Eine Point-of-Care-Plattform zur gleichzeitigen Triplex-PCR-Erkennung von Chikungunya-, Dengue- und Zika-Virusinfektionen

Summary

Dieser Artikel empfiehlt ein vollautomatisches integriertes System, das Triple-PCR-Technologie nutzt, um gleichzeitig Begleitinfektionen von Chikungunya, Dengue und Zika-Virus mit einer einzigen Probe zu diagnostizieren und so die Testeffizienz in klinischen und primärmedizinischen Laboren zu optimieren.

Abstract

Chikungunya-Fieber (CHIKF), eine akute Viruserkrankung, die von Mücken übertragen wird und erstmals 1952 in Tansania entdeckt wurde, zeigt in China eine intermittierende Ausbreitung mit zunehmenden lokalen Ausbrüchen. Bis Juli 2025 hatte die Provinz Guangdong, derzeit das Zentrum des Ausbruchs, 4.824 lokale Fälle gemeldet, darunter fast 3.000 neue Infektionen in nur einer Woche. Dieser schnelle Anstieg schafft einen dringenden Bedarf an fortschrittlichen Diagnosetechnologien. Solche Werkzeuge sind entscheidend, um die Eindämmungsmaßnahmen an vorderster Front zu unterstützen. Wir schlagen eine Lösung für die schnelle gleichzeitige Erkennung von Dengue-Infektionen (DENV), Chikungunya (CHIKV) und Zika-Virus (ZIKV) vor, um die Fähigkeiten zur frühzeitigen Epidemieprävention und -kontrolle zu verbessern. Dieser Ansatz beinhaltet die Entwicklung maßgeschneiderter Testprotokolle für Grenzkontrollen und primäre Gesundheitseinrichtungen.

Traditionelle diagnostische Methoden für CHIKV und DENV weisen bei Koinfektionsfällen oft keine Sensitivität oder Spezifität auf. Da CHIKV, DENV und ZIKV ähnliche Übertragungsmuster und Symptome aufweisen, ist gleichzeitige Überwachung entscheidend. Dieses Protokoll bietet eine triplex-qPCR-Methode mit TaqMan-Sonden, um diese Arboviren in einem einzigen Röhrchen innerhalb von 90 Minuten zu erkennen. Im Vergleich zu viralen Kulturen und serologischen Tests verbessert diese Methode die Effizienz, indem sie aktive Infektionen und Koinfektionen mit hoher Spezifität identifiziert, während der Arbeitsablauf vereinfacht und spezielle Ausrüstungsanforderungen eliminiert werden.

Die Validierung mit klinischen und externen Qualitätsbewertungsproben (EQA) bestätigte eine 100%ige Übereinstimmung mit Goldstandard-Singleplex-Assays. Diese Methode dient als effektives Werkzeug zur Überwachung fieberhafter Erkrankungen in endemischen Regionen, insbesondere in ressourcenarmen Umgebungen, in denen eine schnelle Eindämmung von Ausbrüchen entscheidend ist.

Introduction

Chikungunya-Fieber (CHIKF) ist eine zunehmend verbreitete arbovirale Erkrankung, die hauptsächlich von den Mückenvektoren Aedes aegypti und Aedes albopictus übertragen wird. Diese Krankheit ist durch wiederkehrende Ausbrüche in tropischen Regionen gekennzeichnet und äußert sich klinisch als akute Fiebererkrankung, oft begleitet von starken Gelenkschmerzen und anhaltender Arthritis¹. Bis zum 26. Juli hatte die kumulative Gesamtzahl der laborbestätigten Chikungunya-Fälle in Foshan City 4.824 erreicht, wobei bemerkenswerte 87,2 % dieser Fälle im Bezirk Shunde auftraten. Diese ausgeprägte geografische Konzentration stellt eine erhebliche Belastung für die regionale öffentliche Gesundheitsinfrastruktur dar und führt zu erheblichen Gesundheitskosten sowie zu umfassenderen makroökonomischen Herausforderungen².

Im Kontext der zunehmend überlappenden Zirkulation von CHIKV-, DENV- und ZIKV-Viren stoßen die aktuellen diagnostischen Methoden auf drei Haupteinschränkungen. Erstens können serologische Tests akute Infektionen aufgrund der verlängerten Persistenz von Antikörpern nach viraler Clearance¹ nicht unterscheiden. Zweitens zeigen virale Kulturtechniken niedrige Sensitivitätsraten und benötigen mehrere Tage, was die rechtzeitige klinische Entscheidungsfindung erschwert. Drittens zeigen quantitative PCR-Tests zwar eine hohe Spezifität (über 95 %), können sie keine Koinfektionen innerhalb einer einzigen Reaktion nachweisen, was angesichts der gemeldeten CHIKV-DENV-Koinfektionsrate von 12,8 % in Indien^ein erheblicher Nachteil ist. Phylogenetische Überwachung deutet auf einen Paradigmenwechsel hin. Die ECSA-Linie, die während der indischen Epidemie 2019–2022 dominiert war, hat konvergente Mutationen in ihren Hüllproteinen erworben: E1-A226V (erhöht die Infektionsfähigkeit der Mücken) und E2-K252Q (assoziiert mit Immunausweichung). Diese Mutationen haben zu einem Genotyp mit dokumentierter höherer Virulenz geführt, wie in aktuellen Überwachungsstudien aus Kerala und Maharashtra³ berichtet wurde. Gleichzeitig steht China vor Herausforderungen durch die Einfuhr des ECSA-Genotyps, wie im Yunnan-Ausbruch dokumentiert, und anderer Genotypen, wobei autochthone Übertragungen in mehreren Provinzen, darunter Yunnan⁴, gemeldet wurden.

Diese Realitäten schaffen dringenden, ressourcenbegrenzten Bedarf an (i) Differenzialdiagnosen trotz sich überschneidender klinischer Manifestationen⁵, (ii) diagnostische Tests, die die Komplexität der Instrumentierung eliminieren, die typischerweise für konventionelle quantitative Echtzeit-PCR erforderlich ist (qPCR)⁶, und (iii) umfassende Validierung neuartiger Point-of-Care-Technologien, einschließlich RT-LAMP- und CRISPR-basierter Methoden⁵. Um diese diagnostischen Herausforderungen zu bewältigen, schlagen wir einen schnellen Triple-PCR-Test vor, der ein vollautomatisches integriertes System nutzt und die gleichzeitige Erkennung von CHIKV, DENV und ZIKV in einer einzigen Reaktion ermöglicht. Wir validierten die Leistung unseres Triplex qPCR-Tests durch direkten Vergleich mit etablierten Singleplex-Assays⁵, die als Referenzstandard dienten. Die folgenden Abschnitte beschreiben die Verfahren sowohl für den Triplex-Assay als auch für die Referenz-Singleplex-Assays. Die vergleichende Analyse der Ergebnisse beider Methoden wird im Abschnitt Repräsentative Ergebnisse präsentiert.

Protocol

Diese Studie folgt den ethischen Richtlinien des Ethikausschusses des Guangdong Provincial People's Hospital, Southern Medical University, Guangzhou, China (Genehmigungsnummer: KY2025-510-01). Detaillierte Informationen zu den in dieser Forschung verwendeten Materialien (Reagenzien, Chemikalien, Ausrüstung und Software) finden Sie in der Materialtabelle.

1. Teilnehmerauswahl

1. Wählen Sie Teilnehmer im Alter von 18 bis 60 Jahren.
2. Wählen Sie Teilnehmer aus, die innerhalb von 12 Tagen nach Symptombeginn eine akute Fiebererkrankung (axilläres Testosteron ≥ 38 °C) aufweisen, sowie entweder Ausschlag, Arthralgie oder zervikale Lymphadenopathie sowie kürzliche Reisen in Chikungunya-endemische Gebiete; oder asymptomatische Personen mit identischer Reisegeschichte.
3. Ausschluss: Antimikrobielle/antivirale Anwendung innerhalb von 7 Tagen oder fieberhafte Erkrankung, die auf bestätigtes HIV oder Malignität zurückzuführen ist.

2. Probenentnahme und -verarbeitung

1. Überprüfen Sie, ob die Außenverpackung der Probenbox nicht beschädigt ist und nicht abgelaufen ist, und entfernen Sie dann die Innenmaterialien.
2. Positioniere das Subjekt mit ausgestrecktem Arm. Identifizieren Sie die mediane Kubitalvene, legen Sie ein Tourniquet an und desinfizieren Sie die Venenpunktionsstelle mit einem 70%igen Alkoholabstrich.
3. Entnehmen Sie 1~3 ml Blut aus der antecubitalen Vene des Subjekts mit einem antikoagulantenfreien Blutentnahmerohr.
4. Wenden Sie das Rohr vorsichtig 5-8 Mal um und lassen Sie es 30 Minuten bei Zimmertemperatur gerinnen.
5. Zentrifugieren Sie die Blutprobe bei 4 °C, 1000 x g auf einer Zentrifuge, für 10 Minuten. Die nach der Zentrifugation gewonnene Serumprobe kann sofort getestet werden.
6. Aliquotieren Sie das Supernatanten-Serum vorsichtig in sterile Mikrozentrifugenröhren. Verwenden Sie das Serum sofort zur Untersuchung oder lagern Sie Aliquots bei -80 °C bis zur weiteren Analyse der pathogenen Nukleinsäuren mittels qPCR.

3. Automatisierte Triplex-qPCR-Erkennung von CHIKV, DENV und ZIKV

1. Reagenz und Rohrvorbereitung
   1. Holen Sie alle benötigten Reagenzien aus dem Lager und tauen Sie sie bei Raumtemperatur auf.
   2. Untersuchen Sie jedes versiegelte TD-Detektionsrohr visuell auf Schäden oder Dichtungsversagen. Entsorge alle beschädigten Schläuche.
   3. Kurz den TD-Nukleinsäure-Extraktionspuffer für 5 Sekunden vorversetzen, um Homogenität sicherzustellen.
   4. Dosieren aseptisch 500 μL des homogenisierten Puffers in ein TD-Extraktionsreagenzrohr (das violette gefriergetrocknete magnetische Perlen enthält).
   5. Wirbeln Sie die Mischung kräftig 30 Sekunden lang, bis alle Komponenten vollständig gelöst und die Perlen vollständig wieder suspendiert sind.
   6. Übertragen Sie die gesamte rekonstituierte Lösung in ein vorbeschriftetes TD-Detektionsrohr.
2. Probenladen
   1. Pipette 200 μL klares, nicht hemolysiertes und nicht-lipämisches Serum in das vorbereitete TD-Detektionsrohr.
   2. Versiegeln Sie das Rohr sicher und wenden Sie es zehnmal um, um homogen zu mischen.
      HINWEIS: Während der Inversion lassen Sie die Paraffinschicht kurz im Rohr schwimmen. Das ist ein normaler Teil des Prozesses.
3. Instrumentenbetrieb und Datenerfassung
   1. Setzen Sie die versiegelten Detektionsrohre in die vorgesehenen Schlitze des Analysators ein.
   2. Geben Sie auf der Touchscreen-Oberfläche die Beispielidentifikationsinformationen ein.
   3. Drücken Sie dieS-Tart-Erkennung, um den vollautomatischen, geschlossenen Röhren-Workflow zu starten.
      HINWEIS: Das System führt automatisch Barcode-Scans, Nukleinsäureextraktion mittels magnetischer Perlenerfassung und fluoreszenz-PCR-Amplifikation ohne weitere Benutzerintervention durch. Das Standardprogramm beinhaltet einen Denaturierungsschritt bei 95 °C für 3 Minuten, gefolgt von 40 Amplifikationszyklen.
4. Ergebnisinterpretation
   1. Nach Abschluss des Durchlaufs beobachten Sie die Verstärkungsergebnisse für alle drei Ziele (CHIKV, DENV, ZIKV) und die interne Steuerung auf demselben Bildschirm.
   2. Nehmen Sie die automatisch generierte Anzeige "Positiv", "Negativ" oder "Ungültig" für jeden Zielerreger in seinem jeweiligen Fluoreszenzkanal auf.
      HINWEIS: Die interne Software des Systems verwendet eine Zyklusschwelle (Ct) von 37,0 zur automatischen Interpretation. Manuelle Datenanalyse ist nicht erforderlich.

4. Referenz auf Singleplex qPCR-Assays zum Methodenvergleich

1. Herstellung von Nukleinsäureextraktionsreagenzien
   1. Nimm die vorverpackte 96-Well-Platte aus dem Kit. Klopfen Sie vorsichtig auf die 96-Well-Platte, damit sich die Reagenzien und magnetischen Perlen alle am Boden der 96-Well-Platte konzentrieren. Lösen Sie vorsichtig die Aluminiumfolie-Dichtungsfolie ab, vermeiden Sie Vibrationen der 96-Well-Platte, um das Austreten von Flüssigkeit zu verhindern.
   2. In den Spalten 1 und 7 einer 96-Well-Platte werden zuerst 20 μL Proteinase K hinzugefügt, gefolgt von 200~300 μL der zu extrahierenden Probe.
   3. Automatisierte Nukleinsäureextraktion (magnetische perlenbasierte Methode)
      1. Vorverpackte 96-Well-Platten (mit Proben) werden in die entsprechenden Schlitze des automatisierten Nukleinsäureextraktorsystems platziert.
      2. Der Prozess der Nukleinsäureextraktion erfolgt wie folgt: Adsorbiert die mit Nukleinsäure gebundenen magnetischen Perlen mit einem magnetischen Stab in der Laborkammer. Übertragen Sie den Perlenkomplex in das nächste zugewiesene Reagenzloch. Aktivieren Sie das Rührgerät, um die Flüssigkeit durch schnelles und wiederholtes Rühren gründlich mit den magnetischen Perlen zu vermischen. Lassen Sie den automatischen Nukleinsäureextraktor die folgenden Schritte automatisch ausführen: i) Zelllyse: 10 Minuten bei 25 °C. ii) Nukleinsäureadsorption: 15 Minuten bei 70 °C, wobei die magnetische Adsorption dreimal durchgeführt wird. iii) Waschen: 2 Minuten mischen (3 Mal wiederholen), gefolgt von der magnetischen Adsorption zweimal (jeweils 15 Sekunden). iv) Elution: Zweimal ausgeführt (jeweils 5 Minuten), wobei die magnetische Adsorption 3-mal durchgeführt wird. Schließlich erhält man hochreine Nukleinsäuren.
   4. Zur sofortigen Detektion wird das nukleinsäurehaltige Eluat direkt aus den Säulen 6 und 12 aspiriert. Zur Langzeitlagerung werden die verbleibenden Nukleinsäureproben auf -20°C übertragen.
2. Herstellung von Amplifikationsreagenzien
   HINWEIS: Für eine Singleplex-PCR-Reaktion bereiten Sie drei separate PCR-Röhrchen mit drei verschiedenen Enzymen und drei entsprechenden Reaktionsmischungen vor. Schließen Sie die Reagenzvorbereitung in drei separaten Schritten ab. Da die Vorbereitungsschritte ähnlich sind, werden wir unten nur die Vorbereitungsschritte für das CHIKV-Detektionsreagenz demonstrieren.
   1. Entfernen Sie die Nukleinsäureamplifikationslösung und die CHIKV-Reaktionslösung (CHIKV-spezifische Primer/Sonden) aus dem Kit. Nach dem Auftauen werden sie in eine Umgebung von 22~25 °C gegeben, kräftig geschüttelt und anschließend kurz gezentrifugert (1000 x g, 15 s, 22~25 °C).
   2. Berechnen Sie die Gesamtzahl der Reaktionen als N + 2 (wobei N = Anzahl der Testproben, +2 = eine negative und eine positive Qualitätskontrolle). Bereiten Sie die Hauptmischung in einer entsprechend großen Mikrozentrifugen-Röhre vor, indem Sie für jede Reaktion Folgendes kombinieren: 17 μL Nukleinsäure-Amplifikationslösung (mit Puffer, dNTPs, DNA-Polymerase, UDG-Enzym), 3 μL CHIKV-Reaktionslösung (mit Primern, Sonden für CHIKV-Zielgene und IC). Vortex den Master Mix gründlich, um eine vollständige Mischung sicherzustellen. Zentrifugieren Sie das Rohr kurzzeitig bei 10.000 x g für 15 Sekunden bei Raumtemperatur (22~25 °C), um die Lösung am Boden aufzusammeln. Gib 20 μL des Master-Mixes in jede PCR-Reaktionsröhre ein.
   3. Nukleinsäure- und Qualitätskontrollproben hinzufügen: In die oben vorbereiteten PCR-Reaktionsröhren (20 μL) geben Sie jeweils 5 μL Nukleinsäure aus getesteten Proben, positive und negative Kontrolle, wodurch ein Endvolumen von 25 μL pro Röhre erreicht wird; Schließen Sie die Röhren fest ab und führen Sie eine sofortige Zentrifugation durch (1000 x g, 15 s, 22 ~25 °C) und setzen Sie die Röhren dann in das PCR-Instrument.
3. PCR-Verstärkung
   1. Das Radprogramm wird wie folgt festgelegt: Vordenaturierung: 50 °C für 15 Minuten, dann bei 95 °C für 15 Minuten (beide Schritte zusammen bilden einen Zyklus); folgende 2 Schritte für 40 Zyklen: 94 °C Denaturierung für 15 Sekunden und 55 °C Glühung für 45 Sekunden.
   2. Stellen Sie die Fluoreszenzsignal-Detektionsparameter wie folgt ein: FAM-Fluoreszenzkennzeichnung der CHIKV-Gene; VIC-Fluoreszenzkennzeichnung des IC-Gens wird als interne Kontrolle des Kits verwendet. Sammeln Sie Daten bei 55 °C. Nach Abschluss der Reaktion stellen Sie sicher, dass die Daten für zukünftige Analysen gespeichert werden.
   3. Daten mit qPCR-spezifischer Software analysieren
      1. Stichprobeninformationen: Im Bohrlochplatten-Layout-Diagramm der Software werden die Probentypen (z. B. positive Kontrolle, Negativkontrolle, unbekannte Probe, internes Referenzgen usw.) entsprechend den Probenlastpositionen beschriftet.
      2. Platzierung der Reaktionsröhren: Öffnen Sie den Deckel des Heizmoduls des Instruments, legen Sie die versiegelten PCR-Platten/-Röhren gleichmäßig hinein, stellen Sie sicher, dass sie eng mit dem Heizmodul passen, und schließen Sie den Moduldeckel fest (um Temperaturungleichheiten zu vermeiden).
      3. Reaktion starten: Nachdem Sie bestätigt haben, dass die Programmeinstellungen in der Software korrekt sind, klicken Sie auf Start Run und notieren Sie die Experiment-ID für die spätere Referenz.
      4. Den Betrieb stoppen und Schläuche entfernen: Sobald das Programm abgeschlossen ist, warten Sie, bis die Temperatur des Heizmoduls unter 50 °C gefallen ist. Dann öffnen Sie den Deckel und entfernen Sie vorsichtig die PCR-Platte oder die Schläuche. Führen Sie bei Bedarf eine nachgelagerte Analyse oder Probenlagerung durch.
      5. Datenanalyse Bevor Sie mit der Analyse beginnen, bestätigen Sie: i) Die Verstärkungskurven für alle Proben und die interne Steuerung sind charakteristisch S-förmig; ii) Die Fluoreszenzschwelle wird innerhalb der exponentiellen Phase festgelegt, was zu Ct-Werten ≤ 38 Zyklen ergibt (CV < 5 %); iii) Kontrollergebnisse sind gültig und zeigen keine Kontamination an. Wenn eine Bedingung nicht erfüllt ist oder eine Probe eine abnorme Verstärkung zeigt (z. B. eine atypische Kurve oder ein kritischer Bereich Ct), wird die gesamte Charge oder die spezifische Probe entsprechend erneut überprüft.
      6. Verarbeiten Sie die Rohdaten mit der Software zur Bestimmung der CT-Werte unter Verwendung des automatisch ausgewählten Schwellenwerts; eine Probe gilt als positiv, wenn Ct < 38 und seine Verstärkungskurve eine sigmoidale Form aufweisen.

5. Biosicherheit und Abfallentsorgung

1. Alle Materialien werden in einen ausgewiesenen, punktresistenten Biohazard-Behälter übertragen und vor der endgültigen Entsorgung durch das institutionelle Abfallsystem durch Autoklaven dekontaminiert. Übertragen Sie diese Materialien sofort in einen undichten, punktfesten Biohazard-Behälter, der für Hochrisikoabfälle gekennzeichnet ist. Nach institutionellen Richtlinien dekontaminieren Sie alle Abfälle mit verstärkten Produkten durch Autoklavierung (z. B. 121 °C für 30 Minuten), um Krankheitserreger zu inaktivieren und Nukleinsäuren abzubauen. Schließlich entsorgen Sie den sterilisierten Abfall über das vorgesehene System zur medizinischen Abfallwirtschaft.
   HINWEIS: Führen Sie alle Schritte gemäß den Biosicherheitspraktiken der Stufe 2 (BSL-2) durch und verwenden Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung, um die Expositionsrisiken zu minimieren.

Results

Um die Stabilität und Genauigkeit des Triple-PCR-Detektionssystems zu validieren, wählten wir fünf klinisch repräsentative Proben aus unserem internen Labor und zehn externe EQA-Blindproben zur Verifikation aus. Diese fünf repräsentativen klinischen Stichproben umfassen sowohl negative als auch positive Fälle (S1-S5), darunter Proben, die positiv auf CHIKV und DENV getestet wurden, ausgewählt, um die klinische Anwendbarkeit des Tests zu demonstrieren und die interne Validierung der Testleistung zu unterstützen (T...

Discussion

CHIKV ist ein positives, einzelsträngiges RNA-Virus, das zur Alphavirus-Gattung der Familie Togaviridae⁷ gehört. Beschleunigte globale Erwärmung, verstärkter internationaler Handel und die Ausweitung von Tourismusnetzwerken haben zusammen das Risiko einer menschlichen Exposition gegenüber arboviralen Bedrohungen erhöht⁸. Im vergangenen Jahrzehnt hat die rasante Entwicklung der molekularen Diagnostik die Landschaft des Infektionskrankheitsma...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Automatisierter Nukleinsäureextraktor	DAAN	Smart 32	Für DNA-Extraktion
BECKMAN X-12	BECKMAN	ALA04H01	For  Serumzentrifugation 
BSC-1500IIA2-X	BIOBASE	SEDA 20143222263	Biosicherheitsschrank
Elektrozentrifuge	WEALTEC		Zentrifugiere die Restflüssigkeit an der Wand des Rohrs
Vollautomatischer medizinischer PCR-Analysator	Bioustar‌	UP0102	Fluoreszierende quantitative PCR-Amplifikation
Nukleinsäure-Nachweiskit für das Chikungunya-Virus (PCR-fluoreszierende Sondemethode)	DAAN	20250804	Erkennung von  Chikungunya-Virus-Gene
Nukleinsäure-Detektionsset für das Dengue-Virus (PCR-fluoreszierende Probe-Methode)	DAAN	202504003	Erkennung von  Denguevirus-Gene
Nukleinsäure-Nachweiskit für Dengue-, Zika-Virus und Chikungunya-Virus (PCR-fluoreszierende Sondenmethode)	Bioustar‌	20250724	Erkennung von  Dengue-, Zika-Virus- und Chikungunya-Virus-Gene
Nukleinsäure-Nachweiskit für Zika-Virus (PCR-fluoreszierende Sondenmethode)	DAAN	202508041	Nachweis des Zika-Virus  Gene
Nukleinsäureextraktions-Set	DAAN		Nukleinsäureextraktion
SLAN Vollautomatisches medizinisches PCR-Analysesystem	HONGSHI		Datenanalyse
SLAN-96S Echtzeit-PCR-Maschine	HONGSHI	SLAN-96S	Fluoreszierende quantitative PCR-Amplifikation
Gefrierschränke mit ultraniedriger Temperatur (DW-YL450)	MELING	SEDA 20172220091	-20 &°F; C zur Speicherung von Reagenzien
Vortex-5	Kylin-Bell		Zum Mischen von Reagenz