Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.

Methodenartikel

Entwicklung und Standardisierung einer ex vivo Mikromethode zur intrazellulären Quantifizierung von Vincristin in primären ALLEN Zellen mittels LC-MS/MS

463 Ansichten

⸱

DOI:

10.3791/69535

⸱

23. Januar 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Leukemia Biology Laboratory, Boldrini Children's Center, 2Mass Spectrometry Laboratory, Boldrini Children's Center, 3Boldrini Children's Center

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll zielte darauf ab, eine LC-MS/MS-Methode zur relativen Quantifizierung der Vincristin-Ansammlung in primären pädiatrischen ALLEN Zellen zu etablieren und zu optimieren.

Zusammenfassung

Die Quantifizierung intrazellulärer Vincristin (VCR) in primären pädiatrischen akuten lymphoblastischen Leukämiezellen (ALL) ist essenziell, um probenspezifische Unterschiede in der Arzneimittelaufnahme zu verstehen und experimentelle Studien mit knappem Patientenmaterial zu unterstützen. Hier präsentieren wir eine optimierte LC-MS/MS-Mikromethode, die speziell für primäre ALLE Zellen optimiert ist, die durch patientenabgeleitete Xenografts (PDX) gewonnen werden und dabei zentrale Herausforderungen wie begrenzte Zellverfügbarkeit, kleine Zellgröße und die Notwendigkeit einer reproduzierbaren Erholung nach mehreren Waschschritten adressiert. Zeitverlauf-Assays von 1 bis 5 Stunden zeigten, dass eine 3-stündige Inkubationszeit die höchsten und konstantesten intrazellulären VCR-Werte mit geringerer Variabilität zwischen den Replikaten liefert. Die Methodenoptimierung zeigte außerdem, dass die Verwendung von 2,5 × 106 Zellen pro Bedingung die analytische Robustheit verbessert im Vergleich zu 1 × 106 Zellen, die in wiederholten Experimenten eine größere Dispersion zeigten. Weitere wichtige Verfeinerungen waren der Einsatz von kaltem Methanol zur Verbesserung der Effizienz der Proteinausfällung und die Einführung eines internen Standards zur Überwachung und Minimierung von prozeduralen Variationen. Die Methode ermöglicht eine empfindliche und präzise Quantifizierung des intrazellulären Videorekorders über relevante Konzentrationsbereiche, obwohl die niedrigst getestete Dosis (0,01 μM) nach der 3-Stunden-Inkubation nicht quantifizierbar war. Insgesamt bietet diese Mikromethode einen praktischen, reproduzierbaren und skalierbaren Ansatz zur Messung intrazellulärer Videorekorder in primären ALL-Proben. Ihr Design unterstützt vergleichende Analysen, die Validierung von ex vivo Modellen und zukünftige methodische Anwendungen, die darauf abzielen, intrazelluläre Arzneimittelquantifizierung in breitere pharmakologische Bewertungen zu integrieren.

Einleitung

Akute lymphoblastische Leukämie (ALL) macht etwa 25 % aller Kinderkrebserkrankungen aus und bleibt die häufigste pädiatrische Malignität 1,2. Obwohl Fortschritte in der Therapie die Überlebensraten deutlich verbessert haben und nun über 90 % liegen, treibt die biologische Komplexität von ALL weiterhin die Bemühungen voran, Werkzeuge zu entwickeln, die die Krankheit auf zellulärerEbene 3 besser charakterisieren.

Vinca-Alkaloide, insbesondere VCR, sind Schlüsselbestandteile ALLER Behandlungsprotokolle4. Da VCR seine zytotoxischen Wirkungen intrazellulär ausübt, ist das Verständnis seiner Aufnahme und Ansammlung in leukämischen Zellen grundlegend für Studien zur Wirkstoffwirkung, Pharmakodynamik und zellulärem Verhalten in ex-vivo-Systemen. Die meisten verfügbaren Ansätze zur Beurteilung intrazellulärer Arzneimittelspiegel basieren jedoch auf indirekten Messungen oder semi-quantitativen Methoden, wobei Reproduzierbarkeit und Sensitivitätbegrenzt werden 5,6,7.

Parallel dazu sind viele Untersuchungen weiterhin stark auf Leukämiezelllinien angewiesen, denen die biologische Heterogenität und klinische Relevanz von von Patienten abgeleiteten Primärzellen fehlen. Primärproben stellen häufig Herausforderungen dar, wie begrenzte Zellanzahl, variable Probenqualität und den Bedarf an hochsensiblen analytischen Techniken, die in der Lage sind, intrazelluläre Verbindungen mit geringer Häufigkeit zu erkennen8.

Die Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) bietet die Spezifität und Empfindlichkeit, die für eine präzise Quantifizierung von Chemotherapeutika erforderlich sind, doch standardisierte Protokolle zur direkten Messung intrazellulärer Videorekorder in primären leukämischen Zellen bleiben rar. Die Entwicklung robuster Mikromethoden, die mit begrenztem Patientenmaterial kompatibel sind, kann eine breite Palette von Anwendungen erleichtern, darunter pharmakologisches Profiling, Bewertung von Arzneimittel-Zell-Interaktionen und vergleichende Studien über Krankheitssubtypen oder therapeutische Erkrankungen.

In diesem Protokoll beschreiben wir die Entwicklung und Optimierung einer Mikromethode zur ex-vivo-Quantifizierung intrazellulären Videorekorders in primären leukämischen Zellen mittels LC-MS/MS. Um genügend Material für die Methodenentwicklung zu erhalten, wurden Patientenproben in immundefiziierende NSG-Mäuse transplantiert, um PDX-Modelle9 zu erzeugen. Nach der Expansion in vivo wurden humane leukämische Zellen isoliert und10 Zellen kryokonserviert. Anschließend wurden sie aufgetaut, mit Videorekorder inkubiert, gewaschen, gelysiert und mit LC-MS/MS analysiert, um die intrazellulären Arzneimittelspiegel zu bestimmen.

Diese Methode bietet mehrere Vorteile: Sie benötigt eine kleine Anzahl von Zellen (2,5 Millionen), ist empfindlich und schnell und mit klinisch relevanten Primärproben kompatibel. Da es den intrazellulären Wirkstoffgehalt direkt misst, bietet es ein zuverlässiges quantitatives Werkzeug für Forscher, die die Medikamentenaufnahme, zelluläre Reaktionen auf Chemotherapeutika oder andere pharmakologische Fragestellungen bei hämatologischen Malignitäten untersuchen.

Insgesamt erweitert dieses Protokoll das analytische Toolkit zur Untersuchung von pädiatrischer ALL und lässt sich leicht für andere Medikamente oder Probentypen anpassen, was zukünftige Untersuchungen zur Leukämiebiologie, zum Arzneimittelverhalten und zur Präzisionspharmakologie unterstützt.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

Die in dieser Studie verwendeten Leukämieproben wurden aus biobankierten Phiolen von Patienten entnommen, die im Centro Infantil Boldrini behandelt wurden und die Nutzung ihrer Zellen über ein Einwilligungsformular erlaubten. Das Projekt wurde vom institutionellen Ethikausschuss (CAAE 34601120.7.0000.5376) genehmigt. Die Protokolle zur Erzeugung von PDX bei Tieren wurden gemäß den Vorschriften und ethischen Richtlinien des Tierethikausschusses (Comissão de Ética no Uso de Animais) des Centro Infantil Boldrini (CEUA/Boldrini 0011-2020) durchgeführt.

1. Probenvorbereitung und Medikamenteninkubation (Tag 1)

  1. Vorbereitung des Materials und Arbeitslösungen
    1. Wiegen Sie 2,5 mg Vincristinsulfat (Molekulargewicht: 923 g/mol) und lösen Sie es in 2,0 ml Dimethylsulfoxid (DMSO) in einer 2,0 mL Mikroröhre auf, um eine 1,354 mM große Serienlösung herzustellen. Vortex, bis er vollständig aufgelöst ist.
      VORSICHT: DMSO ist ein Ärgernis; Trage Handschuhe und führe es mit einer chemischen Abzugshaube.
    2. Bereite die 100 μM Arbeitslösung vor, indem Sie 147,71 μL der VCR-Serienlösung mit 1.852,28 μL DMSO in einer 2,0 mL Mikroröhre mischen. Vortex gründlich.
    3. Verteilen Sie 500 μL der Arbeitslösung in vier 0,6 mL Mikroröhren und lagern Sie sie bei -20 °C für bis zu mehrere Monate. Vermeiden Sie es, die Aliquots mehr als dreimal aufzutauen.
    4. Bereite eine 100 μM Vinblastin (VINB) Arbeitslösung vor, indem 181,81 μL einer 1,1 mM starken Lagerlösung (Vinblastinsulfat 1 mg/mL, Molmolekülgewicht: 909,07 g/mol) mit 1.818,19 μL sterilem ultrareinem Wasser in einer 2,0 mL Mikroröhre gemischt wird. Vortex bis homogen.
    5. Aliquot funktioniert die VINB-Lösung genauso wie beim Videorekorder.
    6. Bereiten Sie eine Methanol- + 0,1 μM VINB-Lösung her, indem Sie 49,95 ml Methanol mit 50 μL der VINB-Arbeitslösung in einem 50-mL-Rohr mischen. Vortex bis homogen. Lagere es bis zu 3 Monate bei -20 °C.
      VORSICHT: Methanol ist giftig und entflammbar; mit geeigneter PSA in einer Abzugshaube zu behandeln.
    7. Bereiten Sie eine Lösung mit Wasser + 0,1 % Ameisensäure vor, indem Sie 49,95 ml ultrareines Wasser mit 50 μl Ameisensäure in einem 50 mL Rohr mischen. Vortex gut. Lagern Sie bei Zimmertemperatur (RT).
      VORSICHT: Ameisensäure ist korrosiv; Handschuhe und Augenschutz verwenden.
  2. Auftauen und Waschen der Primärzellen
    1. Kryokonservierte Zellproben auftauen, indem das Fläschchen vorsichtig in einem Becher mit 15 ml 37 °C destilliertem Wasser geschwenkt wird, bis es vollständig aufgetaut ist.
      HINWEIS: Informationen zu den Zellentnahme- und Einfrierprotokollen finden Sie in früheren Publikationen 9,10.
    2. Übertragen Sie den Inhalt der Phiole in ein 50 ml konisches Rohr mit 10–15 ml sterilem 1x PBS und einer sterilen Einweg-Pasteur-Pipette. Zentrifugiere bei 300 × g für 5 Minuten bei RT.
    3. Entsorgen Sie den Supernatant, indem Sie das Rohr umdrehen.
    4. Die Kugel in 10 ml AIM V Medium mit einer Einweg-Pasteur-Pipette wieder aufhängen. Zählen Sie lebensfähige Zellen und messen Sie die durchschnittliche Zellgröße mit einem automatisierten Zähler.
      HINWEIS: Die Verwendung von Zellen, die mindestens 80 % Lebensfähigkeit im Verhältnis zur Gesamtzahl der gesammelten Zellen aufweisen, wird empfohlen.
    5. Berechnen Sie das Volumen, das benötigt wird, um 2,5 × 106 lebensfähige Zellen zu sammeln, anhand eines einfachen Anteils basierend auf der gemessenen Konzentration. Wenn die Konzentration beispielsweise 5 × 106 Zellen/ml beträgt, beträgt das erforderliche Volumen 0,5 mL.
      HINWEIS: Führen Sie jede Behandlung im Dreifachverfahren zur Reproduzierbarkeit der Daten durch. Behalten Sie die mittlere Größe der im automatisierten Zellzähler bereitgestellten Zellen; Verwenden Sie es, um das Volumen der Zellen zu berechnen.
  3. Drogenbehandlungseinrichtung
    1. Berechnen Sie das Volumen der VCR-Arbeitslösung, das benötigt wird, um eine Endkonzentration von 1 μM in einem Gesamtvolumen von 2,0 ml zu erreichen. Vortex die Standardlösung vor dem Pipetten.
    2. Gib das AIM V-Medium, dann 2,5 × 106-Zellen und schließlich die Videorekorder-Lösung zu einer 2,0-mL-Mikroröhre hinzu. Kurz vortexen und leicht nach unten drehen (5 s), um Flüssigkeit aus dem Rohrdeckel aufzufangen.
    3. Inkubieren Sie die offenen Röhren bei 37 °C, 5 % CO2für 3 Stunden.
    4. Nach der Inkubation schließen Sie die Deckel und zentrifugieren Sie die Proben bei 300 × g für 5 Minuten bei RT.
    5. Entsorge den Überstandsstoff vorsichtig mit einer Pipette und gib dann 1 ml PBS bei RT in die Röhre.
    6. Wiederholen Sie die Zentrifugation bei 300 × g für 5 Minuten bei RT, Überlagerungsentfernung und PBS-Waschung zweimal weiter, insgesamt drei Waschen.
    7. Entfernen Sie vorsichtig alle Supernatanten mit einer Pipette, suspendieren Sie das Pellet in 100 μL PBS und lassen Sie es vortexen, bis das Pellet vollständig wieder suspendiert ist.
    8. Fügen Sie 400 μL kaltes Methanol + 0,1 μM Vinblastin (-20 °C) direkt zur Probe hinzu, wobei der Kontakt mit den Röhrenwänden vermieden wird.
    9. Lagern Sie die Proben über Nacht bei -80 °C.
      HINWEIS: Proben können einige Wochen bei -80 °C gelagert werden (sicherer Stopp).

2. Probenverarbeitung für LC-MS/MS (Tag 2)

  1. Probenentnahme
    1. Vorkühlen Sie die Zentrifuge auf 4 °C, bevor Sie die Proben aus dem -80 °C Gefrierschrank entnehmen.
    2. Unmittelbar nach der Entnahme der Proben aus dem Gefrierschrank wird sie bei 13.000 × g für 20 Minuten bei 4 °C zentrifugiert.
    3. Übertragen Sie 300 μL Supernatant auf eine 1,5 ml Mikroröhre.
    4. Trocknen Sie die Proben vollständig mit einem Vakuumkonzentrator bei 40–45 °C für 1 Stunde und 40 Minuten.
      HINWEIS: Getrocknete Pellets können bei -20 °C für einige Wochen gelagert werden (sicherer Stopp).
    5. Jedes Pellet wird in 400 μL Wasser + 0,1 % Ameisensäure (zuvor zubereitet) wieder suspendiert. Vortexen vorsichtig, bis das Pellet vollständig aufgelöst ist.
    6. Zentrifugieren Sie die Proben erneut bei 13.000 × g für 20 Minuten bei 4 °C.
    7. Übertragen Sie 300 μL Supernatant auf ein 2,0 ml Schraubverschluss-Ampulle für die LC-MS/MS-Analyse.

3. LC-MS/MS-Einrichtung und Datenerfassung

  1. Mobilphasenvorbereitung und Säulenkonditionierung
    1. Lösungsmittel A bereiten, indem man ultrareines Wasser mit 0,1 % Ameisensäure mischt.
    2. Lösungsmittel B werden hergestellt, indem Sie Acetonitril mit 0,1 % Ameisensäure mischen.
      VORSICHT: Acetonitril ist giftig und entflammbar; Kontrolle in einer chemischen Abzugshaube.
    3. Sonikieren Sie jedes Lösungsmittel 5 Minuten lang in einem Ultraschallbad. Verbinden Sie die Flaschen mit dem Pumpenmodul und spülen Sie das System mit hohem Durchfluss, um Schadstoffe zu entfernen.
    4. Installieren Sie eine umgekehrte Phase BEH C18-Säule (1,7 μm, 2,1 mm × 50 mm).
      HINWEIS: Zur Durchführung der Analyse verwendete diese Studie ein Acquity H-Klasse chromatographisches System, das mit einem Xevo TQS-Micro Triple-Quadrupol-Massenspektrometer gekoppelt war.
    5. Verwenden Sie einen binären Gradienten, der aus den Lösungsmitteln A und B besteht, die beide zuvor vorbereitet wurden.
    6. Führen Sie den chromatografischen Gradienten von 5 % bis 95 % des Lösungsmittels B in den ersten 2 Minuten durch, gefolgt von 2 Minuten mit Lösungsmittel A zur Säulenreinigung und Neuausgleich.
    7. Stellen Sie den Durchfluss während des gesamten 4-minütigen Laufs auf 0,2 mL/min ein. Halten Sie die Säulentemperatur bei 40 °C und injizieren Sie 10 μL pro Probe.
  2. LC-MS/MS-Methodenaufbau
    1. Öffne die LC-MS/MS-Software. Klicken Sie auf Datei > New > MS-Methode , um eine neue Methode zu starten.
    2. Gehe zum Funktionstab und stelle den Funktionstyp auf multiple reaction monitoring (MRM) ein. Geben Sie Ionenübergänge und Parameter ein, die in Tabelle 1 für Videorekorder und VINB (interner Standard) aufgeführt sind.
    3. Stelle die Erwerbszeit auf 4 Minuten ein. Klicken Sie auf Umwerben, um zu speichern.
      HINWEIS: Überschreiten Sie nicht 4 Minuten, um das Gleichgewicht der Säule zwischen den Injektionen sicherzustellen.
    4. Konfigurieren Sie UHPLC-Parameter unter Inlet-Methode > Bearbeiten der LC-Methode und speichern Sie sie als .mth-Datei (Tabelle 2).
    5. Setze die Quellparameter unter dem Tune-Tab gemäß Tabelle 3. Speichere als .tun-Datei.
    6. Speichere die vollständige Methode: Datei > Speichern Speichern und als .mth-Datei exportieren .
  3. Erstellung einer Beispielliste und Beginn des Durchlaufs
    1. Auf dem Startbildschirm der Software öffnen Sie die Sample-Liste und erstellen Sie eine Liste mit den Probennamen, Injektionsvolumen, Fläschchenpositionen und der zu verwendenden Methode.
    2. Stellen Sie ein Fläschchen mit ultrareinem Wasser in das Autosampler-Tray und benennen Sie es als Blank. Führe die Leerlaufbahn zwischen jedem Satz dreifacher Injektionen durch, um eine Übertragung zu vermeiden.
      HINWEIS: Stellen Sie vor Beginn des Durchlaufs sicher, dass der Säulendruck (ΔP) stabil und unter 10 psi liegt.
    3. Wählen Sie die gewünschten Zeilen in der Beispielliste aus und klicken Sie auf Ausführen > OK , um mit der Datenerfassung zu beginnen.

4. Datenanalyse

  1. Datenvisualisierung und Export
    1. Nach Abschluss des Durchlaufs sehen Sie sich Chromatogramme an, indem Sie eine Probe auswählen und im oberen Menü auf Chromatogramm klicken.
    2. Auf dem Startbildschirm klicken Sie auf TargetLynx, wählen Sie die gerade gestarteten Dateien aus und klicken Sie auf Process > Select the Vincristine-Methode > OK, um Ausgabetabellen zu generieren.
    3. Klicken Sie auf Report > Export Table und speichern Sie die verarbeiteten Daten als .csv oder .xlsx Datei.
      HINWEIS: Exportiere rohe Spitzenbereiche sowohl für den Analyten als auch für den internen Standard.
  2. Datenorganisation und Verhältnisberechnung
    1. Öffnen Sie die exportierte Datei und erstellen Sie die folgenden Spalten:
      1. Probe: Fügen Sie den Namen der Probe oder des Fläschchens hinzu.
      2. Ausführen: Geben Sie an, welcher Replikation der Wert entspricht.
      3. VCR-Bereich: Geben Sie den Bereich unter dem Peak für Vincristin ein.
      4. VINB-Bereich: Gib den Bereich unter dem Peak für Vinblastin ein.
      5. VCR/VINB-Verhältnis: Normalisieren Sie jeden VCR-Wert, indem Sie ihn durch den entsprechenden VINB-Wert teilen.
    2. Füge Spalten für Standardabweichungswerte wie VCR-Fläche, VINB-Fläche und VCR/VINB-Verhältnis für jedes dreifache Set hinzu.
      HINWEIS: Die Normalisierung mit dem internen Standard ermöglicht eine Korrektur von Variationen im Extraktions- oder Injektionsvolumen.
  3. Plottergebnisse
    1. Öffnen Sie die bevorzugte Grafiksoftware und wählen Sie das Format der Gruppierten Tabellen .
    2. Wählen Sie Daten eingeben oder in eine neue Tabelle importieren , und unter Optionen wählen Sie 3 Werte in nebeneinander angeordneten Unterspalten replizieren .
    3. Für jede Probe werden nur die normalisierten VCR/VINB-Verhältnisse dargestellt und die rohen Flächenwerte weggelassen.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

Repräsentative chromatografische Ergebnisse nach intrazellulären Akkumulationstests mit primären ALLEN PDX-Zellen, die mit VCR und VINB inkubiert wurden, sind in Abbildung 1 dargestellt. Die Proben wurden mit 2,5 × 106 Zellen pro Bedingung hergestellt. Unter den beschriebenen chromatografischen Bedingungen wurde der Videorekorder konstant bei 2,85 Minuten mit minimalem Matrixeffekt gehalten, und die Spitzenform war symmetrisch und gut aufgelöst. Diese Profile veranschaulichen das ...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

Eine genaue Bewertung der intrazellulären Arzneimittelspiegel in primären leukämischen Zellen ist entscheidend, um den Umgang mit Medikamenten auf zellulärer Ebene zu verstehen und die Entwicklung funktioneller Assays zu unterstützen, die molekulare Profilierung ergänzen. Bestehende analytische Ansätze erfordern oft große Zellzahlen, erfordern lange Verarbeitungsschritte oder verlassen sich auf indirekte Auslesungen, die die tatsächliche intrazelluläre Verfügbarkeit von Chemotherapeutika...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Danksagungen

Wir danken dem Centro Infantil Boldrini und allen Patienten, die ihre Proben für die Studie gespendet haben. Adrielli C. Soares erhielt ein Stipendium von der Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil (CAPES) und von der Forschungsstiftung São Paulo (FAPESP, 2023/18389-3). José A. Yunes erhielt ein Produktivitätsstipendium vom National Council of Technological and Scientific Development (CNPq, 308399/2021-8). Diese Arbeit wurde durch Forschungsmittel des brasilianischen Gesundheitsministeriums im Rahmen des PRONON-Programms (Programa Nacional de Apoio à Atenção Oncológica, NUP 25000.211174/2019-45) unterstützt.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
2,0 mL Schraubdeckel-FläschchenDurchflussversorgung8-2400Verwendet mit Glaseinsätzen mit Feder (5 x 29 mm) derselben Firma (Kat. 5-29015)
2,0 mL Schraubdeckel-FläschchenDurchflussversorgung8-2400Verwendet mit Glaseinsätzen mit Feder (5 x 29 mm) derselben Firma (Kat. 5-29015)
AcetonitrilMerck (Sigma-Aldrich)100030
AcetonitrilMerck (Sigma-Aldrich)24010152
ZIEL VThermo Fisher Scientific12055091
Chromatographisches System Acquity UPLC H-KlasseWaters Co.https://www.waters.com/nextgen/br/pt/products/chromatography/chromatography-systems/acquity-uplc-h-class-plus-system.html?srsltid=AfmBOoo0mjNgaucBI-Exv97cEmWE96_lVkqKi2IR0IPtA-h1feG-WvtW
Gräfin 3 FLThermo Fisher ScientificA49892
DMSOMerck (Sigma-Aldrich)D 8418
Falcon 50 mLSarstedt62.547.254
AmeisensäureMerck (Sigma-Aldrich)F0507
GlasflascheMerck (Sigma-Aldrich)41121800
InkubatorPHCBIMCO-50M-PE
MethanolMerck (Sigma-Aldrich)34860
Mikroröhre 1,5 mLEppendorf41121702
Mikroröhre 2,0 mLEppendorf30120094
PBSMerck (Sigma-Aldrich)PPB006
Speevac miVacFisher Scientific56340
Die Software zur DatenerfassungWaters Co.MassLynx
Dreifach-Quadrupol-Massenspektrometer Xevo TQ-S microWaters Co.https://www.waters.com/nextgen/us/en/products/mass-spectrometry/mass-spectrometry-systems/xevo-tq-s-micro.html?srsltid=AfmBOoqqmLRNfHGqvtnwaL7xYOOEXPV3NJ9qYNH9HAwqXKXrMvLRQXSW
Ultraschall-SonikatorQuimisQ335D
Vinblastin 1 mg/mLLibbshttps://www.libbs.com.br/nossos-produtos/antineoplasico-faulblastina/Vinblastinsulfat
VincristinCayman Chemicals11764

Referenzen

  1. Inaba, H., Pui, C. H. Advances in the diagnosis and treatment of pediatric acute lymphoblastic leukemia. J Clin Med. 10 (9), 1926(2021).
  2. Pui, C. H., et al. Childhood acute lymphoblastic leukemia: progress through collaboration. J Clin Oncol. 33 (27), 2938-2948 (2015).
  3. Gaudichon, J., et al. Mechanisms of extramedullary relapse in acute lymphoblastic leukemia: reconciling biological concepts and clinical issues. Blood Rev. 36, 40-56 (2019).
  4. Dhyani, P., et al. Anticancer potential of alkaloids: a key emphasis on colchicine, vinblastine, vincristine, vindesine, vinorelbine and vincamine. Cancer Cell Int. 22, 206(2022).
  5. Mateus, A., Matsson, P., Artursson, P. Rapid measurement of intracellular unbound drug concentrations. Mol Pharmaceutics. 10 (6), 2467-2478 (2013).
  6. Chien, H. C., et al. Rapid method to determine intracellular drug concentrations in cellular uptake assays: application to metformin in organic cation transporter 1-transfected human embryonic kidney 293 cells. Drug Metab Dispos. 44 (3), 356-364 (2016).
  7. Calcagno, A. M., Ambudkar, S. V. Analysis of expression of drug resistance-linked ABC transporters in cancer cells by quantitative RT-PCR. Methods Mol Biol. 637, 121-132 (2010).
  8. Richter, M., et al. From donor to the lab: a fascinating journey of primary cell lines. Front Cell Dev Biol. 9, 648272(2021).
  9. Borgmann, A., et al. Childhood ALL blasts retain phenotypic and genotypic characteristics upon long-term serial passage in NOD/SCID mice. Pediatr Hematol Oncol. 17 (8), 635-650 (2000).
  10. Rosati, M. M., Corrêa, J. R., de Sousa Mariano, S., Cardoso, A., Andrés Yunes, J. Murine model of leukemia relapse to induction chemotherapy for acute lymphoblastic leukemia. J Vis Exp. (224), e68797(2025).
  11. Dams, R., Huestis, M. A., Lambert, W. E., Murphy, C. M. Matrix effect in bioanalysis of illicit drugs with LC-MS/MS: influence of ionization type, sample preparation, and biofluid. J Am Soc Mass Spectrom. 14 (11), 1290-1294 (2003).
  12. Yang, Y., Cruickshank, C., Armstrong, M., Mahaffey, S., Reisdorph, R., Reisdorph, N. New sample preparation approach for mass spectrometry-based profiling of plasma results in improved coverage of metabolome. J Chromatogr A. 1300, 217-226 (2013).
  13. Zhang, J., Dasgupta, A., Ayala, R., Bonapace, C., Kassim, S., Faustino, P. J. Internal standard variability: root cause investigation, parallelism for evaluating trackability and practical considerations. Bioanalysis. 16 (15), 771-776 (2024).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Schlagwörter

Intrazellul res VincristinWirkstoffquantifizierungpatientenderivierte XenotransplantateProteinf llungInterner Standardp diatrische Leuk mieZeitverlaufsassay
Entwicklung und Standardisierung einer ex vivo Mikromethode zur intrazellulären Quantifizierung von Vincristin in primären ALLEN Zellen mittels LC-MS/MS
Kontakt
Rückmeldung an Ihre Bibliothek

Datenschutz

Nutzungsbedingungen

Richtlinien

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle Rechte vorbehalten.