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Methodenartikel

Lentiviral-induzierte striatale Pathologie als präklinisches Modell der polyglutamin-spinocerebellären Ataxie

418 Ansichten

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DOI:

10.3791/69550

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13. März 2026

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1ABC-RI, Algarve Biomedical Center Research Institute, 2Faculdade de Medicina e Ciências Biomédicas, Universidade do Algarve, 3ABC Collaborative Laboratory: Integrated Ageing and Rejuvenation Solutions (ABC CoLAB - Ageing Better)

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Polyglutamin spinocerebellare Ataxien werden durch CAG-Expansionen verursacht, die aggregationsanfällige Proteine erzeugen. Dieses Protokoll beschreibt die Vektorproduktion, die stereotaxische Abgabe sowie die Analyse von Einschlüssen und neuronalem Markerverlust und bietet eine kontrollierte Plattform, um Mechanismen zu untersuchen und gezielte Therapien für neurodegenerative Erkrankungen zu evaluieren.

Zusammenfassung

Polyglutamin spinocerebellare Ataxien sind eine Gruppe von sechs neurodegenerativen Erkrankungen, die durch eine Mutation im Trinukleotid-CAG-Trakt innerhalb des kodierenden Bereichs jedes kausalen Gens verursacht werden. Diese Mutation führt zu einer ungewöhnlich erweiterten Polyglutamin-Dehnung im Protein, was es anfällig für Aggregation macht und zur Bildung intraneuronaler Einschlüsse führt, die ein Markenzeichen dieser Krankheiten sind. Die molekularen Mechanismen, die der Pathogenese dieser Krankheiten zugrunde liegen, sind komplex und nicht vollständig verstanden. Bisher bleiben diese Krankheiten unheilbar. Das Verständnis molekularer Mechanismen in gefährdeten Hirnregionen ist für die therapeutische Entwicklung unerlässlich. Flexible, regionsspezifische experimentelle Plattformen sind erforderlich, um Mechanismen und Interventionen schnell zu testen, ohne Zeit und Kosten für die Erzeugung mehrerer transgener Linien, auch wenn sie die selektive Verwundbarkeit nicht adressieren. In den letzten Jahren haben wir und andere mehrere lentivirale Modelle entwickelt, um die Auswirkungen der erweiterten Proteinexpression in bestimmten Gehirnregionen zu untersuchen. Diese Modelle zeigen neuropathologische und verhaltensbezogene Merkmale, die einige Krankheitsmerkmale nachahmen, was ihre Bedeutung für das Verständnis der Pathogenese und die Entwicklung neuer therapeutischer Strategien hervorhebt. In diesem Artikel beschreiben wir die Entwicklung eines striatalen Modells anhand von SCA2 als Beispiel. Wir heben die Entwicklung und Produktion von lentiviralen Vektoren sowie die stereotaxische Injektion der Vektoren hervor, die die erweiterte Form von Ataxin-2 (dem krankheitserregenden Protein) exprimieren. Abschließend charakterisieren wir zwei Hauptmerkmale neuropathologischer Merkmale: die Bildung von Einschlüssen und den Verlust neuronaler Marker. Durch die Bereitstellung einer kontrollierten Plattform, die diese zentralen pathologischen Merkmale reproduziert, bietet dieses Modell ein wertvolles Werkzeug, um regionsspezifische Mechanismen der Neurodegeneration zu analysieren und gezielte therapeutische Interventionen zu bewerten.

Einleitung

Polyglutamin spinocerebellare Ataxien (polyQ SCAs) sind eine Gruppe von sechs autosomal-dominanten neurodegenerativen Erkrankungen, die durch CAG-Trinukleotid-Wiederholungen in verschiedenen kausalen Genen verursacht werden und zu toxischen Polyglutamin-(polyQ)-Trakten innerhalb kodierter Proteine führen1. Dazu gehören die häufigsten polyQ-SCAs SCA3/Machado-Joseph-Krankheit und SCA22. Diese Erkrankungen betreffen hauptsächlich neuronale Zellen in bestimmten Hirnregionen, darunter das Kleinhirn und den Hirnstamm, sowie das Striatum und andere Bereiche. Folglich verursachen sie fortschreitende motorische Koordinationsstörungen, Gangstörungen, schwere Neurodegeneration und vorzeitigenTod.

Mehrere Tiermodelle wurden entwickelt, um polyQ-SCAs zu untersuchen und therapeutische Ansätze zu testen. Transgene Mäuse, Knock-in-Linien und bedingte Expressions-Mausmodelle wurden verwendet, um die molekularen Grundlagen des Krankheitsverlaufs und die beteiligten zellulären Signalwegezu erläutern 4,5. Die Erstellung eines neuen Krankheits-Tiermodells ist jedoch zeitaufwendig und kostspielig und eignet sich oft nicht für die Untersuchung der regionalen Beteiligung des Gehirns an der Krankheitspathogenese6.

Lentivirale (LV)-basierte Mausmodelle bieten eine ergänzende Alternative zu herkömmlichen Modellen, mit geringeren Kosten und der Möglichkeit, bestimmte Gehirnregionen zu untersuchen 7,8. Lentivirus-Vektoren ermöglichen die Abgabe großer Transgene (bis zu 8 kb), was zu einer schnellen Induktion von Pathologien in definierten Hirnregionen ohne Keimbahnmodifikation führt, und sie können bei Tieren unterschiedlichen Alters eingesetzt werden. Die direkte Injektion lentiviraler Vektoren in die Zielhirnregion kann eine regionsspezifische Expression pathogener oder therapeutischer Gene mit reduzierter Immungenität im Vergleich zu anderen viralen Vektoren erreichen4. Außerdem vermeidet die postnatale Geburt die Entwicklungskompensation, um Krankheitsmechanismen unter Bedingungen zu untersuchen, die dem menschlichen Beginn9 näherkommen. Die Expressionswerte können durch Anpassung der Virusdosis getitriert werden, wodurch kontrollierte Phänotypen erzeugt und die Modellierung des graduierten Krankheitsverlaufs erleichtert wird. Zusätzlich ermöglicht diese Methode eine zelltypspezifische Expression abhängig vom gewählten Promotor 4,7.

Mehrere Studien haben die Praktikabilität und Nützlichkeit von LV-basierten Mausmodellen für die Modellierung von PolyQ SCAs 10,11,12,13 gezeigt. Wir und andere haben LV-basierte Modelle für SCA111, SCA212, SCA311, 12 und SCA714 entwickelt, die Plattformen für eine schnelle, regionsspezifische Expression oder zum Abschalten von Krankheitsgenen bilden, während Schlüsselaspekte der Neuropathologie reproduziert werden.

Zusammenfassend bietet der hier beschriebene lentivirale Ansatz ein vielseitiges und effizientes Werkzeug zur Modellierung der Pathogenese von polyQ-SCAs. Indem einige der größten Nachteile aktueller Tiermodelle überwunden werden, beschleunigt diese Methode Proof-of-Concept-Studien und bietet eine bessere Kontrolle über Krankheitsbeginn, Lokalisierung und Schwere – Eigenschaften, die sie für therapeutische Screenings und die Untersuchung molekularer Mechanismen äußerst geeignet machen. Hier beschreiben wir eine reproduzierbare Methode zur Erstellung und Charakterisierung eines striatalen lentiviralen Modells der polyglutamin-spinocerebellaren Ataxie, die eine detaillierte Analyse früher pathogener Ereignisse und die Bewertung von Kandidaten-Therapeutika ermöglicht.

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Protokoll

Alle Tierversuche wurden gemäß den Richtlinien Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments (ARRIVE) und dem National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals durchgeführt. Die vorliegende Studie wurde vom Direção-Geral da Alimentação e Veterinária (DGAV) genehmigt. C57BL/6J-Mäuse wurden in dieser Studie eingesetzt und in Standardkäfigen unter einem 12-Stunden-Licht/12-Stunden-Dunkelzyklus untergebracht, wobei Futter und Wasser ad libitum bereitgestellt wurden.

HINWEIS: Die in diesem Protokoll verwendeten Materialien sind in der Materialtabelle weiter beschrieben.

1. Verpackung lentiviraler Vektoren

HINWEIS: Alle Verfahren mit lentiviralen Vektoren müssen in einem BSL-2-Labor durchgeführt werden, das den Sicherheitsrichtlinien der Institution entspricht. Wir verwendeten das 4-Plasmid-Transfektionssystem aufgrund seiner höheren Biosicherheit im Vergleich zu anderen lentiviral produzierenden Systemen (siehe Abbildung 1 für Details zum Transferplasmid).

  1. Tau HEK 293T-Zellen in einem Wasserbad auf und säen sie in einer T75-Flasche mit Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM), ergänzt mit 2 mM L-Glutamin, 10 % FBS und 1 % Pen-Strep. Dieses vollständige DMEM-Medium wurde in allen Schritten des Protokolls verwendet. Verwenden Sie Zellen bei Passage Nummer ≤10, um hohe virale Titerzahlen und konstante Ergebnisse zu gewährleisten.
    HINWEIS: Überprüfen Sie immer vor Beginn eine Mycoplasma-Kontamination.
  2. Wenn die Zellen eine Konfluenz von 80 % bis 90 % erreichen, erweitern Sie sie zu zwei T175-Kolben, indem Sie die anfängliche Kultur 1:2 aufteilen. Säen Sie 20 100-mm-Kulturschalen mit 3,8 x 106 Zellen pro Schale (Endvolumen 10 ml) und inkubieren Sie sie 24 Stunden bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO₂. Zähle die Zellen durch Trypan-Blue-Ausschluss mit einem Neubauer-Hämozytometer.
    HINWEIS: Erwägen Sie, Pen-Strep aus dem Medium auszuschließen, um den Zellstress zu reduzieren und folglich die Zelltransfektion zu maximieren.
  3. Am nächsten Tag bereiten Sie die Transfektionsmischung wie in Tabelle 1 beschrieben vor. Vortex und kurz nach unten drehen, um zu homogenisieren. Inkubieren Sie die Mischung bei Raumtemperatur 10–20 Minuten, damit sich DNA: PEI-Komplexe bilden können.
  4. Nach der DNA: PEI-Komplexe durften sich bei Raumtemperatur 15 Minuten bilden, das Gemisch wurde mit vollständigem DMEM auf 5 mL eingestellt.
    Entferne 5 ml Medium aus jeder Kulturschale (die Hälfte des Gesamtvolumens) und ersetze sie durch 5 ml Transfektionsmischung. Dies hält das Endkulturvolumen während der Transfektion bei 10 mL.
  5. Transfektieren Sie die Zellen mit den drei Verpackungsplasmiden und dem Transferplasmid, wie in Tabelle 1 beschrieben.
    HINWEIS: Alle Plasmide, die zur lentiviralen Produktion verwendet werden, sollten mit endotoxinfreien Reinigungskits vorbereitet werden. Darüber hinaus sollte die Plasmidintegrität durch eine Restriktionsenzymanalyse überprüft werden, um die Korrektheit der LTR-Regionen und der Transgenkassette vor der Transfektion zu bestätigen.
  6. Gib 5 ml der Transfektionsmischung tropfweise auf jede Platte und inkubiere 6 Stunden lang. Sauge das gesamte Medium ab und ersetze es durch 10 ml frisches Medium. Inkubieren Sie 48 Stunden.
    HINWEIS: Um den viralen Titer zu erhöhen, sammeln Sie das Medium bei 48 Stunden, geben Sie jedem Teller 10 ml frisches Medium hinzu und sammeln Sie nach 24 Stunden erneut. Das zuvor gesammelte Medium kann bei 4 °C bis zu 24 Stunden gelagert werden. Dies ermöglicht eine Konzentration von doppeltem Volumen und erhöht den viralen Titer.
  7. Filtere alle konditionierten Medien, die lentivirale Vektoren enthalten, mit einer 0,22 μm Filtereinheit.

2. Reinigung und Titration von lentiviralen Vektoren

  1. Das gefilterte Supernatant wird in geeignete konische Ultrazentrifugenröhren übertragen und bei 65.000 x g für 1 Stunde 30 Minuten bei 4 °C zentrifugiert, zum Beispiel mit einem Schwing-Bucket-Rotor.
  2. Entsorge vorsichtig den Überstandsstoff und suspendiere jedes Pellet in 400 μL 1 % BSA, verdünnt in 1x PBS, um Blasenbildung zu vermeiden. Inkubiere mindestens eine Stunde auf Eis.
  3. Nach 1 Stunde Brützeit mischen Sie jedes Rohr vorsichtig, um sicherzustellen, dass die Pellets vollständig resuspendiert und homogen sind, und sammeln Sie dann alle wieder suspendierten Pellets in einem einzigen Rohr.
  4. Füllen Sie das Rohr mit 1 % BSA/PBS bis mindestens zwei Drittel voll, um einen Kollaps während der Zentrifugation zu verhindern.
  5. Zentrifugiere erneut mit 65.000 x g für 1 Stunde 30 Minuten bei 4 °C, um die lentiviralen Vektoren zu pelletieren. Entsorge vorsichtig das Supernatant und trockne den Rand der Tube mit sterilem Papier.
  6. Setzen Sie das Pellet mit den lentiviralen Vektoren in 45 μL 1 % BSA/PBS wieder auf, um Blasen zu vermeiden. Versiegeln Sie das Rohr mit transparenter Folie und inkubieren Sie 24 Stunden bei 4 °C.
  7. Am folgenden Tag bereiten Sie 10 μL Aliquoten der lentiviralen Vektoren vor. Behalten Sie einen 10 μL Aliquot für die Titration: 5 μL für das p24 ELISA-Kit und 2 μL für das qPCR-Kit. Titrieren Sie die lentiviralen Vektoren mit ELISA und qPCR gemäß den Anweisungen des Herstellers.
    HINWEIS: Die Wahl der Titrationsmethode hängt von den experimentellen Bedürfnissen ab, zum Beispiel einer schnellen Bewertung oder präziser Quantifizierung infektiöser Einheiten. ELISA auf Basis von p24 quantifiziert das Kapsidprotein und misst daher die Gesamtzahl physikalischer Partikel; Sie ist schnell, kostengünstiger als andere Methoden und hochgradig reproduzierbar. Sie unterscheidet jedoch nicht zwischen infektiösen und nicht-infektiösen Partikeln, was zu einer Überschätzung des funktionellen Titers führen kann. Die Titration basierend auf qPCR misst die Anzahl der viralen Genome (vg), die in Partikeln verpackt sind, was eine genauere Schätzung der genomhaltigen Virionen ermöglicht und einen direkten Vergleich zwischen Vektorpräparaten ermöglicht. Allerdings kann die effektive Infektivität der viralen Partikel weiterhin nicht bewertet werden. Schließlich messen infektivitätsbasierte Tests, wie die Durchflusszytometrie für fluoreszierende Vektoren oder die Bildung von Antibiotikaresistenzkolonien, funktionelle Transducierende Einheiten (TU/ml) direkt und sind biologisch am relevantsten, allerdings arbeitsintensiver, zelltypabhängiger, zeitaufwändiger und teurer15,16.

3. Stereotaktische Operation für beidseitige lentivirale Verabreichung im Mausstriatum

  1. Tierzubereitung
    1. Wiegen Sie das Tier und berechnen Sie die erforderliche Narkosedosis. Verabreichen Sie intraperitoneal eine Anästhesie mit einer Dosis von 10 μL/g Körpergewicht in einer Fertigmischung. Diese Lösung wird hergestellt, indem 7,5 mL 0,9 % NaCl, 500 μL Medetomidin (1,0 mg/mL), 1,0 mL Midazolam (5,0 mg/mL) und 1,0 mL Fentanyl (0,05 mg/mL) kombiniert werden, was ein Endvolumen von 10 mL ergibt. Planen Sie etwa 10 Minuten für die vollständige Einleitung der Anästhesie ein.
    2. Bestätigen Sie die Tiefe der Anästhesie (z. B. Zehenkneifreflex). Trage eine Augensalbe auf beide Augen auf und rasiere die Kopfhaut.
    3. Setzen Sie das Tier in den stereotaxischen Rahmen auf ein Heizkissen. Positioniere den Kopf mit den Ohrbügeln und der Bissstange.
      HINWEIS: Die Anzahl der zu injizierenden Tiere und der Zeitplan sind experimentell abhängig und sollten durch eine a priori statistische Leistungsanalyse basierend auf den spezifischen Hypothesen und erwarteten Effektgrößen bestimmt werden. Als Beispiel wurden in unserer vorherigen Studie12 die injizierten Gehirne 4, 8 und 12 Wochen nach der Injektion analysiert, um den Verlauf neuropathologischer Veränderungen zu bewerten.
  2. Spritzenvorbereitung und Virusladung
    1. Verwende die Standard-Hamilton-Nadel zum Laden und eine 26-G-Nadel mit stumpfer Spitze zur Injektion. Laden Sie 2 μL lentivirale Vektorlösung in die Spritze ein. Stellen Sie sicher, dass die Virusdosis pro Injektionsstelle 400 ng p24-Antigen/ml oder 5 x 109 IU/mL10, 12, 17 beträgt.
    2. Die Spritze wird in die automatische Mikroinjektionspumpe (z. B. Stoelting) montiert. Zünden Sie die Spritze im Infusionsmodus, bis ein Tropfen Flüssigkeit an der Nadelspitze erscheint. Stellen Sie sicher, dass die Facette nach vorne zeigt.
    3. Stellen Sie die Pumpenparameter ein – Geschwindigkeit: 0,25 μL/min, Volumen pro Hemisphäre: 2 μL, Spritzentyp: passend zum verwendeten Bereich.
      HINWEIS: Das zu injizierende Volumen hängt von der Nagetierart und dem zu transduzierenden Zielbereich des Gehirns ab. Injektionen von 1 μL führen zu einer fokalen Expression, während größere Gesamtvolumina (bis zu 10 μL) sehr langsame Injektionsraten erfordern und ein höheres Risiko für Gewebestörungen oder Reflux bergen.
  3. Striatale Zielsetzung und Injektion
    1. Desinfizieren Sie die Kopfhaut mit 70 % Ethanol. Machen Sie einen Schnitt in der Mitte (~1–1,5 cm) mit einer sterilen Skalpellklinge zwischen den Ohren bis zu den Augen.
    2. Den Schädel freilegen und reinigen, wobei das Periost mit Wattestäbchen entfernt wird. Lokalisieren Sie Bregma und zeichnen Sie den stereotaxischen Nullpunkt auf (manuell oder digital).
    3. Bestimmung der Injektionskoordinaten relativ zu Bregma (bei einer Maus im Alter von 8–12 Wochen mit etwa 18–20 g): Antero-posterior (AP) +0,6 mm; Medio-lateral (ML) ±1,8 mm; Dorso-ventral (DV): –3,3 mm.
    4. Üben Sie sorgfältig an den markierten AP/ML-Koordinaten. Gehen Sie langsam vor, um das Eindringen ins Gehirn zu vermeiden. Alternativ sollten Sie aufhören, sobald der Knochen ausreichend ausgedünnt ist – dies zeigt sich durch die Sichtbarkeit der Blutgefäße in der Dura Mater durch den Schädel. Perforatiere die Dura Mater vorsichtig mit einer kleinen Nadel.
    5. Testen Sie, ob das Loch in der richtigen Position ist, indem Sie die Einstichnadel absenken. Testen Sie, ob die Nadel verstopft ist, indem Sie einen Teil der Lösung injizieren, bis ein Tropfen deutlich sichtbar ist.
    6. Senken Sie die Injektionsnadel langsam auf die DV-Koordinate. Injizieren Sie pro Hemisphäre 2 μL Viruslösung mit 0,25 μL/min. Nach der Injektion warten Sie 5 Minuten, bevor Sie die Nadel langsam zurückziehen, um Reflux zu vermeiden.
    7. Lentivirus, das für das Wildtyp-Protein (ATXN2WT oder ATXN3WT) kodiert, in eine Hemisphäre injizieren und Lentivirus, das für das mutierte/expandierte Protein (ATXN2MUT oder ATXN3MUT) codiert, auf die kontralaterale Seite (randomisiert oder vordefiniert)12,13.
      HINWEIS: Mit dem Mouse BrainAtlas 18 können praktisch alle Hirnregionen stereotaktisch jenseits des Striatums gezielt anvisiert werden, einschließlich Cortex, Hippocampus, Substantia nigra und Kleinhirn. Da das Kleinhirn der primäre Pathologiestandort in SCAs ist, stellt es ein besonders relevantes Ziel für die Vektorabgabe dar. Für die Entwicklung dieses kleinhirnären SCA3-Mausmodells verwendeten wir Koordinaten von 1,6 mm Rostral bis Lambda, 0 mm von der Mittellinie und 1 mm ventral zur Schädeloberfläche, wobei der Mundstab auf −3,3 gesetzt ist, um eine präzise Zielerfassung des kleinhirnkortex12,15 sicherzustellen.
  4. Überwachung während der Operation
    1. Beobachte die Bewegung und Reflexe des Schnurrhauts. Wenn eine Bewegung beobachtet wird, verabreichen Sie eine zusätzliche Anästhesiedosis (ein Drittel des Anfangsvolumens).
  5. Wundverschluss und Genesung
    1. Schließen Sie den Schnitt mit 3–5 unterbrochenen 5-0 Nylonnähten. Verabreichen Sie subkutan eine Mischung von antagonistischen Medikamenten mit einer Dosis von 10 μL/g Körpergewicht, um die Wirkung der Anfangsanästhetika rückgängig zu machen. Diese Lösung wird hergestellt, indem 1,5 mL 0,9 % NaCl, 500 μL Atipamezol (5,0 mg/mL), 5,0 mL Flumazenil (0,1 mg/mL) und 3,0 mL Naloxon (0,4 mg/mL) kombiniert werden, was ein Endvolumen von 10 mL ergibt.
    2. Setze das Tier in einen sauberen Erholungs-Käfig über ein Heizkissen und beobachte es über Nacht.
      HINWEIS: Der Injektionsraum sollte idealerweise mit einem biologischen Sicherheitsschrank für die Vektorhandhabung ausgestattet sein. Forscher müssen geeignete persönliche Schutzausrüstung (PSA) tragen, darunter einen Laborkittel, Handschuhe und Augenschutz. Alle Abfälle (z. B. Nadeln, Spritzen und kontaminierte Materialien) müssen gemäß institutionellen und nationalen Vorschriften in Biohazard-Behältern entsorgt werden.

4. Gewebeentnahme, -vorbereitung und -verarbeitung

  1. Zubereitung
    1. Bereiten Sie alle Dissektionsinstrumente und benötigten Lösungen für die Maus-Euthanasie und Gewebeentnahme vor (z. B. Anästhesie, 4% Paraformaldehyd [PFA] in PBS).
    2. Bereite 4 % PFA im Voraus vor, lagere es gefroren und taue es nicht mehr als 24 Stunden vor der Verwendung auf. Stellen Sie sicher, dass die Lösung vor der Infusion gründlich gekühlt ist.
      VORSICHT: PFA ist giftig. Nur in einer Abzugshaube mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (PSA) und Schulung behandeln.
    3. Verabreichen Sie eine tödliche Dosis Pentobarbital (100–200 mg/kg, intraperitoneal), um das Tier zu betäuben. Tiefe Anästhesie durch das Fehlen des Zehenkneifreflexs bestätigen; Wenn der Reflex anhält, verabreichen Sie eine zusätzliche Dosis.
  2. Transkardiale Perfusion
    1. Positionieren und sichern Sie das Tier in der Sektionsvorrichtung. Mit einer Zange heben Sie die Bauchhaut an und machen Sie mit der Schere einen aufsteigenden vertikalen Schnitt (Abbildung 2A, rosa Pfeil).
    2. Heben Sie die oberflächliche Faszie an und machen Sie einen oberen Schnitt, bis die Leber sichtbar ist, um Verletzungen der Bauchorgane zu vermeiden.
    3. Schneiden Sie das Diaphragma horizontal ab und verlängern Sie dann den Schnitt zur Achselhöhle (Abbildung 2A, weißer Pfeil). Reflektieren und festnageln Sie die Brustwand zurück.
    4. Führen Sie eine Perfusionsnadel in die Spitze des linken Ventrikels ein und stellen Sie sicher, dass sie die Ventrikelwand nicht durchdringt. Mache einen kleinen Schnitt im rechten Vorhof mit einer feinen Schere (Abbildung 2B).
    5. Beginnen Sie mit der transkardialen Perfusion mit 50 ml eiskaltem 4%-Paraformaldehyd (PFA) bei einer Durchflussrate von 1–2 mL/min.
      HINWEIS: Oft verursacht die kalte Lösung das Krümmen des Schwanzes und Muskelzuckungen, was ein Indikator für eine gute Durchfluss ist.
  3. Gehirndissektion
    1. Bereiten Sie ein Rohr vor, das ausreichend PFA 4 % enthält, um das Gehirn vollständig zu untertauchen. Köpfe die Maus mit einer großen Schere. Entsorgen Sie die Leiche in einem versiegelten Biohazard-Beutel zur Verbrennung.
    2. Reflektiere die Kopfhaut, um den Schädel freizulegen. Identifizieren Sie das Foramen magnum und beginnen Sie, den Schädel durch seitliches Schneiden mit einer feinen Schere parallel zum Gehirn zu entfernen (Abbildung 2C).
    3. Wiederhole das auf der kontralateralen Seite und schneide dann den Schädel zwischen den Augen oberhalb der Riechzübeln.
    4. Heben Sie den Schädel vom Kleinhirn in Richtung der Riechkolben, um das Gehirn freizulegen. Mit einem Pfannenwender wird das Gehirn vorsichtig von hinten nach vorne entfernt und in 4 % PFA nicht länger als 24 Stunden bei 4 °C eingetaucht.
    5. Ersetzen Sie die Einbettungslösung durch 20%-30% Saccharose in PBS und inkubieren Sie bei 4 °C, bis die Infiltration abgeschlossen ist. Das Gehirn schwebt zunächst und sinkt dann, sobald es vollständig infiltriert ist, typischerweise innerhalb von 24 Stunden. Wenn sie schwimmen bleibt, verlängern Sie die Brutzeit, bis sie sich am Boden des Rohrs absetzt.
      HINWEIS: Dieser Kryoschutzschritt minimiert Gefrierartefakte, indem der Wassergehalt des Gewebes reduziert wird.
      Trockne das Gehirn und den Schlauch vorsichtig und lagere dann bei -80 °C bis zum weiteren Gebrauch.
  4. Kryosektion und frei schwebende Gewebeentnahme
    1. Vor dem Schneiden stellen Sie den Kryostat auf -20 °C und die gewünschte Dicke ein.
      HINWEIS: Für das Striatum bieten koronale Schnitte mit einer Dicke von 20–25 μm einen idealen Kompromiss zwischen struktureller Erhaltung und Antikörperpenetration und erzeugen Schnitte, die robust genug für die Handhabung sind, während sie eine hohe Färbungsqualität und räumliche Auflösung erhalten. Kryosektionsbedingungen sollten auch für andere Hirnregionen festgelegt werden, da die optimale Dicke je nach Zytoarchitektur variieren kann. Für das Kleinhirn werden sagittale Schnitte von 25–35 μm in der Regel empfohlen, da diese Dicke die geschichtete Organisation des kleinhirnkortex bewahrt.
    2. Transportiere das Gehirn auf Trockeneis und lasse es im Kryostat für 5–10 Minuten im Gleichgewicht bleiben. Dieser Schritt ist wichtig, um Gewebeschäden zu verhindern.
    3. Entfernen Sie die Riechzlöken mit einem Skalpell; Sie sollten weich und leicht zu schneiden sein. Tragen Sie einen erbsengroßen Tropfen frischen O.C.T. auf die Probenscheibe auf und bringen Sie das Kleinhirn in Kontakt (Abbildung 1D). Positioniere das Gehirn für die Koronalschnitte. Sobald es eingefroren ist, fügen Sie zusätzliches O.C.T. hinzu, um das gesamte Gehirn einzubetten.
      HINWEIS: O.C.T. ist bei Raumtemperatur transparent und wird bei vollständigem Gefrieren undurchsichtig weiß; Wenn es glänzend bleibt, lasse mehr Einfrierzeit im Kryostat ein.
    4. Setzen Sie die Probenscheibe im Halter an und schneiden Sie zu, bis das Striatum (zwei weiße Kreise in jeder Hemisphäre) sichtbar ist. Wenn die Hemisphären unterschiedliche Behandlungen erhalten haben, sollte eine Hemisphäre mit einer Nadel durchbohrt werden, um die Ausrichtung zu erhalten. Nehmen Sie dies für eine spätere Analyse auf.
    5. Wechseln Sie in den Schnittmodus und sammeln Sie frei schwebende Abschnitte in einer 48-Loch-Platte mit einem feinen Pinsel oder einer feuerpolierten Glas-Pasteur-Pipette.
      HINWEIS: Die frei schwebende Methode verbessert die Antikörperpenetration, reduziert den Hintergrund, ermöglicht Langzeitlagerung und sorgt für gleichmäßig verteilte Abschnitte für eine vollständige striatale Abdeckung.
    6. Füllen Sie die Brunnen mit PBS, das 0,05 % Natriumazid enthält.
      VORSICHT: Natriumazid ist giftig – mit PSA umgehen und Abfälle ordnungsgemäß entsorgen.
    7. Platziere den ersten Abschnitt in Brunnen A1, den zweiten in A2 und fahre fort nacheinander weiter. Wenn die Platte voll ist, setzt man entweder eine neue Platte fort oder kehrt zum Bohrloch A1 zurück und fährt fort, bis das gesamte Striatum durchschnitten ist (~3 volle Platten mit 48 Bohrlöchern). Versiegeln Sie die Platten mit transparenter Folie und lagern Sie sie bis zur Anwendung bei 4 °C.
      HINWEIS: Für die Analyse des gesamten Striatums ergibt das Auswählen einer Spalte aus der Platte gleichmäßig verteilte Abschnitte, die die gesamte Region repräsentieren.

5. Immunhistochemie mit DAB-Färbung

  1. Wasche Abschnitte dreimal in PBS, um restliche Natriumazid zu entfernen. Inkubieren Sie in Phenylhydrazinlösung (0,2 - 0,3 mg/ml in PBS) für 30 Minuten bei 37 °C.
    VORSICHT: Phenylhydrazin ist krebserregend – führen Sie diesen Schritt in einer Abzugshaube durch und entsorgen Sie Abfälle als gefährlich.
  2. Wasche 3-mal in PBS für 5 Minuten, 10 Minuten und 10 Minuten nacheinander. Blockieren Sie das Gewebe für 1 Stunde bei RT in PBS, das 10 % normales Ziegenserum (NGS) und 0,1 % Triton X-100 enthält.
  3. Inkubieren Sie über Nacht bei 4 °C mit primärem Antikörper in der empfohlenen Verdünnung (z. B. Maus-Anti-Ataxin-2, 1:1000 in Blocklösung) unter sanfter Rührung. Wasche 3-mal in PBS für 5 Minuten, 10 Minuten und 10 Minuten nacheinander.
  4. Inkubieren mit biotinyliertem sekundären Antikörper (1:200 in Blocklösung) für 2 Stunden bei RT unter sanfter Bewegung. Wasche 3-mal in PBS für 5 Minuten, 10 Minuten und 10 Minuten nacheinander.
  5. Im ABC-Komplex 30–40 Minuten bei RT inkubieren. 3-mal in PBS für 5 Minuten, 10 Minuten und 10 Minuten nacheinander waschen.
  6. DAB-Lösung frisch vorbereiten: für 2,5 ml ultrareines Wasser, 1 Tropfen Puffer und Vortex hinzufügen; 2 Tropfen, DAB und Vortex hinzufügen; 1 Tropfen H₂O₂ hinzufügen und erneut vortexen.
    VORSICHT: DAB ist krebserregend – im Abzugshaub behandeln und Abfälle ordnungsgemäß entsorgen.
  7. Entwickeln Sie einzeln Schnitte in DAB-Lösung, bis die gewünschte Färbungsintensität erreicht ist (typischerweise 1–10 Minuten). Stoppen Sie die Reaktion sofort, indem Sie auf PBS umsteigen.
    HINWEIS: Die DAB-Reaktivität nimmt mit der Zeit ab; Arbeiten Sie effizient. Wenn sich mehr als ein Abschnitt gleichzeitig im Brunnen befindet, stellen Sie sicher, dass sie keinen Kontakt haben, da dies den Färbungsprozess beeinflusst.
  8. Wasche 3-mal in PBS für 5 Minuten, 10 Minuten und 10 Minuten nacheinander. Montiere Abschnitte auf gelatinebeschichtete Objektträger und lasse sie vollständig trocknen. Beschriften Sie Dias nicht mit einem Graphitstift, da dies die Bildgebung beeinträchtigen kann.
  9. Dehydrieren, klar machen und wie folgt dehydrieren: 30 Sekunden in destilliertes Wasser eintauchen, durch Ethanolserie dehydrieren: 75 %, 96 %, 100 % (jeweils 3 Minuten). 5 Minuten lang in Xylen klären und an der Luft trocknen. Tragen Sie den Deckmantel mit einem schnell härtenden Montagemedium auf und lassen Sie ihn mindestens 24 Stunden im Dampfhaube aushärten, bevor Sie die Bildgebung oder Lagerung durchführen.

6. Quantifizierung des DARPP-32-depleierten Volumens im Mausstriatum mittels FIJI (ImageJ)

  1. Bildaufnahme
    1. Aufnahmen von koronalen Gehirnabschnitten, die das gesamte Striatum umfassen (etwa Bregma +1,0 bis –0,5 mm). Halten Sie konstante Beleuchtung, Vergrößerung (z. B. 10x) und Auflösung aufrecht. Speichern Sie Bilder im TIFF-Format mit aufeinanderfolgenden Dateinamen (z. B. Striatum_Bregma_+0.5.tif).
  2. Bildvorbereitung in FIJI
    1. Öffnen Sie jedes Bild in FIJI. Kalibriere die Pixelgröße: Gehe zu Analysieren > Set-Skala. Verwenden Sie eine bekannte Skala eines Mikrometers oder der Bildmetadaten (z. B. 1 Pixel = 1 μm).
    2. Bilder in 8-Bit umwandeln: Bild > Typ > 8-Bit. Passen Sie Helligkeit/Kontrast bei Bedarf an, um die erschöpfte Fläche optimal zu visualisieren (vermeiden Sie das Schwellenwert in diesem Schritt).
  3. ROI-Auswahl erschöpfter Bereiche
    1. Verwenden Sie das Polygon-, Freihand- oder Pinselwerkzeug, um die durch DARPP-32 abgeschwächte Region umreinigt (meist leichtere oder keine Verfärbungen im Striatum). Gehen Sie zu Analyze > Measure , um die Fläche in μm2 zu erfassen.
    2. Speichere den ROI, indem du zum ROI-Manager gehst, > mehr hinzufüge > mehr > speichere oder die Multi-Measure-Funktion für die Batch-Analyse verwendest.
    3. Wiederhole das für alle relevanten Gehirnabschnitte.
  4. Berechnung des erschöpften Volumens
    1. Multiplizieren Sie die erschöpfte Fläche in jedem Abschnitt mit dem Abstand zwischen den Schnitten (typischerweise 120 – 240 μm, abhängig von Schnittdicke und Abstand).
      Volumen pro Abschnitt (mm3) = Erschöpfte Fläche (mm2) × Schnittintervall (mm)
    2. Summiere das Volumen über alle Abschnitte hinweg:
      Gesamtvolumen (mm3) = Σ (Fläche × Intervall)
    3. Optional: Überlagerung zur Visualisierung. Verwenden Sie Image > Overlay > From ROI, um die erschöpften Bereiche über Abschnitte hinweg zu visualisieren. Exportiere ein zusammenfassendes Bild oder eine Animation für Figuren.
  5. Überprüfe immer die Ausrichtung mit dem Maus-Gehirnatlas für eine genaue rostro-kaudale Kartierung. Analysieren Sie jede Hemisphäre einzeln, um einseitige Effekte zu unterscheiden (z. B. WT vs. mutierte Injektion).

7. Quantifizierung von Proteinaggregaten im Maus-Striatum

  1. Manuelle Quantifizierung mit FIJI
    1. Laden und kalibrieren Sie das Bild. Öffnen Sie das Bild in FIJI. Kalibriere die Pixelgröße (überspringe diesen Schritt, wenn Bilder mit Metadaten verwendet werden).
    2. Gehe zu Analysieren > Set-Skala und gib die bekannte Entfernung ein (z. B. 1 Pixel = 0,5 μm). In FIJI gehe zu Plugins > Analyze > Cell Counter > Cell Counter. Klicken Sie auf Initialisieren und wählen Sie das Bild aus.
    3. Wählen Sie einen Markertyp (z. B. Typ 1) für Aggregate. Klicken Sie manuell auf jedes sichtbare Aggregat, um es zu beschriften. Datensatzdaten: FIJI zeigt die Zählung im Zellzähler-Panel an. Zähle die Datensätze für jedes Bild/jeden Abschnitt. Exportiere Zählungen manuell oder benutze ein Makro, um Ergebnisse zu kompilieren.
  2. Halbautomatisierte Quantifizierung mit IHCAggreCount
    1. Laden Sie Bilder hoch und verarbeiten. Öffnen Sie IHCAggreCount und klicken Sie auf Bild hochladen (ergänzende Abbildung 1).
      HINWEIS: Die Anwendung IHCAggreCount wurde von unserem Labor als eigenständiges wissenschaftliches Werkzeug entwickelt, das die Quantifizierung von Zellaggregaten aus Mikroskopiebildern straffen und standardisieren soll. Die Software wurde vollständig in Python mit einer modularen Architektur entwickelt, die Bildverarbeitung, Auswahlkorrekturen, Messberechnungen und andere Bereiche trennt. IHCAggreCount ist vollständig kompatibel mit Windows 10 und Windows 11 sowie macOS 13 Ventura und macOS 14 Sonoma und wurde auf beiden Plattformen erfolgreich getestet. Im Vergleich zu herkömmlichen manuellen Bildinspektionsmethoden bietet die Software erhebliche analytische Vorteile: Sie reduziert die Subjektivität der Nutzer, eliminiert sich wiederholende manuelle Schritte, beschleunigt die Bildverarbeitung, stellt reproduzierbare Messungen sicher, ermöglicht eine konsistente Extraherung des Interessensbereichs und ermöglicht die Batch-Verarbeitung mehrerer Umgebungen. Insgesamt bietet die Anwendung einen schnelleren, objektiveren und robusteren Workflow zur Globule-Erkennung und -Quantifizierung als der traditionelle manuelle Ansatz. Der Antrag ist bei den Autoren auf angemessene Anfrage verfügbar.
    2. Das Bild erscheint im Originalbild-Display. Navigieren Sie zum Verarbeitungsreiter. Wenden Sie HiLo an, um Aggregate/Hintergrundkontrast zu verbessern (siehe ergänzende Abbildung 2). Wenden Sie eine Helligkeitsschwelle an, um Aggregate aus dem Hintergrund zu filtern (ergänzende Abbildung 3). Verwenden Sie den Min-Size-Filter, um kleine Partikel (Rauschen) zu entfernen (ergänzende Abbildung 4). Wenden Sie optional die Rundheitsschwelle an, um nicht-aggregierte Formen auszuschließen (ergänzende Abbildung 5).
    3. Für die IHC-Aggregaterkennung gehen Sie zum Reiter Allgemeine und klicken Sie auf Gesamtaggregate berechnen und aggregierte Fläche berechnen. Alle erkannten Aggregate werden in der Matrixtabelle hervorgehoben und aufgeführt (ID, Fläche, mittlere Größe; ergänzende Abbildung 6).
  3. Manuelle Korrekturen (optional)
    1. Gehe zum Korrektur-Tab und nutze Smart Add, um Aggregate in ausgewählten Regionen automatisch zu erkennen (ergänzende Abbildung 8). Nutze manuelles Hinzufügen, um Aggregate manuell zu beschriften. Verwenden Sie Smart Delete, um unerwünschte Etiketten zu entfernen. (Markierte Aggregate werden zur visuellen Inspektion angezeigt; ergänzende Abbildung 7).
  4. Exportieren von Ergebnissen
    1. Klicken Sie auf CSV exportieren , um die aktuellen Bilddaten zu exportieren. Klicken Sie auf Alles exportieren , um Daten aus mehreren analysierten Bildern im Batch zu exportieren. Analysieren Sie Bilder immer unter denselben Helligkeits-/Kontrasteinstellungen und anderen Parametern (z. B. Schwellenwert) in experimentellen Gruppen in IHCAggreCount.

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Ergebnisse

Diese Studie identifizierte erfolgreich die Expression von Ataxin-2 und DARPP-32 mit dem aktuellen Protokoll. Nach der stereotaxischen Injektion von lentiviralen Vektoren in das Striatum von C57BL/6J-Mäusen wurde nach 12 Wochen eine robuste Expression sowohl von Wildtyp- als auch von mutantem Ataxin-2 nachgewiesen. Wir haben zuvor12 gezeigt, dass diese Konstrukte neuronspezifisch sind und effektiv durchschnittlich 20.000 Neuronen pro Millimeter3

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Diskussion

Dieser Artikel beschreibt die Erstellung eines striatalen lentiviralen Mausmodells für ein polyQ SCA. Es beschreibt außerdem die Produktion von hoch-titer lentiviralen Vektoren, die den Wildtyp und die erweiterte Form des kausalen Proteins codieren, sowie die bilaterale Injektion der LVs in das Mausstriatum durch stereotaxische Chirurgie. Darüber hinaus beschreibt er das Verfahren zur Gehirnsammlung, die histologische Verarbeitung und die bildbasierte Quantifizierung von Krankhe...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.

Danksagungen

Das Labor von Clévio Nóbrega wird vom Cure CSB-Projekt, von der Viljem Julijan Association for Children with Rare Diseases (Slowenien) und vom Algarve Biomedical Center Research Institute (ABC-Ri) finanziert. Einige der Autoren dieses Artikels haben ein Promotionsstipendium, das von der Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT) finanziert wird, mit folgenden Referenzen: Tiago Moreira-Gomes (2022.11008.BD), Inês T Afonso (2022.10161.BD) und Rafael G Costa (2022). 11973.BD).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,9% NaClLokaler Lieferant—Verwendet für die Herstellung von Anästhesie- und Antagonisten-Mischungen
100 mm GewebekulturschalenSPL Life Sciences11090
ABC-Kit (Avidin-Biotin-Komplex)VECTASTAIN Elite
Atipamezole (5,0 mg/ml)Lokaler Lieferant—Antagonist von Medetomidin
Tischzentrifuge--
Biosicherheitsschrank, Klasse II (BSL-2 konform)--
Biotinylierter Sekundärantikörper--
Bovines Serumalbumin (BSA)NZYTechMB47002
Hirnschnitte (z. B. 30–40 µm koronales Schnitte) immungefärbt für DARPP-32--
Cell Counter-Plugin (FIJI)Eingebaut / ImageJ—Tool für manuelle Aggregatenzählung
CO2-Inkubator (37 °C, 5% CO2, befeuchtet)--
ComputerarbeitsplatzLokaler Lieferant—Verwendet für Bildverarbeitung und Softwareausführung
Konische UltrazentrifugenniereBeckman Coulter358126
WattestäbchenLokaler Lieferant—Verwendet für Periosteum-Entfernung
Kryostat mit Probenhalter-Scheiben--
DAB (Diaminobenzidin)--
Digitaler stereotaktischer KoordinatenleserStoelting/WPI51725Digitale Anzeige zur Koordinatenmessung
Dulbecco's Modifiziertes Eagle Medium (DMEM, hohe Glukose)Gibco/Thermo Fisher11-965-092
Ethanol 70, 96 und 100%--
Ethanol, 70%Lokaler Lieferant—Für Kopfhautdesinfektion
Fentanyl (0,05 mg/ml)Lokaler Lieferant—Anästhetische Komponente
Fetales bovines Serum (FBS), hitzeinaktiviertGibco/Thermo Fisher10500064
FIJI (ImageJ-Distribution)NIH / ImageJhttps://fiji.sc/Open-Source-Software für manuelle Quantifizierung von Aggregaten
Feinzange (für Zehenkniffen)Lokaler Lieferant—Für Anästhesie-Tiefenüberwachung
Flumazenil (0,1 mg/ml)Lokaler Lieferant—Antagonist von Midazolam
Zange und SkalpellLokaler Lieferant—Für Periosteum-Entfernung und Schädelexposition
Hamilton 700/1700 Serie Mikroliter/Gasdichte SpritzenHamilton / Fisher Sci.7653-01/10550203Für Viruslösungsladung
Hamilton Kleine Hub-Abnehmbare Nadeln (26G)Hamilton / Fisher Sci.7804-03/ 10698205Für Viruszufuhr
Heizkissen (für Nagetiere)Kent Scientific / SOMNIz. B. 04-777-177Zum Aufrechterhalten der Körpertemperatur
HEK 293T-Zellen (≤ Passage 10, mykoplasmafrei)ATCC oder ÄquivalentCRL-3216
Wasserstoffperoxid--
IHCAggreCount-SoftwareWird auf Anfrage bereitgestelltN/AProprietäre Inhouse-Software für halbautomatische Erkennung und Quantifizierung von Aggregaten
Invertiertes Mikroskop (für Zellkonfluenz)--
Laborvortexmischer--
Lentivirale Vektoren (WT und Mutant)Inhouse / KerneinrichtungN/AViruslösung für Injektion
L-Glutamin (200 mM)Gibco/Thermo Fisher25030081
Lichtmikroskop mit Kamera (Hellfeld)--
Medetomidin (1,0 mg/ml)Lokaler Lieferant—Anästhetische Komponente
Mikrobohrer (stereotaktisch kompatibel)Stoelting / Lokaler Lieferant—Für Kraniotomie
Mikroinjektionspumpe (z. B. Stoelting)Stoelting/WPI53210Automatisierte Infusionspumpe für Virusinjektionen
Mikropipette (P1000, P200, P10) und Spitzen--
Mikroskopiebilder (IHC-Schnitt)Im Haus erstelltN/AImmunhistochemiebilder zur Analyse
Mikrotom-Klingen (niedriges Profil, Einweg)--
Midazolam (5,0 mg/ml)Lokaler Lieferant—Anästhetische Komponente
Montiermedium--
Naloxon (0,4 mg/ml)Lokaler Lieferant—Antagonist von Fentanyl
Nadelhalter und feine Seziernadeln--
Normales Ziegen-Serum (NGS)--
O.C.T. CompoundTissue-Tek
Ophthalmische Salbe (Bepanthen Augen- und Nasensalbe, 5% Dexpanthenol)Bayer11568-0053Verhindert Hornhauttrocknung während der Operation
Orbitalmischer--
p24 ELISA-KitZeptoMetrix0801111
Parafilm--
Paraformaldehyd (PFA)--
PBS--
PBS ohne Ca2+/Mg2+, pH 7,0Gibco/Thermo Fisher10-010-031
pCMV-dR8.2AddgenePlasmid #12263
Penicillin-Streptomycin (100×)Gibco/Thermo Fisher15140122
Pentobarbital--
Phenylhydrazin--
pMD2.GAddgenePlasmid #12259
Polyethylenimin (PEI), 1 mg/mlPolysciences23966
Primärantikörper--
pRSV-RevAddgenePlas

Referenzen

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Polyglutamin Ataxienlentivirales Modellstereotaktische InjektionAtaxin 2 Expressionneuronale InklusionenMechanismen der Neurodegenerationtherapeutische InterventionenVerlust neuronaler Markerregionspezifische Modelle
Lentiviral-induzierte striatale Pathologie als präklinisches Modell der polyglutamin-spinocerebellären Ataxie
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