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Methodenartikel

Etablierung von Tumororganoiden, karzinomassoziierten Fibroblasten und entsprechenden Fibroblasten aus demselben Speiseröhrenkrebspatienten

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DOI:

10.3791/69548

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3. April 2026

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1Department of Esophageal and Gastroenterological Surgery, Graduate School of Medicine, Juntendo University, 2Department of Molecular Pathogenesis, Graduate School of Medicine, Juntendo University, 3Department of Pathology and Oncology, Graduate School of Medicine, Juntendo University, 4Faculty of Health Sciences, Graduate School of Medicine, Juntendo University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, um gleichzeitig Krebsorganoide, karzinomassoziierte Fibroblasten (CAFs) und nicht-tumorassoziierte Fibroblasten (CFs) vom selben Patienten mit Speiseröhrenplattenepepit (ESCC) zu isolieren. Der Einsatz dieser patientenabgestimmten Materialien könnte Probleme durch interpatientische Variabilität vermeiden und eine geeignete experimentelle Grundlage für die ESCC-Forschung bieten.

Zusammenfassung

Beim Speiseröhren-Plattenepithelkarzinom (ESCC) bleiben die Erwerbung von Behandlungsresistenz und das Tumorrezidiv große klinische Herausforderungen. Karzinom-assoziierte Fibroblasten (CAFs), Schlüsselkomponenten der Tumor-Mikroumgebung, sind dafür bekannt, die Progression von ESCC und die therapeutische Reaktion zu beeinflussen. Viele Aspekte der Rolle von CFs bei der Tumormalignität sind jedoch weiterhin unbekannt, vermutlich aufgrund der interpatientischen Variabilität bei ESCC-Patienten. Verschiedene humane ESCC-Zelllinien, die für die Forschung verfügbar sind, sollen teilweise die Natur des menschlichen Karzinoms nachahmen. Sie werden außerdem jahrelang und jahrzehntelang in vitro in einer Petrischale vermehrt, was zur Anpassung an die Kulturbedingungen führt. Darüber hinaus weisen humane ESCC-Zelllinien verschiedene genetische und epigenetische Veränderungen auf, die bei den ursprünglichen Patienten unterschiedlich sind, was zu einer interpatientischen Variabilität führt. Dennoch wurden in den meisten früheren Studien langfristig kultivierte Krebszelllinien für Experimente mit Patienten-Mismatched CAF verwendet. Die interpatientische Variabilität innerhalb jeder Krebszelllinie sowie zwischen Krebszellen und CAFs könnte daher zu einer verminderten Reproduzierbarkeit und Zuverlässigkeit der Ergebnisse führen. Um die interpatientische Variabilität zu eliminieren, wurden drei verschiedene Zelltypen vom selben Patienten isoliert: Krebsorganoide und CAFs aus einer chirurgisch dissektionierten ESCC-Region sowie entsprechende Fibroblasten (CFs) aus einer angrenzenden nicht-tumorösen Region als patientenspezifische Kontrollgruppen für CAFs. Ein detailliertes Protokoll wird vorgestellt, das die gleichzeitige Isolierung von Krebsorganoiden, KAF und CFs ermöglicht. Die Krebsorganoide wuchsen unter dreidimensionalen Bedingungen gut. CAFs und CFs wurden positiv auf Vimentin, einen der Fibroblast-Marker, gefärbt, was die Anreicherung dieser Zellen in fibroblastischen Linien unterstützt. Das beschriebene Protokoll ermöglicht es uns, ESCC-Organoide und patientenangepasste Fibroblasten zu etablieren und bietet eine wertvolle experimentelle Plattform, die interpatientische Variabilität bei der Untersuchung von Tumor-Stroma-Interaktionen ausschließt.

Einleitung

Speiseröhrenkrebs ist weltweit mit hoher Inzidenz und Sterblichkeit verbunden1. Es wird grob in zwei große histologische Subtypen eingeteilt: Speiseröhren-Plattenepithelkarzinom (ESCC) und ösophageales Adenokarzinom (EAC)2. ESCC ist häufiger als EAC, mit einer besonders höheren Inzidenz in Ostasien und Afrika3. Behandlungsstrategien für ESCC sind relativ gut etabliert 4,5. Bei Läsionen im Frühstadium, die auf die Schleimhaut beschränkt sind, ist die endoskopische Resektion als kurative und minimalinvasive Option angezeigt. Bei Patienten mit lokal fortgeschrittener, aber resectabler Erkrankung hat die Kombination aus neoadjuvanter Chemoradiotherapie gefolgt von einer Ösophagektomie eine klinische Wirksamkeit gezeigt. Bei nicht resektablen oder metastasierten Fällen bleibt die systemische Chemotherapie die Grundlage der Behandlung. Dennoch stellen therapeutische Resistenzen und Krankheitsrückfälle weiterhin große klinische Herausforderungen dar.

Tumore bestehen nicht nur aus Krebszellen, sondern auch aus einem komplexen Tumormikroumfeld, das verschiedene stromale Zelltypen umfasst. Darunter sind karzinomassoziierte Fibroblasten (CAFs), wichtige zelluläre Bestandteile der Tumor-Mikroumgebung, die eine entscheidende Rolle beim Tumorfortschritt und der therapeutischenResponsivität spielen. Im ESCC wurde auch die Beteiligung von CAFs an Tumormalignität und Behandlungsresistenz zunehmend berichtet: 10,11,12. Die genauen molekularen Mechanismen der CAFs, die der ESCC-Malignität zugrunde liegen, bleiben jedoch weitgehend unklar.

In den meisten vorherigen Studien wurden die Auswirkungen von CAFs auf Krebszellen mit verschiedenen ESCC-Zelllinien untersucht, die über viele Jahre oder sogar Jahrzehnte in Petrischalen vermehrt wurden. Solche Zelllinien würden sich an die Kulturbedingungen anpassen und ähneln kaum noch den ursprünglichen Tumoren13. Darüber hinaus stammen ESCC-Zelllinien von verschiedenen Patienten ab und weisen verschiedene genetische und epigenetische Veränderungen auf, die in den jeweiligen ESCC-Zellen offensichtlich unterschiedlich sind und als interpatientische Variabilitäten dienen. Experimentelle Ergebnisse einer Krebszelllinie können oft nicht mit denen einer anderen Krebszelllinie übereinstimmen. Daher können Experimente mit verschiedenen ESCC-Zelllinien und den nicht übereinstimmenden AF-Werten mit Patienten dazu führen, dass es schwierig wird, die Interaktionen dieser Zellen auf reproduzierbare und zuverlässige Weise genau zu adressieren.

Um diese Einschränkungen zu beheben, wurde ein Protokoll entwickelt, um patientenpassende Tumororganoide, AFs und nicht-tumorartige Fibroblasten (CFs) gleichzeitig aus derselben ESCC-Operationsprobe zu isolieren. Patientenabgeleitete Organoide rekapitulieren im Allgemeinen wichtige architektonische und phänotypische Merkmale primärer Tumore, während sie die molekulare Heterogenität bewahren. Die etablierten Organoide bildeten Sphäroide unter dreidimensionalen (3D) Kulturbedingungen und zeigten eine stabile Proliferationskapazität. Sowohl CAFs als auch CFs wurden bei fibroblastischen Zellpopulationen, die positiv auf Vimentin, einen Fibroblastenmarker, angereichert sind.

Dieses Protokoll bietet detaillierte, reproduzierbare Schritte für Gewebeverarbeitung, enzymatische Dissoziation, Organoid-Säung, CAF/CF-Isolierung, Passaging und Kryokonservierung. Um Forschern zu helfen, die Anwendbarkeit vor der Umsetzung zu bewerten, wurden praktische Informationen einbezogen: Organoide entstehen typischerweise innerhalb von 3–5 Tagen, erreichen die Passage-Bereitschaft innerhalb von 7–10 Tagen und können stabil auf mehr als zehn Passagen erweitert werden. CAFs und CFs können über mindestens acht Generationen hinweg vergeben werden. Organoide und Fibroblasten können innerhalb von etwa 20 Tagen kryokonserviert werden. Die Erfolgsraten der Etablierung erreichen etwa 70 % bei Organoiden und 80 % bei CAFs und CFs. Darüber hinaus ist ein validierter Konditioniert-Medium-Test mit CAF- oder CF-konditioniertem Medium enthalten, der einen robusten Ansatz zur Bewertung der parakrinen Effekte stromaler Zellen auf das Verhalten von Tumororganoiden bietet. Zusammen bietet diese abgestimmte Tumor-Organoid-Stromal-Plattform ein experimentell zugängliches und biologisch relevantes Modell zur Untersuchung der ESCC-Tumor-Stromal-Interaktionen und zur Unterstützung der Entwicklung präziser Therapiestrategien.

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Protokoll

Alle Verfahren mit menschlichem Gewebe müssen unter geeigneten institutionellen Biosicherheitszulassungen und in einem zertifizierten biologischen Sicherheitsschrank durchgeführt werden. Der Patient gab eine schriftliche informierte Einwilligung, und das Projekt wurde vom Forschungsethikkomitee der Medizinischen Fakultät der Universität Juntendo genehmigt. Ein Überblick über das Verfahren von Protokollen 2 bis 6 ist in Abbildung 1 dargestellt. Die Zusammensetzung und Konzentration jeder Komponente im ESCC-Organoidmedium (Eso_v1) wurden anhand von Kijima et al.14 und anderen Studien 15,16,17 mit nur geringfügigen Modifikationen bestimmt. Die Reagenzien und die verwendeten Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Reagenzien und Gewebevorbereitung

  1. Bereite Reagenzien und Ausrüstung vor.
    1. Sterilisieren Sie alle Instrumente, einschließlich Schere, Pinzette und Pipetten, bevor Sie mit dem Eingriff beginnen.
    2. Bereiten Sie 10 mL phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) in einem 15-mL-Rohr vor.
    3. Bereiten Sie 15-mL-Röhren mit niedriger Haftung vor und beschriften Sie sie nach Probenherkunft (z. B. Tumor-Waschschlauch (A), Tumor-Verdauungsschlauch (B), Nicht-Tumor-Waschschlauch (C), Nicht-Tumor-Verdauungsschlauch (D)).
    4. Beschichte arbeitende Pipetten, indem fetales Rinderserum (FBS) 2–3 Mal aspiriert und dosiert wird, um die Zelladhäsion während der Verarbeitung zu reduzieren.
      HINWEIS: FBS-Beschichtung verhindert, dass Gewebefragmente während der mechanischen Dissoziation an Kunststoffoberflächen haften.
  2. Enzymlösungen bereiten
    1. Bereite Enzymlösung I für die Tumorverdauung vor, indem 2,7 ml Dulbeccos modifiziertes Eagle's Medium (DMEM) mit 10 % FBS und 1x Penicillin–Streptomycin (PS) (im Folgenden DMEM/10 % FBS), 0,3 ml 10 mg/mL Kollagenase, 0,15 mL 10.000 PU/mL Dispase und 0,03 ml 2,5 μg/mL Amphotericin B gemischt werden. Warm bis 37 °C.
    2. Bereite Enzymlösung II für die nicht-tumorale Verdauung vor, indem 2,7 ml DMEM/10 % FBS, 0,3 ml 1 mg/mL Kollagennase und 0,03 ml 2,5 μg/mL Amphotericin B gemischt werden. Erwärmen auf 37 °C.
      HINWEIS: Kollagenase und Dispase erleichtern die Dissoziation des Tumorgewebes.
  3. Organoid-Kulturmedium bereiten
    1. Bereiten Sie ESCC-Organoidmedium (Eso_v1 Medium) vor, das 60 % organoides Basalmedium, 40 % L-WRN-konditioniertesMedium 18 (siehe Schritt 1.4), 50 ng/mL EGF (Wachstumsfaktor), 1 mM N-Acetyl-L-Cystein (Antioxidans), 5 mM Nikotinamid (wasserlösliches Vitamin), 500 nM A83-01 (TGF-βR-Inhibitor (Verhinderung des Wachstums von Fibroblasten)), 1x B-27 (Serumfreies Kultursupplement), 1x N-2 (Serumfreies Kultursupplement) und 10 μM Y-27632 (ROCK-Inhibitor) enthält.
    2. Gleichgewicht des Mediums vor der Anwendung auf 37 °C aus.
      HINWEIS: L-WRN-konditioniertes Medium (Supernatant aus L-WRN-Zellen) liefert WNT-, R-Spondin- und Noggin-Signale, die für die Organoid-Initiierung unerlässlich sind. Y27632 ist während der gesamten Kulturperiode in diesem Medium enthalten.
  4. Bereite L-WRN-konditioniertes Medium vor
    1. Taue ein Fläschchen mit L-WRN-Zellen auf und entsäe sie auf eine 100-mm-Schale mit 10 ml DMEM/10 % FBS und kündige sie 1–2 Tage lang.
    2. Ersetzen Sie das Medium durch 10 mL DMEM/10 % FBS mit G418 (finales 500 μg/mL) und Hygromycin B (finales 500 μg/mL) und kultivieren, bis die Zellen eine 80%ige Konfluenz erreichen.
    3. Führen Sie die Zellen auf zwei 100-mm-Schüsseln mit 10 ml DMEM/10% FBS (mit G418 und Hygromycin B) und kultivieren, bis die Zellen 100% zusammenkommen.
    4. Die Zellen werden auf fünf 150-mm-Schalen mit 20 ml DMEM/10 % FBS (ohne Antibiotika) pro Schale geführt und bis zu 100 % Zusammenfluss kultiviert.
    5. Aspirieren und entsorgen Sie das Medium aus jeder 150-mm-Schelle.
    6. Fügen Sie pro Schale 25 ml des Sammelmediums hinzu (organoides Basalmedium, ergänzt mit 5 % FBS).
    7. 24 Stunden inkubieren.
    8. Sammeln Sie das Medium aus allen fünf Schalen (25 mL × 5 = 125 mL) in eine sterile Glasflasche.
    9. Wiederholen Sie die Schritte 1.4.6–1.4.8 für insgesamt 8 Sammlungen (Ziel-Pool-Volumen: ~1.000 mL).
    10. Steril filtern Sie das gesammelte CM mit einem Flaschendeckelfilter.
    11. Aliquot 40 mL in 25 sterile 50-mL-Röhren.
    12. Aliquots bei −80 °C aufbewahren.
  5. Bereite ein Fibroblast-Kulturmedium vor
    1. Bereite Fibroblast Medium-1 vor.
    2. Gleichgewicht des Mediums vor der Anwendung auf 37 °C aus.
  6. Bereite Gewebehandhabungsschalen vor
    1. Gib mehrere (drei bis fünf) Tropfen FBS mit einer P1000-Spitze auf zwei 100-mm-Schalen, um eine Beschichtung zu erzeugen (Schüssel T für Tumorgewebe, Schüssel N für nicht-tumorales Gewebe).
      HINWEIS: Die FBS-Beschichtung fördert ein glatteres mechanisches Zerkleinern und verhindert das Anhaften kleiner Gewebefragmente an der Oberfläche der Schüssel.
  7. Gewebehandhabung und Probenidentifikation
    1. Bestätigen Sie, dass Tumor- und Nicht-Tumorproben auf Eis transportiert werden.
    2. Legen Sie die Taschentücher auf eine 60-mm-Schale mit einer kleinen Menge DMEM/10% FBS und lagern Sie sie bis zur Anwendung auf Eis. Beginnen Sie mit der Bearbeitung innerhalb von 16 Stunden nach der chirurgischen Resektion, um die Lebensfähigkeit zu erhalten.
    3. Identifizieren Sie das Tumorgewebe anhand seiner festen Textur und unregelmäßigen Oberflächenmorphologie, die sich von der des Nicht-Tumorgewebes unterscheiden.

2. Gewebeverarbeitung, Waschen und enzymatische Verdauung

HINWEIS: Dieser Schritt wird durchgeführt, um gehackte Tumor- und Nicht-Tumorgewebeschnitte mit verschiedenen Enzymlösungen zu verdauen.

  1. Zerkleinern Sie den Tumor und das Nicht-Tumorgewebe
    1. Übertragen Sie jede Gewebeprobe (ca. 5 mm × 5 mm) auf ihre jeweilige FBS-beschichtete Schale (Dish T für Tumorgewebe und Dish N für Nicht-Tumorgewebe).
    2. Schneiden Sie jedes Gewebe mit einem sterilen Skalpell in ~0,5-mm-Fragmente.
      HINWEIS: Kleinere Fragmente erhöhen die enzymatische Zugänglichkeit und verbessern die Verdauungseffizienz.
  2. Wasche das gehackte Taschentuch.
    1. Beschichte eine 10-mL-Pipette mit FBS, um eine Gewebehaftung zu verhindern.
    2. Gib 5 ml PBS mit der FBS-beschichteten Pipette auf jede Schale und suspendiere das gehackte Gewebe vorsichtig wieder.
    3. Übertragen Sie die Suspension auf das entsprechende Tumorwaschschlauch (Tube A) oder das Nicht-Tumor-Waschschlauch (Tube C).
    4. Wiederholen Sie die Schritte 2.2.2 und 2.2.3 (Gesamtlautstärke: 10 mL).
    5. Lassen Sie die Röhren bei Zimmertemperatur 2 Minuten stehen; Entfernen Sie das Supernatant, während etwa 0,5–1 ml PBS und Gewebe am Boden bleiben.
    6. Fügen Sie 10 ml frisches PBS mit einer neuen Pipette hinzu; nach dem Beschichten der Pipette mit FBS die Aufhängung kraftvoll pipettieren, ohne die Blasenbildung zu vermeiden.
      HINWEIS: Kraftvolles Pipetteren unterstützt die mechanische Dissoziation sowie die Entfernung von Blut und Schleim. Das Vermeiden von Blasen verhindert durch Scherung verursachte Zelllyse. Alle Waschschritte dienen dazu, Schmutz zu entfernen.
    7. Lassen Sie die Röhren bei Zimmertemperatur 2 Minuten stehen; Entfernen Sie das Supernatant, während etwa 0,5–1 ml PBS und Gewebe am Boden bleiben.
    8. Wiederholen Sie das Waschverfahren (Schritte 2.2.6 und 2.2.7) zweimal für insgesamt drei Waschen.
  3. Gewebe werden in die Verdauungsröhren übertragen.
    1. Fügen Sie 10 ml frisches PBS mit einer neuen Pipette hinzu; nach dem Beschichten der Pipette mit FBS wird das Tumorgewebe in das Tumorverdauungsrohr (Tube B) übertragen und das nicht-tumorale Gewebe in das Non-Tumor Digestion Tube (Tube D).
    2. Lassen Sie die Röhrchen 2 Minuten bei Zimmertemperatur stehen, entfernen Sie das Supernatant und lassen Sie am Boden etwa 0,5 ml PBS und Gewebe zurück.
  4. Führen Sie enzymatische Verdauung durch.
    1. Verdauung des Tumorgewebes
      1. Gib das gesamte Volumen der Enzymlösung I (Kollagenase + Dispase) in das Tumorverdauungsrohr (Tube B) ein.
      2. Inkubieren Sie bei 37 °C für 2 Stunden mit sanfter Rotation.
    2. Nicht-tumorale Gewebeverdauung
    3. Gib das gesamte Volumen der Enzymlösung II (nur Kollagenase) in das nicht-tumorale Verdauungsrohr (Tube D) ein.
      1. Inkubieren Sie bei 37 °C für 4 Stunden mit sanfter Rotation.
    4. Setzen Sie je nach Probenherkunft mit Schritt 3 (Tumorprobenverarbeitung) oder Schritt 6 (Fibroblasten-Säung des Gegenstücks) fort.
      HINWEIS: Die Arten von Enzymen, die zur Verdauung von Tumor- und Nicht-Tumorgeweben verwendet werden, sowie die Verarbeitungszeiten wurden auf Grundlage vorheriger experimenteller Optimierung bestimmt. Tumorgewebe enthalten oft eine dichte extrazelluläre Matrix; Dispase in Kombination mit Kollagenase verbessert die Verdauungskapazität.

3. Tumorprobenverarbeitung für Organoid- und CAF-Isolierung

HINWEIS: Dieser Schritt wird durchgeführt, um epitheliale Tumorzellen für die Organoidbildung und stromale Fibroblasten (CAFs) aus denselben verdauten Tumorproben zu isolieren.

  1. Filtere und sammle tumorabgeleitete Zellen.
    1. Setzen Sie ein 100 μm Zellsieb auf ein 50 mL konisches Rohr.
    2. Lass das Sieb vorbefeuchten, indem du 3 ml DMEM/10% FBS hindurchträgst.
      HINWEIS: Vorbefeuchtung reduziert den Zellverlust, indem sie die Haftung an trockenen Netzfasern verhindert.
    3. Bringen Sie den gesamten Inhalt des Tumorverdauungsröhrchens (Tube B) mit einer FBS-beschichteten P1000-Spitze auf das Sieb um, um unverdaute Gewebefragmente zu entfernen.
    4. Fügen Sie zusätzlich 6 ml DMEM/10 % FBS hinzu, um die Restcluster durch das Sieb zu spülen.
    5. Entfernen Sie das Sieb und geben Sie das Filtrat zurück in Röhre B (ein neues 15-ml-Rohr mit niedriger Befestigung kann ebenfalls verwendet werden).
  2. Waschen und konzentrieren Sie das Filtrat.
    1. Zentrifugiere das Rohr bei 300 × g für 5 Minuten bei 4 °C.
    2. Entfernen Sie das Überschussmittel mit einer Einwegpipelette.
    3. Gib 10 ml DMEM/10% FBS dazu, verrühre vorsichtig durch Inversion und zentrifugiere erneut mit 300 × g für 5 Minuten.
    4. Saugen Sie vorsichtig das Supernatant ab, während Sie das Pellet behalten.
    5. Reduzieren Sie das verbleibende Volumen auf 40 μL mit einer P200-Pipette.
  3. Stellen Sie Zellen für Organoid- und CAF-Kulturen zu.
    1. Stellen Sie 30 μL für die Aussaatung von Organoiden bereit.
    2. Stellen Sie 10 μL für die CAF-Aussaatung bereit.
      HINWEIS: Dieses Verhältnis liefert empirisch genügend epitheliale und Fibroblastenpopulationen für eine parallele Expansion.

4. Organoid-Samenpflanzung (3D-Kultur)

HINWEIS: Dieser Schritt wird durchgeführt, um ESCC-Organoide aus einer tumorabgeleiteten Zellsuspension herzustellen.

  1. Bereiten Sie Kellermembran-Matrixkuppeln vor.
    1. Erwärmen Sie eine Standardplatte mit 24 Wellen auf 37 °C vor.
      HINWEIS: Das Vorerwärmen der Platte beschleunigt die Erstarrung der Basement Membrane Matrix Domes.
    2. Mischen Sie 30 μL der tumorabgeleiteten Suspension mit 90 μL eiskalten Basement Membrane Matrix (Verhältnis 1:3).
    3. Trage 30 μL pro Kuppel auf vier Brunnen auf.
    4. Lassen Sie die Kuppeln 15 Minuten lang in einem CO₂-Inkubator fest werden.
  2. Organoid-Kulturmedium hinzufügen
    1. Bereiten Sie organoides Medium mit vorgemischten Präparaten (FGF10, SB202190 und Antibiotika wie 1× Amphotericin B und 100 μg/mL Primocin, falls verwendet) her.
      HINWEIS: Brunnen 1: Eso_v1; Brunnen 2: Eso_v1 + 10 μM SB202190; Brunnen 3: Eso_v1 + 100 ng/mL FGF10; Brunnen 4: Eso_v1 + 10 μM SB202190 + 100 ng/mL FGF10 (Endkonzentrationen).
    2. Gib vorsichtig 1 ml Medium zu jedem Brunnen entlang der Wand hinzu.
    3. Inkubieren Sie unter Standard-CO₂-Kulturbedingungen.
    4. Wechsle das Medium alle 3–5 Tage.
      HINWEIS: Das Vormischen der Ergänzungsmittel verhindert, dass kleine Volumen direkt auf empfindliche Basement Membrane Matrix-Domes gepipiert werden müssen. Antibiotika werden nur in den ersten 6 Tagen nach der Etablierung des Organoids hinzugefügt. Kulturbedingungen (FGF10 +/-, SB202190 +/-) werden anhand der Wachstumsrate und Morphologie (vorzugsweise kugelförmig) bestimmt.
  3. Überwachen Sie die Bildung von Organoiden.
    1. Beobachten Sie die Kuppeln täglich mit einem umgekehrten Mikroskop.
      HINWEIS: Erwartete Morphologie: Tag 3–5 → sichtbare Sphäroide; Tag 7–10 → dichte Sphäroide, bereit zum Passieren.
    2. Passage der Organoide, wenn sie eine Größe von etwa 100–200 μm erreichen oder eine Kuppelbeengung von 90 % oder mehr zeigen.

5. CAF-Aussaaten

HINWEIS: Dieser Schritt wird durchgeführt, um CAFs aus einer tumorabgeleiteten Zellsuspension zu etablieren.

  1. Säe die CAFs auf eine mit Kollagen beschichtete Schale.
    1. Bereiten Sie eine kollagenbeschichtete 60-mm-Schale mit 1,5 ml Fibroblast Medium-1 vor.
    2. Fügen Sie 10 μL des für die CAF-Aussaatung vorgesehenen Tumorfiltrats hinzu.
    3. Fügen Sie Antibiotika wie 1× Amphotericin B und 100 μg/mL Primocin hinzu.
    4. Inkubieren Sie unter Standard-CO₂-Kulturbedingungen.
    5. Wechsle das Medium alle 3–5 Tage.
      HINWEIS: Empirisch ist Fibroblast Medium-1 oft besser geeignet als andere Medien für die Erstbildung und das Wachstum von CAFs und CFs. Antibiotika werden nur in den ersten 6 Tagen hinzugefügt.
  2. Das Wachstum der CAF überwachen
    1. Beobachten Sie das Auftreten der fibroblastenartigen Spindelmorphologie ab etwa den Tagen 3–5.
    2. Passage-Fibroblasten bei 90 % bis 100 % Konfluenz.
      HINWEIS: Bei Kontamination von Epithelzellen können Fibroblasten selektiv isoliert werden, indem die Trypsinisierungsdauer angepasst wird, da sich Fibroblasten während des Durchgehens schneller ablösen als Epithelzellen.

6. CF-Setzung

HINWEIS: Dieser Schritt wird durchgeführt, um patientenabgestimmte CFs aus benachbartem Nicht-Tumorgewebe zu erhalten.

  1. Waschen und bereiten Sie den nicht-tumorhaltigen Verdauungsstoff vor.
    1. Zentrifugiere das nicht-tumorale Verdauungsrohr (Tube D) bei 300 × g für 5 Minuten.
    2. Entfernen Sie das Überschussmittel mit einer Einwegpipelette.
    3. 10 ml DMEM/10 % FBS hinzufügen, vorsichtig durch Inversion mischen und erneut bei 300 × g für 5 Minuten zentrifugieren.
    4. Aspirieren Sie vorsichtig das Überlagerungsmittel und behalten Sie das Pellet zurück.
    5. Wiederholen Sie die Schritte 6.1.3 und 6.1.4 noch einmal.
  2. Säe CFs auf eine kollagenbeschichtete Schale
    1. Übertragen Sie die gesamte Suspension auf eine kollagenbeschichtete 60-mm-Schale mit 1,5 ml Fibroblast Medium-1.
    2. Fügen Sie Antibiotika wie 1× Amphotericin B und 100 μg/mL Primocin hinzu.
    3. Inkubieren Sie unter Standard-CO₂-Kulturbedingungen.
    4. Wechsle das Medium alle 3–5 Tage.
      HINWEIS: Antibiotika werden nur in den ersten 6 Tagen verabreicht.
  3. Überwachen Sie das Wachstum der CF.
    1. Beobachten Sie die Morphologie der fibroblastähnlichen Spindel ab 3–5 Tagen.
    2. Passage-Fibroblasten bei 90 % bis 100 % Konfluenz.

7. Organoid-Passaging und Kryokonservierung

  1. Organoid-Passaging.
    HINWEIS: Ziel dieses Schrittes ist es, die Organoide zu erweitern, sobald sie eine angemessene Dichte erreichen.
    1. Aspirieren Sie das alte Medium und waschen Sie jede Flüssigkeit gut mit 1 ml PBS.
    2. Gib 0,5 ml vorgewärmtes Trypsin für Organoid zu jedem Brunnen.
    3. Pipette kräftig mit einer P1000-Spitze und benutze die Kante der Spitze, um die Kuppel der Basement Membrane Matrix zu stören.
      HINWEIS: Mechanische Schere hilft, die dichte Basementmembranmatrix abzubauen und so den enzymatischen Zugang zu verbessern.
    4. Inkubieren Sie 10–15 Minuten in einem CO₂-Inkubator, bis sich alle Gelklumpen aufgelöst haben. Organoide werden in 20–50 Zellklumpen dissoziiert.
      HINWEIS: Vermeiden Sie vollständige Einzelzell-Dissoziation, da dies die Lebensfähigkeit verringert.
    5. Sammeln Sie die Federung in ein 15-mL-Rohr mit niedriger Befestigung.
    6. Spüle den Brunnen viermal mit 0,5 ml DMEM/10% FBS ab und übertrage alle Spülungen in denselben Tube mit niedriger Haftansatz.
    7. Zentrifugiere das Rohr bei 300 × g für 5 Minuten.
    8. Entfernen Sie das Supernatant und suspendieren Sie das Pellet mit minimalem DMEM/10 % FBS erneut; Stellen Sie das Aufhängungsvolumen auf 80 μL ein.
    9. Mischen Sie 80 μL der organoiden Suspension mit 240 μL eiskalter Basementmembranmatrix (Verhältnis 1:3).
    10. Die Mischung wird auf eine vorgewärmte 6-Wellen-Platte (37 °C) mit 4–6 Kuppeln pro Muld angebracht.
    11. Lass die Kuppeln 15 Minuten fest werden und gib dann 3 ml Eso_v1 Medium (die Zusammensetzung, die in der ersten Kultur bei Schritt 4.2 optimal war) pro Brunnen hinzu.
    12. Wechsle das Medium alle 3–5 Tage.
      HINWEIS: Organoide werden durchführt, wenn sie einen Durchmesser von etwa 100–200 μm erreichen oder wenn die Kuppelbeengung 90 % übersteigt. Zellzählung wird nicht durchgeführt. Bei routinemäßigen Subkulturen werden Organoide im Verhältnis 1:4 zu 1:10 aufgeteilt. Eine schnelle Reformation der Sphäroide wird innerhalb von 48–72 Stunden erwartet.
  2. Organoide Kryokonservierung
    1. Waschen Sie jede mit 3 ml PBS.
    2. Gib 1,5 ml Trypsin für Organoid zu jedem Brunnen, pipettiere kräftig und inkubiere 10 Minuten.
    3. Sammeln Sie die gesamte Federung in ein 15-mL-Rohr mit niedriger Befestigung und spülen Sie den Brunnen viermal.
    4. Zentrifugiere das Rohr bei 300 g × g für 5 Minuten und entferne das Supernatant.
    5. Suspendiere das Pellet in 2 ml 90 % FBS/10 % DMSO.
    6. Aliquot 0,5 mL in jedes Kryovialen.
    7. Stellen Sie die Fläschchen in einen Gefrierbehälter und lagern Sie sie über Nacht bei −80 °C.
    8. Phiolen werden in flüssigen Stickstoff umgefüllt, um sie langfristig zu lagern.
      HINWEIS: Organoide werden besetzt, wenn sie einen Durchmesser von etwa 100–200 μm erreichen oder wenn die Kuppelüberfüllung 90 % übersteigt.
  3. Bergung eingefrorener Organoide
    1. Tauen Sie das Kryovial schnell in einem 37 °C Wasserbad auf.
    2. Übertragen Sie den Inhalt in 5 mL DMEM/10% FBS in einem 15-mL-Rohr.
    3. Zentrifugiere das Rohr bei 300 × g für 5 Minuten.
    4. Entferne das Überdachungsmittel und suspendiere das Pellet in 40–60 μL DMEM/10 % FBS.
    5. Mische die Suspension mit einer eiskalten Basement Membrane Matrix im Verhältnis 1:3.
    6. Die Mischung wird auf eine vorgewärmte 6-Well-Platte (37 °C) als 4–6 Kuppeln pro Mulde angebracht.
    7. Lass die Kuppeln 15 Minuten fest werden und gib dann 3 ml Eso_v1 Medium (die Zusammensetzung, die in der ersten Kultur bei Schritt 4.2 optimal war) pro Brunnen hinzu.

8. Fibroblast-Passaging und Kryokonservierung

  1. Passaging CAFs und CFs
    HINWEIS: Ziel dieses Schrittes ist es, die Fibroblasten zu erweitern, sobald sie eine angemessene Dichte erreicht haben.
    1. Waschen Sie das Geschirr mit 2 ml PBS.
    2. Fügen Sie 0,4 ml 0,25 % Trypsin hinzu.
    3. Inkubieren Sie 5 Minuten in einem CO₂-Inkubator, überwachen Sie die Abtrennung unter dem Mikroskop.
    4. Neutralisieren Sie das Trypsin mit DMEM/10% FBS und übertragen Sie die gesamte Zellsuspension auf eine 100-mm-Schale mit 10 ml Medium.
      HINWEIS: Fibroblasten werden ausgeschieden, wenn sie eine Konfluenz von 90 % bis 100 % erreichen. Für routinemäßige Subkulturen sind sie im Verhältnis 1:3 geteilt. Empirisch verlangsamt oder stoppt die Proliferation von Fibroblasten, wenn die Zelldichte niedrig ist.
  2. Fibroblast-Kryokonservierung
    1. Waschen Sie die Zellen mit 5 ml PBS.
    2. Gib 1 ml 0,25 % Trypsin hinzu und inkubiere dann 5 Minuten in einem CO₂-Inkubator.
    3. Neutralisieren Sie das Trypsin mit DMEM/10% FBS und übertragen Sie die gesamte Zellsuspension in ein 15-mL-Rohr.
    4. Zentrifugiere bei 300 × g für 5 Minuten.
    5. Suspendiere das Zellpellet in 2 ml 90 % FBS/10 % DMSO.
    6. Aliquot 0,5 mL in jedes Kryovialen.
    7. Stellen Sie die Fläschchen in einen Gefrierbehälter und lagern Sie sie über Nacht bei −80 °C.
    8. Die Fläschchen werden in flüssigen Stickstoff umgefüllt, um sie langfristig zu lagern.

9. Konditionierter Medium-Test

HINWEIS: Ziel dieses Schrittes ist es, die parakrinen Effekte von Fibroblasten auf ESCC-Tumororganoide mittels konditioniertem Medium (CM) zu bewerten. Dieser Assay liefert ein reproduzierbares Stroma-Tumor-Interaktionsmodell, wenn die direkte Kokultur noch nicht optimiert ist.

  1. Herstellung eines CAF/CF-konditionierten Mediums
    1. Kultivieren Sie die gleiche Anzahl von CAFs oder CFs in 3 mL DMEM/10 % FBS auf 60-mm-Schüsseln bis zur 80 %–90 % Konfluenz.
    2. Wasche die Zellen einmal mit 2 ml PBS.
    3. Füge 3 ml DMEM/2 % FBS hinzu.
    4. Inkubieren Sie 48 Stunden in einem CO₂-Inkubator.
    5. Sammeln Sie das Supernatant in ein 15-mL-Rohr.
    6. Zentrifugiere bei 2000 × g für 5 Minuten, um Zellreste zu entfernen.
    7. Sammeln Sie 2,5 ml des Supernatanten in eine neue 15-mL-Röhre.
    8. Aliquot das konditionierte Medium in 100–500 μL Portionen und bei -80 °C lagern.
  2. Herstellung des organoiden Assaymediums
    1. Bereiten Sie das ESCC-Organoidmedium wie in Schritt 1.3 beschrieben vor.
    2. Mische das organoide Medium und das konditionierte Medium im Verhältnis 1:1 (50 % v/v).
  3. Kultur von Krebsorganoiden mit dem Organoid-Testmedium.
    1. Nach der Organoid-Passage, wie in Schritt 7 beschrieben, werden die Organoide in eine einzelne 20 μL Basement Membrane Matrix-Kuppel pro Bohrloch auf einer vorgewärmten 48-Well-Platte (37 °C) zusammengeführt.
    2. Nach der Verhärtung der Kuppel geben Sie 0,3 ml Organoid-Assay-Medium zu jedem Brunnen.
    3. Ersetzen Sie das Organoid-Assay-Medium alle 3–7 Tage.
    4. Bewerten Sie die Morphologie und Größe der Krebsorganoide.
      HINWEIS: Alle vom Menschen stammenden Materialien werden als potenziell ansteckend behandelt. Geeignete persönliche Schutzausrüstung, einschließlich Handschuhe, Masken und Schutzbrillen, wird stets getragen. Kollagenase, Dispase und Dimethylsulfoxid (DMSO) können Haut-, Augen- und Atemreizungen verursachen; daher werden direkter Kontakt und Einatmen vermieden. Alle enzymatischen Verfahren mit menschlichem Gewebe werden gemäß institutionellen Biosicherheitsrichtlinien durchgeführt. Flüssige Abfälle mit menschlichem Gewebe werden in versiegelten Biohazard-Behältern gesammelt und vor der Entsorgung autoklaviert. Chemische Abfälle, einschließlich DMSO und Enzymlösungen, werden gemäß institutionellen Richtlinien für gefährliche Abfälle entsorgt. Alle wiederverwendbaren Instrumente werden mit 70 % Ethanol abgespült und vor der Wiederverwendung autoklaviert.

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Ergebnisse

Gewebeproben wurden aus der Tumorregion und einer angrenzenden Nicht-Tumorregion, die 3 cm vom Tumor entfernt liegt, entnommen und operativ von einem Patienten mit ESCC entfernt, der keine neoadjuvante Chemotherapie erhalten hatte. Krebsorganoide und KAFs wurden aus der Tumorregion isoliert, während CFs aus der Nicht-Tumorregion isoliert wurden. Chirurgisches Gewebe wurde in etwa 0,5 mm große Stücke gehackt (Abbildung 2A) und anschließend enzymatisch behande...

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Diskussion

Die vorherigen Berichte verwendeten Krebsorganoide und patientenabgestimmte AF-Tests, um die Rolle von CAFs bei der Proliferation und Medikamentenresistenz bei menschlichen Darm-, Brust-, Bauchspeicheldrüsen- sowie Kopf- und Halskrebszu untersuchen. Diese Studien zeigten, dass CAFs die Proliferation und Arzneimittelresistenz ...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte, die offengelegt werden müssen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch den Young Investigator Award der Juntendo University (2024 und 2025) für P. Z. sowie durch Fördermittel für wissenschaftliche Forschung des Ministeriums für Bildung, Kultur, Sport, Wissenschaft und Technologie, Japan (23K07362, 21K08693), unterstützt. Wir möchten allen Mitgliedern der Abteilungen für Pathologie und Onkologie sowie der Speiseröhren- und Gastroenterologischen Chirurgie danken.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
100-mm-SchüsselTPP93100
100x Penicillin-Streptomycin (PS)Nacalai26253-84
15-ml-RöhreFastGeneFG2001
24-Bohrloch-ZellkulturplatteTPP92024
48-Bohrloch-ZellkulturplatteTPP92448
50-ml-RöhrchenFastGeneFG2004
60 mm SchüsselTPP93060
6-Well-ZellkulturplatteTPP92006
A83-01Cayman9001799
Fortgeschrittene DMEM/F12 Gibco12634010Organoides Basalmedium = Fortgeschrittenes DMEM/F12 + GlutaMAX + 1x PS
Alexa488 Anti-Maus IgGInvitrogenA11029
Amphotericin BThermoFisher15290018
Anti-Vimentin-Antikörper (V9)Santa CruzSC-62601/500 Verdünnung zur Verwendung
B-27ThermoFisher17504044
FlaschendeckelfilterSartorius180F15
Zellsieb, 100 & Mikro; m PoreBD Falcon352360
Kollagenase, Typ ISIGMAC0130
Kollagenbeschichtete 60 mm DischeIWAKI4010-010
Dimethylsulfoxid (DMSO)Wako043-07216
Dispase IGODO SHUSEI386-02271
Dulbeccos modifizierter Eagle Medium (DMEM)Nacalai08459-64
ECLIPSE Ti2Nicon
Fetales Rinderserum (FBS)SERANAS-FBS-CO-015
Fibroblast-Wachstumsmedium 2PromoCellC-23020Fibroblast-Medium-1 = Fibroblast-Wachstumsmedium 2
G418InvivogenAnt-gn-1
GlutaMAX Gibco35050061
HFDM-1KSK87-160Fibroblast-Medium-2 = HFDM-1 + 1 % FBS + 1 x PS
Hoechst33342 Nacalai04929-82
HygromycinInvivogenAnt-HG-1
IncuCyte-SystemEssen BioScience
L-WRN-ZellenATCCCRL-3276
MatrigelCorning354234Basementmembranmatrix = Matrigel
N2ThermoFisher17502048
N-Acetyl-L-CysteinWako017-05131
NikotinamidTCIN0078
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)Nacalai14249-24
PrimocinInvivogenANT-PM-05
Rekombinantes menschliches EGFPEPROTECHAF-100-15
Rekombinantes menschliches FGF-10PEPROTECHPEP-100-26
SB202190SelleckS1077
Skalpell, Nr. 11Feder8-3086-02
STEMFULLSumitomo-BakelitMS-9015015-mL-Röhre mit niedriger Befestigung = STEMFULL
TrypLE ExpressGibco12605028Trypsin für Organoid = TrypLE Express
TrypsinNacalai35556-44
Y-27632SelleckS1049

Referenzen

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