Auswirkungen von Cordyceps-Polysacchariden auf die durch D-Galaktose induzierte Nierenalterszeit

Zusammenfassung

Ein Altersmodell wurde bei Mäusen und HK-2-Zellen unter Verwendung von D-Galactose entwickelt. Die Auswirkungen von Cordyceps-Polysacchariden (CCP) auf die Nierenalterung wurden mittels Western Blotting und Immunfluoreszenz bewertet, wobei mitochondriale Veränderungen durch reaktive Sauerstoffspezies-Detektion und JC-1-Färbung bewertet wurden.

Zusammenfassung

Chronische Nierenerkrankung (CKD) stellt ein erhebliches globales Gesundheitsproblem dar. Das Altern renaler tubulärer Epithelzellen (RTEC) beeinträchtigt die Nierenregeneration und -reparatur und fördert das Fortschreiten der CKD durch die Freisetzung des seneszenzassoziierten sekretorischen Phänotyps (SASP). Cordyceps sinensis, dessen zentrale bioaktive Bestandteile Cordyceps polysaccharide (CCP) umfassen, wird in mehrere klinische Präparate für CKD integriert und hat therapeutische Vorteile nachgewiesen. Um die Rolle von CCP bei der Nierenalterung zu untersuchen, wurde ein D-galaktose-induziertes Nierenaltersmodell bei Mäusen entwickelt, bei dem CCP als Intervention verabreicht wurde. Die Behandlungsergebnisse wurden mittels seneszenzbedingter Färbung und Bewertungen der Nierenfunktion bewertet. Ein D-galaktose-induziertes Alterungsmodell in HK-2-Zellen wurde weiter entwickelt, um zugrunde liegende zelluläre Mechanismen zu untersuchen. JC-1-Färbung und die Erkennung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) wurden verwendet, um mitochondriale Veränderungen nach CCP-Behandlung unter seneszenten Bedingungen zu beurteilen. Immunfluoreszenz, Western Blotting und quantitative PCR (RT-PCR) wurden durchgeführt, um die Auswirkungen von CCP auf die MAPK-Phosphorylierung, NF-κB-Kerntranslokation und die Aktivierung von NLRP3-Inflammasom zu bewerten. Die Ergebnisse zeigen, dass CCP die Tubulointerstitielle Zell-Senezenz, Nierenschäden und Fibrose abschwächt und gleichzeitig die Mitochondrienfunktion sowohl in zellulären als auch in Tiermodellen der D-galaktose-induzierten Senezenz verbessert. Diese Effekte sind mit der Modulation des ROS/MAPK/NF-κB/NLRP3-Signalwegs verbunden.

Einleitung

Die chronische Nierenerkrankung (CKD) ist eine der häufigsten Nierenerkrankungen und betrifft weltweit eine große Bevölkerung. Sein Auftreten steht in engem Zusammenhang mit dem^{Altern 1}. Nierentubuli sind die primären funktionellen Einheiten der Niere, und die zelluläre Seneszenz innerhalb renaler tubulärer Epithelzellen (RTECs) trägt maßgeblich zum funktionellen Verfall der Nierenfunktion² bei. Medikamentenexposition und andere Stressfaktoren können eine tubuläre, stressassoziierte Seneszenz auslösen, was zu einem fortschreitenden Verlust der Nierenfunktion und letztlich zum Fortschreiten einer Endstadium der Nierenerkrankung (ESKD) führt. Daher kann die gezielte Alterung bei RTECs eine effektive Strategie sein, um die Nierenalterung zu verzögern und CKD vorzubeugen oder zu behandeln.

Chronische Entzündungen sind ein Kennzeichen des Alter von³ Jahren und ein wichtiger Treiber vieler altersbedingter Krankheiten. Pro-inflammatoriske Zytokine, die von seneszenten Zellen freigesetzt werden, sind zusammen als der senezessionsassoziierte sekretorische Phänotyp (SASP)⁴ bekannt. SASP fördert anhaltende Entzündungen, induziert Alterung in benachbarten Zellen und trägt zum fortschreitenden funktionellen Abbau^{bei 5}. Das D-galaktose (D-gal)-induzierte Senezenzmodell ist eines der am weitesten verbreiteten experimentellen Alterungsmodelle. Frühere Studien haben gezeigt, dass die D-gal-Behandlung zur intrazellulären Anhäufung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS), mitochondrialer Dysfunktion, Störung der Redoxhomöostase und zur Induktion stressbedingter zellulärer Seneszenz⁶ führt. Im Vergleich zu natürlichen Alterungsmodellen, die zeitaufwendig sind und eine hohe interindividuelle Variabilität aufweisen, bietet das von D-Galaktose induzierte Modell Vorteile wie Einfachheit, schnelle Induktion und relativ geringe intra-gruppenspezifische Variabilität. Dieses Modell ist sowohl auf In-vivo- als auch auf In-vitro-Studien anwendbar. Obwohl sie das langsame, pathologienfreie natürliche Altern nicht vollständig rekapituliert, eignet sie sich gut zur Modellierung der nierenen Alterung, da die Niere eine hohe metabolische Aktivität und Anfälligkeit für oxidativen Stress hat. Aus mechanistischer Sicht fördert D-Galactose die zelluläre Seneszenz hauptsächlich durch oxidativen Stress, was mit Untersuchungen zur ROS-Generierung und mitochondrialen Dysfunktion während des Alterns übereinstimmt.

Cordyceps sinensis ist ein traditioneller chinesischer Heilpilz, der weit verbreitet zur Behandlung von nierenbedingten Erkrankungen^{verwendet wird}. Es enthält mehrere bioaktive Bestandteile, darunter Polysaccharide, Adenosin, Aminosäuren, Cordycepin und Ergosterol. Extrakte und fermentierte Präparate von Cordyceps sinensis zeigen entzündungshemmende, antioxidative und anti-alternde Eigenschaften 8,9,10,11. Beispielsweise wurde gezeigt, dass Cordyceps-Polysaccharide die entzündliche Infiltration in einem Asthma-Mausmodell reduzieren, indem sie den TGF-β1/Smad-Signalweg¹² hemmen. Darüber hinaus können Cordyceps-Polysaccharide die Phosphorylierung des MAPK-Wegs unterdrücken und die Expression entzündlicher Zytokine wie IL-6 und IL-1β in RAW264.7 Zellen¹³ reduzieren. Frühere Studien haben gezeigt, dass Cordyceps polysaccharide (CCP), der wichtigste bioaktive Bestandteil von Cordyceps sinensis, die Seneszenz in renalen tubulären Epithelzellen durch Autophagie und Unterdrückung der SASP-Produktion abschwächen kann. Die molekularen Mechanismen, durch die CCP ROS-vermittelten Schaden entgegenwirkt, bleiben jedoch unvollständig charakterisiert.

Die vorliegende Studie untersucht die schützenden Wirkungen von CCP gegen die Nierenalterung bei Mäusen und untersucht ihre Auswirkungen auf Entzündungen, oxidativen Stress und Alterung anhand eines D-Galactose-induzierten Modells der Alterung der nierentubularen epithelialen Zellen. Wir untersuchen weiter, ob CCP die ROS-Produktion, die mitochondriale Funktion und nachgelagerte Signalwege moduliert, einschließlich MAPK-Phosphorylierung, NF-κB-Kerntranslokation und NLRP3-Inflammasomaktivierung. Gemeinsam zielt diese Arbeit darauf ab, experimentelle Belege zu liefern, die den Einsatz von CCP in Studien zur Nierenaltersalterung und altersbedingter Nierenschädigung unterstützen. Der gesamte experimentelle Arbeitsablauf und der vorgeschlagene Mechanismus sind in Abbildung 1 zusammengefasst.

Protokoll

Alle Tierverfahren wurden gemäß institutionellen Richtlinien durchgeführt und vom Tierethikkomitee der Nanjing-Universität für Chinesische Medizin genehmigt (Ethikgenehmigung Nr. 202108A006). Alle Abfälle, die während der Zellkultur und Färbung entstanden, wurden in versiegelten Behältern und Biohazard-Beuteln gesammelt und von einem lizenzierten medizinischen Abfallmanagementdienst entsorgt.

Tiermodell und therapeutische Interventionen

Um interindividuelle Variationen zu minimieren, wurden 40 Mäuse zufällig fünf Gruppen zugeteilt (n = 8 pro Gruppe) und den folgenden Interventionen unterzogen: (1) Kontrollgruppe: Erhielt intragastrische Verabreichung von 0,2 ml Kochsalzlösung pro Maus; (2) Modellgruppe: Erhielt täglich subkutane Injektionen von D-Galactose (250 mg/kg), verabreicht als 0,2 mL einer 25 mg/mL Lösung pro Maus; (3) CCP-Gruppe mit niedriger Dosis: Erhielt D-Galactose-Injektionen kombiniert mit intragastrischer Verabreichung von CCP bei 50 mg/kg (0,2 mL einer 5 mg/mL Lösung pro Maus); (4) Hochdosierte CCP-Gruppe: Erhielt D-Galactose-Injektionen kombiniert mit intragastrischer Verabreichung von CCP bei 100 mg/kg (0,2 mL einer 10 mg/mL Lösung pro Maus); (5) Vitamin-E-Gruppe: Erhielt D-Galactose-Injektionen kombiniert mit intragastrischer Verabreichung von Vitamin E bei 100 mg/kg (0,2 mL einer 10 mg/mL Lösung pro Maus). Nach 8 Wochen Behandlung wurden die Mäuse eingeschläfert, und Serum-, Urin- und Nierengewebeproben wurden für weitere Analysen entnommen.

Analyse der Nierenfunktion

Die Nierenfunktion wurde mit kommerziellen Assay-Kits bewertet, um Kreatinin, Harnsäure und Harnprotein gemäß den Anweisungen des Herstellers zu messen. Die Absorptionswerte wurden bei 505 nm für Kreatinin, 510 nm für Harnsäure und 585 nm für Harnprotein mit einem multifunktionalen Mikroplattenleser gemessen.

Färbung von Gewebeschnitten

Paraffin-eingebettete Nierengewebe wurden mit einer Dicke von 4 μm durchschnitten. Die Schnitte wurden deparaffinisiert, 5 Minuten mit Hämatoxylin inkubiert, mit fließendem Wasser ausgespült, mit 1% Säurealkohol für 5 Sekunden differenziert und erneut abgespült. Nach einer 1-minütigen phosphatgepufferten Kochsalzlösung (PBS) wurden die Abschnitte 3 Minuten lang mit Eosin gekontert, getrocknet und montiert. Für Massons trichrome Färbung wurden Abschnitte deparaffinisiert und wie oben beschrieben mit Hämatoxylin gefärbt, gefolgt von Ponceau S für 5 Minuten und Anilinblau für 5 Minuten. Anschließend wurden Abschnitte ausgetrocknet und montiert.

Zellviabilitätstest

HK-2-Zellen wurden in 12-Well-Platten mit jeweils 1 × 10⁵ Zellen pro Well. Nach 24 Stunden Exposition gegenüber D-Galactose- und Cordyceps-Polysacchariden wurde jeder Bohrung¹⁰ % CCK-8-Lösung zugesetzt. Nach der Inkubation bei 37 °C für 30 Minuten wurde die Absorption bei 450 nm mit einem Mikroplattenmesser gemessen. Qualitätskontrolldokumentation für Cordyceps-Polysaccharide und STR-Authentifizierung der HK-2-Zellen sind in Supplemental File 1 bereitgestellt.

Umgekehrte Transkriptions-quantitative Polymerase-Kettenreaktion

Nach 24 Stunden Zellkultur wurde das Kulturmedium entfernt und die gesamte RNA mit dem Extraktionsreagenz extrahiert. Die RNA-Konzentration wurde mit einem Mikroplattenspektrophotometer bestimmt, und die RNA-Integrität wurde durch 2%ige Agarosegelelektrophorese bestätigt. Genomische DNA wurde entfernt, und cDNA wurde durch Reverse-Transkription synthetisiert. Die Primer-Sequenzen sind in der Materialtabelle aufgeführt.

Messung intrazellulärer ROS-Spiegel

HK-2-Zellen wurden in 12-Well-Platten mit jeweils 1 × 10⁵ Zellen pro Well. Nach Erreichen von 60–70 % Konfluenz unterzogen sich die Zellen einer Vorbehandlung mit D-Galactose für 12 Stunden. Nach 24 Stunden Drogenexposition wurde das Medium entsorgt und die Zellen einmal mit PBS gespült. Intrazelluläres ROS wurde durch Inkubation mit einer ROS-empfindlichen fluoreszierenden Sonde bei 37 °C für 20 Minuten nachgewiesen, und Fluoreszenzbilder wurden bei Anregungs-/Emissionswellenlängen von 488/525 nm¹⁵ aufgenommen.

Westlicher Blot

Zelluläre Proteine wurden mit einem RIPA-Puffer lysiert und durch Zentrifugation bei 13.000 × g für 15 Minuten bei 4 °C klariert. Die Proteine wurden durch 10 Minuten Kochen denaturiert, und gleiche Mengen Protein (20 μg pro Probe) wurden elektrophoretischer Trennung unterzogen und auf PVDF-Membranen übertragen. Nach einer Blockierung für 1 Stunde wurden die Membranen über Nacht mit primären Antikörpern inkubiert. Nachfolgende PBST-Waschungen wurden von einer Inkubation mit HRP-konjugierten sekundären Antikörpern gefolgt, und der Nachweis erfolgte mit einem verstärkten Chemilumineszenz-(ECL)-Substrat¹⁶. Details zu Antikörpern und Reagenzien-Identifikatoren sind in der Materialtabelle aufgeführt.

SA-β-gal Altersfärbung

HK-2-Zellen wurden in 12-Well-Platten mit einer Dichte von 1 × 10⁵ Zellen pro Bohrloch plattiert. Wenn die Zellen 60–70 % Konfluenz erreichten, wurden sie 12 Stunden lang mit D-Galactose vorbehandelt. Die SA-β-gal-Färbung erfolgte gemäß dem Protokoll des Herstellers, und gefärbte Zellen wurden mit einem optischen^{Mikroskop 17} beobachtet.

Messung des mitochondrialen Membranpotenzials

Das Potential der mitochondrialen Membran wurde mit der JC-1 fluoreszierenden Sonde gemäß den Anweisungen des Lieferanten bewertet. JC-1-Monomere wurden bei Anregungs-/Emissionswellenlängen von 490/530 nm nachgewiesen, während JC-1-Aggregate bei 525/590 nm nachgewiesen wurden. Bilder wurden aufgenommen, wenn klare rote oder grüne Fluoreszenzsignale beobachtet wurden.

Statistische Analyse

Die Daten wurden als Balken- oder Punktdiagramme präsentiert und mit der referenzierten Software analysiert. Die Intensität des Western-Blot-Bands wurde mit ImageJ quantifiziert. Die Daten wurden durch Varianzanalyse (ANOVA) mit anschließenden t-Tests für Gruppenvergleiche analysiert. Die statistische Signifikans wurde als P-Wert < 0,05 definiert. Symbole zeigen Vergleiche mit der Kontrollgruppe (*) oder der D-gal-Gruppe (#) (*P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001).

Ergebnisse

D-Galactose wurde verwendet, um ein Modell der Mausalterung zu etablieren, wobei Vitamin E als häufig verwendete positive Kontrolle gegen die Seneszenz dient. Seneszente Mäuse wurden mit unterschiedlichen Dosen von Cordyceps-Polysacchariden (CCP) behandelt. Gealterte Mäuse zeigten eine signifikante Nierenschädigung, was sich durch erhöhte Harnprotein-, Serum-Harnsäure- und Kreatininspiegel zeigte (Abbildung 2B-D). Sowohl die Vitamin-E- als a...

Diskussion

Diese Studie zeigt die schützenden Wirkungen von Cordyceps-Polysacchariden auf renale tubuläre Epithelzellen und liefert Hinweise darauf, dass sie die entzündliche Seneszenz in HK-2-Zellen abschwächen, indem sie den ROS/MAPK/NF-κB/NLRP3-Signalweg modulieren. Diese Ergebnisse erklären weitere mögliche Mechanismen für die Wirkung von Cordyceps-sinensis-abgeleiteten Verbindungen bei der Behandlung akuter und chronischer Nierenerkrankungen und bieten...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Casepase1/Gespaltenes Kaninchen pAb	WL03450	Wanlei, Shengyang, China
CCK-8-Bausatz	C0037	Biyotime, Shanghai, China
CCP	B21296	Yuanye Bio, Shengyang, China
Kreatinin-Testkit	C011-2-1	Jiancheng, Nanjing, China
D-gal	HY-N0210	MCE, USA
ERK Rabbit pAb	4695	CST, USA	AB_390779
Gapdh Rabbit pAb	AC033	Abclonal, Wuhan, China
H & E-Färbungsset	G1120	Solarbio, Peking, China
JC-1-Bausatz	C2003S	Biyotime, Shanghai, China
Massons Fleckenset	G1340	Solarbio, Peking, China
NLRP3 KaninchenpAb	WLH3383	Wanlei, Shengyang, China
P21 Rabbit pAb	64016s	CST, USA	AB_2892063
S. 38 KaninchenpAb	9212	CST, USA	AB_330713
p50 Rabbit pAb	3035	CST, USA	AB_330564
p65 KaninchenpAb	8242	CST, USA	AB_10859369
p-ERK Rabbit pAb	4370	CST, USA	AB_2315112
Phospho-SAPK/JNK mAntikörper	4668	CST, USA	AB_823588
p-p38 Rabbit pAb	4511	CST, USA	AB_2139682
ROS-Färbungsset	S0033S	Biyotime, Shanghai, China
SAPK/JNK-Antikörper	9256	CST, USA	AB_2250373
SA-β-gal Kit	C0602	Biyotime, Shanghai, China
Harnsäure-Testkit	C012-2-1	Jiancheng, Nanjing, China
Urinprotein-Nachweis-Kit	C035-2-1	Jiancheng, Nanjing, China
Vitamin E	S27812	Yuanye Bio, Shengyang, China
Primer für PCR
Genname	Vorwärtsprimer	Rückwärtszünder
Caspase-1	5'-TACAGACAAGGGTGCTGAACAA-3'	5'-CGGAATAACGGAGTCAATCAAA-3'
GAPDH	5'-AGAAGGTGGTGAAGCAGGCGTC-3'	5'-AAAGGTGGAGGAGTGGGTGTGTCG-3'
NLRP3	5'-GATCTTCGCTGCGATCAACAG-3'	5'-CGTGCATTATCTGAACCCCAC-3'