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Analyse von stabilen Vitamin-A-Isotoptracern mit LC-MS/MS

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DOI:

10.3791/69558

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30. Dezember 2025

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1Human Nutrition and Exercise Research Centre, Newcastle University, 2Newcastle University Centre for Cancer, 3Fera Science Ltd

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um sowohl isotopisch markierte als auch native Retinoide im menschlichen Plasma mit LC-MS/MS gleichzeitig zu quantifizieren, mit Nachweisgrenzen von 6 fmol auf der Säule. Die Methode beinhaltet ein einfaches Verfahren zur Probenentnahme und eine kurze analytische Laufzeit, was einen hohen Durchsatz der Proben ermöglicht.

Zusammenfassung

Die Retinol-Isotopen-Verdünnungsmethode (RID) schätzt die gesamten Körperspeicher (TBS) von Vitamin A beim Menschen durch stabile Isotopenverdünnung mit dem Vitamin-A-Pool des Körpers. Dafür ist es entscheidend, das Plasma-Isotopenverhältnis von markiertem zu nicht-markiertem Retinol mittels Massenspektrometrie genau und effizient zu bestimmen. Um umfangreiche und zeitaufwändige Extraktions- und/oder Reinigungsverfahren wie präparative HPLC und Derivatisierung zu vermeiden, wird LC-MS/MS eingesetzt, um eine schnelle, sensible und gleichzeitige Analyse markierter und nicht-markierter Retinoide durchzuführen. Die Methode nutzt zwei Detektionsstufen: (i) eine anfängliche Masse/Ladung (m/z) Trennung von Eltern- (Vorläufer-)Ionen, gefolgt von (ii) der Detektion fragmentierter Tochter-(Produkt-)Ionen. Dies führt zu einer hohen Empfindlichkeit, mit Retinol-Nachweisgrenzen bis zu 6 fmol auf der Säule. Trotz der Vorteile der Tandem-Massenspektrometrie ist eine flüssigchromatographische Trennung erforderlich, um Retinol von Retinylestern zu trennen, da die terminalen funktionellen Gruppen während der Ionisation verloren gehen, was zu ähnlichen Fragmentierungsmustern von Eltern (m/z von 269) und Tochterionen führt. Der Artikel beschreibt die Isolierung endogenen und markierten (13C oder 2H) Retinols aus dem Plasma durch Lösungsmittelextraktion, gefolgt von der Quantifizierung mit LC-MS/MS unter atmosphärischem Druck chemischer Ionisation (APCI) im positiven Ionenmodus.

Einleitung

Vitamin A ist ein fettlöslicher Nährstoff, der für die menschliche Gesundheit unerlässlichist 1. Der Vitamin-A-Mangel erhöht die Anfälligkeit für schwere infektiöse Morbidität und Mortalität und wird auf eine globale Prävalenz von 29 % geschätzt, mit höheren Werten in Subsahara-Afrika (48 %) und Südasien (44 %). Die Vitamin-A-Supplementierung ist eine effektive Strategie, um die überschüssige Kindersterblichkeit zu verringern, insbesondere in Hochrisikoregionen wie Subsahara-Afrika. Die Einführung halbjährlicher Vitamin-A-Supplementierung zusammen mit großflächiger Vitamin-A-Aufstockung von Grundnahrungsmitteln und der Verteilung von Mikronährstoffpulvern, die oft über verschiedene öffentliche und private Stellen verwaltet werden, hat jedoch das Potenzial, Menschen einer übermäßigen Vitamin-A-Aufnahme auszusetzen 4,5,6,7,8,9,10 . Daher sollten Biomarker von Vitamin A idealerweise das gesamte Spektrum des Vitamin-A-Status abdecken können, von Mangel bis zur Toxizität. Die Retinol-Isotopen-Verdünnungsmethode (RID) ist derzeit die genaueste indirekte Methode zur Bestimmung der gesamten Vitamin-A-Vorräte beim Menschen 11,12,13 und wurde gegen die hepatischen Vitamin-A-Konzentrationen validiert, die als bester biochemischer Marker für den Vitamin-A-Status 14,15 gelten. Die Methode basiert auf dem Prinzip, dass eine orale Tracer-Dosis stabiles, isotop-markiertes Vitamin A mit nicht markiertem Vitamin A (dem Trace) in austauschbaren Körperpools vermischt wird. Die Messung der Plasma-Retinol-spezifischen Aktivität (d. h. das Verhältnis des markierten Retinol-Tracers zum Gesamtretinol im Plasma (Tracer/Trace im Plasma)) zu einem bestimmten Zeitpunkt nach der Dosierung ermöglicht die Schätzung des Vitamin-A-Status mit einer RID-Gleichung 11,12,13.

Um genaue und präzise Konzentrationen sowohl von Retinol-Tracer als auch von Tracer im Plasma zu bestimmen, wurden verschiedene Methoden angewandt, um stabiles, isotopenmarkiertes Vitamin A zu quantifizieren, darunter Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS), Isotopenverhältnis-Massenspektrometrie (IRMS) und Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS)16,17,18,19,20,21,22. 23,24,25,26. Wichtig ist, dass LC-MS/MS hohe Empfindlichkeit, Spezifität und betriebliche Einfachheit mit der Möglichkeit verbindet, sowohl native als auch markierte Retinole in komplexen Matrizen direkt zu messen. Um zeitaufwändige Probenvorbereitung wie präparative Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) für IRMS oder Derivatisierung für GC-MS zu vermeiden, ist die LC-MS/MS-Analyse eine ideale Wahl, da diese Methode ein einfaches Extraktionsverfahren, sehr niedrige Detektionsgrenzen für stabile Isotope und kurze Laufzeiten(7,18,19) erfordert. Hier präsentieren wir eine aktualisierte LC-MS/MS-Methode mit kürzerer Laufzeit, einfachen Arbeitsabläufen kombiniert mit hoher Sensitivität und Selektivität als äußerst geeignete Methode für die Hochdurchsatzanalyse von Proben aus groß angelegten menschlichen Interventionen und Beobachtungsstudien, bei denen die Bestimmung der Gesamtspeicher von Vitamin A erforderlich ist.

Protokoll

Die Studie wurde vom Research Ethics Board der University of the Philippines, Manila (IRB ID: UPMREB 2016-282-01), dem Institutional Review Board an der UC, Davis (IRB ID: 903681-2) genehmigt und bei ClinicalTrials.gov registriert (ID: NCT03030339). Die Studie wurde vom Ethischen Überprüfungsausschuss der Ghana Health Services (GHS-ERC 012/07/20) genehmigt, und die Studie wurde bei https://clinicaltrials.gov als NCT04632771 registriert.

1. Erstellung interner Standards

  1. Interne Standardlösung: Bereite die innere Lagerlösung mit einer Konzentration von 1 mg/mL Retinylacetat in Ethanol mit 0,1 % butyliertem Hydroxytoluol (BHT; w/v) vor. Teilen Sie die Lagerlösungen in Aliquoten auf und lagern Sie sie bei -80 °C bis zu 3 Monate.
    HINWEIS: Für den internen Standard ist es möglich, entweder nicht markiertes Retinylacetat oder etikettiertes Retinylacetat zu verwenden. Wenn ein nicht markierter Retinylacetat-Standard verwendet wird, ist es entscheidend, dass die Ausgangsauflösung der Retinylacetat- und Retinolspitzen erreicht wird (siehe Abbildung 1).
  2. Interne Standard-Arbeitslösung: Bereiten Sie eine interne Standard-Arbeitslösung vor, indem Sie den Lagerstandard (1 mg/mL) auf 1 μg/mL verdünnen. Zunächst wird 60 μL des Standards mit 300 μL Ethanol verdünnt und anschließend 60 μL dieser Lösung in 10.000 μL Ethanol verdünnt. Für jede Probe werden 20 μL der inneren Standardlösung hinzugefügt, die 20 ng Retinylacetat enthält.
    HINWEIS: Interne Standard-Arbeitslösungen können bis zu einer Woche bei -20 °C gelagert werden.

2. Erstellung von Kalibrierungsstandards

  1. Kalibrierungsstandard: Bereite die Kalibrierungsstandardlösungen mit einer Konzentration von 1 mg/mL Retinol in Ethanol mit 0,1 % BHT (w/v) sowohl für den Tracee als auch für den Tracer vor. Aliquot lagert Lösungen und lagert bis zu 3 Monate bei -80 °C. Verwenden Sie jedes Aliquot nur einmal, um Frost-Tau-Zyklen zu vermeiden.
  2. Kalibrierungsstandard-Arbeitslösung: Nehmen Sie 100 μL der Standardlösung der Kalibrierung heraus und verdünnen Sie mit 10.000 μL Ethanol in einem Volumenkolben. Bestimmen Sie die Konzentration der verdünnten Kalibrierungslösung bei 325 nm in einem Spektrophotometer mit einer Quarz-Cuvette (siehe Tabelle 1 für Details).
  3. Nehmen Sie einen Aliquot des verdünnten Kalibrierungsstandards und passen Sie die Konzentration für den Trace auf 8 μM und für den Tracer auf 2 μM an, wobei 50 % Ethanol und 50 % Acetonitril/dH2O (70:30 (v/v) verwendet werden.
  4. Erstellen Sie doppelte Kalibrierungsstandards bei sieben verschiedenen Konzentrationen mit 50 % Ethanol und 50 % Acetonitril/dH2O (70:30 (v/v)). Wenn 200 μL Plasma extrahiert werden, sollten die Tracer-Kalibrierungsstandards zwischen 6 μM und 0,03 μM liegen, und die Tracer-Kalibrierungsstandards zwischen 0,5 μM und 0,004 μM.
    HINWEIS: Zur genauen Quantifizierung werden isotopisch markierte Retinol- und Retinylester im Plasma mit duplizierten 7-Punkt-Kalibrierungskurven27 quantifiziert. Der höchste Punkt der Kalibrierungskurve (doppelt so hoch wie erwartet die höchste erwartete Konzentration von Tracee und Tracer im Plasma) berücksichtigt den Konzentrationsfaktor des rekonstituierten Extrakts aus dem ursprünglichen Plasmavolumen.

3. Gewinnung von Retinoiden aus dem Plasma

  1. Plasmaproben aus -80 °C Gefrierfach entnehmen und bei Raumtemperatur (ca. 30 Min) auftauen.
  2. Nach dem Auftauen wirbeln Sie jede Probe vortexartig und drehen Sie sich einige Sekunden, um sicherzustellen, dass kein Plasma mehr im Deckel übrig bleibt. Danach legen Sie die Proben auf Eis.
  3. Schalten Sie eine gekühlte Zentrifuge ein und lassen Sie sie auf 4 °C abkühlen. Beschriften Sie 15 mL Glasröhren mit Schraubverschlüssen (Personenidentifikation und Zeitpunkt) und pipettieren Sie 200 μL deionisiertes Wasser (dH2O) in jedes Probenröhrchen.
  4. Aus der internen Standardarbeitslösung pipettiert man 20 μL des internen Standardgemisch in das Glasrohr.
  5. Mit einer Pipette wird 200 μL Plasma in das jeweilige Rohr mit dem internen Standard und dH2O gegeben.
  6. Pipettieren Sie 400 μL Ethanol in jede Probenröhre und wirbeln Sie das Rohr, um das Ethanol mit dem Plasma zu mischen. Nicht vortexen, um zu verhindern, dass Proteinreste an der Glaswand haften.
  7. Für die erste Hexanextraktion geben Sie jedem Rohr 2 ml Hexan und schließen die Rohrdeckel fest.
  8. Setzen Sie die Röhren in einen Orbitalshaker und schütteln Sie sie 30 Minuten lang mit 15.000 U/min. Die Rohre werden in eine gekühlte Zentrifuge übertragen und bei 1.800 x g für 10 Minuten bei 4 °C gedreht.
  9. Mit Glas-Pasteur-Pipetten wird das Überlagerungsmittel auf ein sauberes Set beschrifteter Glasreagenzgläser übertragen. Achten Sie darauf, kein Protein, kein Niederschlag oder Wasser zu übertragen.
  10. Eine zweite Hexan-Extraktion erzeugen, indem Sie weitere 2 ml Hexan zum restlichen Rückstand hinzufügen, die Rohrdeckel fest befestigen und die Röhren in den Orbitalshaker setzen und 15 Minuten mit 15.000 U/min schütteln.
  11. Die Rohre werden in eine gekühlte Zentrifuge übertragen und bei 1.800 x g für 10 Minuten bei 4 °C gedreht. Mit Glas-Pasteur-Pipetten wird das Überstandsmittel jeweils in das Glasreagenzglas übertragen, das das Überstandsmittel der ersten Hexanextraktion (Schritt 3.9) für jede Probe enthält.
  12. Verdampfen Sie das kombinierte Hexan-Extraktionslösungsmittel (erster und zweiter Extraktionssupernatant für jede Probe) unter einem sanften Strom von N2 in einer abgedunkelten Dampfhaube für etwa 30 Minuten. Stellen Sie den Heizblock auf 35 °C ein.
  13. Den getrockneten Rückstand in 50 μL Ethanol wieder suspendieren, kurz vorvertexieren, 50 μL mobile Phase (70:30 Acetonitril/dH2O (v/v)) hinzufügen und erneut vorten.
    HINWEIS: Die Resuspension des getrockneten Rückstandes sollte nur mit 100 μL Ethanol durchgeführt werden, wenn das Ziel ist, Retinylester zu quantifizieren.
  14. Übergabe in beschriftete 0,5 mL Mikrozentrifugenröhren. Zentrifugiere bei 16.900 x g für 5 Minuten.
  15. Übertragen Sie 80 μL des rekonstituierten Rückstands auf bernsteinfarbene HPLC-Phiolen mit 300-μL-Einsätzen. Schließen Sie das Fläschchen sofort ab, um Lösungsmittelverlust durch Verdunstung zu verhindern.
  16. Fülle Glasphiolen in eine Kryobox, beschrifte sie mit dem Studiennamen, dem Extraktionsdatum und den Proben-IDs und lagere sie bis zur Analyse in einem -80 °C Gefrierfach.
    HINWEIS: Die Analyse der gelagerten Proben muss innerhalb von 3–5 Tagen abgeschlossen sein. Ein Plasmavolumen von 200 μL reicht normalerweise aus, um den markierten Vitamin-A-Tracer bis zu 90 Tage nach der Dosis nachzuweisen. Das Plasmavolumen kann jedoch auf 400 μL eingestellt werden, wenn das Verhältnis von Plasma/Wasser/Ethanol bei 1:1:2 beim Volumen gehalten wird.

4. Vorbereitung interner Standardkontrollproben

  1. Stellen Sie die Ethanol-/mobile Phasenlösung vor, indem Sie 120 μL Ethanol in ein Mikrozentrifugenrohr pipettieren und 200 μL (70:30) Acetonitril/dH2O (v/v) hinzufügen und vortexieren.
  2. In drei separate 0,6-mL-Röhren wird 20 μL der internen Standard-Arbeitslösung gepipettiert.
  3. Fügen Sie 80 μL der vorbereiteten Ethanol-/mobilen Phasenlösung hinzu und Wirbel. Übertragen Sie die drei internen Standardkontrollproben auf bernsteinfarbene HPLC-Phiolen mit 300-μL-Einsätzen und schließen Sie die Fläschchen sofort ab, um Lösungsmittelverlust durch Verdunstung zu verhindern.

5. Plasma-Hausstandards

  1. Um die Hausstandardproben vorzubereiten, sollte ausreichend Plasmavolumen erreicht werden, um eine Analyse von mindestens drei Proben pro Analyselauf zu ermöglichen. Das insgesamt benötigte Plasmavolumen wird durch die Anzahl der zu analysierenden Proben bestimmt.
  2. Aliquot lagert Standardplasma in kleinen Kryovialen in den für jeden analytischen Lauf benötigten Volumen und speichert bei -80 °C.
    HINWEIS: Es ist entscheidend, dass der Hausstandard den isotopen-markierten Retinol-Tracer enthält, der in den unbekannten Proben verwendet wird. Ausreichend Material kann gewonnen werden, indem freiwillige Proben zu einem Aliquot zusammengelegt werden.
  3. Entnehmen Sie mindestens drei Plasmahaus-Standardproben für jeden analytischen Durchlauf mit demselben Volumen wie unbekannte Plasmaproben, wie in Schritt 3.
  4. Platziere die Plasmahaus-Standards im gesamten Probenregal mit mindestens 10 unbekannten Plasmaproben dazwischen. Verwenden Sie Plasma-Hausstandards, um intra- und inter-day-Variationen zu berechnen.

6. Externe Standardbeispiele

  1. Besorge zertifizierte externe Standardproben und lagere bei -80 °C. Ein weit verbreiteter zertifizierter externer Standard ist der NIST Standard Reference Material SRM 968.
  2. Entnehmen Sie pro Analyse mindestens vier externe Standardproben aus Plasma mit demselben Volumen wie unbekannte Plasmaproben mit Schritt 3. Verwenden Sie externe Standardproben, um die Genauigkeit der erhaltenen Ergebnisse zu überprüfen.

7. Manuelle Verbundoptimierung

  1. Stellen Sie sicher, dass die APCI Heated Nebulizer-Sonde im MS-Quellgehäuse installiert ist. Bereite die Infusionslösung für jeden stabilen Isotop-Tracer bei etwa 1 μg/mL vor.
    HINWEIS: Die Lösung sollte der mobilen Phase ähneln und etwas Säure für die Protonation enthalten. Ein gutes Lösungsmittel wäre 1:1 Acetonitril/dH2O mit 0,1 % Ameisensäure (v/v).
  2. Füllen Sie eine 1 ml Luer-Lock Hamilton-Spritze mit der Infusionslösung und verbinden Sie die Spritze dann mit einem PEEK-Schlauch über die Erdungsverbindung an die Quelle. Stellen Sie den Infusionsdurchfluss auf 10 μL/s ein.
  3. Wählen Sie manuelles Stimmen und stellen Sie sicher, dass das Instrument im Stimmungs- und Kalibrierungsmodus ist. Starte die Spritzenpumpe und wähle Q1 Scan-Typ im positiven Modus.
  4. Stellen Sie einen niedrigeren Massenbereich von 50 Da und einen oberen Massenbereich etwa 100 Da über der Molekülmasse der Zielverbindung ein.
  5. Zyklen auf 500 einstellen, Scanrate 200 Da/s. Klicken Sie auf Start und beobachten Sie das Signal im Massenspektrumfenster.
  6. Warte, bis sich das Signal stabilisiert, und prüfe dann, ob die erwarteten m/z-Spitzen auftreten. Betrachten wir die [M+H]+ und [M+2H]2+ Spitzen, da der MS im positiven Modus ist.
  7. Die Ziel-Gipfelhöhe sollte etwa 1e6 betragen. Der gesamte Ionenstrom (TIC) sollte 1e7-1e9 betragen. Infuzieren Sie weiter, bis das Signal stabil ist, und klicken Sie dann auf Stopp. Es sollte einen deutlichen Peak mit hoher Intensität geben, der aus der Verbindung in der Infusionslösung gebildet wird. Der Gesamtionenstrom (TIC) wird angezeigt, der das Gesamtsignal aller Ionen zusammen darstellt.
    HINWEIS: Die erwartete Masse von 12C Retinol beträgt 269 Da, daher ist ein Bereich von 50-300 Da geeignet, um [M+H]+ und [M+2H]2+ Ionen darzustellen.

8. Produktionen-(MS2)-Scan / CE-Spektrenprüfung

  1. Stelle die Startmasse auf eine niedrigere Masse ein, z. B. 50 Da, und die Stopp-Masse knapp über der Q1-Masse (z. B. 269,1 für 12C Retinol). Setze Zyklen auf 5 und ändere die Kollisionsenergie (CE) auf 10. Überprüfe die Q1-Masse als Vorläuferion. Wenn keine kleineren Fragmente erscheinen, erhöhe CE auf 20.
  2. Mit steigender CE werden mehr Produktionen gebildet. Erhöhe weiter CE, bis das Vorläufer-Ion rechts im Spektrum vollständig verschwunden ist. Erhöhen Sie die CE noch weiter, um potenzielle sekundäre Fragmentierung zu sehen.

9. MRM-Scan

  1. Aus dem MS2-Scan wählen Sie die drei am häufigsten vorhandenen oder am besten geeigneten Produktionen aus, die für weitere Optimierung übernommen werden.
  2. Für jedes Produktion geben Sie die Q1-Masse (Vorläufer) und die gefundenen Q3-(Produkt-)Massen ein. Stelle die Verweilzeit auf 200 ms. Benennen Sie jedes Fragment entsprechend (z. B. 12C_Frag_93).
  3. Wählen Sie die Kollisionsenergie und identifizieren Sie den optimalen CE-Wert mithilfe der Rampenfunktion. Befülle die CE-Spalte mit dem optimierten CE-Wert für jedes Fragment.
  4. Optimieren Sie das Declustering-Potenzial (DP), optimiert nach der Optimierung der CE, um isobare Interferenzen zu minimieren. Optimieren Sie das Collision Cell Exit Potential (CXP) jeweils für einen Übergang.

10. Quelle-/Gasoptimierung

  1. Diese Parameter können nicht automatisch optimiert werden. Wenn Sie die Signalintensität verbessern müssen, führen Sie einen manuellen Optimierungsprozess durch. Ändere jeweils einen Parameter und vergleiche, ob das Signal zugenommen, gleich geblieben oder abgenommen hat.

11. Bedingungen der Flüssigkeitschromatographie

  1. Für die Chromatographie verwenden Sie einen binären mobilen Phasengradienten von 0,1 % (v/v) Ameisensäure in dH2O (A) und 0,1 % (v/v) Ameisensäure in Acetonitril (B).
  2. Je nach verwendetem LC-System wird entweder eine 100 mm x 2,1 mm (3 μm) ABZ PLUS-Säule mit einer 4 mm x 2 mm C18-Patrone (für HPLC) oder eine 100 mm x 2,1 mm (1,7 μm) Premier BEH Shield mit einer RP18 FIT-Säule (für Ultrahochdruckchromatographie (UPLC)) zur Analyse von Retinol verwendet. Halten Sie die Säulen bei einer Temperatur von entweder 40 °C bzw. 50 °C.
  3. Injizieren Sie 10 μL des Plasmaextrakts auf die Säule. Elutieren Sie Analyten mit einer Durchflussrate von 0,4 mL/min. Für HPLC-Systeme beträgt der lineare Gradient: 60 % B bis 95 % B in 6,0 Minuten; 100% B von 6,1 Minuten bis 13,0 Min; 100% B bis 60% B von 13,1 bis 14,0 Min; und 60 % B von 14,0 bis 17,0 Min. Bei UPLC-Systemen hängt der lineare Gradient von der Forschungsfrage ab. Wenn nur Retinol bestimmt werden soll, beträgt der Gefälle: 40 % B auf 60 % B in 1,0 Minuten; 60% B bis 95% B von 1,0 Minuten bis 6,0 Min; 100% B von 6,5 Minuten auf 7,5 Min; 100% B bis 40% B von 7,5 bis 7,6 Min; und 40 % B von 7,6 bis 8,5 Min. Wenn das Ziel ist, Retinylester neben Retinol zu analysieren, beträgt der lineare Gradient: 60 % B bis 95 % B in 3,0 Minuten; 100% B von 3,5 Minuten bis 6,5 Min; 100% B bis 60% B von 6,5 bis 7,0 Min; und 60 % B von 7,0 bis 8,5 Minuten.

12. MS/MS-Bedingungen

  1. Durchführung von MS/MS-Analysen unter chemischer Ionisation (APCI) unter atmosphärischem Druck im positiven Ionenmodus. APCI wird der Elektrosprüh-Ionisation vorgezogen, da sie eine höhere Signalintensität, einen breiteren linearen Bereich bietet und ein geringeresHintergrundrauschen von 26 bietet.
  2. Für die jeweiligen Massenübergänge für [12C] Retinol, [13C10] Retinol und [2H6]Retinol sowie deren jeweilige Ester/Acetat mit ausgewählten Reaktionsüberwachungsparametern (SRM) für das API4000 und das QTRAP 5500 Massenspektrometer siehe Tabelle 2, Tabelle 3 und Abbildung 2.
    HINWEIS: Die ausgewählte Ionenüberwachung für Retinol, Retinylester und Retinylacetat war dasselbe Fragmention von m/z 269 für die APCI-Quantifizierung, da dieses Ion dem Verlust von Wasser, Fettsäure oder Essigsäure aus den protonierten Molekülen entspricht. Da das LC-MS/MS in der Lage ist, die Retinol-Peaks von seinen Estern zu trennen, ermöglicht eine einzige Injektion die Bestimmung der Isotopenanreicherung sowohl im Retinol- als auch im Retinylester-Anteil in einer Probe.

13. Quantifizierung von Retinol

  1. Quantifizieren Sie die Konzentrationen von [12C] Retinol, [2H6] Retinol und [13C10] Retinolproben anhand ihrer jeweiligen Kalibrierungsstandards.
  2. Bestimmen Sie die Extraktionsverluste mithilfe der Rückgewinnung der internen Standardkonzentrationen jeder Probe gegen die internen Standardkontrollproben.
  3. Führen Sie die Bestätigung der Plasmaretinolkonzentrationen mit dem Standardreferenzmaterial (SRM) 968 des National Institute of Standards and Technology (NIST) durch.

Ergebnisse

Um die Wirksamkeit der analytischen Methode zur Analyse stabiler, isotopenmarkierter Retinol in verschiedenen chromatographischen Systemen zu veranschaulichen, präsentieren wir Ergebnisse aus zwei verschiedenen Studien.

Für die Verwendung des API4000 mit voranfangs-HPLC wurden Plasmaproben von 111 philippinischen Kindern im Alter von 12 bis 18 Monaten, die am Tag 0 eine orale Dosis von 400 μg (1,17μmol) [13 C10] Retinylacetat erhielten, gefolgt von einer 6-ml-Blutprobenentnahme 4 Tage nach der Dosis, analysiert 7,28. Die mittlere Gesamtretinolkonzentration im Plasma betrug 1,1 μmol/L, und der mittlere [13C10] Retinol lag bei 0,007 μmol/L. Da der Hintergrundrauschpegel innerhalb des Übergangs m/z 279 zu 100 eine durchschnittliche Spitzenspitze von ~50 cps hatte (Abbildung 1), wurden das Erkennungsniveau (LOD) und die Quantifizierung (LOQ) für [13C10] Retinol auf 150 cps und 500 cps festgelegt, entsprechend 6 fmol bzw. 19 fmol auf der Säule. Da eine gute Ausgangsauflösung zwischen dem [12C] Retinol und dem angewandten internen Standard von Retinylacetat erzielt wurde, bestand keine Notwendigkeit, ein stabiles, isotop-markiertes Retinylacetat zu verwenden.

Eine schnellere chromatografische Trennung kann mit UPLC in Kombination mit dem QTRAP 5500 erreicht werden, mit Betriebszeiten unter 10 Minuten. Je nach Forschungsfrage können zwei verschiedene Trennmethoden angewendet werden; (i) wenn das Ziel ist, natives und isotop-markiertes Retinol mit einem nicht markierten internen Standard von Retinylacetat zu bestimmen, sorgen die Retentionszeiten zwischen Retinol (4,37 Min) und Retinylacetat (5,33 Min) für eine gute Ausgangslinie (Abbildung 3); (ii) Wenn das Ziel ist, natives und isotop-gekennzeichnetes Retinol neben nativen und markierten Retinylestern zu trennen, kann eine gute Trennung innerhalb eines 8,5-minütigen Laufs erreicht werden (Abbildung 4). Aufgrund der engen Retentionszeiten zwischen Retinol (2,10 Min) und Retinylacetat (2,43 Min) ist es jedoch ratsam, isotopisch markiertes Retinylacetat ([2H4] Retinylacetat) stattdessen zu verwenden. In diesem Beispiel wurden Serumproben von 80 ghanaischen Frauen im gebärfähigen Alter analysiert, die eine 2 mg Retinol-Äquivalentdosis von [2H6] Retinylacetat erhielten, gefolgt von einer Blutprobenentnahme 21 Tage nach der Dosis. Die mittleren Serum-Gesamtretinolkonzentrationen betrugen 1,89 μmol/L, mit einem durchschnittlichen [2H6] Retinol bei 0,027 μmol/L und im Mittelwert [13C10] Retinol bei 0,025 μmol/L.

Die vorgestellte Methode erreichte einen niedrigen Nachweisgrad (LOD = 6 fmol; LOQ = 19 fmol auf der Säule), was eine hohe Sensitivität und Spezifität für den Nachweis stabiler, isotopenmarkierter Retinol mit klarer Ausgangsabgrenzung zwischen nativem Retinol und internen Standards zeigt. Darüber hinaus funktionierte die Methode sowohl mit HPLC- als auch mit UPLC-Setups effektiv, trotz Unterschieden in den Aufbewahrungszeiten. Die Verwendung isotopisch markierter interner Standards ([2H4] Retinylacetat) gewährleistete eine genaue Quantifizierung unter schnelleren UPLC-Bedingungen, falls Retinylester bestimmt werden müssen. Die Validierung anhand von NIST-zertifizierten Referenzstandards bestätigte die Genauigkeit, während intraday- und inter-day-Variationskoeffizienten (2,3 % bzw. 4,4 %) hervorragende Präzision und Reproduzierbarkeit zeigten. Eine erfolgreiche Analyse von Plasma-/Serumproben aus zwei unterschiedlichen Populationen (philippinische Kinder und ghanaische Frauen) mit unterschiedlichen Dosierungsprotokollen zeigt Robustheit und praktischen Nutzen in vielfältigen Ernährungsstudien.

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Abbildung 1: LC-MS/MS-Chromatogramm mit dem API4000 Massenspektrometer. Das Chromatogramm von Serumretinol wurde 4 Tage nach oraler Einnahme von 0,4 mg [13C10] Retinylacetat gewonnen. Die ausgewählte Reaktionsüberwachung (SRM) von m/z 269 bis 93 zeigt die Trennung von [12C] Retinol (RT = 5,06 min) und [12C] Retinylacetat (RT = 5,83 min) als internen Standard (IS). Das [13C10] Retinolsignal bei m/z 279 bis 100 überschreitet sowohl den Detektionsgrenzwert (LOD) als auch den Quantitationsgrenzwert (LOQ) ausreichend. Chromatographische Bedingungen: (A) binärer mobiler Phasengradient von 0,1 % (v/v) Ameisensäure in dH2O und (B) 0,1 % (v/v) Ameisensäure in Acetonitril; Durchflussrate von 0,4 mL/min mit einem linearen Gradienten von: 60 % B bis 95 % B in 6,0 Minuten; 100% B von 6,1 Minuten bis 13,0 Min; 100% B bis 60% B von 13,1 bis 14,0 Min; und 60 % B von 14,0 bis 17,0 Min; 100 mm x 2,1 mm (3 μm) ABZ PLUS-Säule, ausgestattet mit einer 4 mm x 2 mm C18-Patrone, die bei 40 °C gehalten wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

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Abbildung 2: APCI-MS/MS-Produkt-Ionenmassespektren. Durchflussinjektions-APCI-MS/MS-Produkt-Ionen-Massenspektren von (A) m/z 269 [12C] Retinol, (B) m/z 273 [2H4] Retinol, (C) m/z 275 [2H6] Retinol und (D) m/z 279 [13C10] Retinol im positiven Ionenmodus. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 3: LC-MS/MS-Chromatogramm mit dem QTRAP 5500-Massenspektrometer. LC-MS/MS-Chromatogramm eines typischen Extrakts aus einem Plasma-Hausstandard, das 21 Tage nach oraler Einnahme von 1,0 mg [2H6] Retinylacetat und 90 d nach oraler Aufnahme von 1,0 mg [13C10] Retinylacetat entnommen wurde. Die ausgewählte Reaktionsüberwachung (SRM) von m/z 269→93 zeigt den [12C] Retinol-Peak (RT = 4,37 min) und Retinylacetat (RT = 5,33 min) als internen Standard (IS); das [2H6] Retinol (RT = 4,36 Min) bei m/z 275→96; und der [13C10] Retinolgipfel (RT = 4,38) bei m/z 279→100. Chromatographische Bedingungen: (A) binärer mobiler Phasengradient von 0,1 % (v/v) Ameisensäure in dH2O und (B) 0,1 % (v/v) Ameisensäure in Acetonitril; Durchflussrate von 0,4 ml/min mit einem linearen Gefälle von: 40 % B bis 60 % B in 1,0 Minuten; 60% B bis 95% B von 1,0 Minuten bis 6,0 Min; 100% B von 6,5 Minuten auf 7,5 Min; 100% B bis 40% B von 7,5 bis 7,6 Min; und 40 % B von 7,6 bis 8,5 Min; 100 mm x 2,1 mm (1,7 μm) AcquityTM Premier BEH Shield RP18 VanGuard FIT-Säule, gehalten bei 50°C. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 4: LC-MS/MS-Chromatogramm von Retinol und Retinylestern mit dem QTRAP 5500-Massenspektrometer. LC-MS/MS-Chromatogramm eines typischen Extrakts aus einem Plasmahaus-Standard, das 6 Stunden nach oraler Einnahme von 1,0 mg [2H6] Retinylacetat und 90 Tage nach oraler Einnahme von 1,0 mg [13C10] Retinylacetat entnommen wurde. Die ausgewählte Reaktionsüberwachung (SRM) von m/z 269→93 zeigt den [12C]-Retinol-Peak (RT = 2,10 Min); das [2H4]Retinylacetat bei m/z 273→94 (RT = 2,43 min) als interner Standard (IS); die Trennung von [2H6]-Retinol (RT = 2,09 Min) und [2H6]Retinylpalmitat (RT = 5,11 Min) erreicht ihren Höhepunkt bei m/z 275→96; und der [13C10]Retinol-Peak (RT = 2,10) bei m/z 279→100. Chromatographische Bedingungen: (A) binärer mobiler Phasengradient von 0,1 % (v/v) Ameisensäure in dH2O und (B) 0,1 % (v/v) Ameisensäure in Acetonitril; Durchflussrate von 0,4 ml/min mit einem linearen Gefälle von: 60 % B bis 95 % B in 3,0 Minuten; 100% B von 3,5 Minuten bis 6,5 Min; 100% B bis 60% B von 6,5 bis 7,0 Min; und 60 % B von 7,0 bis 8,5 Minuten; 100 mm x 2,1 mm (1,7 μm) AcquityTM Premier BEH Shield RP18 VanGuard FIT-Säule, gehalten bei 50 °C. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Parameter
Molare Absorptivität (ɛ) von Retinol in Ethanol:52.770 M-1 cm-1
Verdünnungsfaktor:100 (100μL Serienkalibrierungsstandard in 10 mL Ethanol)
Gemessene durchschnittliche Absorption:0.575
Berechnung
Konzentration (mol) von [12C] Retinol im Ethanol:Konzentration (mol) = Absorption / ɛ x Länge der Cuvette
= 0,575 / 52770 M-1 cm-1 x 1 cm = 1,09 x 10-5 M
Korrektur für Verdünnung:1,09 x 10-5 M x 100 = 1,09 x 10-3 M oder 1,09 mM

Tabelle 1: Bestimmung der Konzentration des Kalibrierungsstandards für Retinol.

AnalyteMRM-Übergänge (m/z)Declustering-Potential (V)Eintrittspotenzial (V)Kollisionsenergie (eV)Kollisionsaustrittspotenzial (V)
[12C]-Retinol/Ester269→935110276
[2H4]Retinylacetat273→945110276
[2H6]Retinol/Ester275→965110276
[13C10]-Retinol/Ester279→1004110276

Tabelle 2: Ausgewählte Reaktionsüberwachungsparameter (SRM). Parameter für [12C] Retinol, [13C10] Retinol und [2H6] Retinol sowie deren jeweilige Ester mit der API4000

AnalyteMRM-Übergänge (m/z)Declustering-Potential (V)Eintrittspotenzial (V)Kollisionsenergie (eV)Kollisionsaustrittspotenzial (V)
[12C]-Retinol/Ester269→939410338
[2H4]Retinylacetat273→9454102011
[2H6]Retinol/Ester275→966910253
[13C10]-Retinol/Ester279→10010210359

Tabelle 3: Ausgewählte Reaktionsüberwachungsparameter (SRM). Parameter für [12C] Retinol, [13C10] Retinol und [2H6] Retinol sowie deren jeweilige Ester mit dem QTRAP 5500

Diskussion

Die vorgestellte LC-MS/MS-Methode bietet eine extrem hohe Empfindlichkeit, mit Nachweisgrenzen von nur 6 fmol/L, sodass Forscher bereits 100 bis 200 μL Plasma19 verwenden können. Diese gezielte Tandem-MS-Methode ist besonders wirkungsvoll zur Bestätigung der Identität von Retinoid-Isotopologen, wenn sowohl Quantor- als auch Qualifikationsproduktionen verwendet werden18. Da isotopenmarkierte Retinoide jedoch in deutlich niedrigeren Konzentrationen als physiologisch nicht markierte Retinoide vorhanden sind, können Plasmaproben mit markierten Retinol- und Retinylestern einen zusätzlichen Konzentrationsschritt erfordern. Diese Notwendigkeit hängt von Faktoren wie dem Zeitpunkt der Blutprobe nach der Dosis, der Konzentration des oralen Tracers und der Empfindlichkeit des LC-MS/MS-Systems ab. Historisch gesehen wurden höhere Anwendungsdosen verwendet, um die geringere Empfindlichkeit früherer Massenspektrometer zu überwinden, aber jüngste Fortschritte haben die Verwendung niedrigererDosen 13 erleichtert. In den dargestellten Beispielen erhöht eine höhere orale Dosis den Spiegel des stabilen, mit Isotopen markierten Retinols selbst zu späteren Zeitpunkten, also nach 21 Tagen im Vergleich zu 4 Tagen.

Da die terminalen funktionellen Gruppen der Retinylester während der Ionisation verloren gehen, werden bei Retinol- und Retinylestern dasselbe Eltern-m/z von 269 und ähnliche Tochterionenfragmentierungsmuster beobachtet. Daher ist die chromatographische Trennung entscheidend, um ihre separaten Konzentrationenzu bestimmen 18. Außerdem wird aufgrund der hohen natürlichen Häufigkeit von 13-C-stabilenIsotopen in endogenen Retinol-Isotopolen empfohlen, mehr als drei 13-C-Atomein den Retinol-Tracer einzubauen, um die Notwendigkeit einer Korrektur der natürlichen 13-C-Anreicherungvon Retinol im menschlichen Plasma29 zu vermeiden.

Plasmaproben müssen vor der Isotopenanalyse in zwei Schritten verarbeitet werden. Zuerst müssen Plasmaproben deproteinisiert werden, gefolgt von der Extraktion von Retinol- und Retinylestern mittels eines unpolaren Lösungsmittels, was ein biphasisches System 18,19,20 erzeugt. Obwohl mit dem oben genannten Protokoll eine klare Phasentrennung erzielt wird, ist es entscheidend, dass die Interphase im biphasischen System nicht gestört oder gesammelt wird, da dies die Trocknungszeit verlängert und die Genauigkeit der Analyse verringert. Alternativ hat unsere Gruppe auch die Anwendung eines einphasigen Extraktionsverfahren für Retinoide20 untersucht. Dafür werden 200 μL Plasmaproben in ein 2-mL Kunststoff-Mikrozentrifugenrohr pipettiert, und Retinoide werden mit einer Kombination aus Ethanol und Ethylacetat extrahiert. Die Anwendung dieses Extraktions-Verfahrens ermöglicht die Analyse von Retinol und polareren Retinoiden, wie Retinosäure-Isomeren, mit einer äquivalenten Rückgewinnung im Vergleich zur biphasischen Extraktion und ist auch vergleichbar mit der einstufigen Acetonitril-Extraktionsmethode von Kane und Napoli30.

Da Retinoide bei UV-Licht und Hitze anfällig für Oxidation und Isomerisierung sind, ist es entscheidend, die Analyse so schnell wie möglich durchzuführen, und bei der Sammlung, Handhabung und Lagerung von Plasma30 sollten allgemeine Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden. Traditionelle Methoden zur Analyse stabiler isotopen-markierter Retinoide verwenden zeitaufwändige Isolierung und/oder Derivatisierungen. Die GC-MS-Analyse erfordert die Isolierung des Retinolbruchs aus dem menschlichen Serum mittels Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC), gefolgt von der Derivatisierung von Retinol22. Obwohl eine Derivatierung für GC-C-IRMS nicht erforderlich ist, wird eine vorherige Trennung von Retinol mittels zwei separaten HPLC-Reinigungsschritten empfohlen(17,25,31), und auch die Bestimmung der natürlichen 13-C-Anreicherung von Retinol im menschlichen Plasma in der Stichprobenpopulation ist erforderlich 17,32. Im Gegensatz dazu bietet die vorgestellte LC-MS/MS-Methode mehrere Vorteile. Es vermeidet umfangreiche und zeitaufwändige Extraktions- und/oder Reinigungsverfahren und ermöglicht eine schnelle, empfindliche und gleichzeitige Analyse von Retinylestern und freiem Retinol 16,18,26,32. Darüber hinaus ist die Methode effektiv, da sie eine hohe Genauigkeit mit geringer Variabilität bietet und an verschiedene LC-MS/MS-Systeme anpassbar ist.

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu erklären.

Danksagungen

Unterstützung für diese Arbeit wurde von der Bill & Melinda Gates Foundation (Projektnummer: OPP1115464) und der Internationalen Atomenergie-Organisation (IAEA) in Wien (Projektnummer E4.30.30) bereitgestellt.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Lösungsmittel
Absolute Ethanol-HPLC-QualitätFisher10428671
Acetonitril HPLC-QualitätFisher10660131
Hexan 95 % n-Hexan für HPLC-zertifizierte HPLCFisherH/0406/17
Isopropanol HPLC-QualitätVWR20880.32
Isopropanol HPLC-QualitätVWR20880.32
Methanol 99 % 2,5 LThermowissenschaftlich11367996
Standards/Isotope
All-Trans-RetinolBioXtra95144
RetinylacetatSigmaPHR1236
Stabiles Isotop, das mit Retinol markiert ist:ReseaChem/Buchem BV
Stabiles Isotop, das mit Retinylacetat gekennzeichnet ist:ReseaChem/Buchem BVN/AFür die RID-Methode kann eine Reihe stabiler Isotope verwendet werden. Eine Liste verschiedener kommerziell verfügbarer Isotope ist in Tabelle 1 aufgeführt.
Vitamin A  (19,19,19,20,20,20,20-D6)
Vitamin A  (8,9,10,11,12,13,14,15,19,20-13C10)
Vitamin-A-Acetat (10,19,19,19-D4)
Vitamin A-Acetat (19,19,19,20,20,20,20-D6)
Vitamin-A-Acetat (8,9,10,11,12,13,14,15,19,20-13C10)
Ausrüstung
5ml verstellbarer LösungsmittelspenderSigma-AldrichZ627607-1EA
ABI 4000 LC-MS/MS.AB Sciex
Analytische Waage Fisher13592970
Kapillarkolben (Pipettenspitzen) CP100 10x96 TIPACKGilsonFD148314
Kapillarkolben CP250ST 6x96GilsonF148714
Abgasschrank
Microman E M100E Pipette (Verdrängung)GilsonFD10004
Microman E M250E Pipette (Verdrängung)GilsonFD10005
Pipetman P100, 10-100 μr, MetallauswurfGilsonF114057M
Pipetman P1000, 100-1000 μL, MetallauswurfGilsonF114059M
Pipetman P20, 2-20 μL, MetallauswurfGilsonF144056M
QTRAP 5500 LC-MS/MSAB Sciex
Gekühlte Zentrifuge 5810 REppendorf
Sonikierendes WasserbadVWRUSC100T
SpektrophotometerThermo Fisher ScientificA51119600C
Techne-Probekonzentrator und Wärmeblock.VWR
Vibrax VXR Basic ShakerIKA0002819002
Vortex-Mixer; MS3 basic IKAFisherMPR-555-050L
VX2-Reagenzglasaufsatz – werke typ VX2IKA0000568900
Verbrauchsgüter
1,5-ml-MikrozentrifugenröhrenFisherFB74323
100 mm x 2,1 mm (1,7 μ m) AcquityTM Premier BEH Shield RP18 VanGuard FIT-SpalteGewässer186009498
100 mm x 2,1 mm (3 & Mikro; m) Säule Supelcosil ABZ PLUSSupelco57917
1000-μl-PipettenspitzenStarlabS1122-1830
100ml VolumenkolbenFisher11323644Pyrex-Borosilikatglas Klasse A zertifizierter Volumenkolben
200-ul-PipettenspitzenStarlabS1120-8810
4 mm x 2 mm SecurityGuard C18 PatronePhenomenexAJ0-4286
50-ml-VolumetrikFisher11313644Pyrex-Borosilikatglas Klasse A zertifizierter Volumenkolben
9mm bernsteinfarbene Glasphiolen mit EinsätzenFisher11583680
9-mm-Gewindekappen für das FläschchenFisher13206419
Papp-KryoboxStarlabA9623-8181
Hellma Cuvette UV-QuarzSLSCEL1600
Stickstoffgas (höchste Reinheit und sauerstofffrei)BOC
Pasteur-PipetteFisher11546963
Pyrex-Kulturröhren 100x16 mmCorningCLS9944916
Schraubkappen PTFE-Innenfutter 16mmCorningCLS999815
Fläschchenglas-Bernstein 2ml PTFE-KappenFisher11573542
Fläschchenschraubkappe 9 mm Silikonweiß/PTFE rotThermo 13206419

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