Methodenartikel

Isolierung von alveolären Typ-II-Epithelzellen aus neonatalen, juvenilen und adulten Mauslungen, anpassungsfähig für infektiöse experimentelle Umgebungen

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DOI:

10.3791/69581

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19. Dezember 2025

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1Infection Immunology Research Group, Institute of Medical Microbiology and Hospital Hygiene, Health Campus Immunology, Infectiology and Inflammation, Otto-von-Guericke University Magdeburg, 2Immune Regulation Research Group, Helmholtz Centre for Infection Research, 3Flow Cytometry and Cell Sorting Platform, Helmholtz Centre for Infection Research, 4Experimental Immunology Department, Helmholtz Centre for Infection Research

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll stellt eine auf Flusszytometrie basierende Methode vor, um lebensfähige alveoläre Typ-II-Epithelzellen (AECII) aus neonatalen, juvenilen oder adulten Mauslungen (infiziert oder nicht infiziert) zu isolieren. Dieser Ansatz ermöglicht nachgelagerte molekulare und/oder funktionelle Studien von AECII, um deren Rolle während der Lungenentzündung und -infektion zu identifizieren.

Zusammenfassung

Alveolare Typ-II-Epithelzellen (AECII) tragen maßgeblich zur Immunregulation in der Lunge bei und sind somit Schlüsselelemente, die die pulmonale Homöostase orchestrieren. Diese Funktionen machen AECII besonders relevant im Zusammenhang mit Infektionen mit Atemwegsviren, die das untere Atemwegsepithel angreifen und die alveoläre Integrität stören. Präklinische Mausmodelle sind wichtige Werkzeuge, um die Rolle von AECII im Zusammenhang mit Lungenentzündungen und/oder Infektionen zu erläutern. Dieses Protokoll bietet eine detaillierte und reproduzierbare Pipeline zur Isolierung lebensfähiger und hochgereinigter AECII aus Mauslungen im neonatalen, juvenilen und adulten Stadium. Die Methodik kombiniert mechanische Dissoziation, enzymatische Verdauung und anschließende fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS), um hoch angereicherte AECII-Populationen zu erhalten, die sich als geeignet für nachgelagerte molekulare und funktionelle Analysen erwiesen haben. Für Anwendungen mit pathogenen Viren beinhaltet das Protokoll einen optionalen Paraformaldehyd-(PFA)-Fixierungsschritt, der einen sicheren Umgang unter geringeren Biosicherheitsbedingungen ermöglicht, ohne die RNA-Integrität zu beeinträchtigen. Mit optimierter Zellwiederherstellung über Entwicklungsstadien hinweg und bis zu 1,0 × 10 AECII-Zellen pro adulterLunge unterstützt dieses Protokoll präklinische Studien zu beispielsweise viraler Pathogenese, Epithelfunktion und Regenerationskapazität.

Einleitung

Aufgrund ihrer vielfältigen Rolle in der Lungenentwicklung, Physiologie, Immunität und Reparaturprozessen tragen alveoläre Typ-II-Epithelzellen (AECII) wesentlich zur Erhaltung sowie zur Wiederherstellung der Homöostase nach einer Lungenverletzung bei. Da AECII primäre zelluläre Ziele von pandemischen Viren wie dem Influenza-A-Virus (IAV) oder SARS-CoV-2 sind, stehen ihr Schicksal und ihre Funktionen im Mittelpunkt der infektionsbiologischen Forschung. In diesem Zusammenhang berichteten frühere Studien, dass intrinsische (z. B. genetischer Status1,Alter 2, 3) sowie extrinsische (z. B. mikrobielle Reize4) Hinweise einen großen Einfluss auf AECII-Phänotypen und deren Reaktion auf Umweltauslöser wie luftübertragene Krankheitserreger haben. Bemerkenswert ist, dass eine pulmonale Entzündung anhaltende Veränderungen im transkriptomischen, proteomischen und epigenetischen Status von AECII 5,6 hinterlässt. Die komplexen zellulären Interaktionen von AECII in der Lunge sowie der Beitrag verschiedener biotischer und abiotischer Faktoren zur AECII-Biologie unterstreichen die Bedeutung geeigneter in vivo Modelle, die eine detailliertere Untersuchung dieser Zellen ermöglichen.

FACS stellt die aktuelle Goldstandardtechnik zur Anreicherung und Reinigung von Primärzellen aus menschlichem und tierischem Gewebe dar, da sie die gleichzeitige Umsetzung multiparametrischer Selektion (oder Ausschluss) ermöglicht und die einzige Methode darstellt, bei der zellintrinsische Eigenschaften wie Größe, Granularität oder Autofluoreszenz zuverlässig in den Auswahl-/Ausschluss-Workflow integriert werden können. Bis heute bieten einige veröffentlichte Protokolle Methoden zur FACS-basierten Isolierung primärer Maus-AECII. Sinha und Lowell berichteten über eine Methode zur AECII-Isolierung aus erwachsenen Mäusen, die einen ähnlichen Gewebeverarbeitungs- und Durchflusszytometrie-Workflow aufweist und die AECII-Anreicherung vor FACS durch perlenbasierte magnetische Depletion auf Nicht-Zielzellen7 beinhaltete. Ein weiteres Protokoll beschreibt die Verwendung der magnetisch-perlenbasierten Isolierung von EpCAM-positiven Lungenzellen oder den Einsatz transgener Mäuse, die eine FACS-basierte Isolierung von AECII auf Basis der Identifikation von SPC-positiven (GFP+)-Zellen mit einem bedingten Reporter-Mausmodell8 ermöglichten. Während die SPC-Expression AECII in Mauslungen zuverlässig identifiziert, ist diese Methodik nur in Kombination mit einem speziellen Maus-Reporterstamm anwendbar und schließt somit eine AECII-Isolierung von z. B. Wildtypmäusen aus. Wichtig ist, dass zwar ähnliche Erträge und Reinheit von AECII berichtet wurden, aber keines dieser Protokolle Anpassungen für die Isolierung von AECII aus neonatalen, juvenilen oder infizierten Wirten bot.

Zu diesem Zweck umfasst das aktuelle Protokoll eine Reihe angepasster Arbeitsabläufe zur Isolierung hochreiner und lebensfähiger AECII aus Mäusen mittels enzymatischer Verdauung in Kombination mit FACS. Diese hochmoderne Methodik basiert auf einem zuvor entwickelten FACS-basierten AECII-Isolationsprotokoll9 und enthält wichtige Verbesserungen, die die AECII-Reinheit durch die Hinzufügung weiterer Identifikations- und Ausschlussmarker verbessern. Wichtig ist, dass dieses aktualisierte Protokoll AECII-Abruf sowohl über "touched" als auch "untouched" Sortierstrategien bietet. Darüber hinaus beinhaltet dieses Protokoll, da die postnatale Lungenentwicklung mit bedeutenden Veränderungen in der zellulären Zusammensetzung und strukturellen Reorganisation verbunden ist, Anpassungen zur Optimierung der AECII-Entnahme aus neonatalen, juvenilen und adulten Lungen. Dies ermöglicht es, die AECII-Biologie während der Ontogenese zu untersuchen, z. B. im Kontext von Lungenreifung oder Infektionsbiologie. Dieser Ansatz kann verwendet werden, um lebensfähige AECII für eine spätere Ex-vivo-Kultivierung und Infektion mit IAV zu erhalten. Zusätzlich beinhaltet dieses Protokoll ein Fixierungsverfahren mit dem chemischen Fixativ Paraformaldehyd (PFA). Dieser Schritt erfordert die Inaktivierung verschiedener Atemwegskrankheitserreger (z. B. SARS-CoV-2, IAV) in Lungenzellsuspensionen, was wiederum eine anschließende Probenbehandlung (einschließlich FACS-basierter AECII-Isolation) in Einrichtungen mit geringeren Biocontainment-Vorsichtsmaßnahmen ermöglicht. Während die PFA-basierte Fixierung eine spätere ex-vivo-Kultivierung von AECII für funktionelle Studien ausschließt, ermöglicht sie die Gewinnung erheblicher Mengen intakter RNA für die transkriptomische Profilierung von AECII, um deren biologische Rolle im Zusammenhang mit Atemwegsinfektionen aufzuklären.

Protokoll

Alle Tiere wurden gezüchtet und in der Tieranlage des Helmholtz Centre for Infection Research unter spezifischen pathogenfreien (SPF) Bedingungen und gemäß nationalen und institutionellen Richtlinien gehalten. Die Euthanasie naiver Mäuse zur anschließenden AECII-Isolierung erfolgte gemäß den nationalen Richtlinien der Society of Laboratory Animal Science (GV-SOLAS, Gesellschaft für Versuchstierkunde). Männliche Mäuse mit einem C57BL/6 genetischen Hintergrund wurden im Alter von 2 Tagen (Neugeborene), 3 Wochen (Jungtier) oder 8–12 Wochen (Erwachsener) eingesetzt. Die Reagenzien und die verwendeten Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Vorbereitung der Mauslunge

  1. Opfere die Maus (nach institutionell genehmigten Protokollen):
    1. Für erwachsene und junge Mäuse: Verabreichen Sie eine Anästhesieüberdosis (z. B. Ketamin/Xylazin) mittels peritonealer Injektion.
    2. Bei Neugeborenenmäusen : Enthaupten.
      HINWEIS: Vermeiden Sie eine zervikale Verrenkung bei erwachsenen und jungen Mäusen, da dieses Verfahren die Luftröhre schädigen kann.
  2. Sterilisiere das Mausfell mit 70 % (v/v) Ethanol.
    VORSICHT: Entzündliche Flüssigkeit. Augenreizung. Halte dich von Hitze fern. Halte den Behälter fest geschlossen und mache einen ventralen Mittellinienschnitt, um innere Organe freizulegen.
  3. Entfernen Sie vorsichtig die Haut und das Peritoneum.
  4. Die Maus wird ausgeblutet, indem sowohl die Halsvenen als auch die Vena cava durchtrennt werden, sodass das Blut aus dem Körper abfließen kann.
  5. Entfernen Sie vorsichtig das Zwerchfell, um Herz und Lunge freizulegen.
    HINWEIS: Achten Sie darauf, die Lunge nicht zu verletzen. Eine Perforation des Lungengewebes würde die Effizienz der anschließenden enzymvermittelten Verdauung des Lungengewebes erheblich beeinträchtigen.
  6. Öffne den Brustkorb mit einer Schere.
  7. Führe eine Kanüle in den rechten Herzkammer ein und perfundiere mit kalter phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), bis das Restblut aus der Lunge entfernt ist und das Lungengewebe blass wird:
    1. Für erwachsene Mäuse: Verwenden Sie eine 26-G-Kanüle und perfundieren Sie die Lunge mit 10 ml PBS.
    2. Bei Neugeborenenmäusen : Verwenden Sie eine 30-G-Kanüle und perfundieren Sie die Lunge mit 1 ml PBS.
      HINWEIS: Lassen Sie die Lunge junger Mäuse nicht perfundieren, um eine Platzung der alveolaren Struktur durch übermäßigen Druck in den Lungengefäßen zu vermeiden. Die Perfusion könnte bei entzündeten Lungen weniger wirksam sein, und die Farbveränderung im Lungengewebe könnte weniger ausgeprägt sein. Bei Bedarf kann vor dem nächsten Schritt bei erwachsenen und jungen Mäusen eine bronchoalveolare Lavage durchgeführt werden.

2. Enzymatische Verdauung des Lungengewebes

  1. Erwachsene und junge Mäuse:
    1. Legen Sie die Luftröhre frei, indem Sie die Speicheldrüsen und den umliegenden Muskel entfernen.
    2. Führe eine 22-G-Kabinenkanüle in die Luftröhre, entferne die Nadel und bewege den Kunststoffkatheter in Richtung Lunge.
    3. Binden Sie ein Stück Garn sicher um Luftröhre und Katheter, um es an Ort und Stelle zu halten.
    4. Bereiten Sie das Lungengewebe vor, indem Sie Dispasen erzeugen.
      VORSICHT: Kann bei Einatmen Allergie- oder Asthmasymptome oder Atembeschwerden verursachen. Vermeiden Sie es, Staub einzuatmen. Tragen Sie Atemschutz. Entsorge den Inhalt/Behälter an eine zugelassene Abfallentsorgungsanlage.) Durch den in die Luftröhre eingeführten Katheter:
      1. Für erwachsene Mäuse: 2 ml Dispase einführen.
      2. Für junge Mäuse: 500 μL Dispase einfügen.
        HINWEIS: Verwenden Sie eine Spritze mit einer Luer-Slip-Verbindung, um den Austausch der Spritzen zwischen den Schritten 2.1.4 und 2.1.5 zu erleichtern. Um eine effiziente enzymatische Verdauung des Lungengewebes zu gewährleisten, ist es entscheidend, die bronchoalveolären Räume vollständig zu füllen.
    5. Die Spritze wird ausgetauscht und mit schmelzarmer Agarose (1 % (w/v), 45 °C) wiederholt, um die Struktur während der Verarbeitung zu erhalten.
      1. Für erwachsene Mäuse: Verwenden Sie 500 μL Agarose mit niedriger Schmelze.
      2. Für junge Mäuse: 200 μL Agarose mit niedriger Schmelze verwenden.
        HINWEIS: Um Rückfluss der Flüssigkeiten zu vermeiden, lassen Sie die Spritze angebracht.
        HINWEIS: Vor der Anwendung: Agarose mit niedriger Schmelze mit Erhitze (95 °C) auflösen, Agaroselösung auf 45 °C abkühlen lassen, z. B. in einem Thermoblock.
    6. Decken Sie die Lunge mit Laborpapier ab und fügen Sie Eis hinzu, damit die Agarose für 2 Minuten fest werden kann.
    7. Entferne Eis, Seidenpapier, Spritze und Katheter.
    8. Binden Sie das Garn so, dass die Luftröhre geschlossen wird, damit das Enzym in den unteren Atemwegen bleibt.
    9. Entferne Herz und Thymus.
    10. Schneide die Luftröhre oberhalb des Garns durch und entferne die intakte Lunge aus der Brust.
    11. Übertragen Sie die Lunge in ein 15-mL-Rohr mit vorgewärmter Dispase (37 °C) und inkubieren Sie das Lungengewebe in Dispase für 45 Minuten bei Raumtemperatur (20–25 °C).
      1. Für erwachsene Mäuse: Inkubieren Sie die Lunge in einer 2-mL-Dispase.
      2. Bei jungen Mäusen: Inkubieren Sie die Lunge in einer Dispase von 1,5 mL.
  2. Neugeborene Mäuse
    1. Sammeln und zerkleinern Sie einzelne Lungenlappen mit einer feinen Schere im Deckel eines 2-mL-Rohrs.
    2. Fügen Sie eine Dispase von 500 μL hinzu, schließen Sie den Deckel und wenden Sie das Rohr um, um sicherzustellen, dass das gesamte Gewebe mit Dispase bedeckt ist.
    3. Inkubieren Sie das Lungengewebe in Dispase bei Raumtemperatur für 45 Minuten.

3. Vorbereitung des Lungengewebes

  1. Für erwachsene und junge Mäuse:
    1. Entfernen Sie die Lunge aus der Dispase und sezieren Sie die Lungenlappen vom Bronchialstamm.
    2. Setzen Sie die Lungenlappen in eine Petrischale (Durchmesser: 8,5 cm) mit 7 mL DMEM + HEPES, 1 μg/mL (Endkonzentration) Anti-CD16/32-Blockierungsantikörper und 100 μL DNAse (Endkonzentration ~600 Kunitz-Einheiten).
      VORSICHT: Kann bei Einatmen Allergie- oder Asthmasymptome oder Atembeschwerden verursachen. Vermeiden Sie es, Staub einzuatmen. Tragen Sie Atemschutz. Entsorgen Sie den Inhalt/Behälter an eine zugelassene Abfallentsorgungsanlage.
    3. Zerstören Sie das Lungengewebe mit einer Pinzette.
      HINWEIS: Um eine effiziente enzymatische Verdauung des Lungengewebes zu gewährleisten, ist es entscheidend, eine gründliche mechanische Gewebezersetzung sicherzustellen.
    4. Inkubiere 10 Minuten bei Zimmertemperatur, während du sanft mit 200 U/min schaukelst.
      HINWEIS: Die Zellsuspension kann bei 4 °C bis zum nächsten Schritt gelagert werden, falls erforderlich.
  2. Für Neugeborenemäuse:
    1. Übertragen Sie die Dispase, einschließlich des verdauten Gewebes, in eine Petrischale (Durchmesser: 5,4 cm), die 3 mL DMEM + HEPES, 1 μg/mL (Endkonzentration) Anti-CD16/32-Blockierungsantikörper und 100 μL DNAse (Endkonzentration ~ 600 Kunitz-Einheiten) enthält.
    2. Inkubiere 10 Minuten bei Zimmertemperatur, während du sanft mit 200 U/min schaukelst.
      HINWEIS: Die Zellsuspension kann bei 4 °C bis zum nächsten Schritt gelagert werden, falls erforderlich.
  3. Fortsetzung für alle Altersgruppen:
    1. Filtern Sie die Zellsuspension durch eine Reihe von Nylon-Sieben mit abnehmender Porengröße (100 μm - 70 μm - 40 μm), um Ablagerungen und große Aggregate zu entfernen.
    2. Spülen Sie Zellsiebe und Schläuche vorsichtig aus, um den Zellverlust zu minimieren. Wenn Proben zusammengelegt werden, können Zellsuspensionen von Mäusen derselben Gruppe durch dieselben Zellsiebe geleitet werden.
      HINWEIS: Im Falle einer Verstopfung wechseln Sie die Zellfilter.
    3. Je nach Volumen wird die gefilterte Zellsuspension auf ein oder mehrere 15-mL-Röhren übertragen und die Zellsuspension 12 Minuten bei 140 x g bei 4 °C zentrifugiert.
    4. Entsorgen Sie das Supernatant und lassen Sie das Zellpellet im Erythrozytenlysepuffer (ACK-Puffer) wieder aufhängen.
      1. Für erwachsene und juvenile Mäuse: 2 ml Erythrozyten-Lysepuffer verwenden und 2 Minuten inkubieren.
      2. Bei Neugeborenenmäusen : 3 ml Erythrozyten-Lysepuffer verwenden und 3 Minuten inkubieren.
    5. Die Erythrozytenlyse stoppen, indem Sie das 15-ml-Rohr mit DMEM + HEPES + 10 % (v/v) FBS füllen und erneut 12 Minuten bei 140 x g bei 4 °C zentrifugieren.

4. Antikörperfärbung zur fluoreszenzaktivierten Zellsortierung

  1. Die Zellen werden in einer Antikörperfärbungslösung mit Anti-F4/80, Anti-CD93, Anti-CD11c, Anti-CD19, Anti-CD31, Anti-CD11b, Anti-CD16/32, Anti-CD45, Anti-CD24 und Anti-CD326 fluorochromgekoppelten Antikörpern resuspendiert, die in DMEM + HEPES + 10 % (v/v) FBS hergestellt werden.
    HINWEIS: Für optimale Färbungsergebnisse verwenden Sie nur vortitrierte Antikörper. Wenn AECII für die Zellsortierung unberührt bleiben müssen, sollte Anti-CD326 nicht in die Antikörperfärbungslösung aufgenommen werden.
    1. Für erwachsene Mäuse: Verwenden Sie 600 μL Antikörperlösung pro Lunge.
    2. Bei jungen Mäusen : Verwenden Sie 400 μL Antikörperlösung pro Lunge.
    3. Bei Neugeborenenmäusen : Verwenden Sie 200 μL Antikörperlösung pro Lunge.
  2. Inkubieren Sie die Zellsuspension mit den Antikörpern 10 Minuten lang bei 4 °C im Dunkeln.
  3. Nach der Inkubation werden die Zellen gewaschen, indem Sie das Rohr mit DMEM + HEPES + 10 % (v/v) FBS füllen.
  4. Zentrifugiere 12 Minuten bei 140 x g bei 4 °C.
  5. Suspendiere die Zellen DMEM + HEPES + 10 % (v/v) FBS:
    1. Bei erwachsenen Mäusen: Wieder in 300 μL pro Lunge suspendieren.
    2. Bei jungen Mäusen : In 200 μL pro Lunge resuspendieren.
    3. Bei Neugeborenenmäusen : Wieder in 100 μL pro Lunge suspendieren.

5. Sortierung der AECII

HINWEIS: Instrumentenvorbereitung: Installation einer 100 μm Düse zur Sortierung von AECII mit einem FACS-Gerät.

  1. Direkt vor der Sortierung filtern Sie die Zellen durch ein 50-μm-Zellsieb. Spülen Sie das Zellsieb mit DMEM, ergänzt mit HEPES und 10 % (v/v) FBS, um übermäßigen Zellverlust zu verhindern:
    1. Erwachsene Mäuse : Spülen Sie das Zellsieb mit 300 μL pro Lunge ab.
    2. Junge Mäuse: Spülen Sie das Zellsieb mit 200 μL pro Lunge ab.
    3. Neugeborene Mäuse : Spülen Sie das Zellsieb mit 100 μL pro Lunge ab.
  2. Suspendiere die Zellen direkt vor dem Sortieren wieder, indem du sie vortexierst.
  3. Gate für AECII, indem Ereignisse identifiziert werden, die i) eine hohe Seitenstreuung (SSC-hoch) haben, II) negativ für die Linienfluorochrome sind und III) positiv für das CD326-Fluorchrom gekoppelt mit dem Anti-CD326-Antikörper sind.
    HINWEIS: Verwenden Sie Fluorochrome mit hohen bis sehr hohen Helligkeitsindizes (wie APC, PE und BV785), um die Unterscheidung zwischen Nicht-AECII und AECII zu erleichtern. Für einen unberührten Sortieransatz (Ausschluss von Anti-CD326 in der Färbungslösung) werden AECII als liniennegativ, SSC-hoch und autofluoreszenz-positiv/hoch identifiziert. AECII-Autofluoreszenz kann in Grünlichtdetektoren identifiziert werden, z. B. FITC- oder GFP-Detektoren.
  4. Doublets oder Aggregate unter Verwendung der Vorwärtsstreuungshöhe vs. Gebiet (FSC-H vs. FSC-A) und seitlicher Streuhöhe vs. Gebiet (SSC-H vs. SSC-A).
  5. Sammeln Sie die sortierten Zellen in einem Röhrchen, das DMEM enthält, ergänzt mit HEPES und 10 % (v/v) FBS sowie Zentrifuge zur weiteren Analyse oder Kultur.

6. RNA-Isolierung aus PFA-fixiertem AECII (optional)

HINWEIS: Falls AECII von Mäusen isoliert wird, die z. B. mit respiratorischen Viruspathogenen infiziert wurden, muss die AECII-Isolierung je nach Krankheitserreger unter BSL2- oder BSL3-Bedingungen durchgeführt werden. Wenn das Experiment unter den geeigneten Sicherheitsbedingungen keinen Zugang zur Zellsortierung hat, kann AECII, das mit dem oben beschriebenen Protokoll isoliert wurde, nach der Antikörperfärbung mit PFA fixiert werden. Dieser Schritt inaktiviert die Krankheitserreger10,11 und somit kann eine anschließende flowzytometrische AECII-Sortierung unter BSL1-Bedingungen erfolgen. Obwohl die Zellen aufgrund des Fixationsprozesses nicht mehr für funktionelle Assays eingesetzt werden können, eignen sie sich für molekulare Analysen.

  1. Zur Inaktivierung von Viren sollten antikörpermarkierte Einzelzellsuspensionen in 500 μL mit 4 % (w/v) PFA fixiert werden.
    VORSICHT: Brennbarer Feststoff. Schädlich, wenn sie geschluckt oder eingeatmet wird. Verursacht Hautreizungen und schwere Augenschäden. Kann eine allergische Hautreaktion, Atemreizungen und Krebs verursachen. Wird vermutet, genetische Defekte zu verursachen. Halte dich von Hitze fern. WENN GESCHLUCKT: Rufen Sie ein GIFTZENTRUM oder einen Arzt an, wenn Sie sich unwohl fühlen. INHALIERT: Bringen Sie die Person an frische Luft und halten Sie sie angenehm zum Atmen. Ruf ein GIFTZENTRUM oder einen Arzt an, wenn du dich unwohl fühlst. WENN IN DEN AUGEN: Spülen Sie vorsichtig mehrere Minuten mit Wasser. Entfernen Sie Kontaktlinsen, falls vorhanden und einfach zu machen. Spülen Sie weiter. BEI EXPONIERTER ODER BESORGNIS: HOL ÄRZTLICHEN RAT ODER HILFE EIN.
    HINWEIS: In Übereinstimmung mit den 3R-Richtlinien wurden AECII von nicht infizierten Mäusen in dieser Studie verwendet. AECII waren bei Raumtemperatur auf 10 Minuten festgelegt. Die Fixierungsdauer muss individuell für jeden Krankheitserreger getestet werden, der ein potenzielles Risiko für Mensch und Umwelt darstellt. Die anschließende Sortierung unter S1-Bedingungen erfordert eine vorherige Überprüfung in einem BSL2- oder BSL3-Labor, dass nach der PFA-Fixierung kein replizierbares Virus vorhanden ist.
  2. Nach der Fixierung werden die Zellen mit DMEM gewaschen und 15 Minuten bei 140 x g zentrifugiert.
  3. Die Zellen werden in 300 μL DMEM + HEPES + 10 % (v/v) FBS neu suspendiert und die Zellsuspension durch ein 100 μm Zellsieb geleitet.
  4. Spülen Sie das Zellsieb mit einem zusätzlichen 300 μL DMEM + HEPES + 10% (v/v) FBS-Medium, um übermäßigen Zellverlust zu verhindern.
  5. Sortiere die Zellen wie in Schritt 5 beschrieben. "Sortierung von AECII".
    HINWEIS: Nach verpflichtender experimenteller Verifikation, dass ein Virus durch eine Behandlung mit 4 % (w/v) PFA inaktiviert wurde, kann AECII unter BSL1-Bedingungen sortiert werden.
  6. Für RNA-Isolierung aus PFA-fixierten Zellen verwenden Sie das RNeasy FFPE Kit.
    VORSICHT: Dieses Set enthält gefährliche Chemikalien. Befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers. Achten Sie auf das beigefügte Sicherheitsdatenblatt mit folgenden Anpassungen:
    1. Nach dem Sortieren zentrifugieren Sie die Zellen 15 Minuten bei 140 x g bei 4 °C.
    2. Die Zellen in 150 μL Buffer PKD wieder aufhängen und in ein 1,5 mL Rohr übertragen.
    3. Fügen Sie 10 μL Proteinase K hinzu und inkubieren Sie bei 56 °C für 15 Minuten, gefolgt von der Inkubation bei 80 °C für bis zu 15 Minuten, abhängig vom Zellanzahl (siehe Tabelle 1).
  7. Setzen Sie den RNA-Isolationsprozess gemäß dem Protokoll fort, einschließlich DNase-Behandlung, Waschschritte und abschließender Eluation in 30 μL RNase-freiem Wasser.

Ergebnisse

Das hier beschriebene Protokoll stellt eine optimierte und detaillierte Methode zur Isolierung und Analyse von AECII aus Mauslungengewebe in verschiedenen Entwicklungsstadien dar, von neonatalen bis hin zu juvenilen und erwachsenen Mäusen. Die Methodik beinhaltet mechanische und enzymatische Lungendissoziation, kombiniert mit einem optimierten Flow cytometrischen Zellsortier-Workflow, wobei benutzerdefinierte Protokolle verwendet werden, die sich für die Verarbeitung von Proben infizierter Tiere für die anschließende Flow Sorting unter BSL1-Bedingungen eignen.

Die experimentellen Daten zeigten eine hohe Wirksamkeit dieses Isolationsverfahrens (zusammengefasst in Abbildung 1) bei der Erzeugung lebensfähiger und hochreiner (>95 %) AECII-Populationen. Flow-Sorting erzeugte reine AECII-Populationen, wobei die Nachsortierungsanalyse nahezu 100 % Spezifität für etablierte zelluläre Marker validierte (Abbildung 2). Die Quantifizierung von Postsort-Zellproben zeigte hohe Erträge zwischen 0,15 ×10,6 lebensfähigen AECII aus neonatalen Lungen und 1,0 × 10,6 Zellen aus adulten Proben pro Ganzlungenvorbereitung (Abbildung 3A). Isolierte AECII behielten während des gesamten Isolationsprozesses eine typische Morphologie (Abbildung 3B) und zelluläre Integrität (Abbildung 3C). Zusätzlich wurde die Anwendbarkeit des Protokolls für funktionelle Studien durch erfolgreiche ex-vivo-Infektionen mit einem mausangepassten IAV (H1N1, Stamm A/Puerto Rico/8/34) bestätigt, das das mCherry-Reporterprotein (IAV-mCherry12) exprimierte, wobei die Fähigkeit der Zellen zur Unterstützung der viralen Replikation demonstriert wurden (Abbildung 4).

Um experimentelle Arbeitsabläufe zu unterstützen, die eine Probenfixierung erfordern, beinhaltet das Protokoll einen spezialisierten RNA-Extraktionsansatz unter Verwendung der PFA-Fixierung. Eine gründliche Untersuchung der RNA-Qualität aus PFA-fixierten AECII zu verschiedenen Verarbeitungszeitpunkten zeigte, dass hochwertige RNA, die für nachgelagerte molekulare Analysen geeignet ist, zuverlässig aus fixierten Proben extrahiert werden können (Tabelle 1). Die Qualität der extrahierten RNA zeigte einen direkten Zusammenhang mit der Dauer der thermischen Behandlung bei 80 °C während des Extraktionsverfahrens und bot klare Optimierungsrichtlinien basierend auf den spezifischen experimentellen Bedürfnissen (Tabelle 1, Abbildung 5). Die Validierung mittels quantitativer Reverse-Transkriptions-PCR-Analyse (qRT-PCR) zeigte eine erfolgreiche Amplifikation sowohl der Housekeeping-Gene (Ribosomprotein S9, Rps9) als auch AECII-spezifischer Marker (Tensidprotein C, Sftpc) mit PFA-fixierten Proben und frischen Kontrollpräparaten (Abbildung 6).

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Abbildung 1: Schematischer Arbeitsablauf für die AECII-Isolierung aus neonatalen, juvenilen und adulten Mauslungen mittels enzymatischer Gewebeverdauung und zytometrischer Flow-Zellsortierung. Das Diagramm zeigt die systematische Verarbeitung von Mauslungen aus verschiedenen Altersgruppen. Auf die Euthanasie von Mäusen und Lungenextraktion folgen eine mehrstufige enzymatische Verdauung mit Dispase zur Gewebezersetzung. Nach der mechanischen Störung werden die Zellen durch eine Reihe von Filtrationsschritten mit abnehmender Porengröße gereinigt. Anschließend werden Erythrozyten lysiert. Die spezifische Anreicherung von AECII erfolgt durch negative Selektion mittels Antikörpermarkierung gegen hämatopoietische Marker (CD45, CD11b, CD11c, F4/80, CD19, CD16/32), Endothelmarker CD31, Thrombozytenmarker CD93 und bronchiale Epithelzellmarker CD24, positive Selektion von Epithelzellen mittels einer Antikörpermarkierung gegen CD326 und anschließende Flowzytometrie-Sortierung basierend auf dem charakteristischen SSC-Hoch Profil des granularen AECII. Dieses Protokoll ermöglicht die Isolierung hochreiner (≥ 95 %) lebensfähiger primärer AECII für nachgelagerte funktionelle und molekulare Analysen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 2: Repräsentative Gating-Strategie zur Isolierung von AECII aus erwachsenen Mäusen. (A) Lungen-Einzelzell-Suspensionen wurden mit Antikörpern gegen folgende Antigene gefärbt: F4/80, CD93, CD11c (gekoppelt mit APC) und CD19, CD31, CD11b, CD16/32, CD45, CD24 (gekoppelt mit PE) und CD326 (gekoppelt mit BV785). (B) Neuanalyse (A) zur Reinheitsanalyse. Sortierte AECII wurden erneut analysiert, um die Reinheit von 97,2 % von AECII zu bestätigen. (C) Repräsentative Fluoreszenzmikroskopie-Bilder von AECII nach der Sortierung. Die Kerne wurden mit DAPI (blau) gefärbt. Die intrazelluläre Färbung erfolgte mit einem primären Anti-SPC-Antikörper (Art: Kaninchen), und die sekundäre Färbung erfolgte mit Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG gekoppelt mit Alexa 594 (rot). AECII, nur mit DAPI und sekundären Antikörpern gefärbt, und Splenozyten, gefärbt mit primären und sekundären Antikörpern, dienten als relevante Kontrollen, was auf spezifische Bindung von Anti-SPC sowie Anti-RabbitAlexa 594 hinweist. Maßstabsbalken: 20 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

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Abbildung 3: Ertrag, Morphologie und Vitalität von AECII nach fluoreszenzaktivierter Zellsortierung. (A) Gesamtzahl der lebensfähigen AECII pro Lunge, die von neonatalen, jungen und erwachsenen Mäusen erhalten wurden. (B) Lichtmikroskopiebild der sortierten AECII-Nachbearbeitung. Skalenbar: 75 μm. (C) AECII-Viabilität durch Trypan-Blaufärbung nach der Sortierung beobachtet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 4: Ex-vivo-Infektion der sortierten AECII mit IAV-mCherry. AECII-Zellen, die aus erwachsenen Mäusen isoliert wurden, wurden ex vivo in matrigelbeschichteten Gewebekulturplatten über Nacht kultiviert, um eine Anhaftung zu ermöglichen. Anschließend wurden die Zellen 8 Stunden lang mit IAV-mCherry (Multiplizität der Infektion 2) infiziert. Ein zeitabhängiger Anstieg der mCherry-Signalintensität wurde beobachtet. Maßstabsleiste: 200 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

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Abbildung 5: RNA-Integrität von 4 % PFA-fixierten AECII. Repräsentative RNA-Profile von PFA fixierten und sortierten AECII nach RNA-Isolation mit dem Qiagen FFPE RNeasy Kit mit Modifikationen. Spezifische Spitzen für 18S- und 28S-rRNA sowie die RNA-Qualitätsnummer (RQN) stellen die RNA-Integrität und -Qualität für intakte isolierte RNA aus PFA-fixierten AECII dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 6: Amplifikationskurven des Rps9-Housekeeping-Gens und des AECII-spezifischen Gens Sftpc aus der Kontrolle (unbehandelt) und 4 % PFA-fixierten AECII. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

BeispielBrutzeit bei 80 °C28S/18SRQNRNA konzentriert [ng/μ]
Steuerung 0,5x106-2105.8
Control 1x106-1.91012.3
PFA fixiert 0,5x106526.45.5
PFA fixiert 0,5x106101.98.13.7
PFA fixiert 0,5x106151.88.22.76
PFA fixiert 1 x106528.26.26
PFA fixiert 1 x106101.18.45.12
PFA fixiert 1 x106150.98.55

Tabelle 1: Qualität der RNA, die aus 4 % PFA fixiertem AECII isoliert wurde – Auswirkungen unterschiedlicher Fixierungszeiten. RNA aus AECII wurde gemäß dem Herstellerprotokoll (FFPE RNeasy Kit) isoliert, mit den in Schritt 6 beschriebenen Modifikationen. Die fixierten Zellen wurden bei 80 °C für entweder 5, 10 oder 15 Minuten inkubiert, um die RNA aus der Probe zu elutieren. Die RNA-Integrität wurde mit dem Fragmentanalysator von Agilent bestimmt.

Diskussion

Das hier beschriebene optimierte Protokoll bietet einen zuverlässigen und reproduzierbaren Ansatz zur Isolierung und Analyse von AECII aus Mauslungengewebe im neonatalen, jugendlichen und Erwachsenenalter. Darüber hinaus bietet es vor der Sortierung einen optionalen PFA-Fixierungsschritt, der es ermöglicht, AECII unter BSL1-Bedingungen aus Mäusen zu sortieren, selbst wenn sie zuvor mit Atemwegskrankheitserregern infiziert waren. Durch die Kombination aus sorgfältig durchgeführter Lungenexposition und Perfusion, gefolgt von intratrachealer Enzymimplantation und niedrigschmelzender Agarose in die Lunge wird die Gewebestruktur erhalten, was die Rückgewinnung hochwertiger Einzelzellsuspensionen für die nachgelagerte Analyse ermöglicht. Die Hinzufügung von Flowzytometrie-Sortierung auf Seitenstreueigenschaften, lineage-negativem Gating und positiver Selektion für CD326-positive Zellen führte zu bemerkenswert reinen Populationen von AECII. Eine solche Reinheit ist besonders wichtig, um sicherzustellen, dass die nachgeschalteten molekularen und funktionellen Assays repräsentativ für die intrinsische AECII-Biologie sind und nicht durch kontaminierende Zelltypen gestört werden, was die Interpretierbarkeit von Genexpressions- und Virus-Wirt-Interaktionsstudien verbessert.

Das oben erwähnte Protokoll beinhaltet den Ausschluss von nicht-AECII mittels einer Vielzahl fluoreszenzmarkierter Antikörper, die gegen leukozytische und nicht-leukozytäre Antigene gerichtet sind, sowie die anschließende positive Selektion von AECII durch Seitenstreueigenschaften und die Expression des epithelialzellspezifischen Moleküls CD326. Obwohl gezeigt wurde, dass diese Methodik zu hochreinen AECII-Populationen führte (unter Verwendung von SPC, einem typischen AECII-Marker), konnte die Reinheit der erhaltenen Populationen bisher nur mittels post-sortierender intrazellulärer Färbung bestätigt werden. Dieses Protokoll kann angewendet werden, um AECII aus SARS-CoV-2- und Influenzavirus-infizierten Lungen zu isolieren, wobei AECII hauptsächlich vom Virus angegriffen werden und unterschiedliche zelluläre Anpassungen zeigen1. Diese Methode ist jedoch möglicherweise nicht geeignet, um Maus-AECII im Zusammenhang mit Lungenkrebsbiologie zu isolieren, da EpCAM (CD326) auch von Lungenkrebszellen bei Mäusen und Menschen exprimiertwird. Für diese Studien könnte der Einsatz transgener Mausstämme, die fluoreszierende Proteine unter der transkriptionellen Kontrolle des Spc-Promotors exprimieren, einen geeigneteren Ansatz für die zuverlässige Isolierung primärer AECII bieten.

Eine Ausbeute von 0,15 × 106 lebensfähigen AECII pro neonataler Lunge und bis zu 1,0 × 106 Zellen pro adulter Lunge verdeutlicht die Effizienz und Skalierbarkeit des Protokolls. Ein großes Hindernis für die erfolgreiche Isolierung großer AECII-Mengen ist die ineffiziente enzymatische Verdauung und die mechanische Auflösung des Lungengewebes. Daher ist es entscheidend, die bronchoalveolären Räume in Schritt 2.1.4 vollständig mit dem Enzym zu füllen und in Schritt 3.1.3 sorgfältig die mechanische Gewebedesintegration durchzuführen. Eine effektive enzymatische Verdauung ergibt eine trübe Zellsuspension mit minimalem Anteil sichtbarer Aggregate, die in den folgenden Filterschritten meist mit einem Kolben zerlegt werden kann. Größere Aggregate, die nicht durch das Zellsieb passieren können, entstehen meist als Folge unzureichender enzymatischer Verdauung. Beachten Sie, dass es nicht empfohlen wird, die enzymatischen Verdauungszeiten zu verlängern, da dies sich negativ auf die nachfolgende Immunfärbung14 und damit auf die Genauigkeit der FACS-basierten AECII-Isolierung auswirken kann.

Neben der Effizienz der enzymatischen und mechanischen Gewebezersetzung kann der genetische Hintergrund auch die AECII-Ausbeute beeinflussen. Für dieses Protokoll wurden Mäuse auf C57BL/6-Hintergrund verwendet. Im Einklang mit den gemeldeten entwicklungsspezifischenUnterschieden von 15, immunologisch16 und physiologischen 17,18,19 stammspezifischen Unterschieden ist es denkbar, dass die Verwendung anderer Labormausstämme (z. B. BALB/c, DBA) zu unterschiedlichen AECII-Erträgen führen kann. Darüber hinaus kann die AECII-Ausbeute aus entzündeten Lungen (infektiös oder nicht-infektiös) deutlich reduziert werden. Dies kann die Folge von indirektem (inflammatorischem) oder direktem (pathogen-vermitteltem) Zelltod von AECII sein, die Hauptziele für z. B. IAV20,21 und SARS-CoV-2 22,23,24 darstellen.

Die Erhaltung der zellulären Integrität während der mechanischen Dissoziation, der enzymatischen Verdauung und der Flusssortierung ist ebenfalls entscheidend für nachgelagerte molekulare und/oder funktionelle Analysen. Daher wurden die Lebensfähigkeit von AECII und die zelluläre Funktion nach der Sortierung bewertet. AECII waren in der Lage, sich an das Matrigel zu halten und eine charakteristische, lamelläre, körperreiche Morphologie für mindestens 24 Stunden aufrechtzuerhalten, was auf funktionelle Kompetenz nach Isolation und Eignung für ex-vivo-Kultur (einschließlich Infektionsmodellen) hinweist.

Die effiziente Infektion sortierter AECII mit dem IAV-mCherry-Reportervirus12 und die Beobachtung starker viraler Replikation validieren dieses System als robuste Plattform zur Aufklärung epithelial-intrinsischer antiviraler Reaktionen. Da AECII zentrale Prozesse regulieren, die an der Tensid-Biosynthese, alveolärer Regeneration und angeborener Immunität beteiligt sind,wird die Fähigkeit, die IAV-Replikationskinetik und die transkriptionellen Reaktionen des Wirts in gereinigten AECII-Populationen zu untersuchen, Erkenntnisse liefern, die in Mixed-Cell-Präparaten nicht erhalten sind.

Eine wichtige Innovation dieses Protokolls ist die Einbindung eines Fixierungsverfahrens, das eine parallele Analyse frischer und inaktivierter Proben ermöglicht. Die PFA-Fixierung und die angepassten FFPE-RNA-Extraktionsprozesse erhalten die RNA-Integrität in einem Ausmaß, das mit nachgelagerten transkriptomischen Analysen kompatibel ist, wie ein erfolgreicher quantitativer Reverse-Transkriptions-PCR (qPCR) zeigt.

PFA-Fixierungszeiten können die Qualität der Färbung beeinflussen und damit die Wiederherstellung von AECII durch FACS. Darüber hinaus werden Ertrag und Qualität der RNA im Allgemeinen durch Fixationsprozesse beeinflusst. Je nach verwendetem in-vivo-Infektionsmodell müssen diese Aspekte für das experimentelle Design berücksichtigt werden. Es wird empfohlen, eine lange Fixierungszeit zu vermeiden und stattdessen die Dauer der PFA-Behandlung so zu optimieren, dass die minimale notwendige Zeit genutzt wird, was experimentell bewiesen ist, um eine vollständige Inaktivierung des jeweiligen Virus sicherzustellen.

Die Bewertung der Häufigkeit von ribosomaler RNA (rRNA) mittels eines Mikrofluidikinstruments dient als Ersatz zur Abschätzung der mRNA-Qualität in biologischen Proben. Das beschriebene AECII-Fixations-/RNA-Isolationsprotokoll ermöglicht die Isolierung intakter RNA mit ausreichender Qualität für nachgelagerte transkriptomische Analysen, wie die 28S/18S-rRNA-Verhältnisse >1 und die RNA-Qualitätszahl (RQN)-Werte >8 zeigen. Es ist wichtig zu beachten, dass der 80 °C-Inkubationsschritt die RNA-Ausbeute und -Qualität kritisch verringert. Eine Anpassung der thermischen Behandlungszeiten kann optional angewendet werden, um RNA-Ausbeute und -Qualität für nachgelagerte Anwendungen zu erhöhen.

Zusammen bieten diese methodischen Verbesserungen einen umfangreichen Werkzeugkasten für die Untersuchung der AECII-Biologie im Kontext von Gesundheit, Infektionskrankheiten und Entwicklung (von Neugeborenen bis Erwachsenen). Die hohe Ausbeute und Reinheit der durch diesen Ansatz isolierten AECII ermöglichen multiomische Profilierungen, darunter transkriptomische, proteomische und chromatinbezogene Zugänglichkeitstests sowie funktionelle Assays (z. B. ex vivo Infektionen), um relevante Mechanismen von AECII in vivo weiter zu analysieren.

Offenlegungen

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Danksagungen

Die Autoren möchten Tatjana Hirsch und Friederike Kruse für ihre fachkundige technische Unterstützung danken, Lisa Hönicke und Justine Smout für ihre hilfreichen Diskussionen sowie Yoshihiro Kawaoka für die Bereitstellung des IAV-mCherry Reporter-Virus. Diese Studie wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG, Deutsche Forschungsgemeinschaft) – TRR 359 – Projektnummer 491676693 (an D.B. und J.H.), der COVIPA-Initiative (KA1-Co-02, Helmholtz-Verein; an D.B.) und einem Zuschuss der Deutschen Forschungsgemeinschaft (BO 7036/1-1; an J.D.B.) finanziert. Wir erkennen die Unterstützung durch den Open Access Publication Fund der medizinischen Fakultät der Otto-von-Guericke-Universität Magdeburg an.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
ACK-Puffer--8,29 g NH4Cl, 1 g KHCO3, 200 µ L von 0. 5 M EDTA, 1000 mL Milli-Q hinzufügen, pH-Wert auf 7,2 bis 7,4 anpassen
Anti-Maus CD11beBioscience12-0112-83Klon M1/70; PE-gekoppelt
Anti-Maus-CD11cBiolegende117310Klon N418; APC gekoppelt
Anti-Maus CD16/32BD Biosciences553141Klon 93; gereinigt
Anti-Maus CD16/32BD Biosciences561727Klon 2.4G2; PE-gekoppelt
Anti-Maus CD19Biolegende115508Klon 6D5; PE-gekoppelt
Anti-Maus CD24Biolegende101808Klon M1/69; PE-gekoppelt
Anti-Maus CD31Biolegende102408Klon 390; PE-gekoppelt
Anti-Maus CD326Biolegende118245Klon G8.8; BV785 gekoppelt
Anti-Maus CD45BD Biosciences553081Klon 30-F11; PE-gekoppelt
Anti-Maus CD93eBioscience17-5892-82Klon AA4-1; APC gekoppelt
Anti-Maus F4/80Biolegende123116BM8 klonen; APC gekoppelt
anti-Maus SPC abcamab211326Wirtsart: Kaninchen; Klon: EPR19839; gereinigt
Aria-FusionBD BiosciencesZellsortierer
Aria-II SORPBD BiosciencesZellsortierer
Biozym-Plaque AgaroseBiozym8401011 % (w/v) in H2O
Zellsieb (100 & Mikro; M, 70 & Mikro; m, 40 & Mikro; m)BD Falcon352360, 352350, 352340
CellTrics (50 & Mikro; m)Sysmex04-004-2327
Desoxyribonuklease I aus der rindischen Bauchspeicheldrüse, 2000 Kunitz-Einheiten/FläschchenSigma-AldrichD4263Frisch aufgelöster Inhalt von 1 Fläschchen in 330 & Mikro; L DMEM
Dispase, 100 mL (5000 caseinolytische Einheiten)Corning354235Sterile Filtration durchführen (Porengröße 0,22 & Mikro; m), 4 mL Aliquots in 15 mL Röhren vorbereiten, bei -20 °C lagern; C
DMEMGibco31885-049niedrige Glukose, mit Pyruvat, Zusatz HEPES (Endkonzentration von 25 mM)
FACS DivaBD BiosciencesSortiersoftware
FlowJoEvaluierungssoftware für FACS-Daten
Ziegen-AntikaninchenAlexa 594 gekoppelt
Innewohnende Kanüle Introcan 22GBraun4252098B
RNeasy FFPE-KitQiagen73504
Symphony S6 SEBD BiosciencesZellsortierer

Referenzen

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