CRISPR/Cas9-vermittelte Erzeugung und Charakterisierung eines Ent2*/CyO Drosophila melanogaster-Stamms

Zusammenfassung

Der Gleichgewichtsnukleosidtransporter 2 (ENT2) ist ein konserviertes transmembranäres Protein, das am Nukleosidtransport und dem zellulären Stoffwechsel beteiligt ist. In dieser Studie wurde ein CRISPR/Cas9-basierter Genom-Editierungs-Workflow etabliert, um ein Ent2-gezieltes Allel in Drosophila melanogaster zu erzeugen. Eine stabile Ent2*/CyO-heterozygote Linie wurde mit einer Balancer-Chromosomenstrategie konstruiert und gepflegt. Diese Arbeit beschreibt das Design, die Erzeugung und die molekulare Validierung der mutierten Linie sowie ihre phänotypische Charakterisierung unter unterschiedlichen Temperaturbedingungen. Der etablierte Arbeitsablauf und der mutierte Stamm bieten einen praktischen Rahmen zur Untersuchung von Genen mit homozygoten lethalen Phänotypen und zur Untersuchung temperaturassoziierter phänotypischer Variationen bei Drosophila.

Zusammenfassung

In dieser Studie wurde ein CRISPR/Cas9-basierter Genom-Editierungsansatz verwendet, um Mutationen im gleichgewichtigen Nukleosidtransporter-2 (Ent2)-Gen in Drosophila melanogaster einzuführen. Guide-RNAs, die auf die kodierende Region von Ent2 abzielen, wurden entworfen und gemeinsam mit Cas9-mRNA in ^{w1118-Embryonen} injiziert. Mutante Allele wurden durch Sanger-Sequenzierung identifiziert und als stabile Ent2*/CyO-heterozygote Linie mit einem Balancerchromosom aufrechterhalten. Anschließend bewerteten wir das Körpergewicht, die Kletterfähigkeit, die Überlebensrate sowie die Aktivitäten von Superoxiddismutase (SOD) und Katalase (CAT) bei Fruchtfliegen bei 22 °C bzw. 25 °C. Die Ergebnisse zeigen, dass bei sowohl 22 °C als auch bei 25 °C die Körperlänge und das Gewicht der Ent2*/CyO-Fruchtfliegen im Vergleich zur W¹¹¹⁸ signifikant reduziert wurden und ihre Entwicklung verzögert wurde. Bei 22 °C war die Gesamtlebensspanne der Ent2*/CyO-Fliegen etwas länger als die der W¹¹¹⁸, während bei 25 °C kein signifikanter Unterschied festgestellt wurde. Was die Fortbewegungsfähigkeit betrifft, so war die Kletterleistung der heterozygoten Fliegen bei beiden Temperaturen deutlich geringer als die der W¹¹¹⁸, wobei die Männchen stärker betroffen waren. Darüber hinaus waren die antioxidativen Enzymaktivitäten von CAT und SOD bei Ent2*/CyO-Fruchtfliegen signifikant reduziert, was auf eine deutliche Beeinträchtigung der antioxidativen Kapazität hinweist. Diese Ergebnisse beschreiben das phänotypische Profil einer von CRISPR erzeugten Ent2-Mutantenlinie und zeigen die Machbarkeit, Genom-Editierung mit Balancer-Chromosomenstrategien bei Drosophila zu kombinieren. Diese Studie bietet einen methodischen Rahmen und eine genetische Ressource für zukünftige Untersuchungen von Genen, die mit Stoffwechsel und Umweltreaktionen assoziiert sind.

Einleitung

Drosophila melanogaster bleibt eines der am weitesten verbreiteten Modellorganismen für Genetik und Entwicklungsbiologie¹. Es zeichnet sich durch einen kurzen Lebenszyklus, schnelle Fortpflanzung, etablierte genetische Manipulationswerkzeuge und ein vollständig annotiertes Genom ^2,3 aus. Diese Art wird umfangreich in Studien zur Genfunktion, Stoffwechselregulation und Umweltanpassungsfähigkeit^{eingesetzt 4,5}. Nukleoside und ihre Derivate wie ATP sind zentral für die zelluläre Energieerzeugung, die Nukleinsäuresynthese und die Signaltransduktion in Drosophila und spiegeln die konservierte Stoffwechselregulation über Metazoen^wider. Purinerge Signalwege in Drosophila, die von extrazellulären Adenosin- und Nukleosidtransportmechanismen abhängen, verdeutlichen die funktionelle Rolle der Nukleosidbewegung über Membranen bei der Koordination von Energie- und Signaltransduktionsantworten⁷. Unter diesen Prozessen wird der Transport von Nukleosiden über die zytoplasmatische Membran hauptsächlich durch die Familie der gleichgewichtigen Nukleosidtransporter (ENT) vermittelt, wobei DmENT2 funktionelle Transportaktivität in Drosophila⁸ zeigt.

Die HNO-Familie umfasst mehrere Untertypen, darunter ist ENT2 ein umfassend untersuchter transmembraner Nukleosidtransporter⁹. Es erleichtert den energieunabhängigen transmembranen Transport verschiedener Purin- und Pyrimidinnukleoside^10,11. Bei Säugetieren ist ENT2 ein allgegenwärtig exprimierter bidirektionaler Transporter, der die zelluläre Aufnahme von Purin- und Pyrimidinnukleosiden sowie Nukleobasen erleichtert. Diese Transportaktivität trägt zur Nukleotidrettung bei und hilft, die zelluläre metabolische Homöostase¹² aufrechtzuerhalten. ENT2 vermittelt außerdem den Transport verschiedener nukleosid-abgeleiteter Medikamente und erweitert seine funktionelle Relevanz über die endogene Nukleosidbewegung hinaus und hebt damit seine breitere physiologische und klinische Bedeutung hervor¹³. Darüber hinaus wurde ENT2 mit neurologischen Störungen¹⁴, Tumorstoffwechsel¹⁵, vaskulärer Dysfunktion¹⁶ und zellulärem Energiestoffwechsel beim Menschen¹⁷ in Verbindung gebracht. Studien zu den organismischen Rollen von Ent2 in Drosophila bleiben jedoch begrenzt.

Die Rolle von ENT2 im Wachstum und in der Entwicklung, im Energiestoffwechsel, in der Bewegungsfähigkeit und in der antioxidativen Kapazität unter wechselnden Temperaturbedingungen wurde noch nicht^{vollständig erforscht}. Die Temperatur beeinflusst den Basalstoffwechsel und die Lebensdauer bei Drosophila stark, wobei höhere Aufwuchstemperaturen im Allgemeinen die Stoffwechselaktivität erhöhen und die Lebenserwartung^verkürzen. Diese temperaturabhängigen Veränderungen in der Genexpression können physiologische Wege beeinflussen und somit die phänotypischen Effekte spezifischer Genmutationen verändern²⁰.

Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-assoziiertes Protein 9 (CRISPR/Cas9) wurde in Drosophila häufig für verschiedene genomische Modifikationsoperationen wie ortsspezifische Knockout, Deletion, Ersatz und Tag-Einführung eingesetzt und zeigt seine Effizienz und Zuverlässigkeit 21,22,23. Die neuesten Fortschritte zeigen, dass CRISPR-abgeleitete Basiseditoren auch für feinere standortspezifische Basenmodifikationen in Drosophila verwendet werden können, was ein neues Werkzeug für Punktmutationen und präzise phänotypische Kontrolle²⁴ bietet. Traditionelle Mutagenese-Methoden, darunter chemische und strahlende Mutagenese sowie transposonvermittelte Screens, können genetische Mutationen erzeugen²⁵. Diese Ansätze sind oft durch geringe Effizienz und hohe Zufälligkeit bei den Mutationsereignissen begrenzt. Daher müssen Forscher große Gruppen von Individuen screenen, um spezifische Interelen^{von Interesse 26} zu isolieren. CRISPR/Cas9 ermöglicht eine programmierte Guide-RNA (gRNA)-gesteuerte Spaltung an bestimmten DNA-Sequenzen. Die resultierenden Doppelsträngbrüche werden durch nicht-homologe Endverbindungen oder homologiegesteuerte Reparaturen repariert, wodurch definierte, erbbare Mutationen entstehen und Hintergrundmutationen signifikant reduziert werden, die die phänotypische Analyse^{erschweren könnten 27,28}. Mutante Allele, die durch CRISPR/Cas9 erzeugt werden, können durch Verknüpfung mit Balancerchromosomen wie Curly O (CyO)²⁹ in einem heterozygoten Zustand erhalten bleiben. Diese Strategie hat sich in der Drosophila-Genetik als wirksam erwiesen, um den Verlust tödlicher Allele in homozygoter Form zu verhindern. Dadurch unterstützt es eine langfristige und systematische phänotypische Bewertung, einschließlich funktioneller Studien unter wechselnden Temperaturen oder Umweltbedingungen^29,30. Das einfache Design und die hohe Effizienz von CRISPR/Cas9 haben den Zyklus der Stammkonstruktion erheblich verkürzt und die Stabilität des genetischen Hintergrunds verbessert. Dies ist besonders wichtig für die Untersuchung langfristiger Umweltfaktoren wie Temperaturreaktion und Entwicklungshomöostase.

Aufbauend auf diesem Fundament wurde das Ent2-Gen in Drosophila melanogaster mit dem CRISPR/Cas9-System beseitigt, und ein stabil vererbter Ent2*/CyO-heterozygoter Mutantenstamm wurde etabliert. Der Entwicklungszyklus, das Körpergewicht, die Bewegungsfähigkeit und die Aktivitäten der antioxidativen Enzyme SOD und CAT wurden systematisch bewertet. Durch den Vergleich multidimensionaler Phänotypen von w¹¹¹⁸ und mutierten Fliegen unter unterschiedlichen Temperaturbedingungen zielt diese Studie darauf ab, eine reproduzierbare Strategie zur Erzeugung und Aufrechterhaltung von CRISPR-abgeleiteten mutierten Linien zu präsentieren und eine beschreibende Charakterisierung der resultierenden Phänotypen zu liefern. Diese Arbeit bietet einen methodischen Rahmen und eine nützliche genetische Ressource für zukünftige Studien, die Gene untersuchen, die an Stoffwechsel und Umweltreaktionen beteiligt sind.

Protokoll

1. Design von CRISPR/Cas9-Zielen für das Ent2-Gen

1. Wählen Sie potenzielle CRISPR-Standorte in Exons 2 und 5 von Ent2 (FlyBase ID: FBgn0263916) mit CHOPCHOP (v3)³¹ und CCTop (v1.0)³² aus.
2. Das Referenzgenom wurde als Drosophila melanogaster Release 6 (dm6) definiert (RefSeq Assembly Accession: GCF_000001215.4). Anschließend wurden anwärtliche gRNA-Stellen identifiziert. Schließlich wurden die identifizierten Stellen gefiltert, um die optimalen gRNAs zu erhalten.
3. Filterziele nach MIT-Spezifitätsscore ≥ 80 (CHOPCHOP), CFD-Wert ≤ 0,1 (CCTop), GC-Gehalt 40–60 % und minimaler PAM-Entfernung.
4. Bewerten Sie Ziele mit einem gewichteten Wert (Effizienz 50 %, Spezifität 30 %, GC-Optimierung 20 %) und wählen Sie zwei gRNAs aus.
5. Fügen Sie einem "G" an das 5′-Ende jeder gRNA hinzu, um den T7-Promotorbedarf zu erfüllen. Verwenden Sie die folgenden gRNA-spezifischen vorwärtsgerichteten Oligonukleotiden, um die vollständige sgRNA-Transkriptionsvorlage mittels PCR zu erzeugen:
   Ent2-sg1-F: TAATACGACTKAKTAT
   AGGTGACGTTAAATCCATCGTTTTAGAGCTAGAAATAAATAGC
   Ent2-sg2-F: TAATACGACTCAC
   TATATTGCCGTTGGAATCATGGGGGGGTTTTAGAGCTAGATAGAAATAGC
6. Die verbleibende sgRNA-Gerüstsequenz wird durch das universelle Reverse-Oligonukleotid während der PCR bereitgestellt.

2. Herstellung von sgRNA-Transkriptionsvorlagen

1. Herstellung von sgRNA-Transkriptionsvorlagen
   1. Stellen Sie eine 60 μL PCR-Reaktionsmischung mit der Doppel-Oligonukleotid-Annealing–PCR-Methode³³ gemäß den Anweisungen des Herstellers zusammen. Kombinieren Sie das gRNA-spezifische vorwärtsgerichtete Oligonukleotid (Ent2-sg1-F oder Ent2-sg2-F) mit einem universellen Reverse-Oligonukleotid, das das sgRNA-Gerüst kodiert, um die vollständige dsDNA-Vorlage für die in-vitro-Transkription zu erhalten.
   2. Programmieren Sie den Thermocycler: 95 °C 3 Min; 35 Zyklen mit 95 °C 30 S, 55 °C 30 S, 72 °C 20 S; dann 72 °C 10 min; Halte bei 12 °C.
2. Reinigen Sie die Transkriptionsvorlage
   1. Fügen Sie 100 μL Ammoniumacetat (siehe Materialtabelle) zum 60 μL PCR-Produkt hinzu; mischen. 400 μL wasserfreies Ethanol hinzufügen; Umdrehen, um zu mischen, und 20 Minuten bei -20 °C inkubieren.
   2. Zentrifugieren bei 4 °C, 20.000 x g für 15 Minuten; Supernatant wegwerfen.
   3. Lass das Pellet 10 Minuten mit offenem Schlauch an der Luft trocknen. Die Kugel wird in 10 μL nukleasefreiem ddH₂O wieder suspendiert.
3. In-vitro-Transkription von gRNA
   1. Richten Sie eine 10 μL T7-In-vitro-Transkriptionsreaktion gemäß den Kit-Anweisungen ein (siehe Materialtabelle).
   2. Inkubieren Sie bei 37 °C für 35 Minuten. Fügen Sie 0,5 μL DNase I hinzu (im Transkriptionsset bereitgestellt) und inkubieren Sie bei 37 °C für 15 Minuten.
4. Reinigen Sie gRNA
   1. Verdünnen Sie das Transkriptionsgemisch auf 60 μL mit nukleasefreiem ddH₂O. Fügen Sie 60 μL wassergesättigtes Phenol/Chloroform hinzu (siehe Materialtabelle); Kurz wirbeln und bei 4 °C, 16.000 x g für 5 Minuten zentrifugieren.
   2. Übertragen Sie 45 μL der wässrigen Phase auf eine neue 1,5 mL RNase-freie Röhre. Fügen Sie 5 μL Natriumacetat hinzu; Mischen.
   3. Fügen Sie 125 μL vorgekühltes wasserfreies Ethanol hinzu; Rühren und bei -20 °C 20–30 Minuten inkubieren. Zentrifugieren bei 4 °C, 20.000 x g für 15 Minuten; Supernatant wegwerfen.
   4. Waschen Sie das Pellet mit 200 μL 70 % Ethanol (RNase-frei); Zentrifugieren bei 4 °C, 20.000 x g für 5 Minuten; Entferne Supernatant.
   5. Trockne das Pellet bei 37 °C, bis das Ethanol vollständig verdunstet ist. Wieder suspendieren bei 20 μL ddH₂O; aliquot und bei -80 °C lagern.
   6. Messen Sie die gRNA-Konzentration mit einem NanoDrop-Spektrophotometer und stellen Sie die Konzentration für die Injektion auf 250 ng/μL ein. Stellen Sie die Reinheit der gRNA mit einem A260/A280-Verhältnis von etwa 2,0 sicher.
      HINWEIS: Wir betonen, dass Handschuhe während des gesamten Prozesses zum Schutz der RNase getragen werden müssen. Alle Verbrauchsmaterialien, einschließlich vorgekühlter RNase-freier Zentrifugenröhren und Pipettenspitzen, müssen während des Verfahrens regelmäßig verwendet werden. Während der Operation entstehende organische Reagenzienabfälle müssen getrennt in ausgewiesenen Abfallbehältern nach Typ gesammelt und regelmäßig zu einer zertifizierten Entsorgungsanlage für gefährliche Abfälle zur ordnungsgemäßen Behandlung transportiert werden.

3. Herstellung von Cas9-mRNA

1. Vorbereitung der Transkriptionsvorlage
   HINWEIS: Verwenden Sie RNase-freie Spitzen und Tuben während der RNA-bezogenen Schritte.
   1. Das Cas9-Expressionsplasmid MLM3613 (siehe Materialtabelle) auf Eis auftauen. In einem RNase-freien Röhrchen werden 20 μg Plasmid-DNA, 7,5 μL 10x Restriktionspuffer, 1 μL PmeI (10.000 U/mL) und nukleasefreier ddH₂O bis 75 μL kombiniert.
   2. Inkubiere bei 37 °C für 30 Minuten. Überprüfen Sie die vollständige Linearisierung, indem Sie 5 μL auf ein 1%-Agarose-Gel bei 120 V für 30 Minuten legen.
2. Reinigung von Transkriptionsvorlagen
   1. Fügen Sie 23 μL 2 % Natriumdodecylsulfat (SDS, siehe Materialtabelle für Details) und 0,5 μL Proteinase K (siehe Materialtabelle für Details) zu 70 μL des Digests hinzu; Inkubieren Sie bei 50 °C für 30 Minuten.
   2. Fügen Sie 45 μL Chloroform und 45 μL tris-gesättigtes Phenol hinzu; kurzzeitig Vortex; Zentrifuge 13.800 x g, 5 Min.
   3. Übertragen Sie 90 μL wässrige Phase auf ein neues Rohr. Fügen Sie 10 μL Natriumacetat (bereitgestellt vom Kit) und 200 μL vorgekühltes wasserfreies Ethanol hinzu; Mix; Inkubieren −20 °C, 30 Min.
   4. Zentrifuge 20.000 x g, 4 °C, 15 min; Supernatant wegwerfen. Waschen Sie das Pellet zweimal mit 100 μL 70 % Ethanol; Zentrifuge 20.000 x g, jeweils 2 Minuten; Lufttrocknen.
   5. Lösen Sie DNA in 20 μL nukleasefreiem ddH₂O; Bestätigen Sie >500 ng/μL.
3. In-vitro-Transkription mit Co-Capping
   1. Richten Sie die Reaktion mit einem T7-In-vitro-Transkriptionskit mit Kappe (siehe Materialtabelle) gemäß den Anweisungen des Herstellers ein.
   2. Inkubieren Sie bei 37 °C für 2 Stunden, um gekappte Cas9-mRNA zu erzeugen.
   3. Nach Abschluss der Transkriptionsreaktion wird 1 μL DNase (im Kit bereitgestellt, Konzentration 2 U/μL) hinzugefügt, gründlich vermischt und 15 Minuten bei 37°C inkubiert, um die DNA-Vorlage abzubauen.
4. Fügen Sie einen Poly(A)-Schwanz hinzu
   1. Bringen Sie die RNA auf 14 μL ddH₂O.
   2. Fügen Sie 2 μL 10x E. coli Poly(A) Polymerasepuffer, 2 μL ATP (10 mM), 1 μL RNase-Inhibitor und 1 μL Poly(A)-Polymerase hinzu.
   3. Inkubiere bei 37 °C für 45 Minuten.
5. Reinigen Sie die mRNA
   1. Wenden Sie die Reaktion auf ein Spin-Säulen-Gesamt-RNA-Kit an (siehe Materialtabelle). Die Probe wird auf eine 2-mL-Siliziummembran-Spinsäule geladen; Zentrifuge 8.000 x g, 15 s; Verwerfen Sie Durchfluss.
   2. Fügen Sie 500 μL RPE-Puffer in die RNeasy-Säule ein, zentrifugieren Sie bei 8000 x g für 15 Sekunden und entsorgen Sie die Restflüssigkeit. Wiederhole diesen Schritt einmal, zentrifugiere dann 2 Minuten und entsorge die Restflüssigkeit.
   3. Setze die RNeasy-Säule in ein neues 1,5-mL-Zentrifugenrohr. Fügen Sie 30 μL RNase-freien ddH₂O hinzu und zentrifugieren Sie bei 8000 x g für 1 Minute, um die RNA zu elutieren. Stellen Sie die mRNA-Konzentration für die Injektion auf 500 ng/μL an. Lagern Sie die elutierte RNA bei -80 °C.

4. Mikroinjektion von Drosophila-Embryonen

1. Vorbereitung von Injektionsproben
   1. Mischen Sie 15 μg Cas9-mRNA mit 7,5 μg doppelsträngiger gRNA bei einem Volumenverhältnis von 2:1.
   2. Auf 30 μL mit DEPC-behandeltem RNase-freiem Wasser einstellen; Bleib auf Eis.
2. Drosophila-Aufzucht
   1. Übertragen Sie den injizierten Drosophila-Stämm w¹¹¹⁸ auf große Speiseröhren zur Verstärkung. W¹¹¹⁸ Fliegen wurden als Referenzkontrolle verwendet, um den physiologischen Ausgangszustand ohne Balancer-assoziierte Effekte darzustellen.
   2. Halten Sie die Fliegen in einer künstlichen Klimakammer mit 25 °C, einer Luftfeuchtigkeit von 60–70 % und einem Hell-Dunkel-Zyklus von 12:12 für 14 Tage.
   3. Um 17:00 Uhr am Tag nach der 14-tägigen Aufzuchtphase (Tag 15) sammeln Sie erwachsene Fliegen, um die zeitlich begrenzte Embryonenablage zu synchronisieren. Diese genaue Entnahmezeit stellt sicher, dass die für die Injektion verwendeten Embryonen sich in einem konstanten Entwicklungsstadium befinden. Die Kontrolle der Tageszeit ist wichtig, um die Auswirkungen des zirkadianen Rhythmus auf die Embryonalentwicklung und das Fortpflanzungsverhalten zu minimieren und so die experimentelle Reproduzierbarkeit zu gewährleisten und die physiologische Variabilität zwischen den Chargen zu verringern.
3. Mikroinjektion von Drosophila
   1. Sammeln Sie erwachsene Fliegen zur Injektion in Fliegenkäfige, mit etwa 400 erwachsenen Fliegen pro Käfig. Embryonen auf hefebeschichteten Agarplatten sammeln; Sammeln Sie Embryonen innerhalb von 60 Minuten nach der Eiablage und spülen Sie sie auf Deckzettel. Vor der Injektion wurde keine Dechorionation durchgeführt.
   2. Richten Sie die Embryonen auf Deckblättern so aus, dass ihre hinteren Pole nach außen zeigen, geordnet von oben nach unten. Stellen Sie sicher, dass die Injektionsnadel den hinteren Pol bis zu einer angemessenen Tiefe (etwa ein Fünftel der Embryolänge) durchdringt, um eine gleichmäßige zytoplasmatische Verabreichung zu gewährleisten. Insgesamt wurden 300 Embryonen in dieser Studie verwendet.
   3. Unter einem Stereomikroskop fokussieren Sie Nadelspitze und Embryo in derselben Ebene.
   4. Mit dem Injektionsinstrument wird der hintere Pol durchbohrt und 0,001 μL der Mischung in jeden Embryo eingespritzt.
   5. Injizierte Embryonen in Lebensmittelphiolen übertragen; Inkubieren bei 25 °C, ~70 % relativer Luftfeuchtigkeit (RH), um die P₀-Erzeugung (die injizierten erwachsenen Tiere, die überleben, um Nachkommen zu zeugen) zu erhalten.

5. Konstruktion stabiler Expressionsstämme in Drosophila

1. Kreuz umschlossen P₀ mit Bc/CyO-Fliegen .
   1. Mikroinjizieren Sie eine Mischung aus gRNA, die auf das relevante Gen und das Cas9-Protein abzielt, in 300 Embryonen des W1118-Drosophila-Stamms . Nach der Injektion werden insgesamt 30 lebensfähige und fruchtbare P0-Erwachsene erhalten. Kreuzen Sie jedes erwachsene P0-Tier (Mosaik) einzeln mit Fliegen aus dem W1118-Stamm , was 16 Einzelpaar-Kreuzungen ergibt (8 Phiolen mit P0-Männchen mit jungfräulichen Weibchen und 8 Phiolen mit P0-Weibchen mit Männchen gekreuzt). Halten Sie alle Kreuzungen bei 25 °C unter konstanten Kulturbedingungen.
   2. Nach dem Auftreten der F1-Larven werden die P0-Elternfliegen entfernt. Genomische DNA aus den F1-Nachkommen extrahieren und sie einer PCR-Analyse unterziehen, um die F1-Genotypen (Ent2/+) zu bestimmen.
   3. F2-Nachkommen durch einzelne Kreuzungen zwischen Bc/CyO-Fliegen generieren. Wählen Sie einzelne erwachsene F2-Tiere aus und genotypisieren sie, um Fliegen mit dem Ent2/CyO-Genotyp zu identifizieren.
   4. Intercross F3 fliegt (Ent2/CyO), um das Vorhandensein homozygoter Mutanten zu beurteilen. Wenn keine homozygoten Fliegen gefunden werden, kreuzen Ent2/CyO-Fliegen für eine weitere Generation, um weiter festzustellen, ob der homozygote Genotyp tödlich ist.
2. Genomische DNA-Extraktion von Drosophila
   1. Sammeln Sie ein oder zwei erwachsene Fliegen in ein 1,5-mL EP-Rohr und fügen Sie 110 μL Plant DNA Extraction Buffer PA hinzu.
   2. Homogenisiere die Proben gründlich mit einem Gewebeschleifer für mindestens 3 Minuten.
   3. Inkubieren Sie die Homogenate in einem 65 °C Metallbad für mindestens 30 Minuten.
   4. Gib 100 μL Chloroform hinzu, drehe die Mischung vorsichtig um, um zu mischen, und wirbel für 10 Sekunden vor. Zentrifugieren Sie die Proben bei 14.000 U/min für 10 Minuten bei Raumtemperatur.
   5. Geben Sie vorsichtig etwa 65 μL (oder mehr) des Supernatanten in ein neues Rohr, fügen Sie zwei Bände vorgekühltes absolutes Ethanol hinzu (mindestens 10 Minuten bei 4 °C vorinkubiert), wenden Sie es vorsichtig um, um zu mischen, und inkubieren Sie bei -20 °C für mindestens 15 Minuten.
   6. Zentrifugieren Sie Proben bei 14.000 U/min für 10 Minuten bei 4 °C und entsorgen Sie den Überstandsstoff sorgfältig.
   7. Lassen Sie das DNA-Pellet bei Zimmertemperatur oder in einem Inkubator an der Luft trocknen, bis es vollständig trocken ist, und lassen Sie es dann in einem geeigneten Volumen PB-Puffer wieder suspendieren. Für weibliche (f)-Proben fügen Sie 50 μL PB-Puffer hinzu, während bei männlichen (m)-Proben 15 μL hinzugefügt werden.
3. PCR-Verstärkung und Sanger-Sequenzierung
   1. Führen Sie eine PCR-Amplifikation mit spezifischen Primern durch, die darauf ausgelegt sind, die upstream- und downstream-Regionen des gRNA-Zielortes zu flankieren.
   2. Reinigen Sie die PCR-Produkte und unterziehen Sie sie einer Sanger-Sequenzierung. Analysieren Sie die sequenzierenden Chromatogramme mit der SnapGene-Software³⁴ und richten Sie sich für die vergleichende Analyse an die Wildtyp-Referenzsequenz aus.
   3. Untersuchen Sie die Peak-Plots in der Nähe der gRNA-Zielstelle auf überlappende Peaks, die auf Indel-Mutationen hinweisen. Führen Sie Peak-Splitting durch, um gemischte Signale aufzulösen und den Mutationstyp zu bestätigen, einschließlich Einfügungen oder Löschungen an der Zielstelle.
   4. Rückkreuzung zu BC/CyO-Männchen für 4 Generationen, um Ent2/CyO zu etablieren.
      Hinweis: Es wurde beobachtet, dass Ent2*/Ent2* und CyO/CyO in frühen Entwicklungsstadien tödlich sind; daher bleiben Ent2*/CyO-Heterozygoten erhalten.
4. Nach der Etablierung der Ent2*/CyO-Heterozygoten entnehmen Sie Proben aus derselben Charge von Ent2*/CyO-Heterozygoten unter einem Stereomikroskop.
5. Wählen Sie zufällig 20 erwachsene Fliegen aus und wiegen Sie sie mit einer Präzisionsbalance mit einer Auflösung von 0,001 g. Fotografieren Sie die Proben, um die phänotypischen Merkmale zu dokumentieren.

6. Beschreibende phänotypische Charakterisierung

1. Hintere 120 Männchen und 120 Weibchen (getestet wurden jeweils drei Phiolen pro Gruppe, wobei jede Phiole 20 Fliegen enthielt) jeweils Ent2*/CyO und w¹¹¹⁸ bei 22 °C und 25 °C.
2. Erfassen Sie wöchentlich die Anzahl der Todesfälle und zeichnen Sie die Überlebenskurven auf.
3. Setzen Sie pro Gruppe 30 zufällige Paarungspaare ein; 24 Stunden Paarung zulassen;
4. Erwachsene Tiere werden in frische Röhren übertragen; Rear Offs.
5. 7 Tage nach der Eclosion wird der Klettererfolg (≥8 cm innerhalb von 30 Sekunden) mit sechs Replikaten pro Gruppe bewertet.
6. Alle Beobachtungen wurden als beschreibende Eigenschaften der mutierten Linie aufgezeichnet und nicht zur Bestimmung der Genfunktion verwendet.

7. Messung der Aktivitäten von Antioxidantien-Enzymen

1. Sammeln Sie 300 männliche und 300 weibliche erwachsene Fläschen (pro Gruppe wurden drei Fläschchen getestet, wobei jede Phiole 100 Fliegen enthält) Ent2*/CyO und w¹¹¹⁸ Kontrollfliegen, die 5 Tage nach der Erschließung sind, um die physiologische Reife und ein vergleichbares Alter sicherzustellen.
2. Fliegen werden in leere Röhren ohne Nahrung übertragen und 2 Stunden verhungert, um den Stoffwechselzustand vor biochemischen Tests zu standardisieren.
3. Fügen Sie eine Stahlperle/Rohr hinzu; Homogenisieren bei 60 Hz, 2 Minuten.
4. Zentrifuge 4 °C, 161 x g, 10 min; Sammle das Supernatant.
5. Missen Sie die gesamte Superoxiddismutase (SOD, siehe Materialtabelle für Details) und Katalase (CAT, siehe Materialtabelle für Details) gemäß den Anweisungen des Kits.

8. Datenstatistik und -analyse

1. Drücken Sie alle Daten als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (± SEM) aus.
2. Verwenden Sie Einweg-ANOVA, um Enzymaktivitätsdaten zu vergleichen; Anwendung der Dreifach-ANOVA (Faktoren: Genotyp, Temperatur, Geschlecht) auf Körpergewicht, Kletterfähigkeit und Körperlänge. Führen Sie den Tukey-HSD-Post-hoc-Test durch, wenn es angebracht^{ist 35}.
3. Definiere die Signifikanz als P < 0,05 für alle statistischen Tests.
4. Analysieren Sie Lebenserwartungsdaten mit Überlebenskurven und führen Sie den Log-Rank-Test (Mantel-Cox) durch, der bewertet, ob signifikante Unterschiede in den Überlebenstrajektorien zwischen experimentellen Kohorten³⁶ bestehen.
5. Führen Sie alle Analysen und Darstellungen in der GraphPad Prism 9.5.0 Software gemäß den Softwarerichtlinien³⁷ durch.
6. Alle statistischen Analysen wurden ausschließlich zum deskriptiven Vergleich durchgeführt und nicht zur Feststellung kausaler Zusammenhänge.

Ergebnisse

Design- und Wirksamkeitsverifikationsanalyse der Ent2-Genzielstellen
Kandidatenzielstellen für das Ent2-Gen wurden mit CHOPCHOP- und CCTop-Plattformen entworfen (Abbildung 1). Zwei gRNAs, die auf Exon-2- und Exon-5-Regionen abzielen, wurden anhand von Spezifitäts- und Effizienzkriterien ausgewählt. Um eine erfolgreiche Genomeditierung zu überprüfen, wurde genomische DNA von zufällig ausgewählten Personen der etablierten Ent2*/CyO-Linie amplifiziert und einer Sanger-Sequenzierung unterzogen. Sequenzierungschromatogramme zeigten überlappende Spitzen, die in der Nähe der Zielstelle begannen, was mit Insertion/Deletion (Indel-)Mutationen übereinstimmt. Weitere Sequenzanalysen zeigten Frameshift-Mutationen, die zu vorzeitigen Stop-Codons führen (Abbildung 2). Diese Ergebnisse bestätigen, dass das CRISPR/Cas9-System erfolgreich Mutationen am Ziel-Ent2-Locus eingeführt hat, und demonstrieren die Machbarkeit des Genom-Editierungs-Workflows.

Abbildung 1. Das schematische Diagramm der Knockout-Stelle des Ent2-Gens und des Standorts des Detektionsprimers im Genom. Dieses Schema zeigt die genomische Struktur des Ent2-Lokus und hebt CDS (grün), Start- und Stoppcodons (rot), das gRNA-PAM-Motiv (grau), die gRNA-Zielsequenz (blau) und die gRNA-Amplifikationsprimersequenz (gelb) hervor. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 2. Das Spitzendiagramm der Sequenzierungsergebnisse von Drosophila-Nachkommen stabiler Linien selbstinzuchtierter Ent2*/CyO. Sequenzierungschromatogramm bestätigt den Genotyp der Nachkommen, die durch das Selbstkreuzen der stabilen Ent2*/CyO-heterozygoten Linie gewonnen wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Beschreibende morphologische Beobachtungen der Ent2/CyO-Linie
Wir beobachteten Unterschiede in der Körperform zwischen den beiden Genotypen von Fruchtfliegen über das Geschlecht hinweg unter 22 °C und 25 °C Bedingungen mit einem Stereomikroskop (Abbildung 3). Unter beiden Temperaturbedingungen zeigten sowohl männliche als auch weibliche Fruchtfliegen eine typische "lange Spindel"-Körperform. Weibliche Hinterleibchen waren breit und spindelförmig, mit Flügelspitzen, die leicht über die Bauchspitze hinausragten. Die Verbindung zwischen Thorax und Abdomen bei Männchen war klar definiert, und die verdunkelte Pigmentierung am Ende des Abdomens – ein charakteristisches Merkmal der Männchen – war sichtbar. Die Flügel der ^{W-1118-Fliegen} beider Geschlechter waren durchsichtig mit klar definierten Adern, und es wurde keine Flügelkantenkrümmung oder Adernbruch beobachtet. Im Gegensatz dazu zeigten Ent2*/CyO-Heterozygoten eine auffällige Verbiegung der Flügelbasis und eine Flügelkantenkrümmung. Bei 22 °C, unabhängig vom Geschlecht, war die Körperlänge der Fruchtfliegen bei 25 °C deutlich größer als die desselben Genotyps. Außerdem war die Körperlänge der Frauen bei derselben Temperatur deutlich größer als die der Männer. Außerdem war bei sowohl 22 °C als auch bei 25 °C die Körpergröße der Ent2*/CyO-Heterozygoten kleiner als die der entsprechenden w¹¹¹⁸ Fliegen. Um die morphologische Grundlage zu untersuchen, maßen wir gleichzeitig die Körperlänge der Fliegen (Abbildung 3E, Tabelle 1). Eine dreifache ANOVA zeigte signifikante Haupteffekte wie Genotyp (F(1,16)=230,1, P<0,0001), Temperatur (F(1,16)=19,50, P=0,0004) und Geschlecht (F(1,16)=166,9, P<0,0001). Eine signifikante Geschlechtsinteraktion zwischen Genotyp x (F(1,16)=14,96, P=0,0014) und eine signifikante Dreifachinteraktion zwischen Genotyp x Temperatur x Geschlecht (F(1,16)=6,231, P=0,0239) wurden ebenfalls beobachtet.

Abbildung 3. Die Kontrollmorphologie von W¹¹¹⁸ und Ent2*/CyO-adulten . Repräsentative Bilder, die die Haltungsmerkmale von weiblicher (A, C) und männlicher (B, D) Drosophila bei 22 °C und 25 °C zeigen, zusammen mit einem quantitativen Vergleich der Körperlänge (E). ** P < 0,01. Maßstabsleiste: 1 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Überlebensanalyse unter unterschiedlichen Temperaturbedingungen
Wir analysierten statistisch die Überlebenskurven von Ent2*/CyO-Heterozygoten und w¹¹¹⁸ Fliegen bei 22 °C und 25 °C (Abbildung 4). Die Ergebnisse zeigten, dass die Überlebenskurve der Ent2*/CyO-heterozygoten Weibchen die höchste war, mit zwei noch lebenden Personen in der 14. Woche. Alle ¹¹¹⁸ Frauen starben bis zur 14. Woche. Alle Ent2*/CyO-heterozygoten Männer starben bis zur 12. Woche, während alle ^{mit 1118} Männchen bis zur 11. Woche starben. Diese Ergebnisse zeigen, dass bei 22 °C die Gesamtlebenserwartung der Weibchen länger ist als die der Männchen, und innerhalb desselben Geschlechts ist die Überlebensfähigkeit der Ent2*/CyO-Heterozygoten etwas stärker als die des ^W-1118-Typs.

Unter 25 °C Bedingungen wurde die gesamte Überlebensdauer deutlich verkürzt. Die Überlebenskurven von ^{mit 1118} Weibchen und Ent2*/CyO-heterozygoten Männern sanken bis zur 10. Woche auf null. Die Überlebenskurven der Ent2*/CyO heterozygoten Weibchen und der W¹¹¹⁸ Männchen sanken bis zur 8. Woche auf 1–2 Individuen und erreichten bis zur 9. Woche null. Der Unterschied zwischen dem Mutanten und W¹¹¹⁸ war statistisch nicht signifikant (P > 0,05). Diese Beobachtungen beschreiben die Überlebensmerkmale der mutierten Linie unter unterschiedlichen Umweltbedingungen.

Abbildung 4. Überlebenskurven von Drosophila unter unterschiedlichen Temperaturbedingungen. Überlebensanalyse vergleicht die Lebensdauer von Ent2*/CyO und w¹¹¹⁸ Fliegen bei 22 °C und 25 °C. n=3. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Bewertung der Lokomotorischen Aktivität
Die Kletterfähigkeiten der ^W-1118- und Ent2*/CyO-Fruchtfliegen wurden unter zwei Temperaturbedingungen verglichen: 22 °C und 25 °C (Abbildung 5, Tabelle 2). Die Ergebnisse zeigen, dass bei 22 °C (Abbildung 5A) 98,15 % der ¹¹¹⁸ Frauen innerhalb von 30 Sekunden mehr als 8 cm kletterten, während dieser Anteil bei Ent2*/CyO-heterozygoten Frauen auf 89,74 % sank (P < 0,05). Alle ^{mit 1118} Männchen konnten mehr als 8 cm klettern, während die Klettererfolgsrate bei Ent2*/CyO-Männchen 98,14 % betrug (P < 0,05). Bei 25 °C (Abbildung 5B) stiegen alle ¹¹¹⁸ Frauen (100 %) innerhalb von 30 Sekunden um mehr als 8 cm, aber dieser Anteil sank bei Ent2*/CyO heterozygoten Frauen auf 91,31 % (P < 0,05). Unter ^{den W 1118} Männern erreichten 77,28 % erfolgreich mehr als 8 cm (P < 0,01), während nur 63,57 % der Ent2*/CyO-heterozygoten Männer dies erreichten (P < 0,01). Um die Lokomotorleistung weiter zu bewerten, wurde der Anteil der Fliegen analysiert, die über 15 cm steigen (Abbildung 5C). Eine Dreifach-ANOVA zeigte hochsignifikante Haupteffekte von Geschlecht (F(1,16) = 201,7, P < 0,0001) und Aufzuchttemperatur (F(1,16) = 72,60, P < 0,0001) auf die Kletterleistung. Der Haupteffekt des Genotyps war jedoch nicht signifikant (F(1,16) = 0,59, P = 0,4545). Diese Ergebnisse zeigen, dass die Bewegungsleistung je nach experimentellen Bedingungen variiert und sich kontextabhängig zwischen den Gruppen unterscheiden kann.

Abbildung 5. Vergleich der Kletterfähigkeit von Drosophila bei unterschiedlichen Temperaturen. Quantifizierung der Kletterleistungen bei 22 °C (A) und 25 °C (B) sowie Statistiken für Personen mit einer Kletterstrecke > 15 cm (C). ** P < 0,01. n=3. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Körpergewichtsmessung
Das Körpergewicht wurde bei W¹¹¹⁸ und Ent2*/CyO heterozygoten Fruchtfliegen bei 22 °C und 25 °C gemessen (Abbildung 6). Unsere Ergebnisse zeigen, dass im Vergleich zu W¹¹¹⁸ Fliegen das Gewicht der Ent2*/CyO-Heterozygoten sowohl bei 22 °C als auch bei 25 °C signifikant reduziert wurde (P < 0,05 oder P < 0,01). Wir beobachteten, dass das Gewicht der männlichen ^W1118 Fliegen signifikant niedriger war als das der weiblichen ^{W1118-Fliegen} (P < 0,01). Ebenso war das Gewicht männlicher Ent2*/CyO-Heterozygoten signifikant niedriger als das weiblicher Ent2*/CyO-Heterozygoten (P < 0,01). Wir führten eine Dreifach-ANOVA durch, um die unabhängigen und interaktiven Effekte von Genotyp, Aufreistemperatur und Geschlecht auf das Körpergewicht bei Drosophila zu bewerten. Die Analyse zeigte signifikante Haupteffekte wie Genotyp (F(1,16) = 32,38, P < 0,0001), Temperatur (F(1,16) = 23,31, P = 0,0002) und Geschlecht (F(1,16) = 25,52, P = 0,0001) (Abbildung 6; Tabelle 3). Zusätzlich gab es eine signifikante zweiseitige Wechselwirkung zwischen Temperatur und Geschlecht (F(1,16) = 24,76, P = 0,0001), was darauf hindeutet, dass der Einfluss der Temperatur auf das Körpergewicht je nach Geschlecht variierte. Es wurden jedoch keine signifikanten Wechselwirkungen zwischen Genotyp und Temperatur (F(1,16) = 0,40, P = 0,538), Genotyp und Geschlecht (F(1,16) = 1,31, P = 0,269) oder der Dreifach-Wechselwirkung (Genotyp x Temperatur x Geschlecht: F(1,16) = 0,48, P = 0,497) gefunden), was darauf hindeutet, dass die Reaktion der Ent2*/CyO-Mutanten auf Temperatur und Geschlecht der des Wildtyps ähnelte.

Angesichts der erheblichen Temperatur × Geschlechtsinteraktion führten wir eine einfache Effektanalyse durch, um das spezifische Muster zu klären. Die Ergebnisse zeigten, dass bei weiblichen Fliegen die bei 22 °C aufgezogenen Personen ein signifikant höheres Körpergewicht hatten als bei 25 °C aufgezogenen Fliegen (P = 0,0012); bei Männern gab es jedoch keinen signifikanten Unterschied im Körpergewicht zwischen den beiden Temperaturen (P > 0,9999). Dies zeigt, dass die Senkung der Temperatur von 25–22 °C das Körpergewicht der weiblichen Fliegen gezielt erhöhte, ohne signifikante Auswirkungen auf die Männchen zu haben.

Obwohl es keine signifikanten Wechselwirkungen zwischen Genotyp und anderen Faktoren gab, zeigte der starke Haupteffekt des Genotyps, dass die Ent2*/CyO-Mutanten im Allgemeinen ein geringeres Körpergewicht unter allen Bedingungen als der Wildtyp hatten. Post-hoc-Vergleiche zeigten außerdem, dass bei 22 °C Wildtyp-Weibchen (mit¹¹¹⁸:22 °C Weibchen) signifikant ein höheres Körpergewicht als alle mutierten Gruppen hatten (P < 0,0001), und bei derselben Temperatur zeigten beide Genotypen einen signifikanten sexuellen Dimorphismus (Weibchen > Männchen, P < 0,01). Bei 25 °C zeigte der Unterschied in dem Körpergewicht zwischen Wildtyp und Mutanten einen ähnlichen Trend, erreichte jedoch keine statistische Signifikan. Diese Ergebnisse beschreiben die Körpergewichtsmerkmale der mutierten Linie unter unterschiedlichen Umwelt- und biologischen Bedingungen.

Abbildung 6. Der Vergleich des Körpergewichts bei Drosophila bei unterschiedlichen Temperaturen. Körpergewichtsmessungen bei 22 °C und 25 °C. ^ns P > 0,05, * P < 0,05, ** P < 0,01. n=3. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Antioxidative Enzymaktivität
Die antioxidative Enzymaktivitäten von w¹¹¹⁸ und Ent2*/CyO heterozygoter Drosophila wurden bei 25 °C verglichen (Abbildung 7). Unsere Ergebnisse zeigten, dass im Vergleich zu w¹¹¹⁸ Fliegen sowohl männliche als auch weibliche Ent2*/CyO-Heterozygoten signifikant reduzierte Katalase (CAT) und Superoxiddismutase- (SOD)-Aktivitäten aufwiesen (P < 0,01). Wir stellten außerdem fest, dass CAT- und SOD-Aktivitäten bei W¹¹¹⁸ männlichen Fliegen signifikant höher waren als bei W¹¹¹⁸ Weibchen (P < 0,05 oder P < 0,01). Ähnlich waren die antioxidative Enzymaktivitäten bei Ent2*/CyO-heterozygoten Männern signifikant höher als bei Ent2*/CyO-heterozygoten Frauen (P < 0,01).

Abbildung 7. Der Vergleich der antioxidativen Kapazität von Drosophila bei optimaler Fresstemperatur. Enzymatische Aktivitätstests zeigen die Aktivität von CAT (A) und SOD (B) bei Ent2/CyO-Fliegen im Vergleich zu^{w 1118} Fliegen. * P < 0,05, ** P < 0,01. n=3. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

	SS	DF	MS	F (DFn, DFd)	P-Wert
Genotyp	0.8026	1	0.8026	F (1, 16) = 230,1	P<0,0001
Temperatur	0.06803	1	0.06803	F (1, 16) = 19,50	P=0,0004
Geschlecht	0.5822	1	0.5822	F (1, 16) = 166,9	P<0,0001
Genotyp x Temperatur	0.005798	1	0.005798	F (1, 16) = 1,662	P=0,2156
Genotyp x Geschlecht	0.05218	1	0.05218	F (1, 16) = 14,96	P=0,0014
Temperatur x Geschlecht	0.01323	1	0.01323	F (1, 16) = 3,793	P=0,0692
Genotyp x Temperatur x Geschlecht	0.02173	1	0.02173	F (1, 16) = 6,231	P=0,0239
Residuen	0.05581	16	0.003488

Tabelle 1: Varianzanalyse von Körperlängenmessungen bei Drosophila.

ANOVA-Tabelle	SS	DF	MS	F (DFn, DFd)	P-Wert
Geschlecht	0.1483	1	0.1483	F (1, 16) = 201,7	P<0,0001
Genotyp	0.0004319	1	0.0004319	F (1, 16) = 0,5877	P=0,4545
Temperatur	0.05336	1	0.05336	F (1, 16) = 72,60	P<0,0001
Geschlecht x Genotyp	0.01418	1	0.01418	F (1, 16) = 19,30	P=0,0005
Geschlecht x Temperatur	0.007134	1	0.007134	F (1, 16) = 9,708	P=0,0067
Genotyp x Temperatur	0.0135	1	0.0135	F (1, 16) = 18,37	P=0,0006
Geschlecht x Genotyp x Temperatur	0.005903	1	0.005903	F (1, 16) = 8,032	P=0,0120
Residuen	0.01176	16	0.0007349

Tabelle 2: Varianzanalyse der Kletterfähigkeit (> 15 cm) bei Drosophila.

	SS	DF	MS	F (DFn, DFd)	P-Wert
Genotyp	4.363E-07	1	4.363E-07	F (1, 16) = 32,38	P<0,0001
Temperatur	3.141E-07	1	3.141E-07	F (1, 16) = 23,31	P=0,0002
Geschlecht	3.439E-07	1	3.439E-07	F (1, 16) = 25,52	P=0,0001
Genotyp x Temperatur	5.333E-09	1	5.333E-09	F (1, 16) = 0,3958	P=0,5381
Genotyp x Geschlecht	1.765E-08	1	1.765E-08	F (1, 16) = 1,310	P=0,2692
Temperatur x Geschlecht	3.336E-07	1	3.336E-07	F (1, 16) = 24,76	P=0,0001
Genotyp x Temperatur x Geschlecht	6.513E-09	1	6.513E-09	F (1, 16) = 0,4834	P=0,4968
Residuen	2.156E-07	16	1.347E-08

Tabelle 3: Varianzanalyse von Körpergewichtsmessungen bei Drosophila.

Diskussion

Ent ist ein evolutionär konserviertes Protein, das mehrere biologische Prozesse^{beeinflusst 38}. Wenn Ent2 in Xenopus laevis-Oozyten exprimiert wird, zeigt es eine Nukleosidtransportaktivität⁸. Studien haben gezeigt, dass der homozygot Mutant von Ent2 im späten Larven- oder frühen Puppenstadium¹⁰ tödlich ist. In der vorliegenden Studie wurde ein CRISPR/Cas9-basierter Genom-Editierungs-Workflow etabliert, um Ent2-gezielte Allele in Drosophila melanogaster zu erzeugen. Die beobachtete Lethalität homozygoter Mutanten während der Stammbildung stimmt mit diesen früheren Berichten überein und unterstützt die Validität der Genom-Editierungsstrategie. Innerhalb dieses Rahmens liefert die in dieser Studie erzeugte Ent2*/CyO-heterozygote Linie ein Modell zur Dokumentation phänotypischer Merkmale, die mit einem partiellen Ent2-Verlust einhergehen. Unter den getesteten experimentellen Bedingungen wurden Unterschiede in Körpergröße, Körpergewicht, Bewegungsaktivität und Antioxidantien-Enzym-Spiegeln zwischen Ent2**/CyO und W-1118-Fliegen beobachtet. Diese Beobachtungen beschreiben das phänotypische Profil der etablierten Mutantenlinie.

Hinsichtlich Entwicklung und Körpergröße waren Ent2*/CyO-heterozygote Individuen bei 22 °C und 25 °C signifikant kleiner als w¹¹¹⁸ Fliegen. Dieser Unterschied könnte auf eine verminderte Effizienz des Nukleosidtransports zurückzuführen sein, die durch das Fehlen des Ent2-Gens resultiert, was wiederum die Stabilität des Energiestoffwechsels und die Regulation von Ecdyson beeinflusst. Außerdem wurden die Nebenwirkungen bei 25 °C deutlicher. Forschungen haben gezeigt, dass die Lebenserwartung von Tieren durch die Stoffwechselrate beeinflusst wird, ein Konzept, das als Stoffwechseltheorie¹⁹ bekannt ist. Die Ergebnisse dieser Studie deuten darauf hin, dass die erhöhte Stoffwechselrate von Fruchtfliegen bei höheren Temperaturen eng mit den Nährstoffmängeln und Entwicklungsverzögerungen infolge eines gestörten Nukleosidstoffwechsels zusammenhängt. Angesichts der Verwendung eines einzigen CRISPR-abgeleiteten Allels sollten diese Ergebnisse jedoch eher als beschreibende Beobachtungen denn als direkte Belege für die Genfunktion interpretiert werden.

Temperaturabhängige Variationen waren auch über mehrere phänotypische Anzeigen hinweg erkennbar. Der Mutant zeigt eine bescheidene Lebensspannverlängerung bei 22 °C, insbesondere bei Weibchen, ein Befund, der mit früheren Studien^39,40 übereinstimmt. Im Gegensatz dazu nimmt bei 25 °C der Lebenszeitunterschied ab oder verschwindet sogar. Als poikilotherme Organismen zeigen Fruchtfliegen eine höhere Stoffwechselrate und folglich eine kürzere Lebensdauer bei erhöhten^{Temperaturen von 41,42 Grad}, was mit den Ergebnissen dieser Studie übereinstimmt. In diesem Zusammenhang könnten die beobachteten Muster allgemeine physiologische Reaktionen auf die Temperatur widerspiegeln.

Die Bewegungsleistung und die Aktivitäten der antioxidativen Enzyme variierten ebenfalls je nach Genotyp, Geschlecht und Temperaturbedingungen. Eine verminderte Kletterleistung sowie geringere SOD- und CAT-Aktivitäten wurden bei Ent2/CyO-Fliegen unter bestimmten Bedingungen beobachtet. Frühere Studien haben Nukleosidtransporter mit dem NAD⁺-Stoffwechsel, der mitochondrialen Funktion und der Regulation von oxidativem Stressⁱⁿ Verbindung ^gebracht. Obwohl diese Berichte einen möglichen biologischen Kontext bieten, beschränken sich die aktuellen Daten auf phänotypische Charakterisierung und stellen keine mechanistischen Verbindungen zwischen Ent2 und diesen Signalwegen her.

Unsere Ergebnisse zeigen außerdem, dass männliche Fruchtfliegen unter denselben Bedingungen in der Regel eine höhere antioxidative Enzymaktivität aufweisen als weibliche^{Fruchtfliegen 39,48}. Das bedeutet, dass geschlechtsbezogene Faktoren die antioxidative Antwort über verschiedene Signalwege regulieren können. Transkriptionsfaktoren, die mit Antioxidant-Antworten zusammenhängen, wie Nrf2/CncC und deren nachgelagerte Zielgene, zeigen Expressionsunterschiede zwischen verschiedenen Geschlechtern und beeinflussen dadurch die gesamte antioxidative Kapazität⁴⁹. Diese Beobachtung stimmt mit Berichten über Geschlechtsunterschiede in der oxidativen Stressresistenz und der Antioxidativabwehr bei Drosophila überein, wobei Frauen typischerweise niedrigere ROS-Werte und höhere normale antioxidative Enzymaktivitäten im Vergleich zu Männern aufweisen, was zu Unterschieden in der Stressresistenz und Langlebigkeit zwischen den Geschlechtern^beitragen kann. Diese Beobachtungen unterstreichen zudem die Bedeutung, biologische Variablen wie das Geschlecht bei der Charakterisierung mutanter Phänotypen zu berücksichtigen.

Aus methodischer Sicht skizziert diese Studie einen reproduzierbaren Arbeitsablauf zur Erzeugung und Validierung von CRISPR/Cas9-vermittelten Mutationen in Drosophila. Ein präzises Design und die Auswahl der gRNA sind unerlässlich, da wirksame gRNAs die Effizienz der gezielten Spaltung durch Cas9 bestimmen und unbeabsichtigte Veränderungen^minimieren. Eine hochpräzise Mikroinjektion von Cas9- und gRNA-Komponenten in Embryonen ist ebenfalls entscheidend, da ineffiziente Injektionen zu niedrigen Bearbeitungsraten oder Mosaizismus⁵² führen können. Eine gründliche Genotypbestätigung durch Sequenzierung stellt sicher, dass beabsichtigte Bearbeitungen vorhanden sind und schließen Off-Target- oder unvollständige Bearbeitungen aus, wodurch die Modellintegrität⁵³ gestärkt wird. Bemerkenswert ist, dass die Verwendung des CyO-Balancerchromosoms unerlässlich war, um das Ent2-Mutantenallel aufrechtzuerhalten, da homozygot Mutanten tödlich sind. Dieser Ansatz wird in der Drosophila-Genetik weit verbreitet eingesetzt, um schädliche Mutationen zu erhalten und nachgelagerte Analysen zu ermöglichen. Die vorliegende Studie zeigt die praktische Anwendung dieser Strategie innerhalb eines CRISPR/Cas9-Bearbeitungsrahmens.

Mehrere Einschränkungen sollten anerkannt werden. Zunächst wurden phänotypische Analysen mit einer einzigen CRISPR-abgeleiteten mutierten Linie durchgeführt. Es ist allgemein bekannt, dass die CRISPR/Cas9-Editierung heterogene Allele erzeugen kann, und die Analyse mehrerer unabhängiger Linien wird allgemein empfohlen, um genetische Schlussfolgerungen zu stärken. Daher sollten die hier berichteten Ergebnisse als vorläufige Charakterisierung eines mutierten Allels interpretiert werden. Zukünftige Studien mit zusätzlichen unabhängig erzeugten Ent2-Allelen werden notwendig sein, um die Robustheit der Schlussfolgerungen zu verbessern. Zweitens wurde die mutierte Linie mit dem CyO-Balancerchromosom aufrechterhalten, während die Kontrollgruppe (w¹¹¹⁸) kein Balancerchromosom trägt. Da Balancerchromosomen selbst Entwicklungs- und physiologische Merkmale beeinflussen können, stellt das Fehlen einer balancer-angepassten Kontrolle eine potenzielle Quelle von Verwirrungen dar. Diese Einschränkung sollte bei der Interpretation phänotypischer Unterschiede zwischen Genotypen berücksichtigt werden. Drittens wurden Umweltbedingungen wie Luftfeuchtigkeit, Lichtzyklus und Ernährung unter Standardlaborbedingungen aufrechterhalten, aber nicht systematisch verändert. Da diese Faktoren den Stoffwechsel und die Stressreaktionen beeinflussen können, würden zukünftige Studien mit kontrollierten Umweltgradienten eine umfassendere Bewertung der Phänotyp-Umwelt-Interaktionen ermöglichen.

Zusammenfassend etabliert diese Studie einen CRISPR/Cas9-basierten Workflow zur Erzeugung und Pflege von Ent2-mutierten Allelen in Drosophila melanogaster und liefert eine beschreibende Charakterisierung der resultierenden heterozygoten Linie unter unterschiedlichen Umweltbedingungen. Die Ergebnisse unterstreichen die Anwendbarkeit dieses Ansatzes zur Untersuchung von Genen mit tödlichen Phänotypen und unterstreichen die Bedeutung experimenteller Designaspekte, einschließlich genetischer Hintergründe, ausgleichender Chromosomen und Umweltvariablen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Ammonium acetat	Sigma	A1542
Catalase (CAT) Assay Kit (sichtbare Lichtmethode) (Ammoniummolybdat-Methode)	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	A007-1-1
Dodecylsulfat	Sigma	L3771
Injektionsvorrichtung	Eppendorf FemtoJet	4i
Linearisiertes Plasmid: MLM3613	Addgene	42251
Mikroskop	OLYMPUS	CKX3-SLP
mMESSAGE mMACHINE T7 kit	Thermo Fisher	AM1344
mMESSAGE mMACHINE T7 Transkriptions-Kit	Thermo Fisher	AM1344
PmeI Restriktionsenzym	NEB	R0560S
Poly(A)-Polymerase	NEB	M0276S
Protease K	Thermo Fisher	EO0491
RNeasy Mini Kit	QIAGEN	74104
T7 RiboMAX Express Large Scale RNA Production System	Promega	P1320
T7 RiboMAX Kit	Promega	P1320
Totales Superoxid-Dismutase (T-SOD) Assay Kit (Hydroxylamin-Methode)	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	A001-1
w1118 Drosophila	Fangjing Biology
Wassergesättigtes Phenol/Chloroform	Sigma	P2069