Standardisierung des Ratten-intraluminalen MCAO-Modells: Ein detailliertes Protokoll mit Qualitätskontrollmaßnahmen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll demonstriert eine optimierte 60-minütige Technik zur Okklusion der mittleren Gehirnarterie (MCAO) bei Ratten. Das Protokoll wird mit multimodalen Ansätzen validiert, erreicht eine Erfolgsrate von 87,5 % bei minimaler Sterblichkeit und liefert reproduzierbare Infarkt- und Verhaltensergebnisse für die Schlaganfallforschung.

Zusammenfassung

Das Modell der Ratten-Mittelarterie-Okklusion (MCAO) bleibt der Referenzstandard zur Aufklärung der ischämischen Schlaganfallpathophysiologie und zur Validierung neuroprotektiver Therapien. Subtile chirurgische Abweichungen können jedoch das Infarktvolumen und die Verhaltensergebnisse grundlegend verändern. Mit einem "visualisieren-dann-systematisieren"-Rahmen haben wir jeden Schritt der Modellentwicklung und -validierung erneut überprüft. Eine detaillierte fotografische Dokumentation wichtiger chirurgischer Orientierungspunkte und kritischer Schritte wurde durchgeführt, um die anatomische Ausrichtung und Filamentplatzierung zu standardisieren. Die 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC)-Färbung wurde verwendet, um das Volumen und die Topologie der Infarkte bei 24 Stunden und 72 Stunden nach Reperfusion präzise abzubilden. Neurologische Defizite wurden mit den Zea-Longa-, Bederson- und modifizierten Garcia-Skalen bewertet. Vierundzwanzig männliche Sprague-Dawley-Ratten unterzogen sich einer 60-minütigen vorübergehenden MCAO; Infarktvolumen und neurologische Werte wurden bei 24 Stunden und 72 Stunden bewertet. Etwa 87,50 % der Tiere erreichten eine erfolgreiche Blockade des zerebralen Blutflusses (Zea-Longa ≥ 1 und eindeutiger TTC-definierter Infarkt), mit einer Gesamtsterblichkeit von 12,50 %, was die hohe Genauigkeit des Modells bestätigt. Dieses standardisierte Protokoll bietet eine technisch verfeinerte, reproduzierbare Grundlage für die präklinische Schlaganfallforschung und ermöglicht eine konsistenz zwischen Laboren in Studien zur Schlaganfallpathophysiologie und therapeutischen Interventionen.

Einleitung

Schlaganfall ist die zweithäufigste Todesursache und weltweit die dritthäufigste Ursache für Behinderung ^1,2. Schlaganfall betrifft überproportional Länder mit niedrigem und mittlerem Einkommen, wo er im Durchschnitt 15 Jahre früher auftritt als in Ländern mit hohem Einkommen¹. Die beiden Haupttypen sind ischämischer Schlaganfall (85 %) und intrazerebrale Blutungen (15 %)³. Der ischämische Schlaganfall, der die überwiegende Mehrheit der Schlaganfälle ausmacht, entsteht durch eine Blockade des zerebralen Blutflusses, was zu Zelltod und Hirninfarkt führt. Die ischämische Kaskade umfasst mehrere biochemische Ereignisse, darunter bedeutende prooxidative Prozesse ^5,6.

Trotz umfangreicher präklinischer und klinischer Bemühungen haben nur wenige Therapien – insbesondere intravenöse Thrombolyse mit Gewebeplasminogenaktivator und mechanische Thrombektomie – sich als wirksam erwiesen, und diese Behandlungen sind durch enge therapeutische Zeitfenster und strenge Patientenauswahlkriterien begrenzt. Daher besteht ein dringender Bedarf, die zellulären und molekularen Mechanismen hinter ischämischer Verletzung, neurovaskulärer Reparatur und der Genesung nach einem Schlaganfall aufzuklären. Ein reproduzierbares, klinisch relevantes Tiermodell ist für dieses Ziel unverzichtbar.

Das Modell der mittleren cerebralen arterienokklusion (MCAO) wird weit verbreitet verwendet, um ischämischen Schlaganfall bei Nagetieren ^7,8 zu untersuchen. Die intraluminale Filament-Okklusionsmethode ist eine der klassischsten und am weitesten verbreiteten MCAO-Techniken⁹. Diese Technik kann sowohl permanente als auch vorübergehende Verschlüsse modellieren, ohne eine Kraniektomie erforderlich zu machen. Eine neuere transfemorale Technik mit endovaskulären Drähten hat sich als vielversprechend für die Auslösung von vorübergehendem MCAO bei Ratten erwiesen und liefert konsistentere Ergebnisse¹⁰. Dieses Modell beinhaltet die Verschließung der mittleren Gehirnarterie, typischerweise unter Verwendung einer intraluminalen Filamenttechnik¹¹. MCAO verursacht eine fokale zerebrale Hypoperfusion, die zu Ischämie und Reperfusionsverletzung^führt.

Obwohl MCAO für die Untersuchung der Schlaganfallpathophysiologie und möglicher Behandlungen wertvoll ist, kann es variable Läsionenvolumen⁷ hervorbringen. Daher können Verbesserungen des MCAO-Modells – wie die Verfeinerung von Reperfusionstechniken, die Einführung standardisierter Betriebsprotokolle und die Entwicklung einheitlicher Bewertungskriterien – die Variabilität bei Infarktstandort und -volumen verringern und so dessen Nutzen in der ischämischen Schlaganfallforschung erhöhen.

Dieses Protokoll erfordert eine Lernkurve von etwa 10–15 Operationen, um konsistente Ergebnisse^{zu erzielen}. Die Erfolgsraten können je nach Bedienererfahrung und Rattenstamm¹⁴ variieren. Das Modell eignet sich zur Untersuchung eines akuten ischämischen Schlaganfalls, kann jedoch menschliche Begleiterkrankungen wie Bluthochdruck oder Diabetes¹⁵ nicht vollständig replizieren. Dementsprechend wollten wir ein optimiertes MCAO-Protokoll entwickeln und rigoros validieren, das darauf abzielt, die experimentelle Variabilität durch standardisierte Verfahren und strenge Qualitätskontrollmaßnahmen zu verringern. Vier komplementäre Innovationen wurden integriert, um doppelte Gewinne bei Standardisierung und Datenzuverlässigkeit zu erzielen: (1) Dual-Time-Point-Longitudinalbewertung – neurologische Werte von den Zea-Longa-, Bederson- und Modified Garcia-Skalen wurden parallel zu 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC)-abgeleiteten Infarktvolumen bei 24 und 72 Stunden nach der Reperfusion ermittelt, wobei die zeitliche Beziehung zwischen Ödemauflösung und funktioneller Erholung abgegrenzt wird; (2) Dreifache Kreuzvalidierung – verblindete, doppelte Prüferbewertung mit integrierter dreiskaliger Kalibrierung erhöhte die Sensitivität und Präzision der Verhaltensbewertung signifikant; (3) Ganzdurchschnitt von hypothermischer Schnellschnitt – ein Standardverfahren (SOP) der "90-Sekunden-Eisbad-Extraktion gefolgt von einstufigem 2-mm-koronalen Schneiden in vorgekühlten Formen" – wurde eingeführt, um Autolyse und menschliches Versagen zu minimieren und so hochpräzise volumetrische Messungen zu gewährleisten; (4) Ein integriertes Qualitätskontrollsystem – eine umfassende SOP über präoperatives Fasten, Anästhesietiefenkontrolle, präoperative Thermoregulation und Kreuzkontaminationsprävention – wurde entwickelt, um ein reproduzierbares und leicht übertragbares MCAO-Standardverfahren zu schaffen und eine solide Grundlage für interlaborative Konsistenz und Kreuzstudienvergleichbarkeit zu schaffen.

Protokoll

Das Experiment wurde vom Institutional Animal Experiments and Experimental Animal Welfare Committee der Capital Medical University genehmigt und überwacht. Alle Protokolle entsprechen dem NIH-Leitfaden zur Pflege und Nutzung von Labortieren (NIH Publ. 80-23, 1996 Rev.), und sterile Ausrüstung sowie aseptische Techniken sind erforderlich.

1. Tierauswahl

1. Verwenden Sie männliche Sprague-Dawley-Ratten (6–8 Wochen alt, 240–270 g schwer), die von einem zertifizierten Labortierlieferanten stammen (Lizenznummer SCXK (Peking) 2021-0011) zur Etablierung eines MCAO-Modells.
2. Die Tiere konventionell mit ad libitum-Futter und Wasser zu beherbergen; alle Verfahren folgten dem Internationalen Ethikkodex.
3. Verwenden Sie bei der Auswahl der Filamentgröße folgende Kriterien basierend auf dem Körpergewicht des Tieres, um eine konsistente Okklusion sicherzustellen:
   - 220–250 g: 0,33–0,35 mm Durchmesser
   - 250–280 g: 0,35–0,38 mm Durchmesser
   - 280–310 g: 0,38–0,40 mm Durchmesser
   HINWEIS: Diese Spezifikationen berücksichtigen altersbedingte Vergrößerungen des Gefäßdurchmessers und verringern die Häufigkeit von SAH oder unvollständiger Okklusion¹³.

2. Stichprobengröße

1. Berechnen Sie die Stichprobengröße mit einer Stichprobengrößenberechnungssoftware. Basierend auf vorläufigen Daten, die ein erwartetes Infarktvolumen von 35 % ± 10 % (mittlere ± SD) in der MCAO-Gruppe gegenüber 0 % ± 2 % in der SHAM-Gruppe zeigen, wird eine Effektgröße (Cohens d) geschätzt. Für einen zweiseitigen Mann-Whitney-U-Test (nichtparametrische Alternative zum t-Test) mit α = 0,05 und Potenz (1-β) = 0,80 berechnen Sie eine minimale Stichprobengröße.
   HINWEIS: Die Effektgröße wurde auf 3,5 geschätzt und die Mindeststichprobengröße betrug 6 Tiere pro Gruppe.
2. Um die erwartete Sterblichkeit (12,5 %) und die Ausschlussrate (5–10 %) zu berücksichtigen, werden 24 Ratten in der MCAO-Gruppe und 6 Ratten in der SAM-Gruppe aufgenommen, was für den primären Endpunkt (Infarktvolumen bei 24 Stunden) ausreichende Leistung (>0,90) bietet.

3. Einschluss- und Ausschlusskriterien

1. Beziehen Sie die Tiere ein, wenn sie folgende Kriterien erfüllen: (1) männliche Sprague-Dawley-Ratten, 240–270 g, 6–8 Wochen alt; (2) Fehlen bereits vorhandener neurologischer Defizite (präoperativer neurologischer Wert = 0); (3) erfolgreiche Einleitung der Anästhesie ohne Komplikationen.
2. Tiere werden von der Analyse ausgeschlossen, wenn sie zeigen: (1) Subarachnoidalblutungen (SAH), die bei der Obduktion erkennbar sind; (2) vorzeitiger Tod (<24 Stunden nach der Reperfusion), der nicht mit experimenteller Intervention zusammenhängt; (3) fehlgeschlagene Okklusion (neurologischer Wert = 0 und Fehlen eines vom TTC definierten Infarkts); (4) technisches chirurgisches Versagen (z. B. CCA-Ruptur).
   HINWEIS: Diese Kriterien wurden vor Beginn der Studie vorgegeben, um Selektionsverzerrung zu minimieren.
3. Tierersatzpolitik: Ersetzen Sie nur Tiere, die aufgrund technischer chirurgischer Versagen oder intraoperativen Todes ausgeschlossen sind, um die statistische Stärke zu erhalten. Ersetzen Sie Tiere nicht durch erfolglose Modellierung (fehlgeschlagene Okklusion), sondern melden Sie sie als Teil der Erfolgsrateberechnung, um eine künstliche Verringerung der Variabilität zu vermeiden.

4. Vorchirurgische Vorbereitungen

1. Bereite autoklavierte Werkzeuge, steriles Filament und ein drapiertes Feld vor.
2. Routinemäßiges Fasten ist nicht erforderlich; Wenn nötig, begrenzen Sie die Fastendauer auf 2–4 Stunden. Führen Sie eine Anästhesie mit Isofluran (3–4 %) ein und halten Sie diese während des Eingriffs bei 1,5–2 % bei 30–40 % O₂. Bestätigen Sie die Tiefe der Anästhesie durch den Verlust des Aufrichtreflexes und des Zehenkneifens.
3. Halten Sie die Körpertemperatur bei 37 ± 0,5 °C mit einem rückkopplungsgesteuerten Heizkissen mit Rektaltemperaturüberwachung.
4. Rasieren Sie Hals und Kopfhaut, reinigen Sie dann die Stelle mit Povidon-Jod, gefolgt von 70 % Ethanol.
5. Verabreichen Sie Buprenorphin (0,05 mg/kg, subkutan) 30 Minuten vor der Operation und alle 12 Stunden postoperativ für 48 Stunden, oder Meloxicam (1 mg/kg, subkutan) einmal täglich für 3 Tage¹⁶. Schmerzen durch Überwachung des Pflegeverhaltens, der Haltung und der spontanen Aktivität zu beurteilen; Gewähren Sie zusätzliche Analgesie, falls die Anzeichen von Beschwerden bestehen.

5. Verschluss der MCA

1. Stellen Sie die Ratte in dorsale Rückenlehnung und den Kopf sanft ausgestreckt, um den ventralen Hals freizulegen.
2. Machen Sie mit einer Irisschere einen Halsschnitt in der Mitte (1,5–2,0 cm).
3. Trennen Sie die Sternomastoideus- und Omohyoideus-Muskeln stumpf mit gebogener Pinzette, um die Bifurkation der linken gemeinsamen Halsschlagader (CCA) freizulegen.
4. Ligate die äußere Halsschlagader (ECA) distal mit einer permanenten 4-0-Seidennaht und proximal mit einer temporären Ligatur. Erzeugen Sie mit der Mikroskopschere einen kleinen Schnitt zwischen den beiden ECA-Ligaturen.
5. Temporäre Verschluss der CCA und der inneren Halsschlagader (ICA) mit mikrovaskulären Klemmen (60 g Druck).
6. Führen Sie ein 4-0 silikonbeschichtetes Monofilament (0,35–0,40 mm Durchmesser) durch den ECA-Schnitt ein. Schieben Sie sie rückläufig in die CCA vor und leiten Sie sie dann über die CCA-Bifurkation hinaus in die ICA um.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass der Filament in Richtung Schädelbasis in die ICA eintritt, nicht in die Arterie pterygopalatina (PPA), die seitlich verzweigt. Tritt ein Widerstand bei <10 mm auf, ziehen Sie den Filament zurück, drehen Sie den Kopf des Tieres um 30° zur kontralateralen Seite und bewegen Sie sich zurück, um über den PPA-Ursprung hinaus umzuleiten.
7. Schieben Sie das Filament 18–20 mm von der CCA-Bifurkation heraus, bis ein leichter Widerstand auf eine Verschluss des MCA-Ursprungs hinweist. Überprüfen Sie die Tiefe mit der vormarkierten Referenzlinie am Filament (2 mm proximal zum Silikonstopper positioniert), gemessen mit einem Bremssättel am ECA-Stumpfeinsatzpunkt. Löse die CCA-Klemme, sobald das Filament in Position ist.

6. Reperfusion

1. Nach 60 Minuten Verschluss öffnen Sie den Schnitt wieder und lockern Sie die temporäre ECA-Ligatur.
2. Ziehen Sie das Filament vorsichtig heraus, bis die Spitze den ECA-Stumpf überquert hat, wodurch die Durchblutung wiederhergestellt wird. Setzen Sie umgehend eine permanente Ligatur proximal zum Stumpf an, um Rückblutungen zu verhindern. Schließe die Wunde in Schichten.
3. Bringen Sie die Ratte in einen erwärmten Erholungskäfig zur kontinuierlichen Überwachung.

7. Schein-Operation

1. Bereiten Sie das Tier nach demselben oben beschriebenen Verfahren für MCAO vor (Fasten, Anästhesie, Temperaturkontrolle, sterile Draperung).
2. Führen Sie wie oben oben eine Zervikalschnitt- und CCA-Bifurkationsexposition durch.
3. Sezieren und legen Sie das Gefäß frei. Führe das Filament nicht ein.
4. Die Arterien sollen offen bleiben; Keine zerebrale Ischämie induzieren.
5. Schließen Sie den Schnitt nach 10 Minuten Belichtung schichtweise. Bringen Sie das Tier zur Überwachung in einen erwärmten Erholungskäfig.

8. Postoperative neurologische Scores

1. Bewerten Sie 24 Stunden und 72 Stunden nach der Reperfusion, unmittelbar vor dem Opfer zur Infarktvolumenmessung.
2. Gewöhne das Tier an einen ruhigen Raum, 25 °C für 30 Minuten.
3. Lassen Sie zwei unabhängige Ermittler blind für die Gruppenzuweisung sein. Jeder Ermittler sollte die Ergebnisse auf separaten Blättern ohne Rücksprache erfassen; Jeder Unterschied zwischen den Bewertern ≥1 Punkt löst eine Neubewertung aus.
4. Skalen (in der Reihenfolge der Verabreichung): Zea-Longa¹⁷ (Tabelle 1), Bederson¹⁸ (Tabelle 2) und modifizierte Garcia¹⁹ (Tabelle 3) Bewertung, basierend auf den neuesten veröffentlichten Protokollen für konsistente Kriterien.
5. Verwenden Sie den Mittelwert der beiden Beobachter für die statistische Analyse. Schließen Sie Daten von Tieren aus, wenn sich die Mittelwerte um >10 % unterscheiden, und ersetzen Sie sie durch ein neues Subjekt.

9. Messung des Infarktvolumens im Gehirn

1. Bei 24 und 72 Stunden nach der Reperfusion sollten Ratten mit 5 % Isofluran tief betäubt werden. Bestätigen Sie die tiefe Anästhesie durch Verlust des Aufrichtreflexes und der Zehenkneifreaktion sowie stabile Atmung, bevor Sie fortfahren.
2. Entfernen Sie das Gehirn innerhalb von 90 Sekunden nach tiefer Narkosebestätigung, spülen Sie es mit eiskaltem PBS ab und schneiden Sie mit einer gekühlten Rattenhirnmatrix in 2 mm große koronale Scheiben. Beachten Sie beim Schneiden die folgenden Vorsichtsmaßnahmen
   1. Halten Sie das gesamte Verfahren auf Eis bei 0–4 °C; Entnehmen Sie das Gehirn innerhalb von 90 Sekunden und positionieren Sie es flach in einer vorgekühlten Matrix.
   2. Verwenden Sie eine scharfe Klinge, um einzelne, saubere Schnitte für präzise 2-mm-Koronalschnitte zu machen, wobei jede Scheibe in rostro-kaudaler Reihenfolge in eiskaltes PBS aufgenommen wird.
   3. Reinigen Sie die Matrix und die Klinge sofort mit 75 % Ethanol zwischen den Tieren, um Kreuzkontamination zu vermeiden.
3. Nach dem Vorerwärmen von 2 % auf 37 °C, die Scheiben vollständig eintauchen und 20 Minuten im Dunkeln inkubieren, wobei Sie alle 5 Minuten sanft bei 20 Minuten wirbeln.
4. Stoppen Sie die Reaktion umgehend, indem Sie dreimal mit 4 °C PBS spülen. Dann über Nacht 4 % Paraformaldehyd bei 4 °C fixieren.
5. Bei 300 dpi fotografiere beide Seiten jedes Stücks einmal.
   1. Verwenden Sie eine feste Beleuchtung vor weißem Hintergrund, um Schatten und Reflexionen zu eliminieren.
   2. Legen Sie Scheiben flach und überlappen Sie sich und fügen Sie in jedem Rahmen eine Skalaleiste und ein ID-Etikett hinzu. Halte die Kamera senkrecht zu den Schnitten und halte die Brennweite sowie den Weißabgleich durchgehend konstant.
6. Quantifizieren Sie das Infarktvolumen mit ImageJ.
   1. Importiere das 300-DPI-Bild (RGB-Format) und konvertiere in 8-Bit-Graustufen (Bild > Typ > 8-Bit).
   2. Wenden Sie Otsus Auto-Thresholding an (Bild > Anpassen > Auto-Schwellenwert > Otsu auswählen), um den Infarkt (weiß) vom lebensfähigen Gewebe (rot) zu trennen.
   3. Verwenden Sie das Freihand-Auswahlwerkzeug , um die ipsilaterale Hemisphärengrenze zu skizzieren.
   4. Messen Sie die Fläche (analysieren > messen) und notieren Sie die Pixelanzahl.
   5. Infarktvolumen berechnen: Σ (Infarktfläche × Schnittdicke [2 mm]) × (kontralaterales Hemisphärenvolumen/ipsilaterales Hemisphärenvolumen), ausgedrückt als Prozentsatz der kontralateralen Hemisphäre.

10. Statistische Analyse

1. Präsentieren Sie die Daten als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) oder Median [Interquartilbereich], je nach Anwand.
2. Führen Sie Vergleiche zwischen Gruppen mit dem ungepaarten Student's t-Test oder dem Mann-Whitney U-Test für nicht-normalverteilte Daten durch.
3. Setze die statistische Signifikanz auf P < 0,05. Führen Sie alle Analysen mit einer geeigneten Statistiksoftware durch.

Ergebnisse

Die Tiere wurden entweder in 24 Stunden (n = 10) oder 72 Stunden (n = 10) Überlebensgruppen nach der Reperfusion für die terminale TTC-Färbung eingeteilt. Weitere 4 Ratten unterzogen sich MCAO, starben jedoch vor dem geplanten Endpunkt (Sterblichkeitsrate 12,5 %). Die SAM-Gruppe bestand aus n = 6. Somit betrug die Gesamtzahl der verwendeten Tiere 30 (24 MCAO + 6 SHAM).

Die Ratten unterzogen sich einer 60-minütigen MCAO, um eine zerebrale Ischämie auszulösen (Abbildung 1). Die Reperfusion wurde durch das Entfernen des intraluminalen Filaments und das Lösen der proximalen Ligatur am ECA eingeleitet. Unter den 24 MCAO-Ratten starben 3 innerhalb von 72 Stunden; einer zeigte bei postmortaler TTC-Färbung innerhalb von 24 Stunden einen ausgedehnten Infarkt, während der andere innerhalb von 72 Stunden an unbekannten Ursachen starb. Zwei weitere Ratten wurden aufgrund erfolgloser Modellierung ausgeschlossen (neurologische Werte erfüllten die Kriterien nicht, und die TTC-Färbung zeigte keinen Infarkt). Daher lag die 72-Stunden-Sterblichkeitsrate bei 12,50 %. Wir definierten die erfolgreiche Modellbildung als Überleben von 24 Stunden plus einen Longa-Wert von 1–3, und die erfolgreiche Modellierungsrate erreichte 87,50 %.

Die neurologische Funktion wurde 24 und 72 Stunden nach Schlaganfallbeginn (vor der Infarktvolumenmessung) bewertet. Drei am häufigsten in der Literatur beschriebene Skalen – Zea-Longa, Bederson und modifizierte Garcia – wurden verwendet, um eine umfassende Bewertung zu liefern (Abbildung 2). Bei 24 Stunden erzielten die Ratten (n = 20) 2,02 ± 0,41 auf der Zea-Longa-Skala, 2,80 ± 0,41 auf der Bederson-Skala und 8,15 ± 1,18 auf der modifizierten Garcia-Skala; diese Defizite blieben bei 72 Stunden ausgeprägt (Zea-Longa: 1,65 ± 0,59; Bederson: 1,93 ± 0,38; modifizierte Garcia: 11:00 ± 1:34). Das Infarktvolumen, ausgedrückt als Prozentsatz der kontralateralen Hemisphäre, betrug 37,61 ± 2,81 % nach MCAO und sank auf 28,32 ± 4,18 % nach 72 Stunden.

Abbildung 1: Schematisches Diagramm der linken zervico-cerebralen arteriellen Physiologie und der mittleren Zerebralarterieembolie bei der Ratte. Schematisches Diagramm von (A) zervikisch-zerebraler arterieller Anatomie, (B) Voreinführung, (C) Nacheinsetzung und (D) Filamentfehlstellung in der Pterygopalatinarterie. CCA: Arterie Halsschlagader gemeinsam; ICA: Halsschlagader interner; ECA: äußere Halsschlagader; PPA: Arterie pterygopalatine; MCA: mittlere Großhirnarterie. "Schwarzes Dreieck": die Schnittstelle; Blaue Linie: Das Filament. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 2: Messung des Infarktvolumens und neurologische Verhaltensbeurteilung nach einer Okklusion der Gehirnarterie bei Ratten. (A) Versuchende Färbung von Gehirnschnitten. (B) Das Infarktvolumen bei 72 Stunden ist kleiner als bei 24 Stunden. (C,D) Die Zea-Longa- und Bederson-Werte bei 72 Stunden sind niedriger als die bei 24 Stunden. (E) Die modifizierten Garcia-Werte bei 72 Stunden sind höher als bei 24 Stunden. ****P < 0,0001, ***P < 0,001, **P < 0,01. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Manifestation	Punktzahl / Punkte
Kein neurologisches Defizit	0
Kontralaterale Vordergliedmaße gebogen und adduktiert während der Schwanzsuspension (leichtes neurologisches Defizit)	1
Spontanes Kreisen zur kontralateralen Seite beim Kriechen (mäßiges neurologisches Defizit)	2
Beim Stehen oder Gehen auf die gegenseitliche Seite fallen	3
(schweres neurologisches Defizit)
Keine spontane Bewegung begleitet von beeinträchtigtem Bewusstsein	4

Tabelle 1: Zea-Longa-Wertung^.

Manifestation	Punktestand/Punkte
Greifen Sie den Schwanz des Tieres und heben Sie ihn so, dass der Körper 10 cm über der Bank hängt. Bei normalen Ratten bleiben beide Vordergliedmaßen zum Boden ausgestreckt. Ratten mit neurologischen Defiziten können folgende Verhaltensweisen zeigen:
Kein neurologisches Defizit	0
Die paretische Vordergliedmaße ist gebogen und nahe am Bauchraum gehalten, während die nicht betroffene Gliedmaße zur Bank hinausragt	1
Zusätzlich zu dem in 1 beschriebenen Verhalten ist der Widerstand gegen seitlichen Stoß zur Paretikseite deutlich reduziert, wenn das Tier auf die Bauchlage gelegt wird	2
Zusätzlich zu den in 1 und 2 beschriebenen Verhaltensweisen kreist das Tier beim Gehen zur Paretikusseite	3

Tabelle 2: Bederson-Ergebnis^.

Gegenstand	Manifestation	Punktestand/Punkte
a) Spontane Bewegung	Normale Aktivität	3
(Beobachten Sie die Aktivität der Ratte in ihrem Hauskäfig für 5 Minuten)	Leicht beeinträchtigt	2
	Mäßig beeinträchtigt	1
	Keine spontane Bewegung	0
b) Symmetrische Gliedmaßenbewegung	Symmetrische Haltung	3
	Asymmetrische Haltung	2
	Hemiplegie	1
c) Vordergliedmaßenausstreckung	Symmetrisch	3
(Greifen Sie den Schwanz und bringen Sie die Vordergliedmaßen zum Rand des Tisches; Beobachten Sie die Vorderpfotenstreckung)	Leicht asymmetrisch	2
	Deutlich asymmetrisch	1
	Hemiplegie	0
d) Grip und Kletterfähigkeit	Klettert stark mit festem Griff	3
	Unilaterales Defizit beobachtet	2
	Nicht klettern oder kreisen	1
e) Beidseitiger taktiler Reflex am Körper	Symmetrisch auf beiden Seiten	3
	Träge Reaktion auf einer Seite	2
	Keine Antwort von einer Seite	1
f) Beseitigte Vibrissae-Berührungsantwort	Symmetrisch	3
	Asymmetrisch	2
	Keine Antwort	1

Tabelle 3: Modifizierter Garcia-Punkt. Gesamtpunktzahl: 0–18 Punkte; Höhere Werte deuten auf eine bessere neurologische Funktion hin.

Diskussion

Es ist wichtig klarzustellen, dass das Hauptziel dieser Studie die methodologische Standardisierung und nicht die biologische Entdeckung war. Die Entwicklung eines standardisierten MCAO-Protokolls ist entscheidend, um die Variabilität zwischen Laboren zu verringern und die Reproduzierbarkeit in der ischämischen Schlaganfallforschung zu verbessern. Dieses Protokoll erhöht die prozedurale Transparenz durch strenge Qualitätskontrollmaßnahmen und adressiert häufige technische Mängel in der MCAO-Modellierung, einschließlich standardisierter Filamenteinführung, Temperaturregulierung und histologischer Verarbeitung.

Während die beobachtete Verringerung des Infarktvolumens von 24 auf 72 Stunden und die teilweise neurologische Erholung erwartete pathophysiologische Phänomene bei vorübergehender MCAO darstellen, liegt der Beitrag dieser Studie darin, die zeitliche Zuverlässigkeit dieser Endpunkte mittels eines streng standardisierten Verfahrens festzustellen. Durch die Bereitstellung eines detaillierten, schrittweise technischen Rahmens stellt dieses Protokoll sicher, dass zukünftige mechanistische Studien – sei es zur Untersuchung neuroinflammatorischer Kaskaden, apoptotischer Signalwege oder therapeutischer Interventionen – auf reproduzierbaren und vergleichbaren Basisdaten basieren. Wir positionieren diese Arbeit ausdrücklich als technische Ressource, die mit dem Umfang von JoVE vereinbar ist und eine Grundlage für standardisierte präklinische Schlaganfallforschung bietet, anstatt mechanistische Erkenntnisse voranzutreiben.

Mehrere Schritte in diesem Protokoll sind besonders entscheidend, um eine konsistente Ischämie und Reperfusion sicherzustellen. Erstens ist es unerlässlich, die Okklusionslinie präzise vorzuschieben, bis ein leichter Widerstand spürbar ist, um reproduzierbares MCAO zu erreichen, da eine geringfügige Abweichung der Einsatztiefe zu einer unvollständigen Verschluss oder einer Subarachnoidalblutung^{führen kann 20,21}. Zweitens ist die Einhaltung einer strengen intraoperativen Normaltemperatur (37 ± 0,5 °C) und postoperativer Temperaturmanagement entscheidend, da entweder zu niedrige oder zu hohe Körpertemperatur den Infarktbereich und das neurologische Ergebnis erheblich verändern kann^12,22. Drittens kann das schnelle Entfernen des Gehirns innerhalb von 90 Sekunden und die Durchführung von Eisbadkühlung die Autolyse minimieren und die Gewebeintegrität erhalten, wodurch die Genauigkeit der TTC-Färbung und der Volumenanalyse^{sichergestellt} wird. Wenn diese Schritte konsequent umgesetzt werden können, werden sie die Modelltreue und Vergleichbarkeit zwischen den Studien erheblich verbessern.

Wir haben die traditionelle MCAO-Methode verbessert, um ihre Reproduzierbarkeit und Benutzerfreundlichkeit zu erhöhen. Der Einsatz vorgekühlter Gehirnschnittformen und standardisierter Schnittprotokolle hat menschliche Fehler und Schnittartefakte reduziert. Zusätzlich hat die Einführung einer dreiskaligen (Zea-Longa, Bederson und modifizierten Garcia) neurologischen Funktionsbewertung durch zwei blinde Forscher die Robustheit und Sensibilität der funktionellen^{Bewertung erhöht.} Durch detaillierte Standardarbeitsanweisungen, die jede Programmstufe abdecken, hilft es, häufige Probleme wie Fädenfehlpositionen, vorzeitige Reperfusion oder postoperative Unterkühlung zu identifizieren. Fehlerbehebungshinweise bei häufigen Komplikationen umfassen: (1) Fehlplatzierte Okklusionslinie (PPA-Eingang), erkannt an fehlendem Widerstand bei 10–12 mm und sofortiger neurologischer Verbesserung – bei Bemerkung wird der Filament sofort zurückgezogen, der Kopf des Tieres 30° zur kontralateralen Seite gedreht und mit leichter medialer Winkelung zur Schädelbasis wieder vorgerückt; (2) Vorzeitige Reperfusion, angezeigt durch plötzliche neurologische Verbesserung während der Verschlussphase – sicherstellen, dass der Silikonstopper sicher am ECA-Stumpf fixiert ist, prüfen, ob der Filamentdurchmesser zur Arteriegröße passt (0,35–0,40 mm bei 240–270 g Ratten), und erwägen Sie die Verwendung eines längeren Filaments (Vergrößerung der Silikonbeschichtung um 0,5 mm), falls die Verschiebung anhält; und (3) Postoperative Unterkühlung (rektale Temperatur <36 ºC) – die Temperatur des Heizmatters auf 38 °C erhöhen, eine Wärmelampe 30 cm über dem Tier platzieren und warme, sterile Kochsalzlösung (0,5 ml, intraperitoneal, 37 ºC) verabreichen.

Trotz dieser Fortschritte hat dieses Protokoll mehrere Einschränkungen. Erstens erfordert die Technik eine beträchtliche Lernkurve (10–15 Operationen), um konstante Erfolgsraten zu erreichen, und individuelle Variationen in der Gefäßanatomie der Ratten können die Filamentplatzierung^{beeinflussen 21,24}. Zweitens basiert das vorliegende Protokoll auf einer nachträglichen Überprüfung (neurologische Bewertung und TTC-Färbung) statt auf intraoperativer Überwachung des zerebralen Blutflusses (LDF oder LSCI), was die Qualitätskontrolle während der Operation einschränkt und einen frühen Ausschluss von Tieren mit unvollständiger Okklusion²⁵ verhindert. Drittens war die Validierung auf junge männliche Sprague-Dawley-Ratten beschränkt, was die Generalisierbarkeit auf Weibchen, alte Tiere und komorbide Modelle^26,27 einschränkte. Zukünftige Studien sollten einbeziehen: (1) beide Geschlechter, um das Geschlecht als biologische Variable zu berücksichtigen; (2) alte Ratten (12–18 Monate) mit vaskulären Komorbiditäten; und (3) Echtzeit-CBF-Überwachung zur Verbesserung der Reproduzierbarkeit in Arzneimittelinterventionsstudien.

Diese Methode ist besonders wertvoll im präklinischen Medikamentenscreening, da die Konsistenz und translationale Relevanz ihrer Ergebnisse von entscheidender Bedeutung sind. Das in diesem Artikel beschriebene standardisierte Protokoll birgt großes Potenzial zur Verbesserung der Strenge und Reproduzierbarkeit der ischämischen Schlaganfallforschung. Zukünftige Anwendungen dieses Protokolls umfassen: (1) präklinisches Screening der neuroprotektiven Substanzen, die während des Reperfusionsfensters verabreicht werden; (2) mechanistische Studien zur Ischämie-Reperfusionsverletzung unter Verwendung der 24-Stunden- und 72-Stunden-Zeitpunkte; (3) Untersuchung der Neuroplastizität nach einem Schlaganfall und der funktionellen Erholung; und (4) Validierung therapeutischer Ziele in Kombination mit genetischen oder pharmakologischen Interventionen. Durch die Bereitstellung detaillierter und videogestützter SOP ist es unser Ziel, die breite Einführung dieser Methode in Laboren verschiedener Fachstufen zu fördern und letztlich zu einer zuverlässigeren und klinisch relevanteren präklinischen Schlaganfallforschung beizutragen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
2% TTC-Färbelösung	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.	T8170	25 g/Flasche, ≥98 % Reinheit
4% PFA	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.	P1110	500 mL gebrauchsfertig
Resorbierbare Naht	Shandong Weigao Group Medical Polymer Co., Ltd.	VCP345H	5-0 Vicryl
Adson-Pinzette	Shanghai Jinzhong Surgical Instrument Co., Ltd.	JD-11010	1×2 Zähne, 12 cm
Dumont-gekrümmte Pinzette	Shanghai Jinzhong Surgical Instrument Co., Ltd.	JD-11052	11 cm Länge, 0,05 mm feine Spitze
Feedback-Wärmepad	Shenzhen Reward Life Science & Technology Co., Ltd.	69001	37 ± 0,3 °C geschlossener Kreislauf
ImageJ	National Institutes of Health	Version 1.53k
Iris-Schere	Shanghai Jinzhong Surgical Instrument Co., Ltd.	JD-14060	Gebogene Spitze, 10 cm
Mikrovaskuläre Clips	Shenzhen Ruiwode Lift Technology Co.,Ltd.	JD-16010	1,5 cm gebogener Clip
Nicht resorbierbare Seide	Shanghai Pudong Jin-Huan Medical Products Co., Ltd.	S-2304	6-0 Schwarzer Seidenfaden
PASS-Software	NCSS, LLC, Kaysville, UT, USA	Version 15.0	Stichprobengrößenberechnungssoftware
Rattenhirnmatrix	Shenzhen Ruiwode Lift Technology Co.,Ltd.	68610	2 mm koronale Schlitze
Silikonbeschichtetes Nylonfilament	Shenzhen Ruiwode Lift Technology Co.,Ltd.	60-1250	0,35 mm AU, 30 mm Silikonspitze, EO-steril
Kleintier-Narkosemaschine	Shenzhen Ruiwode Lift Technology Co.,Ltd.	R500IE	Isofluran-Verdampfer, Induktionskammer & Maske enthalten
SPSS	IBM Corp., Armonk, NY, USA	Version 26.0	Statistische Analysesoftware
Vannas-Mikro-Schere	Shanghai Jinzhong Surgical Instrument Co., Ltd.	JD-14058	Gebogene Spitze, 8 cm