RNA-seq-Profilierung der drainierenden und metastatischen Lymphknoten bei HER2-positivem Brustkrebs identifiziert POSTN als prognostischen Marker

Zusammenfassung

Wir zeigen ein extrazelluläres und PI3K-AKT-zentriertes Programm, das der Lymphknoten-Dissemination bei HER2-positivem Brustkrebs zugrunde liegt, und identifizieren POSTN als Marker für schlechte Prognosen, der Risikostratifizierung und wege-gesteuerte Therapiestrategien unterstützt.

Zusammenfassung

HER2-positiver Brustkrebs ist klinisch aggressiv und verbreitet sich häufig an regionale Lymphknoten, doch die mit der Ausbreitung der Knoten assoziierten transkriptomischen Programme bleiben unvollständig definiert. Hier profilierten wir abgeglichene tumordrainierende Lymphknoten (TDLN) und metastasierte, tumorbeteiligte Lymphknoten (TMLN) von sechs Patienten mit HER2-positivem Brustkrebs mittels RNA-Sequenzierung (RNA-seq). Die differentielle Expressionsanalyse wurde mit DESeq2 durchgeführt, wobei die Benjamini-Hochberg-Korrektur (FDR < 0,05) und eine absolute log2-fache Änderungsschwelle (|log2FC| ≥ 1) angewendet wurde. Wir identifizierten 237 differenziell exprimierte Gene (182 hochreguliert und 55 herunterreguliert bei TMLN vs. TDLN). Funktionelle Anreicherungsanalysen hoben die Interaktion der extrazellulären Matrix (ECM)-Rezeptoren, die PI3K-AKT-Signalübertragung, die fokale Adhäsion und den Cholesterinstoffwechsel als prominente Wege hervor, die mit metastatischen Lymphknoten assoziiert sind, was auf eine koordinierte ECM-Remodellierung und Signalaktivierung während der Knotendissemination hindeutet. Zu den am stärksten hochregulierten Genen trat POSTN als Schlüsselkandidat hervor und wurde weiter mit unerwünschten klinisch-pathologischen Eigenschaften in Verbindung gebracht. In einer unabhängigen Validierungskohorte (n = 120) war eine höhere POSTN-Expression mit einem inferioren krankheitsfreien Überleben assoziiert. Zusammen nennen diese Ergebnisse POSTN als potenziellen prognostischen Biomarker und unterstützen ECM-zentrierte und PI3K-AKT-bezogene Mechanismen als handlungsfähige biologische Merkmale der Lymphknotenmetastasen bei HER2-positivem Brustkrebs.

Einleitung

Brustkrebs (BC) ist der am häufigsten diagnostizierte Krebs bei Frauen und eine der weltweit führenden Ursachen für Krebssterblichkeit, mit einer erheblichen und steigenden Belastung in China¹. Ungefähr 15–20 % der BCs sind HER2-positiv (HER2+), gekennzeichnet durch ERBB2-Amplifikation/-Überexpression und einen aggressiven Phänotyp mit höherem Risiko für Rückfall und Tod ^2,3. Obwohl die systemische Anti-HER2-Therapie die Ergebnisse deutlich verbessert hat, erleidet ein beträchtlicher Anteil der Patienten noch Rückfälle oder entwickelt Metastasen, was die Notwendigkeit biologisch informierter Risikostratifizierung und neuer therapeutischer Optionen unterstreicht⁴.

Die Lymphknotenmetastase (LNM) ist ein entscheidender Faktor für die Stadieneinteilung, die Auswahl der adjuvanten Behandlungen und die Prognose in der BC; Die Beteiligung der Achselhöhlen deutet auf ein unterlegenes Überleben hin und erleichtert die weitere Ausbreitung in entfernte Organe ^5,6. Dennoch bleiben robuste Biomarker, die die Biologie der Knotenausbreitung bei der HER2+-Erkrankung erfassen, begrenzt, und aktuelle klinisch-pathologische Faktoren erklären nur teilweise die Outcome-Heterogenität⁷.

Fortschritte in der RNA-Seq ermöglichen transskriptomweite, hochdynamische Profilierung und werden heute weit verbreitet in der translationalen Onkologie⁸ übernommen. Allerdings konzentrieren sich die meisten Expressionsstudien in HER2+ BC auf primäre Tumore oder ungepaarte Kohorten, während die vergleichende Profilierung von abgestimmten tumordrainierenden Lymphknoten (TDLN) und tumormetastasierten Lymphknoten (TMLN) spärlich ist, was Einblicke in molekulare Programme einschränkt, die der knotenbesiedlung und -progression^{zugrunde liegen}.

Basierend auf der klinischen Bedeutung der Lymphknotenmetastasen und vorherigen Evidenzen für eine extrazelluläre Matrix (ECM)-Remodellierung und PI3K-AKT-Aktivierung in metastasiertem Seeding¹⁰ haben wir die Hypothese aufgestellt, dass im selben Patienten tumormetastasierte Lymphknoten (TMLN) ein eigenes transkriptomisches Programm im Vergleich zu passenden tumordrainierenden Lymphknoten (TDLN) aufweisen und dass eine Teilmenge der konsequent hochregulierten ECM-assoziierten Gene mit unerwünschten klinisch-pathologischen Merkmalen verknüpft ist und Rückfallrisiko. Um diese Hypothese zu testen, profilierten wir gepaarte TDLN und TMLN von sechs HER2-positiven Patienten, um differenziell exprimierte Gene (DEGs) und Signalwege zu identifizieren, die mit der Nodaldissemination assoziiert sind. Anschließend priorisierten wir POSTN und bewerteten seine prognostische Relevanz in einer unabhängigen Kohorte, wobei wir ECM-Remodellierung und PI3K-AKT-Signalisierung mit klinisch nützlicher Risikostratifizierung bei HER2+-Brustkrebs verknüpften. Details zur HER2-Bewertung (nach zeitgenössischen ASCO-CAP-Kriterien), zur Sequenzierungsqualitätskontrolle, DEG-Anruf mit DESeq2 und Benjamini-Hochberg FDR-Kontrolle sowie zu Validierungsverfahren sind hier aufgeführt^11,12.

Protokoll

Diese Studie wurde vom institutionellen Ethikkomitee genehmigt und gemäß der Helsinkier Erklärung sowie den lokalen Vorschriften zur Verwendung menschlicher Bioproben durchgeführt. Diese Studie wurde vom Ethikausschuss des Boai-Krankenhauses in Zhongshan (KY-2020-012-124) genehmigt. Vor jedem studienspezifischen Verfahren wurde von allen Teilnehmern eine schriftliche informierte Zustimmung eingeholt.

Studienkohorten und Stichproben
Die Entdeckungskohorte bestand aus gepaarten tumordrainierenden Lymphknotengeweben (TDLN) und metastasierenden Lymphknoten (TMLN), die intraoperativ von 6 Patienten mit HER2-positivem Brustkrebs entnommen wurden. Für jeden Patienten wurde das abgestimmte TDLN als drainierender Lymphknoten ohne histologische Metastasehinweise definiert und diente als Kontrollkomparator innerhalb des Patienten, während das TMLN pathologisch bestätigtes metastasiertes Gewebe war. Frisches Gewebe wurde kurz in kalter phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) abgespült, trocken getupft, innerhalb von 30 Minuten nach der Exzision in flüssigem Stickstoff gelassen und bis zur Extraktion bei -80 °C gelagert. Die Einschlusskriterien waren pathologisch bestätigtes invasives Brustkarzinom, HER2-positiver Status gemäß ASCO/CAP, Verfügbarkeit paariger Knoten und keine neoadjuvante Therapie. Die Ausschlusskriterien waren unzureichende Gewebe- oder RNA-Integritätszahl (RIN) < 7,0. Eine ursprünglich gescreente Probe fiel aufgrund von RIN < 7,0 durch die QC durch und wurde ausgeschlossen, sodass alle Entdeckungsanalysen konsequent n = 6 verwenden. Die unabhängige Validierungskohorte bestand aus 120 archivierten FFPE-Lymphknotenproben mit klinischer Nachbeobachtung und wurde für qRT-PCR- und Endpunktanalysen verwendet. Für die prognostische Modellierung wurden die Patienten mit POSTN-Expressionsgruppen verglichen (High vs. Low, mit einem durch X-Kachel bestimmten Cut-Point), wobei die Low-Gruppe als Referenzkomparator diente. Fälle mit fehlender Nachbeobachtung oder unvollständigen Kovariaten wurden aus der prognostischen Modellierung ausgeschlossen.

Begründung zur Stichprobengröße (Entdeckung und Validierung)
Die Entdeckungsphase verwendete ein gepaartes TDLN-TMLN-Design, um den Kontrast innerhalb des Patienten zu maximieren und die interindividuelle Varianz zu reduzieren, während die Multiplizität bei FDR = 0,05 kontrolliert wurde. Für die Validierungskohorte (n = 120) wurde der POSTN-Ausdruck am durch X-Kachel bestimmten Grenzpunkt (High/Low = 40/80) dichotomisiert. Gegeben 48 krankheitsfreie Überlebensereignisse (DFS) und α = 0,05 gibt eine Schoenfeld-Näherung ≥ 80%ige Stärke zur Erkennung klinisch relevanter Hazard-Verhältnisse von etwa HR ≥ 2,3 bei gleicher Verteilung an; dies entspricht der beobachteten Effektgröße (HR = 2,31, 95%-KI 1,41–3,77).

Definition der HER2-Positivität
Die HER2-Positivität folgte den zeitgenössischen ASCO/CAP-Kriterien ¹³: Immunhistochemie (IHC) 3+, definiert als einheitliche intensive Membranfärbung in >10 % der Tumorzellen, oder in situ Hybridisierung (ISH)-amplifiziert, definiert als HER2/CEP17-Verhältnis ≥2,0 mit einer durchschnittlichen HER2-Kopienzahl ≥4,0 Signale pro Zelle. Die IHC 2+-Ergebnisse wurden reflexartig ISH mit blinder Erfassung von ≥20 invasiven Tumorzellen durchgeführt, um den Amplifikationsstatus zu bestätigen.

Gewebeverarbeitung und RNA-Isolierung
Alle Verfahren wurden auf Eis, sofern nicht angegeben, unter Verwendung von RNase-freien Verbrauchsmaterialien durchgeführt. Für jede Probe mit ≤ 100 mg Gewebe wurde eine Homogenisierung in 1 ml Säure Guanidiniumthiocyanat-Phenol-Chloroform-Reagens (AGPC) durchgeführt, gefolgt von der Zugabe von 200 μL Chloroform, 15 s intensiver Mischung und einer 2–3 Minuten Inkubation bei Raumtemperatur. Die Phasentrennung wurde durch Zentrifugation bei 12.000 x g für 15 Minuten bei 4 °C erreicht. Die wässrige Schicht wurde dann in ein frisches Röhrchen übertragen, und RNA wurde nach einer 10-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur mit 500 μL Isopropanol ausgefällt. Das Pelletieren erfolgte bei 12.000 x g für 10 Minuten bei 4 °C. Das Pellet wurde mit 1 ml 75 % Ethanol gewaschen, bei 7.500 x g für 5 Minuten bei 4 °C zentrifugiert, 5–10 Minuten an der Luft getrocknet und in RNase-freiem Wasser gelöst. Eine On-Column DNase-I-Verdauung wurde verwendet, wenn eine Übernahme von genomischer DNA vermutet wurde. Visuelle Kontrollpunkte umfassten eine klare Phasentrennung nach der Chloroform-Extraktion und ein intaktes, durchscheinendes Pellet nach der Isopropanol-Niederschlagung. Die Fehlersuche umfasste das Wiederholen der Ethanolwäsche für niedrige A260/230-Verhältnisse sowie das Verlängern der Niederschlagsausfälle oder das Sicherstellen der Abkühlung während des Pelletings bei geringen Erträgen.

Qualitätskontrolle der RNA
Die Quantifizierung nutzte Spektrophotometrie zur Überwachung von A260/280 und A260/230 mit Zielen von etwa 1,8–2,1, ergänzt durch fluorometrische Messungen zur Genauigkeit. Die Integrität wurde mit einem mikrofluidischen Elektrophoresesystem bewertet und benötigte einen RIN ≥ 7,0. Deutliche 18S/28S rRNA-Peaks und das Fehlen eines genomischen DNA-Abstrichs wurden als Akzeptanzkriterien verwendet; Proben, die die Schwellenwerte nicht erfüllten, wurden erneut extrahiert oder ausgeschlossen.

Vorbereitung der Bibliothek
Strangierte mRNA-Bibliotheken wurden mit Poly(A)-Selektion für intakte RNA konstruiert, während rRNA-Depletion für teilweise degradierte Eingaben erlaubt war. Der typische Eingang betrug ≥ 1 μg Gesamt-RNA pro Bibliothek. Die Fragmentierung erfolgte 8 Minuten lang bei etwa 94 °C; Erststrang-cDNA-Synthese bei 50 °C für 50 Minuten; Zweitsträngsynthese bei 16 °C für 60 Minuten; Adapterligation bei 20 °C für 15 Minuten; und die PCR-Amplifikation verwendete 10–12 Zyklen, die angepasst wurden, um Überamplifikation zu vermeiden. Bei den Aufräumarbeiten wurden Perlenverhältnisse von etwa 0,8x bis 1,0x verwendet, und die erwartete Bibliotheksgrößenverteilung betrug 300 bp, einschließlich Adaptern. Die Qualität der Bibliothek wurde durch mikrofluidische Elektrophorese überprüft; Adapter-Dimer-Kontamination führte zu einer strengeren Reinigung, und übermäßig breite Größenverteilungen wurden durch eine moderate Verkürzung der Fragmentierung korrigiert.

Sequenzierung
Indexierte Bibliotheken wurden im Paired-End-Modus von 150 bp (PE150) sequenziert, mit dem Ziel von 30 Millionen Lesepaaren pro Bibliothek. Die Laufzeitqualität erforderte Q30 ≥ 90 % und stabile Clusterdichten mit minimalem Lane-Bias. Die Bibliotheken wurden zufällig über die Spuren verteilt, um Batch-Effekte zu mindern, und sie führten Aufzeichnungen aus, dokumentierten Lane-Zuweisungen und alle Sentinel-Kontrollen zur Überwachung der Kreuzkontamination.

Berechnungsanalyse und Differentialausdruck
Die Analysen wurden in R (v4.3.2) unter Linux durchgeführt. Die Rohlesequalität wurde mit FastQC (v0.11.9) bewertet. Adapter- und Qualitätstrimming wurden mit fastp (v0.23.4) unter Verwendung automatischer Adaptererkennung, Sliding-Window-Trimming (Fenstergröße 4 bp; mittlerer Phred Q ≥ 20), einer Mindestleselänge von 50 bp und Poly-G-Trimming bei relevanten Chemikalien durchgeführt. Die Reads wurden mit HISAT2 (v2.2.1) auf das GRCh37/hg19-Referenzgenom ausgerichtet, mit bibliothekspassenden Strängenparametern und bekannten Splice-Site-Indexen. Gen-Level-Zählungen wurden mit featureCounts (Subread v2.0.3) gegen GENCODE v19 unter Verwendung von Paired-End-Counting, chimerischer Lesebehandlung, Multi-Mapper-Einstellungen und der korrekten Sträng-Flagge generiert. Gene mit niedriger Anzahl wurden durch Zählungen ≥ 10 in mindestens drei Proben gefiltert. Die Analyse des Differentialausdrucks (DE) wurde mit DESeq2 (v1.40.2) unter einem gepaarten Design (Design = ~ Paar + Bedingung) durchgeführt, um TMLN mit TDLN zu vergleichen, mit Standard-Größenfaktor-Normalisierung und log2-facher Änderungsschrumpfung mittels apeglm. Potenzielle Ausreißer wurden anhand von Cooks Distanz bewertet. Die transkriptomweite Multiplizität wurde mit der Benjamini-Hochberg-Falschentdeckungsrate (FDR) kontrolliert. Die Signifikans wurde definiert als FDR < 0,05 und eine absolute log2-fache Änderungsschwelle (|log2FC|) ≥ 1. Das negativ-binomiale Rahmenwerk von DESeq2 bietet geeignete Mittelwertvarianzmodellierung für Zähldaten und stabilisiert Faltungsänderungsschätzungen in kleinen bis mittleren Kohorten. Als Sensitivitätsanalysen führten wir DE-Tests mit edgeR und Limma-voom mit denselben Filterkriterien und FDR-Schwellenwerten erneut durch, was übereinstimmende Top-Signale lieferte und die Robustheit der Hauptanalyseentscheidungen unterstützte.

Funktionale Anreicherung (GO und KEGG)
Die funktionale Annotation wurde in R mit clusterProfiler (v4.8.3) durchgeführt. Up- und Downregulierte DEGs wurden separat analysiert. Genidentifikatoren wurden vor der Anreicherung auf Entrez-Gen-IDs (Organismus: Homo sapiens) abgebildet. Die Genontologie (GO)-Anreicherung erfolgte mit enrichGO (OrgDb: org. Hs.eg.db; ont = BP/CC/MF; pAdjustMethod = "BH"; pvalueCutoff = 0,05; qvalueCutoff = 0,05), und die KEGG-Anreicherung des Signalwegs wurde mit enrichKEGG durchgeführt (organism = "has"; pAdjustMethod = "BH"; pvalueCutoff = 0,05; qvalueCutoff = 0,05). Das Hintergrunduniversum wurde definiert als alle exprimierten Gene, die nach Low-Count-Filterung in der DE-Analyse erhalten geblieben sind. Angereicherte Begriffe wurden zusätzlich gefiltert, um Gensätze mit 10–500 annotierten Genen zu behalten (minGSSize = 10; maxGSSize = 500). Visualisierungen wurden mit ggplot2 (v3.5.1) und ComplexHeatmap (v2.16.1) erstellt, einschließlich Punktdiagrammen des Genverhältniss und -log10(angepasster P)-Werte; der Begriff "Immunantwortwege" bezieht sich auf kuratierte GO-Module, die Antigenverarbeitung und -präsentation, Interferon-Signalübertragung und Lymphozytenaktivierung abdecken.

Abfrage externer Datenbank
Kandidatengene wurden in externen Quellen untersucht, um orthogonalen Kontext zu liefern. Die Tumor-gegen-Normal-mRNA-Expression wurde mit GEPIA2 (v2.0) mit TCGA breast invasive Carcinoma (TCGA-BRCA) Tumorproben mit normalem Brustgewebe (GTEx/TCGA-Normale, soweit verfügbar) abgefragt. Von GEPIA2 berichtete Ausdruckswerte (log2[TPM+1]) und sein Standard-Statistik-Testrahmen für Gruppenvergleiche wurden verwendet, um Boxplots und P-Werte für jedes abgefragte Gen zu erzeugen. Die Protein-Lokalisierung wurde mit dem Human Protein Atlas (HPA) bewertet, indem immunhistochemische Bilder und Annotationen aus dem Tissue Atlas and Pathology Atlas für Brustgewebe/Krebs überprüft und die berichtete Färbungsintensität und das zelluläre Kompartiment (z. B. stromal vs. epithelial), sofern verfügbar, erfasst wurden.

qRT-PCR-Validierung
Unabhängige Lymphknotengewebe wurden wie oben beschrieben verarbeitet, um die gesamte RNA zu extrahieren, und cDNA wurde aus 1 μg RNA in 20 μL Reverse-Transkriptionsreaktionen synthetisiert. Quantitative Echtzeit-PCR (qRT-PCR) wurde mit SYBR-basierter Chemie durchgeführt, wobei jede Reaktion 1x Mastermischung und 0,2–0,4 μM jedes Primers enthielt. Die Primer-Spezifität wurde durch Single-Peak-Schmelzkurvenprofile bestätigt, und die Amplifikationseffizienz wurde mit Verdünnungsreihen-Standardkurven bewertet, wobei akzeptable Effizienzgrade von 90 % bis 110 % definiert wurden. Jede Probe wurde in technischem Dreifachverfahren geprüft; Replikaten mussten einen Zyklus-Schwellenwert (Ct) SD ≤ 0,3 erreichen. Die Genexpression wurde auf GAPDH (oder ein anderes validiertes Referenzgen, wo anwendbar) normalisiert, und die relative Expression wurde mit der 2^-ΔΔCt-Methode berechnet. Die Normalität wurde mit Shapiro-Wilk-Tests bewertet; Zwischengruppenvergleiche verwendeten beidseitige T-Tests für ungefähr normale Daten oder Mann-Whitney-U-Tests ansonsten.

Prognostische Analyse in der Validierungskohorte
Das krankheitsfreie Überleben (DFS) war der primäre Endpunkt und wurde vom Operationsdatum bis zum ersten dokumentierten Rückfallereignis oder letzter Nachbeobachtung berechnet (zensiert). Für die Primäranalyse wurde die POSTN-Expression am durch X-Kachel bestimmten Schnittpunkt dichotomisiert (High vs Low = 40/80); Sensitivitätsanalysen verwendeten alternative Cut-Points wie Tertilen. Kaplan-Meier-Kurven und Log-Rang-Tests wurden für Univariablen-Vergleiche verwendet. Mehrvariable Cox-Proportional-Hazard-Modelle wurden so angepasst, dass sie Hazard Ratios (HRs) und 95%-Konfidenzintervalle schätzen und a priori Alter, Tumorgröße, Knotenstatus, histologischen Grad und Rezeptorstatus korrigierten. Die Annahme der proportionalen Risiken wurde anhand von Schoenfeld-Residuen bewertet, Kollinearität mit Varianzinflationsfaktoren und einflussreiche Beobachtungen mit DFBETAS bewertet. Vollständige Fallanalysen wurden durchgeführt, nachdem Fälle mit fehlender Nachbeobachtung oder unvollständigen Kovariaten, wie oben beschrieben, ausgeschlossen wurden.

Allgemeine Statistiken und Berichterstattung
Sofern nicht anders angegeben, werden die Daten als Mittelwert ± SD oder Median (IQR) zusammengefasst, beidseitige Tests werden verwendet, und p < 0,05 gilt als statistisch signifikant. Für transkriptomweite Analysen und Anreicherungen wird die Multiplizität mit BH-FDR kontrolliert, und die Effektgrößen werden, wenn möglich, von 95%-Konfidenzintervallen begleitet.

Sicherheit und Abfallentsorgung
Phenol-Guanidinium-Reagenzien und organische Lösungsmittel wurden in einer zertifizierten Abzugshaube mit Laborkitteln, Nitrilhandschuhen und Spritzschutz behandelt. Organische und halogenierte Abfälle wurden in beschriftete Behälter sortiert und gemäß den institutionellen Richtlinien entsorgt. Biologische Abfälle wurden vor der Entsorgung autoklaviert oder chemisch desinfiziert, und Oberflächen sowie Werkzeuge wurden mit RNase-inaktivierenden Lösungen dekontaminiert. Reagenzienspezifische Gefahren wie Korrosivität und Toxizität wurden in Labor-SOPs dokumentiert und während aller Verfahren beobachtet.

Ergebnisse

Kohorten und klinisch-pathologische Merkmale
Die Entdeckungskohorte bestand aus 6 gepaarten TDLN/TMLN-Proben, und die Validierungskohorte umfasste 120 archivierte Lymphknotenproben mit longitudinaler Nachbeobachtung. Die klinisch-pathologischen Merkmale beider Kohorten, einschließlich Alter, Tumorgröße, Grad, Rezeptorstatus und Knotenstatus, sind in Tabelle 1 zusammengefasst.

Sequenzierungsqualität und globale Datenstruktur
Alle 12 Disco...

Diskussion

HER2-positiver Brustkrebs zeichnet sich durch erhöhte Invasivität, häufige Lymphknotenmetastasen (LNM) und schlechtere Ergebnisse trotz moderner systemischer Therapie^aus. Konventionelle klinisch-pathologische Faktoren erklären die Prognose in diesem Subtyp nur teilweise und lassen eine Lücke für biologisch begründete Marker, die das Risiko der Knotenverbreitung¹⁶ erfassen. Durch vergleichende Profilierung von tumordrainierenden Lym...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Bioanalysator	2100-BA	Agilent, USA	Ausrüstung zur Bewertung der RNA-Integrität und Qualitätskontrolle.
DESeq2	N/A	R Bioconductor	Software zur Analyse der differentiellen Expression für RNA-seq-Daten.
FastQC-Software	N/A	Babraham Bioinformatik	Qualitätskontrollsoftware für RNA-Seq-Daten zur Bewertung der Sequenzqualität.
HEK293-Zellleitung	ATCC-CRL-1573	ATCC, USA	Menschliche embryonale Nierenzelllinie, die für Transfektionsexperimente verwendet wird.
qRT-PCR-Kit	4385616	ThermoFisher, USA	Quantitatives PCR-Kit zur Validierung der Genexpression.
RNA-Extraktionskit	74204	Qiagen, Deutschland	RNA-Extraktionskit, das verwendet wird, um hochwertige RNA aus Gewebeproben zu isolieren.
RNA-Sequenzierungskit	RS-122-2001	Illumina, USA	RNA-Bibliotheksvorbereitungskits zur Sequenzierung von RNA-Proben.
Sequenzierungsplattform	NovaSeq 6000	Illumina, USA	Hochdurchsatz-RNA-Sequenzierungsplattform zur Sequenzierung von RNA-Bibliotheken.
Gewebsgefriergeräte	TFE-300	Thermo Fisher, USA	Ausrüstung zum Einfrieren von Gewebeproben in flüssigem Stickstoff.
Trommelfellthermometer	55678-TT	ThermoScience, Japan	Genaues Thermometer zur Körpertemperaturmessung.