Resolution-Image aller Kanäle zu speichern, öffne alle bearbeiteten .hdf5-Dateien. Die Farbe jedes Kanals kann geändert werden, indem man im Menü auf Dateien anzeigen → Ansehen wählt.
  23. Alle Kanäle ausrichten und Nachbearbeitung auswählen → Kanäle ausrichten.
  24. Wählen Sie die Datei → Export Complete Image aus, um ein .png Bild oder eine Datei zu speichern → Aktuelle Ansicht exportieren für einen bestimmten Zoom des Bildes.
    HINWEIS: Verwenden Sie konsistente Dateibenennungen und Dokumentationspraktiken zur Reproduzierbarkeit. Die Picasso-Software fügt jeder gespeicherten Datei automatisch ein Suffix hinzu. Cramer Rao Lower Bound- und Nearest neighbor Based Analysis (NeNA)22-Metriken können extrahiert werden, indem man aus dem Menü Informationen anzeigen → anzeigen . Das NeNA quantifiziert die räumliche Verteilung lokalisierter Fluorophore, indem es den euklidischen Abstand zwischen benachbarten Lokalisierungen bewertet. Während das CRLB eine theoretische untere Grenze für die Lokalisierungsgenauigkeit basierend auf Photonenstatistik und Hintergrundrauschen liefert, bietet das NeNA eine experimentelle Schätzung der Lokalisierungsgenauigkeit, die direkt aus dem Datensatz selbst abgeleitet wird. Aus diesem Grund wird NeNA in SMLM häufig als ergänzendes Maß zum CRLB verwendet, da es nicht nur theoretische Grenzen, sondern auch praktische Einflüsse wie Driftkorrektur, Anpassungsfehler und experimentelle Variabilität erfasst. Die NeNA-Metrik wird aus dem Picasso Render-Modul extrahiert. Das CRLB der Einzelmolekülanpassung wird verwendet, um die Lokalisierungsgenauigkeitswerte zu bestimmen (σSMLM). Der gemeldete Wert ist der Durchschnitt zwischen σx und σy für alle Lokalisierungen, die den Modenwert der Verteilung der Lokalisierungsgenauigkeit in x bzw . y darstellen.

Ergebnisse

Um die Superauflösungs-Bildgebungsfähigkeiten des SDC-OPR-Systems (Abbildung 1A) zu demonstrieren, wurde seine In-Plane-Auflösung durch DNA-PAINT-Bildversuche (Abbildung 1B) an Kernporenkomplexen (NPCs) bewertet, die eine biologische Referenzstruktur17 darstellen. Abbildung 1C zeigt ein repräsentatives DNA-PAINT SDC-OPR-Bild von Nukleoporin 96 (Nup96), markiert mit monomerisch verstärktem grünem fluoreszierendem Protein (mEGFPs) und markiert mit DNA-konjugierten Anti-GFP-Nanokörpern in U2OS-Zellen. Die heranzoomten Panels zeigen die NUP-Unterstruktur, und Abbildung 1D zeigt gepaarte Nup96-Proteine (angezeigt durch Pfeile), die mit der erwarteten 8-fachen Symmetrie der Kernporen übereinstimmen. In Abbildung 1E wurde der euklidische Abstand zwischen Nup96-Paaren gemessen, indem sie ausgerichtet und das Querschnittshistogramm des summierten Bildes (n = 16 Paare) dargestellt wurden. Die Analyse zeigte eine Peak-zu-Peak-Trennung von (13 ± 2) nm (Abbildung 1E), was mit den Ergebnissen von EM-Modellen sowie der HILO- und TIR-Bildgebung23 übereinstimmt. Jeder Peak-Fit zeigte eine Standardabweichung von 4 nm, was die hohe Lokalisierungspräzision (σSMLM = 3,3 nm, NeNA = 4,4 nm) bestätigte, die mit DNA-PAINT auf SDC-OPR erreicht wurde. Bemerkenswert ist, dass diese Präzision über das gesamte 53 × 53 μm² Sichtfeld erhalten wurde, was für konfokalbasierte Systeme außergewöhnlich ist.

Um die Fähigkeit zur Mehrfarbbildgebung zu demonstrieren, wurden Nup96, Mitochondrien und Mikrotubuli in U2OS-Zellen, DNA-kennzeichnungen für die Erfassung mit Exchange-PAINT18. Diese Technik verwendet orthogonale DNA-Imager-Stränge, die zu einem einzelnen Fluorophor konjugiert sind, sodass alle Ziele mit derselben Laserquelle angeregt werden können (Abbildung 2A). Anstatt Signale gleichzeitig zu empfangen, werden sie über sequentielle Bildrunden verteilt, was eine einfache Integration in jedes kommerzielle SDC-OPR-System ermöglicht. Abbildung 2B zeigt Nup96 in Blau mit einem Anti-GFP-Nanokörper, Mitochondrien in Rot mit einem sekundären Anti-TOM20-Antikörper und Mikrotubuli in Grün mit einem primären Anti-α-Tubulin-Antikörper. Bemerkenswert ist, dass die herausragende Einzelmolekül-Lokalisierungspräzision, die für die Einfarb-Nup96-Bildgebung erzielt wurde, über alle Ziele des Multi-Target-Experiments erhalten blieb und Lokalisierungspräzisionswerte von 3,9 nm für den NPC, 4,0 nm für α-Tubulin und 3,3 nm für Mitochondrien ergab (Abbildung 2B, Panel 1, 2 und 3).

Für die Bildgebung mit großem FOV wurden Mikrotubuli in HeLa-Zellen mit verschiedenen Vergrößerungen des SDC-OPR-Systems abbildet, kombiniert mit unterschiedlichen Kamera-Binning-Einstellungen, um Pixelgrößen zwischen 78 nm und 108 nm zu halten (Abbildung 3). Abbildung 3A zeigt das Mikrotubuli-Zytoskelett von 10 HeLa-Zellen, wobei Farben die Lokalisierungsgenauigkeit darstellen. Bei 1× Vergrößerung ist die durchschnittliche Lokalisierungsgenauigkeit deutlich schlechter als bei höheren Vergrößerungen (Abbildung 3B-D), wobei eine größere Variabilität beobachtet wird. Dies liegt an der reduzierten Laserleistungsdichte über dem größeren Sichtfeld, wo das Gaußsche Beleuchtungsprofil sichtbar wird, was zu einer verringerten Präzision gegenüber den Rändern des Sichtfelds führt. Dennoch ist das Erreichen einer durchschnittlichen Lokalisierungsgenauigkeit von 9,5 nm über das weitläufige 211 × 211 μm² FOV für konfokalbasierte Systeme beeindruckend und ermöglicht eine hochauflösende Untersuchung biologischer Heterogenität.

Schließlich wird die Möglichkeit der Bildgebung ganzer Zellen demonstriert, indem DNA-PAINT-Bilder des Mikrotubulinetzwerks in fixierten HeLa-Zellen mit einem konfokalen Volumen von ~500 nm Dicke und 1 μm Z-Step unter Verwendung der höchsten Vergrößerung des Systems (4×, 53 × 53 μm² Sichtfeld) aufgenommen werden. Abbildung 4A zeigt die Einzelmoleküll-Rekonstruktionsbilder für jede z-Ebene zusammen mit der entsprechenden Lokalisierungsgenauigkeit und NeNA-Werten. Zusätzlich wird in Abbildung 4C eine farbgerenderte Visualisierung des Mikrotubulinetzwerks in der HeLa-Zelle dargestellt. Mit zunehmender Tiefe nimmt die Anzahl der detektierten Photonen aufgrund von Streuung und optischen Aberrationen ab, was zu einer geringeren Lokalisierungsgenauigkeit sowohl für die Lokalisierungsgenauigkeiten aus der Cramér-Rao-Untergrenze (CRLB) (Abbildung 4A, rechts) als auch für die mit der NeNA-Metrik berechneten Genauigkeiten führt. Dennoch ermöglicht die hohe Photonensammlung, die durch das SDC-OPR-System möglich ist, σSMLM ≤ 10 nm für eine Bildtiefe von bis zu 9 μm mit enger Verteilung. Tatsächlich wurden doppelwandige filamentöse Mikrotubuli-Strukturen in verschiedenen Tiefen klar aufgelöst: nahe der Deckungszell-Grenzfläche, an Zwischenachsen und oben in der Zelle, mit einem Spitzenabstand zwischen 30 nm und 40 nm (Abbildung 4C), was mit den gemeldetenWerten 24 übereinstimmt. Diese Ergebnisse unterstreichen die Fähigkeit des SDC-OPR, hochauflösende Bildgebung über große Sichtfelder und über die gesamte Zellhochhöhe zu liefern.

Abbildung 1
Abbildung 1: In-plane Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie verschiedener Zellproben und mehrfarbige Superauflösungsbildgebung. (A) Schaltplan des Spinning Disk Confocal with Optical Photon Reassignment (SDC-OPR)-System, mit einem Mikrolinsenarray, das zur Maximierung der Photonensammlung entwickelt wurde. (B) Schematik von DNA-PAINT: Fluoreszierend markierte DNA-Stränge, bekannt als Imager-Stränge, hybridisieren vorübergehend mit komplementären DNA-Sequenzen (Docking-Strängen), die am Antikörper/Nano verankert sind und das gewünschte Protein anvisieren. Diese kurzlebigen Bindungsereignisse erzeugen Fluoreszenzsignale, die wie stochastisches Blinzeln erscheinen. (C) Repräsentatives DNA-PAINT-Bild auf dem SDC-OPR-System mit 4× Vergrößerung des NPC der U2OS-Zellen. Die hochauflösende Fähigkeit wird im Inset demonstriert, wo einzelne NPCs eindeutig aufgelöst sind. (D) SDC-OPR-verbesserte DNA-PAINT ermöglicht die Visualisierung einzelner NPCs, wobei weiße Pfeile charakteristische Nup96-Proteinpaare innerhalb der Porenarchitektur hervorheben. (E) Verteilung der Abstandsmessungen zwischen Nup96-Dimern (n=16 Paare) innerhalb einzelner NPC-Symmetrieeinheiten. Diese Abbildung wurde aus Zaza et al.14 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen. 

Abbildung 2
Abbildung 2: Exchange-PAINT für mehrfarbige Bildgebung mit einem SDC-OPR-Mikroskop. (A) Schaltplan von Exchange-PAINT von drei Zielen, sequentiell abgebildet. Drei Proteinziele wurden entweder mit DNA-funktionalisierten Antikörpern, Fab-Fragmenten oder Nanokörpern markiert. Die Cy3B-Imager-Stränge wurden sequentiell nach Strängtyp mit Spülschritten zwischen den Bildrunden abgebildet. (B) Dreifarbige Exchange-PAINT-Bildgebung von U2OS-Zellen mittels SDC-OPR-Mikroskopie mit 4× Vergrößerung, die Mikrotubuli (rot; beschriftet mit DNA-konjugiertem Anti-α-Tubulin), Mitochondrien (grün; TOM20-gezielte DNA-Nanokörper) und NPC (blau; mEGFP-markiert Nup96 mit Anti-GFP-DNA-Nanokörpern). Maßstabsanzeige: 5 μm. Der heranzoomte Bereich betont die verbesserte Auflösung des SDC-OPR-Systems, wobei der Fokus auf (1) Mitochondrien, (2) Mikrotubuli und (3) NUP liegt. Skalenbalken = 1 μm. Diese Abbildung wurde aus Zaza et al.14 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 3
Abbildung 3: DNA-PAINT-Bildgebung innerhalb großer Sichtfelder mit einem SDC-OPR-Mikroskop. Mikrotubuli-DNA-PAINT-Bilder (Anti-α-Tubulin-Labeling), aufgenommen bei mehreren Vergrößerungen: (A) 1× Vergrößerung und 1 Binning (FOV 211 × 211 μm²), (B) 2,8× und 2 Binning (FOV 76 × 76 μm²), (C) 4× Vergrößerung und 4 Binning (FOV 53 × 53 μm²). Farbe stellt die Lokalisierungsgenauigkeit von 0–16 nm im Fall von 1x Vergrößerung und 0–4 nm bei anderen an. (D) Lokalisierungsgenauigkeit gemessen in unterschiedlichen Abständen (in μm) vom Zentrum des FOV bei Vergrößerungen von 1× (rot), 2,8× (gelb) und 4× (grün). Diese Abbildung wurde aus Zaza et al.14 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 4
Abbildung 4: Ganzzellige DNA-PAINT-Bildgebung. (A) Links. Volumetrische Mikrotubuli-Bildgebung in HeLa-Zellen mittels DNA-PAINT, aufgenommen mit SDC-OPR bei 4× Vergrößerung, wobei axiale Schnitte von z = 0 bis 9 μm (1 μm Schritte) gezeigt werden. Jede Ebene zeigt z-Position , Lokalisierungsgenauigkeit und NeNA-Metrik an. Skalenbalken: 5 μm (xy). Richtig. Lokalisierungspräzision versus Durchdringungstiefe für alle Ebenen. (B) 3D-Darstellung des Mikrotubulinetzwerks auf derselben HeLa-Zelle wie in (A). Farbe stellt die Penetrationstiefe von 0 bis 9 μm dar. (C) Eingezoomte Bilder der markierten kleinen Bereiche aus jeder in (A) angegebenen Durchdringungstiefe. Diese Abbildung wurde aus Zaza et al.14 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Diskussion

Die Superauflösungs-Fluoreszenzmikroskopie hat die Beugungsbarriere durchbrochen und die räumliche Auflösung dramatisch verbessert. Dennoch steht seine weitverbreitete Einführung in der biologischen Forschung vor anhaltenden Herausforderungen. Bemerkenswert ist, dass Abwägungen zwischen Sichtfeld, Auflösung und Durchdringungstiefe es erschweren, alle drei Faktoren gleichzeitig zu optimieren. Diese Herausforderungen wurden durch die Nutzung der kombinierten Fähigkeiten von SMLM und rotierender Scheibenkonfokalmikroskopie, verstärkt durch optische Photonen-Neuzuweisung (SDC-OPR), gelöst. Durch die Integration von Mikrolinsenarrays in eine Standard-SDC-Konfiguration, wie sie durch das kommerzielle SDC-OPR-System ermöglicht wurde, wurde die Photonenaufnahme erhöht, während die effektive Lochgröße reduziert wurde, was zu einer erheblichen Auflösung führte. Im Vergleich zum Standard-SDC zeigte das SDC-OPR-System eine deutliche Verbesserung der Auflösungsleistung, indem es erfolgreich Merkmale mit 10 nm14 Abstand in der Brennebene unterschied, während Standard-SDC nur Abstände von mehr als 20 nm11 auflösen konnte. Diese verbesserte Auflösungskapazität unterstreicht den Vorteil der Photonen-Neuzuweisung zur Erreichung molekular-skaliger Trennungen. Konkret wurde eine seitliche Lokalisierungspräzision unter 2 nm in der Fokalebene (z = 0 μm) erreicht, wobei die laterale Präzision bei Tiefen bis zu 9 μm unter 10 nm blieb, kombiniert mit einem hoch anpassungsfähigen Sichtfeld von 53 × 53 μm² oder 76 × 76 μm². Selbst bei einem großen Sichtfeld von 211 × 211 μm² lieferte das System eine beeindruckende durchschnittliche Inplane-Lokalisierungspräzision von 9,5 nm. Diese Ergebnisse unterstreichen die Fähigkeit des Systems, hochauflösende Bildgebung in ganzen Zellen durchzuführen.

Bezüglich der Kopplungsreaktionen der verschiedenen verwendeten Antikörper muss das Protokoll sorgfältig befolgt werden, um ein optimales Antikörper-DNA-Verhältnis sicherzustellen. Das Überschreiten dieses Verhältnisses kann die Lokalisierungsgenauigkeit verringern und quantitative Messungen, wie sie beispielsweise in qPAINT25 durchgeführt werden, negativ beeinflussen. Daher ist es entscheidend, das Verhältnis mit einem Mikrovolumen-UV-Vis-Spektrophotometer zu überprüfen, um ein endgültiges Verhältnis von 1:1 zwischen DNA und Antikörper sicherzustellen.

Ein entscheidender Schritt zur Erlangung hochwertiger Superauflösungsbilder von Mikrotubuli ist die korrekte Fixierung. Konventionelle Fixierungsmethoden, die ausschließlich auf hohen PFA-Konzentrationen basieren, stören oft Mikrotubulistrukturen. Stattdessen verbessert die Verwendung von Glutaraldehyd (GA) allein oder in Kombination mit PFA die strukturelle Erhaltungsignifikant 26,27.

Für eine optimale Bildgebung ist ein Ziel mit hoher numerischer Apertur (NA) unerlässlich, um die Photonensammlung pro Einzelmolekülereignis zu maximieren. Im kommerziellen SDC-OPR-System ist die Laserleistung absichtlich geringer als bei herkömmlichen TIRF-Mikroskopen, die für SMLM verwendet werden, um das Photobleachen der Proben zu minimieren. Während DNA-PAINT Bedenken beim Photobleaching beseitigt und theoretisch eine höhere Laserleistung nutzen könnte, setzen aktuelle kommerzielle Systeme Einschränkungen auf, die längere Belichtungszeiten im Vergleich zur TIRF-Beleuchtung erfordern. Außerdem werden die Beleuchtung in SDC-OPR konfogal und die Moleküle während der Belichtung nicht kontinuierlich angeregt. Daher sind längere Belichtungszeiten im Vergleich zur kontinuierlichen TIRF-Beleuchtung notwendig; In dieser Studie wurde eine Belichtungszeit von 300 ms verwendet. Je nach Auflösungsanforderungen eines Experiments können jedoch kürzere Integrationszeiten (z. B. 150–200 ms) mit minimalem Verlust vonAuflösung 28 eingesetzt werden.

Die Optimierung der Konzentration des Imager-Strangs ist ein entscheidender Schritt, um sicherzustellen, dass einzelne Molekülsignale gut getrennt bleiben und dennoch genügend Lokalisierungen für eine genaue Rekonstruktion erzeugt werden. Diese Anpassung ist analog zu Standard-SMLM-Aufnahmen, bei denen das Gleichgewicht zwischen Ereignisdichte und Signalüberlappung sorgfältig kontrolliert wird. Die optimale Konzentration des Bildgeräts sollte für jedes einzelne Ziel angepasst werden. Beispielsweise wird für Mikrotubuli eine anfängliche Strängkonzentration von weniger als 1 nM empfohlen, wobei bei Bedarf Anpassungen vorgenommen werden.

Die Aufrechterhaltung stabiler Fokussierung während längerer Akquisitionen ist entscheidend, da axiale (z)-Drift nicht nachträglich korrigiert werden kann. Laterale (xy) Drift kann durch RCC- oder fiduziale Marker kompensiert werden. In diesem Setup sorgt das Perfect Focus System (PFS) des Mikroskops für Fokusstabilität über stundenlange Bildgebung.

Zusammenfassend bietet die Integration von SMLM mit SDC-OPR eine leistungsstarke Plattform für hochauflösende Bildgebung tief in ganze Zellen und überwindet damit traditionelle Kompromisse zwischen Auflösung, Tiefe und Sichtfeld. Um die Fähigkeiten des Systems jedoch vollständig auszuschöpfen, ist eine sorgfältige Aufmerksamkeit für experimentelle Bedingungen unerlässlich, von der Antikörperkonjugation und -fixierung bis hin zu Erfassungseinstellungen und Datenverarbeitung. Jeder Schritt, von der Probenvorbereitung bis zur Driftkorrektur, spielt eine entscheidende Rolle bei der Gewinnung zuverlässiger, hochpräziser Daten. Mit sorgfältiger Protokolloptimierung bietet dieser Ansatz eine robuste und vielseitige Lösung für quantitative, nanoskalige Bildgebung in komplexen biologischen Proben. Dieses Protokoll soll der Gemeinschaft dabei helfen, die Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie einzuführen und superaufgelöste Bilder von Probenebenen zu erhalten, die mit herkömmlicher TIRF- oder HILO-Beleuchtung schwer zugänglich sind. Beide Ziele werden mit kommerziell erhältlichen Mikroskopen ermöglicht, die typischerweise weltweit in Mikroskopieeinrichtungen zu finden sind.

In Bezug auf andere und zukünftige Anwendungen ist die Methode sowohl auf ganze Zellproben als auch auf komplexere Gewebeproben bei größeren Bildabnahmetiefen anwendbar, wie in früheren Studiengezeigt wurde 14. Im Gegensatz zu Ansätzen, die eine physische Schnittung erfordern, ermöglicht diese Technik die volumetrische Bildgebung intakter Gewebe, wodurch die native Architektur erhalten bleibt und Artefakte minimiert werden, die durch physikalische Schnitte entstehen. Der Einsatz kleinerer Affinitätsproben, wie Nanobodies, verbessert die Gewebepenetration im Vergleich zu Volllängen-Antikörpern zusätzlich und ermöglicht eine gleichmäßigere Markierung in dicken Proben. Dieser Ansatz öffnet die Tür zur Untersuchung zellulärer Organisation und molekularer Verteilung in situ mit höherer Genauigkeit. Über diese Anwendungen hinaus eignet sich die Strategie auch für Hochdurchsatz-Screening von Nanostrukturen und biomolekularen Assemblierungen, was systematische Untersuchungen struktureller Heterogenität und Funktion ermöglicht. Darüber hinaus haben jüngste Entwicklungen im DNA-PAINT selbstabschreckende Imager-Sonden hervorgebracht, entweder basierend auf Farbstoff-Quencher- oder Farbstoff-Farbstoff-Interaktionen 29,30,31, die Hintergrundsignale effektiv senken, die Fluoreszenzintensität erhöhen und die räumliche Auflösung verbessern, wodurch schnellere Aufnahmeraten ermöglicht werden. Die Integration dieser fluorogenen Sonden in das SDC-OPR-Framework hat das Potenzial, sowohl die Bildgebungsgeschwindigkeit als auch die Auflösung weiter zu steigern. Die Kombination dieser Fortschritte mit den Stärken des SDC-OPR-Systems könnte seine Anwendbarkeit auf komplexere biologische Proben erweitern und die Plattform als flexibles Werkzeug für detaillierte Kartierung zellulärer und molekularer Strukturen in einer Vielzahl von Geweben etablieren.

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu erklären.

Danksagungen

Diese Forschung wurde von der Human Frontier Science Program Organization (HFSP) durch ein interdisziplinäres Postdoktorandenstipendium für CZ (LT0025/2023-C) und den Engineering and Physical Sciences Research Council finanziert, um M.T. (EP/R513143/1 und EP/W524335/1) sowie O.P.L.D (EP/R513143/1 und EP/T517793/1) zu unterstützen. S.S würdigt außerdem die Royal Society durch ein Dorothy Hodgkin-Stipendium (DHF\R1 191019\ und DHF\R 251006\). Diese Arbeit wurde außerdem durch die Chan Zuckerberg Initiative (2023-321188) und BBSCR (BB/Y513064/1) für S.S. unterstützt.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
(±)-6-Hydroxy-2,5,7,8-Tetramethylchroman-2-CarbonsäureMerck 238813-5GTrolox
3,4-Dihydroxybenzoesäure Merck 37580-25G-FPCA
60& Mal; Apo NA 1.49 ObjektivobjektivNikon
7.0 KDA Spin-Entsalzungssäule mit Größenausschlussharz & nbsp;Fisher Scientific Ltd89882Zeba Spin Entsalzungskolonnen für Schritt 2.4
Accutase – EnzymzellablösungsmediumPromo CellC-41310
Alpaca sdAb (1H1) Anti-GFP gekoppelt mit individueller DNA (sdAB-5'-TCCTCCTCCTCCTCCT-3')Massive PhotonikIndividuelles ProduktAnti-GFP-Kandidat für Drosophila
Alpaca sdAb (1H1) Anti-GFP gekoppelt mit DNAMassive PhotonikMASSIVE-TAG-Q-FAST anti-GFP - F3Anti-GFP-Kandidat für NUP
Anti-Alpha-Tubulin (YL1/2)Thermo Fisher ScientificMA1-80017
Anti-Kaninchen-IgGMassive PhotonikMassive-sdAB-FAST 2-Plex, sekundäre sdAB F2
Anti-TCRζ (6B10.2)BioLegend644102
RinderserumalbuminMerck A4503-10GBSA
Konische Zentrifugalröhre 15 mLFisher Scientific Ltd17705004
Konische Zentrifugalröhre 50 mLVWR International734-0448
CSU-W1 SoRaNikonSDC-OPR-Mikroskop
Entsalzung von Spin-Säulen mit Sephadex G-25 (Größenausschlussharz zur DNA-Reinigung) Fisher Scientific Ltd11743309Marke: Cytiva. G-25-Spalten für Schritt 2.5
D-GlukoseMerck G8270-1KG
DMEM MediaThermo Fisher Scientific11965092
DMSO, WasserfreiThermo Fisher ScientificD12345
DTT  (Dithiothreitol)Thermo Fisher Scientific15976082
EDTAThermo Fisher Scientific15575020
EGTAMarck324626
Fetales RinderserumThermo Fisher ScientificA5256701
GlutaraldehydServa2311402
GlycerolMerck G5516-500ML 
GlycinMP Biomedizin219482580
Maleimid-PEG2-Succinimidyl Merck 746223-50MG
McCoys 5A-MedienFisher Scientific Ltd16600082
MES (2-(N-Morpholino)Ethanesulfonsäure)MerckM3671-50G
MethanolFisher Scientific Ltd32213-25L
MgCl2Fisher Scientific Ltd10418464
Mikrozentrifugenröhren 0,5 mLFisher Scientific Ltd11508232
Mikrozentrifugenröhren 1,5 mLEppendorf10509691 
Mikrovolumen-UV-Vis-SpektrophotometerThermo Fisher ScientificND-ONE-WNanodrop
NaCl2Sigma-AldrichS6546-1L 
Nanopteilchen 90 nm -GoldZytodiagnostikG-90-100
Orca Fusion-BT CMOS-KameraHamamatsu
Penicillin-StreptomycinThermo Fisher Scientific15070063P/S
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (1x-Lösung)Fisher Scientific Ltd11530546PBS
Pierce 16 % Formaldehyd (w/v), methanolfreiFisher Scientific Ltd11586711PFA
Kaliumchlorid Merck   P9541-500G
Protokatechuat 3,4-Dioxygenase & nbsp;Merck P8279-25UN PCD
natrium  HydroxidFisher Scientific Ltd12963614
TOM20-AntikörperAbcamAb186735
Tris-PufferVWR InternationalA4577.1000
Triton  X-100   VWR International1086031000
Tween-20Merck P9416-50ML
Ultrafiltrations-Zentrifugalfiltereinheit, 100 kDa MWCOMerck UFC510024Hersteller: Amicon Ultra
μ-Slide 8 Brunnen hoher GlasbodenIbidiIB-80807
μ-Slide VI 0.5 GlasbodenIbidiIB-80607

Referenzen

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DNA PAINT BildgebungEinzelmolek l LokalisierungGanzzell BildgebungMehrfarben Bildgebungintrazellul re MarkierungDeep Cell BildgebungBildrekonstruktion
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