Methodenartikel

Intramuskuläre Transplantation von humanen pluripotenten Stammzellen-abgeleiteten endokrinen Zellen der Pankreasbildung bei Mäusen

DOI:

10.3791/69562

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10. April 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Instituto de Investigaciones Biomédicas Sols-Morreale, Consejo Superior de Investigaciones Científicas, Universidad Autónoma de Madrid, 2Centro de Investigación Biomédica en Red de Diabetes y Enfermedades Metabólicas Asociadas CIBERDEM, Instituto de Salud Carlos III

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Wir bieten ein minimalinvasives Protokoll für die intramuskuläre Transplantation von von humanen Stammzellen abgeleiteten Pankreas-Stammzellinseln in immundefiziente Mäuse für die In-vivo-Implantation und nachgelagerte Analyse.

Zusammenfassung

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Humane pluripotente Stammzellen (hPSC)-abgeleitete endokrine Pankreaszellen sind eine vielversprechende Quelle für die Diabeteszelltherapie und Krankheitsmodellierung. Obwohl mehrere Differenzierungsprotokolle etabliert wurden, ist eine In-vivo-Implantation häufig erforderlich, um Reifung und Funktion im physiologischen Kontext zu untersuchen. Die meisten Transplantationsansätze basieren auf Stellen wie der Nierenkapsel oder dem subkutanen Raum, was technische oder physiologische Einschränkungen mit sich bringen kann. Hier präsentieren wir ein detailliertes Protokoll für die intramuskuläre Transplantation von hPSC-abgeleiteten Pankreas-SC-Inseln in immundefiziierende Mäuse. Dieser Ort ermöglicht einen einfachen chirurgischen Zugang, reduzierte Invasivität und eine zuverlässige Entnahme des Transplantats für die spätere Analyse. Das Verfahren ermöglicht die intramuskuläre Einnistung stammzellbasierter Inselchen und unterstützt deren Wiederherstellung für die nachgeschaltete Beurteilung der Insulinsekretion nach einer oralen Glukose-Challenge. Das Protokoll umfasst Schritte zur Clusterpräparation und -verdichtung, Transplantationschirurgie, in vivo glukosestimulierte Insulinsekretion (GSIS) und Transplantatentnahme für histologische Analysen, wodurch ein reproduzierbares Rahmenwerk für intramuskuläre Transplantationen in präklinischen Mausmodellen bereitgestellt wird.

Einleitung

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Diabetes ist eine heterogene Stoffwechselerkrankung, deren Prävalenz sich in den letzten drei Jahrzehnten verdoppelt hat und die bis 2050 voraussichtlich 1,3 Milliarden Menschen betreffenwird. Während Umweltfaktoren wie Ernährung und Lebensstil eine bedeutende Rolle beim Beginn von Typ-2-Diabetes (Typ-2D) spielen, trägt auch die genetische Veranlagung wesentlich zur Entstehung seiner Pathogenesebei. Bauchspeicheldrüsen-β Zellen sind für die Insulinsynthese und -sekretion verantwortlich und spielen eine zentrale Rolle in der Diabetespathophysiologie3. Um zu verstehen, wie genetische Risiken zur Dysfunktion der β-Zellen beitragen, liefern menschliche stammzellbasierte β Zellen, die als dreidimensionale endokrine Cluster (im Folgenden als SC-Inseln bezeichnet) organisiert sind, ein äußerst informatives und relevantes Modellsystem 4,5. Jüngste Protokolle steuern effektiv die Differenzierung menschlicher Stammzellen in insulinproduzierende β Zellen, indem sie Schlüsselstadien der Bauchspeicheldrüsenentwicklung mithilfe spezifischer Inhibitoren und Wachstumsfaktoren 6,7 rekapitulieren.

Diese Systeme replizieren Entwicklungsmeilensteine zuverlässig auf skalierbare, reproduzierbare Weise und überwinden damit die Einschränkungen von donorbasierten Inselchen, die keine Entwicklungsmodellierung unterstützen und Versorgungsbeschränkungen unterliegen. Murine Modelle haben wertvolle Einblicke in die Entwicklung der Bauchspeicheldrüse geliefert, können jedoch oft die phänotypischen Erscheinungen, die bei menschlichen Patienten beobachtet wurden, vollständig reproduzieren5. Folglich ermöglicht der Einsatz eines stammzellbasierten Systems die Charakterisierung genetischer Varianten, die an der menschlichen Bauchspeicheldrüsenentwicklung und β Zelldysfunktionbeteiligt sind.

Trotz dieser Fortschritte bleiben in vitro erzeugte SC-Inselchen transkriptomisch und funktional unreif im Vergleich zu einheimischen adulten β Zellen. Sie zeigen eine suboptimale glukosestimulierte Insulinsekretion und fehlen die Expression reifer β-Zellmarker wie MAFA und G6PC2 9,10. Um diese Lücke zu schließen, wird häufig die In-vivo-Reifung durch Transplantation in immungeschwächte Mäuse eingesetzt; Dies verbessert typischerweise sowohl die Insulinsekretionsdynamik als auch die Genexpressionsprofile6.

Der Glukosestoffwechsel ist streng reguliert und erfordert die Integration systemischer Signale. Transplantierte SC-Inselchen können Signale mehrerer Organe integrieren und bieten so eine physiologisch relevantere Umgebung, die für die Bewertung der funktionellen Folgen genetischer Variation in menschlichen β Zellenentscheidend ist.

Die SC-Inseltransplantation bei Mäusen wurde an verschiedenen anatomischen Standorten durchgeführt. Die konventionelle Stelle ist die Nierenkapsel, die wirksam zur Förderung der Reifung β Zellen und zur Umkehrung von Diabetes bei mit Streptozotocin (STZ) behandelten Nagetieren12 wirkt, aber sie beinhaltet eine komplexe invasive Operation, die deren Durchführung auf Laborebegrenzt. Darüber hinaus lässt sich diese Methode aufgrund von Größen- und Gefäßeinschränkungen nicht auf klinische Einrichtungen übertragen, um Patienten mit Typ-1-Diabetes zu behandeln14. Alternative Transplantationsstellen wie intramuskuläres, subkutanes und Fettgewebe wurden berichtet, die weniger invasive und klinisch anwendbarere Wege bieten. Obwohl die intramuskuläre Transplantation im Vergleich zur Nierenkapsel12 Herausforderungen für eine optimale Reifung der β-Zellen und Insulinsekretion darstellen kann, kann sie dennoch eine effektive Insulinsekretion und die Aufrechterhaltung der Glukosehomöostase erreichen, während sie einen einfacheren und zugänglicheren chirurgischen Ansatzbietet.

Daher präsentieren wir in diesem Protokoll einen Ansatz zur intramuskulären Transplantation, der mehrere Einschränkungen anderer Transplantationsprotokolle adressiert. Diese Methode ist minimalinvasiv und bietet eine zuverlässige In-vivo-Strategie zur Reifung von SC-Inselchen und zur Untersuchung genetischer Varianten, die mit einer β-Zell-Dysfunktion verbunden sind.

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Protokoll

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Alle Experimente mit pluripotenten Stammzellen (hPSCs) und Labortieren wurden von institutionellen, regionalen und nationalen Ethikkomitees genehmigt. Die hier verwendeten hPSC-Linien wurden ursprünglich gemäß den entsprechenden ethischen Genehmigungen und Verfahren zur informierten Einwilligung an den Quellinstitutionen abgeleitet und verteilt. Abbildung 1 zeigt den gesamten Arbeitsablauf, von der hPSC-Pflege über die gezielte Differenzierung der Pankreaslinie und die Reifung zu SC-Inseln, die für Transplantationen geeignet sind.

1. Differenzierung von hPSCs zu Bauchspeicheldrüsenvorläufern

HINWEIS: Dieses Protokoll baut auf zwei wesentlichen vorbereitenden Schritten auf: 1) der Erhaltung und Erweiterung der hPSCs und 2) ihrer gezielten Differenzierung hin zur endokrinen Bauchspeicheldrüsenlinie. Beide Schritte wurden imDetail beschrieben 7,17. hPSCs werden in beschichteten Platten mit B8-Medien gemäß den Empfehlungen von Lyria-Leyte et al.17 aufbewahrt. Ernten Sie hPSCs zur Differenzierung während des exponentiellen Wachstums, bevor sie konfluent werden. Bei der empfohlenen Aussaatdichte sollten sie am nächsten Tag 90-100 % Zusammenfluss erreichen und bereit für die Differenzierung. Die Differenzierung hin zur endokrinen Pankreaslinie erfolgt gemäß dem von Barsby et al.7 beschriebenen Verfahren. Alle Details der Medien finden Sie in Tabelle 1.

  1. Die Differenzierungsplatten werden frisch mit einer von der Basalmembran abgeleiteten extrazellulären Matrix beschichtet.
  2. Saat 0,16–0,19 Millionen Zellen/cm² am Tag 0 (1,7 Millionen Zellen in einem Bohrloch von einer 6-Brunnenplatte). Verwenden Sie 1,5- bis 2-mal das Volumen von B8 + CEPT, um Nährstoffmangel zu verhindern (3-4 ml pro Brunnen in einer 6-Well-Platte).
    HINWEIS: Beim Passieren von hPSCs oder Seeding-Differenzierungsexperimenten ergänzen wir B8-Medien bevorzugt mit CEPT, einem Cocktail aus Chroman 1, Emricasan, Polyaminen und trans-ISRIB, anstelle des herkömmlichen ROCK-Inhibitors Y-27632, da dessen nachgewiesene Fähigkeit zur Verbesserung des hPSC-Überlebens18 nachgewiesen ist. Dennoch bleibt Y27632 eine gültige Alternative zu diesem Protokoll.
  3. Führen Sie Medienwechsel mit Differenzierungsmedien S1 bis S4 gemäß folgendem Zeitplan durch: S1 (Tage 1-4), S2 (Tage 4-7), S3 (Tage 7-9) und S4 (Tage 9-11).
    HINWEIS: Siehe Tabelle 1 für vollständige Medienkompositionen; weitere prozedurale Details werden von Barsby et al. 7 beschrieben.

2. Erzeugung von 3D-Clustern und Differenzierung zu insulinproduzierenden Zellen

HINWEIS: Am 11. Tag sollten differenzierte Zellen zu Bauchspeicheldrüsenvorläufern entwickelt sein. Um die endokrine Differenzierung in diesem Stadium weiter zu fördern, wechseln die Zellen von der planaren Kultur zur 3D-Kultur.

  1. Fügen Sie 0,5 ml 5 % (w/v) Anti-Adhärenzlösung hinzu (siehe Tabelle 1 für Details ), um den Boden einer 24-Well-Mikrowellplatte mit invertierten pyramidalen Mikrobohrlöchern (400 μm Durchmesser) zu bedecken. Zentrifugiere bei 1.300 g für 10 Minuten bei Raumtemperatur (RT).
    HINWEIS: Die Anti-Adhärenzlösung erzeugt eine anti-haftende Oberfläche, die verhindert, dass Zellen am Kunststoff haften, und eine gleichmäßige Aggregation fördert.
  2. Untersuchen Sie die Mikrobrunnen unter einem Mikroskop auf Luftblasen und zentrifugieren Sie bei Bedarf neu, um eingeschlossene Luft zu entfernen (Abbildung 2A). Aspirieren Sie die Anti-Adhärenzlösung und waschen Sie zweimal mit 0,5 ml PBS pro Well. Lassen Sie die Brunnen mit PBS bedeckt, bis sie einsatzbereit sind.
  3. Waschen Sie die Zellen mit 1 ml PBS-0,5 mM EDTA, aspirieren Sie das PBS-EDTA und decken Sie die Bohrungen mit Trypsin ab (1 ml für ein Bohrloch einer 6-Well-Platte). Inkubiere bei 37 ºC für 8–12 Minuten (bis das Tippen eine deutliche Ablösung verursacht).
  4. Entfernen Sie das Trypsin nicht; stattdessen mit 2x Bänden DMEM-F12 oder PBS verdünnen und sanft durch Pipettern wieder suspendieren. Setzen Sie die Suspension in ein konisches Rohr und gehen Sie sofort zum nächsten Schritt über.
    HINWEIS: Es ist besser, länger in Trypsin zu inkubieren, als eine harte mechanische Trituration durchzuführen.
  5. Zentrifugieren Sie die Suspension bei 200 g für 3 Minuten bei RT. Aspiratieren Sie den Supernatant vorsichtig und suspendieren Sie das Pellet vorsichtig in vorgewärmtem S4-Medium (1,25 mL pro Brunnen eines 24-Bohrloch-Mikrowells).
  6. Aspiratiere das PBS aus Mikrowell-Schüsseln. Fügen Sie vorsichtig 1,25 ml der suspendierten Zellen zu jedem Brunnen der Mikrowellplatte hinzu.
    HINWEIS: Jede Bohrung der 24-Mikrowell-Platte enthält 1.200 Mikrowellen. Die erforderliche Aussaatdichte, um Cluster in geeigneter Größe zu erhalten, beträgt 1.500 Zellen pro Mikrowell, was 1,8 Millionen Zellen pro Brunnen entspricht. Alternativ können 6-Well-Mikrowellen verwendet werden, um Volumen und Anzahl der Zellen anzupassen (etwa 8,85 Millionen Zellen in 5 mL Stadium 4 Medium).
  7. Zentrifugiere die Platte bei 100 g für 3 Minuten bei RT, um die Zellen gleichmäßig in den Mikrobrunnen zu verteilen. Übertragen Sie die Mikrowellplatten vorsichtig in einen befeuchteten Inkubator.
  8. Führen Sie Medienwechsel mit den Differenzierungsmedien S5 (D14-D18), S6 (D18-D25) und S7 (D25-D46) durch.
    HINWEIS: Vollständige Zusammensetzungsdetails sind in Tabelle 1 enthalten, mit zusätzlichen Verfahrensdetails, die von Barsby et al. 7 beschrieben werden.
    Der CEPT-Cocktail kann in diesem Schritt anstelle des ROCK-Inhibitors Y-27632 verwendet werden, da er nachweislich das Überleben der Zellen während der Organoidbildung18 verbessert. Eine erfolgreiche Aggregation wird durch die Bildung kompakter, kugelförmiger Cluster innerhalb von 24–48 Stunden angezeigt (siehe Abbildung 2B).

3. Transplantation von SC-Inseln in den straffen Muskel immungeschwächter Mäuse

HINWEIS: SC-Inselchen wurden in verschiedenen Differenzierungsstadien (von Stadium 4 bis Stadium 7) verpflanzt. Während die Transplantation differenzierter S7-SC-Inselchen die optimale Strategie zur Beurteilung der Glukose-Responsivität6 darstellt, kann die Transplantation von Vorläufern im früheren Stadium (S4-S5) oder unreifer SC-Inseln (S6) dazu beitragen, Unterschiede in der Alterung aufzudecken, die in vitro durch definierte Kulturbedingungen verdeckt werden. Allerdings birgt die Transplantation weniger differenzierter Vorläufer ein erhöhtes Risiko der Teratombildung, hauptsächlich aufgrund von verbliebenen undifferenzierten Zellpopulationen.

  1. Verdichtung von Clustern
    1. Übertragen Sie die entsprechende Menge an Clustern in ein 1,5-mL Mikrozentrifugenrohr (siehe Anmerkung).
      HINWEIS: Die Zelldosis hängt vom experimentellen Ziel ab. Für die Histologie reichen 0,5–1 Million Zellen pro Maus für eine zuverlässige Transplantatsentnahme aus, während funktionelle Assays oder Diabetes-Umkehrungen bei STZ-behandelten Mäusen typischerweise höhere Dosen erfordern, bis zu 2–5 Millionen Zellen. Vor der Verdichtung sollten SC-Inselchen eine einheitliche sphärische Morphologie mit einem Zieldurchmesser von ~150–250 μm (akzeptabler Bereich: 100–300 μm) aufweisen. Dieser Größenbereich entspricht ungefähr ~10³–4 × 10³ Zellen pro Cluster; übergroße Aggregate (>300–400 μm) sollten vermieden werden, da sie anfälliger für zentrale Nekrose sind. Clustergröße und Gleichmäßigkeit werden vor der Verdichtung durch Brightfield- oder Stereomikroskopbildgebung repräsentativer Bohrungen überprüft, gefolgt von der Durchmessermessung mit Standardbildanalysesoftware.
    2. Schließen Sie die Spritze an die Nadelrohr-Baugruppe an und füllen Sie sie mit S7-Medium.
    3. Saugen Sie die Cluster direkt aus dem Mikrozentrifugenrohr in den Schlauch. Falten Sie das Rohr in der Mitte und führen Sie den gefalteten Abschnitt in eine 200-μL-Pipettenspitze ein. Führen Sie die Spitzen-Rohr-Nadel-Baugruppe in ein 15-mL konisches Rohr ein und befestigen Sie die Enden mit Klebeband am Rand des Rohrs.
    4. Zentrifugieren Sie das Rohr bei 100 g für 2 Minuten bei 4 °C, um die Cluster zu verdichten. Stellen Sie das Rohr sofort auf Eis.
  2. Transplantation von Clustern in Mäuse
    HINWEIS: Alle chirurgischen Eingriffe müssen mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung durchgeführt und in Übereinstimmung mit institutionellen Biosicherheits- und Tierschutzvorschriften durchgeführt werden. Anästhetika und scharfe Gegenstände sollten gemäß den genehmigten Sicherheitsvorschriften behandelt und entsorgt werden.
    1. Einleitung von Anästhesie bei NOD-scid-gamma-Mäusen mit 3–5 % Isofluran.
    2. Rasieren Sie die hintere Seite des rechten Beins unterhalb des Knies und desinfizieren Sie mit 70 % Ethanol.
    3. Lösen Sie den Schlauch von der Pipettenspitze ab und verbinden Sie ihn mit der Spritze. Schneiden Sie den Schlauch nahe an die verdichteten Cluster und befestigen Sie ihn am stumpfen Ende der Nadel. Drücken Sie die Kochsalzlösung, bis der erste Cluster die Spitze der Nadel erreicht.
    4. Positioniere die Maus auf Bauch, lehne dich nach rechts und strecke das rechte Bein aus. Führen Sie die Nadel 4–5 mm tief in das mediale Kompartiment des rechten Oberschenkels, im Bereich zwischen Adduktor- und Gracilismuskeln.
    5. Injizieren Sie die Cluster, während Sie die Nadel um ~3 mm zurückziehen. Drehen Sie die Spritze und ziehen Sie die Nadel heraus.
    6. Überwachen Sie die Maus, bis sie vollständig von der Narkose erholt ist.
      HINWEIS: Für die funktionelle Charakterisierung (d. h. in vivo GSIS, Abschnitt 4) müssen SC-Inselchen eines einzelnen Genotyps pro Maus verwendet werden; Eine einzige Transplantation reicht aus. Für die histologische oder transkriptomische Charakterisierung der Reifung nach der Implantation können jedoch beide Beine verwendet werden (z. B. ein Bein mit SC-Clustern, die von hPSCs abgeleitet sind, die eine krankheitsassoziierte genetische Variante enthalten, und das andere Bein mit korrigierter Variante). Eine korrekte intramuskuläre Verabreichung kann nicht direkt in vivo unmittelbar nach der Injektion bestätigt werden. Die erfolgreiche Implantation wird stattdessen rückwirkend durch makroskopische Identifikation des Transplantats zum Zeitpunkt der Entnahme bestätigt (Abbildung 3) und durch histologische Analyse (Abbildung 4).

4. In vivo glukosestimulierte Insulinsekretion (GSIS)

HINWEIS: In vivo GSIS mittels oraler Glukose-Challenge bewertet die funktionelle Insulinsekretion als Reaktion auf einen physiologischen Reiz. Alle Verfahren müssen den institutionellen Richtlinien zur Tierpflege und -nutzung folgen. Die funktionellen Reaktionen transplantierter β-Zellen verbessern sich mit der Reifung in vivo : Humanes C-Peptid kann bereits 2 Wochen nach der Transplantation nachgewiesen werden, während eine robuste, glukoseresponsive Sekretion typischerweise bereits nach 4 Wochen erreicht wird. Diese Zeitpläne können je nach Entwicklungsstadium der SC-Inselchen bei der Transplantation variieren

  1. Schnelle Mäuse für 4–6 Stunden vor der Glukoseverabreichung, um den Zugang zu Wasser sicherzustellen.
  2. Bereiten Sie eine 20%ige (w/v) D-(+)-Glukoselösung in Wasser vor. Sterilisieren Sie, indem Sie einen 0,22-μm-Filter durchlaufen und vor der Verwendung auf Raumtemperatur erwärmen.
  3. Wiegen Sie jede Maus und berechnen Sie die erforderliche Glukosedosis bei 3 g/kg Körpergewicht.
  4. Füllen Sie das entsprechende Volumen Glukoselösung in eine 20-G-Gebogennadel, die an einer 1-mL-Spritze befestigt ist.
  5. Halten Sie die Maus vorsichtig fest und führen Sie eine orale Gabe durch, wobei Sie das sanfte Einführen der Gavage-Nadel sicherstellen, um eine Trachealaspiration zu vermeiden.
  6. Nehmen Sie Blutproben mittels Submandibular- oder Schwanzvenenpunktion am Ausgangspunkt (0 Min) und 15 und 30 Minuten nach der Schenkung, wobei Kapillarröhren und 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhren verwendet werden. Lass das Blut etwa 15 Minuten bei Zimmertemperatur gerinnen und lagere die Schläuche dann auf Eis.
  7. Zentrifugieren Sie die Proben bei 1.000 g für 15 Minuten bei 4 °C und übertragen Sie das Serum in neue Röhren. Lagern Sie bei −80 °C bis zur Analyse durch ELISA.
    HINWEIS: Zeitpunkte können je nach experimentellem Modell angepasst werden. Es ist entscheidend, einen Test zu verwenden, der in der Lage ist, zwischen menschlichem und Mausinsulin oder C-Peptid zu unterscheiden, um die Insulinsekretion von Transplantaten in Xenotransplantationsmodellen zu bewerten.

5. Wiederholung von veredelten Clustern

  1. Lassen Sie die Maus nach institutionellen Tierethik-Richtlinien einschläfern.
  2. Um eine Gewebekontamination mit Fell zu minimieren, sprühen Sie 70 % Ethanol (v/v) über den Körper.
  3. Entfernen Sie die Haut, um die unteren Gliedmaßenmuskeln freizulegen, und lokalisieren Sie die transplantierten Cluster mit einer Lupe. Entfernen Sie transplantathaltiges Gewebe mit Schere und Pinzette.
  4. Spülen Sie das Gewebe einmal mit PBS ab und übertragen Sie es auf 4% (mit Alkohol) Paraformaldehyd (PFA) auf Eis. Fixiere das Gewebe bei 4 % PFA bei 4 °C für 4 Stunden mit sanftem Schütteln.
  5. Waschen Sie die Probe 1 Stunde lang in PBS mit sanftem Schütteln. Transferiere das Gewebe auf 30 % (w/v) Saccharose mit PBS und inkubiere es über Nacht bei 4 °C.
    HINWEIS: Biologisches Gewebe, Blutproben und chemische Abfälle (einschließlich Fixierungsmittel und Anästhetikum) müssen gemäß den institutionellen Richtlinien zur Biosicherheit und dem Umgang mit chemischen Abfällen entsorgt werden.

6. Färbung von Explants

  1. OCT-Einbettung
    1. Fügen Sie das Gewebe in eine Form ein, die mit einer Optimal Cutting Temperature (OCT)-Verbindung gefüllt ist.
    2. Setzen Sie den Schimmel in ein Trockeneis-Isopropanol-Bad, um die Probe im Schnellgefrieren zu erlöschen. Lagern Sie bei -80 °C bis zur Kryosektion.
    3. Mit einem Kryostat schneiden Sie 5–7 μm Abschnitte und lagern Sie die Objektträger bei -80 °C.
  2. Immunfärbung
    1. Gleiche die Folien bei RT 15 Minuten in einem Behälter aus, um Kondensation zu vermeiden.
    2. Die Objektträger 3 x 5 Minuten mit PBS abspülen.
    3. Inkubieren Sie jeden Abschnitt mit 100 μL Blockier-/Permeabilisierungslösung für 30 Minuten bei RT (0,1 % nicht-ionisches Tensid in PBS, mit 5 % Serum der Art, bei der der sekundäre Antikörper genährt wurde).
    4. Inkubieren Sie jeden Abschnitt mit 50 μL Primärantikörper, verdünnt in einer Blockierungs-/Permeabilisierungslösung über Nacht bei 4 °C.
    5. Die Objektträger 3 x 5 Minuten mit PBS abspülen.
    6. Inkubieren Sie jeden Abschnitt mit 50 μL sekundärem Antikörper, verdünnt in blockierender/permeabilisierter Lösung 1 Stunde bei RT.
    7. Die Objektträger 3 x 5 Minuten mit PBS abspülen.
    8. Die Verschlüsse mit 15 μL Befestigungslösung mit DAPI montieren und einen Deckmantel anbringen. Im Dunkeln bei 4 °C lagern, bis zur Bildgebenden Untersuchung.

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Ergebnisse

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Die gezeigten Ergebnisse entsprechen einer intramuskulären Transplantation von Stadium-7-SC-Inseln in immungeschwächte Mäuse und einer Analyse, die 6 Wochen nach der Transplantation durchgeführt wurde. Eine begrenzte Anzahl von Tieren mit repräsentativen Transplantaten wurde analysiert, um die Machbarkeit des Verfahrens zu veranschaulichen. In dieser Studie wird ein erfolgreiches Ergebnis als makroskopische Entnahme des intramuskulären Transplantats defin...

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Diskussion

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In diesem Protokoll beschreiben wir die intramuskuläre Transplantation von SC-Inseln als einen einfachen, reproduzierbaren und minimalinvasiven Ansatz für die In-vivo-Reifung mit Potenzial für funktionelle Bewertung. Obwohl die Transplantation unter der Nierenkapsel weithin als "Goldstandard" für Insel- oder SC-Insel-Engraftment bei Nagetieren gilt, erfordert sie größere technische Expertise und einen längeren chirurgischen Eingriff. Im Gegensatz dazu bietet der intramuskuläre S...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir danken Dr. Danwei Huangfu (Memorial Sloan Kettering Cancer Center, New York, USA) für die großzügige Bereitstellung der in dieser Studie verwendeten hPSC-Linien. Diese Arbeit wurde durch Fördermittel PID2021-122284NA-I00 und CNS2023-145179 vom spanischen Ministerium für Wissenschaft, Innovation und Universitäten MICIU/AEI/10.13039/501100011033 und Next GenerationEU/PRTR (A.B.) sowie vom CIBER-Konsortium für biomedizinische Forschung im Netzwerk, CB07/08/0029 und PID2023-150719OB-I00 (M.V.), Instituto de Salud Carlos III (ISCIII), unterstützt. Das Center for Biomedical Research in Diabetes and Associated Metabolic Disorders (CIBERDEM) ist eine Initiative von ISCIII und wird teilweise vom Europäischen Fonds für regionale Entwicklung (FEDER) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
2-Phospho-L-ascorbinsaeure-TrinatriumsalzSigma Aldrich49752
Activin AQkineQk001
AggreWell 400 24-Well (Mikroplatten)Stemcell34415
BetacellulinGenScriptZ03102
Rinder-Serum-Albumin, Fraktion V, fettsaeurefreiGoldbioA-421
CHIR 99021LC labsC-6556 
Chroman-1Medchem ExpressHY-15392CEPT-Cocktail
CMRL-1066Pan BiotechP04-84600
D-(+)-GlukoseSigma AldrichG7021
Dibenzazepin (DBZ)SyncomKundenspezifischGamma-Sekretase-Inhibitor
Dulbecco's modifiziertes Eagle-Medium und Ham’s F12-Medium (DMEM/F12)Corning15383541
EGFQkineQk011
EmricasanMedchem ExpressHY-10396CEPT-Cocktail
EthanolamineSigma AldrichE9508
FGF2-G3GenScriptKundenspezifisch
FGF7GenScriptZ03047
HeparinSigma AldrichH3149
InsulinGibco30284510
L-Alanyl-L-GlutaminLinusX0551-100
L-AscorbinsaeureSanta Cruzsc-202686
LDN-193189 Sigma AldrichSML0559
LipidkonzentratGibco11548846
Matrigel (basalmembranabgeleitete extrazellulaere Matrix)Falcon354230
MCDB 131Corning15-100-CV
N-AcetylcysteinThermo Scientific10521221
NaHCO3Fisher Scientific10553325
NicotinamidSigma AldrichN0636
NRG-1QkineQk045
Pluronic F-127 (Anti-Adhäsionslösung)Sigma Aldrich82184Verwendet bei 5% (w/v)
Polyamin-Supplement (1000×)Sigma AldrichP8483CEPT-Cocktail
RepSoxMedChemExpressHY-13012Alk5-Inhibitor
RetinsäureSigma AldrichR2625
SANT-1SelleckchemS7092
Sobetirome (GC1)Sigma AldrichSML1900-5MGZellpermeables T3-Analogon
NatriumpyruvatCorning25-000-CI
NatriumselenitSigma AldrichS5261
T3 (3,3′,5-Triiod-L-Thyronin-Natriumsalz)Sigma AldrichT6397
TGF-β1 QkineQk010
TPBTocris5343
Spurelemente ACorning15333641
Spurelemente BCorning15343641
Trans-ISRIBMedchem ExpressHY-12495CEPT-Cocktail
TransferrinInVitria777TRF029
Triton X-100 (nichtionisches Tensid)Thermo Scientific11488696
TrypLEGibco11538856
Y-27632LC LaboratoriesY-5301ROCK-Inhibitor
ZM-447439 MedChemExpressHY-10128
ZnSO4Sigma AldrichZ0251
Antikörper
Ratte anti-menschliches C-Peptid (Insulin)DSHBGN-ID4-sVerwendet bei 150 ng/ml
Maus anti-GlucagonProteintech67286-1-Ig1:2000
Kaninchen anti-SomatostatinMilliporeAB54941:500
Ziege anti-Ratte AF488InvitrogenA-110061:500
Esel anti-Maus AF488InvitrogenA-212021:500
Esel anti-Kaninchen AF488InvitrogenA-212061:500

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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  2. Ismail, L., Materwala, H., Al Kaabi, J. Association of risk factors with type 2 diabetes: A systematic review. Comput Struct Biotechnol J. 19, 1759-1785 (2021).
  3. Prasad, M. K., Mohandas, S., Ramkumar, K. M. Dysfunctions, molecular mechanisms, and therapeutic strategies of pancreatic β-cells in diabetes. Apoptosis. 28 (7-8), 958-976 (2023).
  4. Xue, D., et al. Functional interrogation of twenty type 2 diabetes-associated genes using isogenic human embryonic stem cell-derived β-like cells. Cell Metab. 35 (11), 1897-1914.e11 (2023).
  5. Bartolomé, A. Stem cell-derived β cells: A versatile research platform to interrogate the genetic basis of β cell dysfunction. Int J Mol Sci. 23 (1), 501(2022).
  6. Balboa, D., et al. Functional, metabolic and transcriptional maturation of human pancreatic islets derived from stem cells. Nat Biotechnol. 40 (7), 1042-1055 (2022).
  7. Barsby, T., et al. Differentiating functional human islet-like aggregates from pluripotent stem cells. STAR Protoc. 3 (4), 101711(2022).
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