Method Article

Isolierung und Quantifizierung axonaler mRNAs mittels poröser Membraninserts und RTddPCR

DOI:

10.3791/69601

⸱

February 6th, 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Rutgers University- Newark, 2College of Arts & Sciences, Boston University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Studie präsentiert eine robuste Methode zur Isolierung axonaler mRNAs mittels poröser Membraneinsätze, wodurch die Trennung von totalen Neuronen versus Neuriten und RNA-Reinigung ermöglicht wird. In Kombination mit RTddPCR ermöglicht der Ansatz eine absolute Quantifizierung von Low-Copy-Transkripten, was Studien zum mRNA-Transport und der lokalen Übersetzung mit hoher Sensitivität, Reproduzierbarkeit und breiter experimenteller Anwendbarkeit erleichtert.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die räumliche Dynamik der mRNA-Lokalisierung und -Translation innerhalb von Neuronen ist wesentlich für verschiedene Mechanismen der neuronalen Funktion, darunter neuronale Konnektivität, synaptische Plastizität und Reaktion auf Verletzungen. Aufgrund der extremen Polarität der Neuronen sind viele dieser Funktionen auf die Fähigkeit der Axone angewiesen, bestimmte Transkripte lokal zu übersetzen. Die Quantifizierung dieser subzellulären RNA-Populationen bleibt jedoch technisch herausfordernd. Hier beschreiben wir einen reproduzierbaren Ansatz zur Gewinnung separater somatischer und axonal angereicherter Kompartimente aus kultivierten Nagetierneuronen und zur Quantifizierung der kompartmentspezifischen mRNA-Expression. Primäre embryonale oder adulte Neuronen der Nagetiere wurden auf Einsätzen mit einer porösen Membran von Größe 1–3 μm kultiviert. Diese Membranen sind nur Axonen zulassend, was eine physische Trennung der somatischen und axonalen Kompartimente ermöglicht. RNA wurde anschließend separat aus dem gesamten Neuron und axonangereicherten Fraktionen isoliert, die anschließend für die digitale PCR (RTddPCR) mit genspezifischen Primern für die Reverse Transkriptase-Tröpfchen-PCR verwendet wurden. Dieses System bietet einen absoluten quantitativen Vergleich zwischen subzellulären Kompartimenten und ermöglicht so eine hochsensible Erkennung lokalisierter Transkripte. Dieser Ansatz misst die Häufigkeit der stationären RNA und erleichtert die Untersuchung axonaler RNA-Veränderungen im Zeitverlauf als Reaktion auf neurotrophe Faktoren, Stress oder Verletzungsmodelle. Die Kombination aus physikalischer Kompartimentierung und RTddPCR-Analyse reduziert Kreuzkontamination und liefert exakte Kopienzahlen seltener Transkripte, was eine hohe Sensitivität, Reproduzierbarkeit und Detektion von mRNAs mit niedriger Kopienzahl bietet, die das Wachstum und die Regeneration des Axons steuern. Diese Methode funktioniert auch mit nachgelagerten Tests, wie der Messung der Proteinsynthese, der Untersuchung der RNA-Stabilität und der Durchführung von Störungsexperimenten mit siRNA oder Medikamenten, die bestimmte Proteine blockieren. Wichtig ist, dass diese Technik an verschiedene neuronale Subtypen, Entwicklungsstadien oder Verletzungsmodelle angepasst werden kann. Im Allgemeinen ist dieser Ansatz eine flexible, sensible und reproduzierbare Methode, um die molekulare Grundlage der axonalen mRNA-Lokalisierung sowie deren Einfluss auf neuronale Funktion und Krankheitsmechanismen zu untersuchen.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neuronen gehören zu den strukturell komplexesten und polarisiertesten Zellen der Biologie. Sie haben lange Prozesse, die manchmal Entfernungen von mehr als einem Meter erreichen können. Diese Polarität erschwert die zelluläre Kommunikation und die Proteinhomöostase auf unterschiedliche Weise. Ein verfeinerter Ansatz zur Bewältigung dieser Anforderungen besteht darin, mRNAs zu entfernten Kompartimenten wie Axonen und Dendriten zu transportieren und deren Translation auf regulierte Weise als Reaktion auf lokalisierte Signale 1,2,3 zu erleichtern. Die lokale Translation ermöglicht es Axonen, Proteine raumzeitlich zu synthetisieren. Dieser Prozess ist entscheidend für die axonale Entwicklung, synaptische Plastizität, Regeneration nach Verletzung sowie die Reaktionen auf Entwicklungs- und extrazelluläre Reize 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15.

Die Fähigkeit, die Funktionen lokalisierter mRNAs in Axonen zu analysieren, ist entscheidend, um ihre Rolle sowohl in der normalen neuronalen Funktion als auch im Kontext der Pathophysiologie zu verstehen. Die Dysregulation der axonalen mRNA-Translation wurde mit verschiedenen neurodegenerativen Erkrankungenin Verbindung gebracht, wie etwa amyotropher Lateralsklerose (ALS)17,18,19, spinale Muskelatrophie (SMA)20,21 und Alzheimer-Krankheit (AD)22. Die axonale Regeneration nach Schäden ist stark von der schnellen, präzisen Translation von Zytoskelettproteinen, Signalmolekülen und Rezeptoren 3,23,24,25,26,27,28 abhängig. Trotz dieser neuartigen Konzepte steht die Disziplin weiterhin vor Herausforderungen bei der effektiven Quantifizierung und Erfassung axonspezifischer mRNA-Populationen.

Eine der Herausforderungen bei der axonalen Transkriptomik ist es, Soma und Axone sauber zu trennen. Da die meisten mRNAs im Soma angereichert sind, können selbst geringe Mengen an Kontamination durch den Zellkörper die Ergebnisse bei der Beurteilung des axonalen Gehalts einer bestimmten mRNA beeinflussen. Konventionelle Techniken, darunter Mikrofluidikkammern29, 30, 31, 32 oder Campenot-Kammern33, bieten richtungsorientiertes axonales Wachstum und eine klare Trennung zwischen den beiden Kompartimenten, aber die axonale Ausbeute kann für biochemische Studien wie Bulk-RNA-Sequenzierung (RNA-seq), RNA-Ko-Immunpräzipitation gefolgt von RNA-Sequenzierung oder quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) zu niedrig sein. Bulk-RNA-seq und qPCR, so vorteilhaft sie auch sind, fehlen häufig die erforderliche Sensitivität, um Low-Copy-Transkripte in Axonen genau zu identifizieren, was zur falschen Schätzung physiologisch signifikanter Spezies führt.

Um diese Herausforderungen zu bewältigen, haben wir und andere durchlässige Membraneinsätze zur physischen Trennung von Axonen und Somaten 34,35,36,37,38,39,40,41 verwendet. Diese Einsätze ermöglichen es Neuronen, sich auf einer mikroporösen Oberfläche zu entwickeln, und Axone können durch sie in das untere Kompartiment gelangen, aber nicht in das Soma. Diese grundlegende, aber effektive Architektur ermöglicht es, eine große Anzahl von Neuronen mit einer klaren physischen Trennung von Soma und Axonen zu kultivieren. Die membranbasierte Methode ist wichtig, da sie die technischen Probleme mit mikrofluidischen Geräten vermeidet und große Mengen an axonalem Material liefert, das für molekulare und biochemische Studien verwendet werden kann. Das Einsatzsystem ist auch für Dinge wie mechanische Verletzungen einfach zu bedienen, was es in vielen verschiedenen experimentellen Situationen im Zusammenhang mit neuronaler Reparatur nützlich macht. Die hier beschriebene Methode optimiert die neuronale Ausbeute und Reinheit weiter, indem sie die Kulturbedingungen verfeinert, die Membranporeneigenschaften anpasst und die auf Reverse Transkriptase-Tropfen-Tropfen-Digital-PCR (RTddPCR)-basierte Validierung für axonale RNA-Proben mit geringer Ertragsrate einsetzt.

Es ist auch wichtig sicherzustellen, dass axonale Fraktionen rein sind. Wir extrahieren Axone nur aus der unteren Kammer, nachdem wir vorsichtig alle übrig gebliebenen somatischen Materialien von der oberen Oberfläche entfernt haben. Die Primervalidierung zeigt eine starke Anreicherung axonaler Marker und keine oder vernachlässigbaren somatischen Marker. Die molekulare Bestätigung unterstreicht diesen Unterschied: Axonale Fraktionen sind mit anerkannten axonalen mRNAs wie Gap43 angereichert und haben eine niedrigere Expression von Actγ42. Dies zeigt, dass das Einsatzsystem axonale Proben mit vernachlässigbarem Soma-Anteil erzeugt, die sich für eine weitere Untersuchung eignen.

Nach der Isolierung angereicherter axonaler Fraktionen besteht die nächste Hürde darin, mRNAs zu messen, die in extrem niedrigen Kopienzahlen vorkommen. Das geringe Ausgangsmaterial aus axonalen Fraktionen und das Vorhandensein von mRNAs mit niedriger Kopienzahl in den Axonen verschieben die Empfindlichkeitsgrenzen der konventionellen quantitativen PCR (RT-qPCR), die Standardkurven zur Quantifizierung verwendet. Außerdem liefert RT-qPCR auch keine absoluten Kopiennummern eines bestimmten Transkripts. RTddPCR hingegen trennt cDNA-Proben in Tausende von Tröpfchen, was hilft, mithilfe von Poisson-Statistiken eine genaue Transkriptzählung zu erhalten. Dies macht es möglich, Transkripte zuverlässig zu finden, selbst wenn nur wenige Kopien davon in einem einzigen Nanogramm der Gesamt-RNA 5,6,7,43 vorhanden sind.

In diesem Manuskript bieten wir einen vereinfachten Ansatz, der Methoden zur Kultivierung verschiedener adulter oder embryonaler Nagetierneuronen auf Einsätzen, die Isolierung von RNA aus ganzen Neuronen im Vergleich zu axonalen angereicherten Kompartimenten, die Überprüfung der axonalen Reinheit sowie die RTddPCR-basierte absolute Quantifizierung von mRNA-Kopien umfasst. Diese Methoden können verwendet werden, um die Niveaus spezifischer mRNAs zu bestimmen, die unter basalen Bedingungen auf Axone lokalisieren, und wie sich diese bei Axotomie oder als Reaktion auf Wachstumsfaktorstimulation oder neurotoxische Signale verändern. Durch die Kombination dieser Methode mit Protein-Co-Immunpräzipitationen kann man auch die Dynamik von ribonuklearen Protein- (RNP)-Komplexen in Axonen bewerten. So haben wir diese Methode umfangreich verwendet, um die mRNAs zu untersuchen, die in den axonalen Ras GTPase-aktivierenden proteinbindenden Protein-1 (G3BP1)-Granulen vorhanden sind. G3BP1 ist ein Kernbestandteil von Stressgranulen44, und unsere früheren Studien haben gezeigt, dass es die axonale Proteinsynthese hemmt und wiederum sowohl die Axonregeneration des PNS als auch das ZNSblockiert. Darüber hinaus kann diese Methode genutzt werden, um die Rolle der axonalen Translationsdysregulation bei verschiedenen pathophysiologischen Erkrankungen, darunter ALS, SMA und AD, zu untersuchen.

Ziel dieser Studie ist es, eine Methode zur Messung axonaler mRNAs zu entwickeln und zu testen, die empfindlich, reproduzierbar und skalierbar ist. Durch die Kombination von kompartimentierten, insertbasierten Kulturen mit RTddPCR-basierter Quantifizierung bieten wir dem Feld eine Lösung für die anhaltenden Probleme der axonalen Transkriptomik. Diese Methodik wird nicht nur wesentliche Entdeckungen zur lokalen Übersetzung ermöglichen, sondern auch eine Grundlage für translationale Untersuchungen schaffen, die sich auf therapeutische Interventionen bei neuronaler Reparatur und Neurodegeneration konzentrieren.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Vorbereitung der Einsätze für die Zellaussaatung

  1. Setzen Sie die Einsätze mit der passenden Porengröße in eine 6-Well-Platte.
    HINWEIS: Verwenden Sie eine Porengröße von 1 μm, um Axone vom Soma zu trennen, und eine Porengröße von 3 μm, um alle Neurite (Axone und Dendriten) vom Soma zu trennen.
  2. Fügen Sie 100 μg/mL Poly-L-lysin (PLL) zur 6-Well-Platte hinzu, sodass sie den Boden der Einsätze und die Oberseite der Einsätze berührt (2 mL/Bohrloch und 1 mL/Einsatz).
  3. Über Nacht bei 37 °C inkubieren.
  4. Wasche die Brunnen (unten an den Einlagen) und oben mit sterilem, ultrareinem Wasser – 4 Waschen × 5 Minuten.
  5. Nur für Neuronen des dorsalen Wurzelganglions (DRG) werden 5 μg/mL Laminin (2 mL/Brunnen und 1 mL/Einsatz) hinzugefügt und mindestens 1 Stunde bei 37 °C inkubiert. Achte darauf, dass sowohl Ober- als auch Unterseite des Einsatzes gleichmäßig beschichtet sind.
  6. Waschen mit steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) (pH 7,4) mit 100 U/mL Penicillin/Streptomycin – 2 Waschungen × 5 Minuten.
  7. Führen Sie die Dissektion durch und säen Sie etwa 1 × 106 Zellen/Einsatz für embryonale kortikale5, hippocampale45 und basale Vorderhirn-cholinergeNeuronen 31,32. Für erwachsene Ratten-DRGs, Tellen Sie 6-8 DRGs/Insert 5,7 (Abbildung 1).

2. Sammlung neuronaler subzellulärer Fraktionen aus 6-Well-Einsätzen

  1. Aliquot 250 μL TRIzol jeweils in einem 1,5-mL Mikrozentrifugenröhrchen pro Einsatz und einem Bohrloch/Einsatz einer 6-Bohrloch-Platte. Leg es beiseite.
  2. In einer weiteren 6-Well-Platte fügen Sie 2 ml steriles PBS pro Brunnen hinzu. Die Anzahl der Bohrungen/Platten sollte proportional zur Anzahl der Einsätze sein.
  3. Aspiratieren Sie Kulturmedien von oben und unten am Einsatz und übertragen Sie den Einsatz auf eine 6-Well-Platte mit PBS.
  4. Mit einer Pinzette setzt man den Einsatz vorsichtig ein und fügt 2 ml PBS auf den Einsatz hinzu. Sauge das Medium von oben und unten aus dem Insert ab und wiederhole das. Insgesamt zweimal mit PBS waschen und in frischem PBS lassen (1 mL bzw. 2 ml oben und unten am Einsatz).
  5. Isolierung der gesamten Neuronenfraktion
    1. Mit einem sterilen Zellschaber wird der gesamte Neuronenanteil (oben am Insert) abgekratzt. Üben Sie gerade genug Druck aus, damit die Zellen loskommen, aber die Membran nicht bricht (Abbildung 1).
    2. Sammeln Sie das gesamte Neuron aus dem Einsatz und übertragen Sie es in ein 1,5-mL Mikrozentrifugenrohr.
    3. Zentrifugiere das Rohr bei 10.000–15.000 g für 2 Minuten.
    4. Entsorge das Supernatant und suspendiere das Lysat in 250 μL Trizol.
    5. Kennzeichnen Sie dieses Rohr als gesamte Neuronenfraktion.
    6. Fahren Sie mit der Neuritfraktionssammlung fort.
  6. Isolierung der Neuritfraktion
    1. Nehmen Sie einen sterilen Wattestäbchen und bewegen Sie sich mit einem Ende sehr langsam in einem Zickzackmuster von oben nach unten auf der gesamten Neuronenseite. Drehen Sie den Einsatz um 90 Grad und wiederholen Sie den Vorgang mit dem anderen Ende des Abstrichers (wenn Sie einen doppelseitigen Abstrich verwenden, oder einen neuen Abstrich für einen einseitigen). Entsorgen Sie diesen Abstrich (Abbildung 1).
    2. Verwenden Sie einen neuen Abstrich und bewegen Sie sich in konzentrischen Kreisen, beginnend in der Mitte des Einsatzes und nach außen. Achte darauf, auch die Wände (Umfang) zu reinigen.
    3. Drehen Sie den Membraneinsatz um (Neuritseite nach oben) und schneiden Sie die Membran mit einer neuen sterilen Skalpellklinge durch, während Sie sie mit einer Pinzette halten. Achte darauf, am Rand ~2-3 mm zu lassen.
    4. Setzen Sie die Schnittmembran in die 6-Well-Platte mit TRIzol, wobei die Neuritseite nach unten zeigt. Stelle sicher, dass sie unter Wasser steht.
    5. Sammeln Sie das TRIzol mit dem Neuritlysat aus der 6-Well-Platte und übertragen Sie es in eine 1,5-mL-Mikrozentrifugenröhre.
  7. Sowohl für Ganzneuron- als auch Neuritlysate sollten Sie mit RNA-Isolierung fortfahren oder die Lysate bei -80 °C aufbewahren, um sie später zu verarbeiten.

3. RNA-Isolierung und Quantifizierung

  1. RNA-Isolierung
    HINWEIS: Für diesen Teil solltest du immer in einer RNase-freien Umgebung mit speziellem, sterilem Plastikzubehör und Handschuhen arbeiten.
    1. Gib 0,2 ml Chloroform pro 1 ml Trizol dazu, schüttle kräftig 15 Sekunden lang und brüte 2–3 Minuten bei Zimmertemperatur. Zentrifugieren Sie bei 12.000 × g für 15 Minuten bei 4 °C, um sie in Schichten zu trennen: organisch, interphasisch und wässrig (RNA-haltig).
    2. Übertragen Sie die obere wässrige Phase in ein neues Rohr und vermeiden Sie die Interphase. Um die RNA auszufällen, geben Sie 1 Volumen Isopropanol und mischen Sie vorsichtig. Inkubieren Sie 10 Minuten bei Raumtemperatur (oder länger bei -20 °C für höhere Ausbeute), um RNA auszufällen. Zentrifugiere bei 12.000 × g für 10 Minuten bei 4 °C, um RNA zu pelletieren.
    3. Entsorge das Supernatant und wasche das Pellet mit 1 ml 75% Ethanol. Kurz vortexen und Zentrifugieren bei 7.500 × g für 5 Minuten bei 4 °C.
    4. RNA lösen: Entfernen Sie vorsichtig das Ethanol-Wash und lassen Sie das Pellet 5-10 Minuten an der Luft trocknen, um vollständige Trockenheit zu vermeiden. Setzen Sie das Pellet in einem kleinen Volumen RNase-freies Wasser oder 1x Tris-EDTA (TE) Puffer wieder auf und inkubieren Sie bei 55-60 °C für die vollständige Auflösung. Lagert gereinigte RNA bei -80 °C.
  2. RNA-Quantifizierung mit dem RiboGreen-Assay
    HINWEIS: Der RiboGreen-Test (unten) verwendet einen fluoreszierenden Farbstoff, der spezifisch für Nukleinsäuren ist und eine höhere Sensitivität, Spezifität und die Fähigkeit bietet, intakte RNA zu erkennen, als UV-Absorptionsmethoden. Ziehen Sie eine Behandlung mit DNase in Betracht, wenn eine DNA-Kontamination ein Problem darstellt.
    1. Bereite einen 1x TE-Puffer vor, verdünne den bereitgestellten 20x-TE-Puffer 20-fach mit RNase-freiem Wasser. Bereiten Sie RiboGreen-Arbeitslösungen vor und schützen Sie den lichtempfindlichen Farbstoff mit Alufolie. Verdünnen Sie den konzentrierten Farbstoff um 1:200 in 1x TE für den Hochbereichstest (10 ng/mL-1 μg/mL) oder 1:2000 in 1x TE für den Niedrigbereichstest (2,5 ng/mL-50 ng/mL). Bereite RNA-Standards durch serielle Verdünnung des RNA-Standards des Kits in 1x TE vor, um den erwarteten Probenbereich abzudecken. Führe Standards in dreifacher Ausführung durch.
    2. Bereite Proben vor, indem du RNA-Proben in 1x TE verdünnst, um dem Dynamikbereich des Tests zu entsprechen. Führe Proben in dreifacher Ausführung aus.
    3. Fügen Sie gleiche Volumina RiboGreen-Arbeitslösung und RNA-Standard oder Probe hinzu (z. B. jeweils 100 μL). Inkubiere 2-5 Minuten bei Zimmertemperatur, geschützt vor Licht. Messung der Fluoreszenz mit den entsprechenden Einstellungen (Anregung ~500 nm, Emission ~525 nm). Messen und subtrahieren Sie eine Reagenz-Blank-Messung (1x TE + RiboGreen-Farbstoff).
    4. Analysieren und quantifizieren: Diagrammieren Sie eine Standardkurve anhand der Fluoreszenzwerte der Standards im Vergleich zu ihren Konzentrationen. Verwenden Sie diese Kurve, um die RNA-Konzentration in den Proben zu bestimmen (Abbildung 2).

4. cDNA-Synthese

  1. Alle Komponenten auf dem Eis auftauen. Rühren Sie jede Tube vorsichtig durch Klicken und drehen Sie sie kurz herunter, bevor Sie sie verwenden. In einem PCR-Röhrchen auf Eis werden für jede Reaktion folgende Komponenten kombiniert:
    RT-Mastermix (5x): 4 μL
    RNA-Probe: variabel (bis zu 1 μg Gesamt-RNA)
    Nukleasefreies Wasser: bis zu 20 μL Gesamtvolumen
    HINWEIS: Für eine No-Template Control (NTC) ersetzen Sie die RNA-Probe durch nukleasefreies Wasser.
  2. Sanft die Röhren mischen und drehen, um den Inhalt am Boden aufzusammeln, und das Thermocycler-Programm laufen lassen.
    Grundierungsannealing: 25 °C für 2 Minuten
    cDNA-Synthese: 55 °C für 10 Minuten
    Wärmeinaktivierung: 95 °C für 1 Minute

5. Primer-Design und Validierung

HINWEIS: Das Design des RTddPCR-Primers folgt im Allgemeinen denselben Prinzipien wie quantitative qPCR, erfordert jedoch zusätzliche Aufmerksamkeit, um eine klare Trennung von positiven und negativen Tröpfchen sicherzustellen. Verwenden Sie Primer-Design-Tools von NEB, IDT oder ThermoFisher, um diesen Prozess zu erleichtern. Ein erfolgreicher RTddPCR-Test ist durch eine hohe Spezifität und robuste Amplifikation definiert, die eine deutliche Trennung zwischen amplifizierten (positiven) und unamplifizierten (negativen) Tröpfchen erzeugt. Die folgenden NCBI RefSeq-Anschluss-IDs wurden für die Entwicklung von PCR-Primern verwendet:

Actg: NM_001127449.1
Stürmer 1: CAGTCTAACAGGGTGGGAAAG
Rückseite 1: CCAACTCAAGGCAAGTAACAAC
Amplicon-Länge: 98
Forward 2: GTAGTGATCTGTGCAGGGTATT
Rückseite 2: GACTTTCCCACCCTGTTAGAC
Amplicon-Länge: 118

Gap43: NM_017195,3
Stürmer 1: GGAAATTCTTGCACTGTACCC
Rückseite 1: GACTCCTCAGAACGGAACACAT
Amplicon-Länge: 122
Forward 2: CAGTCATCTTGGGAAATTCTTGC
Rückseite 2: CATTGCACACACACACACTTGG
Amplicon-Länge: 116

  1. Entwerfen Sie eine Grundierung mit der empfohlenen Grundierungslänge von 18–30 Basenpaaren und einem GC-Gehalt von 40–60 %. Stellen Sie sicher, dass die Schmelztemperatur (Tm) zwischen 55 und 65 °C liegt und die Vorwärts- und Rückwärtszünder innerhalb von 2-5 °C voneinander liegen. Integrieren Sie eine GC-Klemme, ein oder zwei G- oder C-Basen innerhalb der letzten fünf Basen am 3′-Ende, um die Bindungsspezifikität zu verbessern, aber lange Läufe von Gs oder Cs zu vermeiden.
  2. Validieren Sie die Primer-Spezifität mit Ausrichtungswerkzeugen wie dem Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) des National Center for Biotechnology Information (NCBI), um sicherzustellen, dass Primer nur an die beabsichtigte Zielsequenz binden. Entwerfen Sie Amplicons mit einer Größe von 50–200 Basenpaaren, wobei ~100 Basenpaare optimal sind, da kürzere Produkte effizienter verstärken und dennoch von Primer-Dimeren unterscheidbar bleiben.
    HINWEIS: In dieser Studie werden die kurzen PCR-Produkte typischerweise mit höherer Effizienz verstärkt als längere Produkte bei RT-ddPCR.
  3. Minimieren Sie Primer-Dimere, indem Sie Primer mit 50–60 % GC-Gehalt entwerfen, Sekundärstrukturen vermeiden und 3'-Komplementarität vermeiden. Während der Primer-Validierung verwenden Sie Agarosegel-Elektrophorese und verwenden Sie immer eine No-Template-Kontrolle zur Bewertung der Primer-Dimere.
  4. Vermeiden Sie das Entwerfen von Primern in Bereichen der Vorlage, in denen eine hohe Wahrscheinlichkeit zur Bildung von Sekundärstrukturen besteht, da dies die Verstärkungseffizienz beeinträchtigen kann.

6. RTddPCR

HINWEIS: Verwenden Sie das QX200 ddPCR System (Bio-Rad), um RTddPCR gemäß den Anweisungen des Herstellers und wie zuvor von Das et al. (2022)43 beschrieben durchzuführen, mit einigen kleinen Anpassungen zur Verbesserung der Proproduzierbarkeit des Assays.

  1. Bereiten Sie RTddPCR-Reaktionen mit ddPCR-fertiger universeller Mischung und zielspezifischen Primern mit geeigneter cDNA vor.
  2. Erzeugen Sie die Tröpfchen mit dem Tröpfchengenerator.
  3. Lesen Sie die Endpunkt-Fluoreszenz mit dem Tröpfchenleser ab und analysieren Sie die Daten mit der integrierten Software.
  4. Setzen Sie folgende Qualitätskontrollmaßnahmen ein, um eine präzise Quantifizierung und reproduzierbare Tröpfchenbildung sicherzustellen:
    1. Führe Grundzünder konsequent in derselben Reihe oder Spalte, um Platteneffekte zu minimieren.
    2. Bereite Mastermischungen vor, um das Pipetieren kleiner Volumina zu reduzieren.
    3. Pipetten mit niedriger Durchflussrate, um Blasen zu vermeiden, und verwenden Sie Mehrkanalpipetten für die gleichmäßige Probendosierung.
    4. Haltet die Platten nach der Tröpfchenbildung vorsichtig und verschließt sie sofort, um Verdunstung zu verhindern.
    5. Bereiten Sie alle Reaktionen auf Eis vor und vermeiden Sie wiederholte Frost-Tau-Zyklen für Reagenzien.
    6. Fügen Sie für jedes Primer-Set keine Vorlagen ein, um die Verunreinigung zu überwachen.
    7. Bohrlöcher mit weniger als 10.000 akzeptierten Tröpfchen werden aus der Analyse ausgeschlossen.
    8. Führen Sie technische Replikationen für alle Proben durch, um die Reproduzierbarkeit sicherzustellen.
  5. Inspizieren Sie manuell die Tropfenfluoreszenzamplitudendiagramme, um die Genauigkeit der automatischen Schwellenwerte zu überprüfen.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Primäre embryonale Nagetier-kortikale Neuronen, hippocampale Neuronen und BFCNs, die auf PLL-beschichteten 1-μm-Einsätzen verlagert sind, haften robust und dehnen Neurite in vitro (DIV) um 5–7 Tage über die Membran aus. Bis 11 DIV zeigen Kulturen dichte Netzwerke. Bei erwachsenen Ratten-DRGs hilft das Hinzufügen einer Lamininschicht auf PLL-beschichtete 3-μm-Einsätze, um eine vergleichbare axonale Erweiterung durch 5 DIV zu erreichen. Diese Beobachtungen bestätigen die Fähigkeit von Einsätzen, das langfristige neuronale Wachstum zu unterstützen und ausreichend axonalt Material für die nachgelagerte RNA-Extraktion bereitzustellen. Falls es skalieren muss, kombinieren wir mehrere Einsätze, um genügend Material zu erhalten.

Die TRIzol-Extraktion aus einzelnen Einsätzen liefert ausreichend RNA für die Reverse-Transkription und die anschließende ddPCR. Die RiboGreen-Quantifikation bestätigt konsistente RNA-Erträge aus ganzen Neuronenfraktionen (212,85 ng/Einsatz) und niedrigere Ausbeute aus Neuritfraktionen (42,75 ng/Einsatz) (Abbildung 2). Wir erhalten in der Regel ~5–7-fache RNA aus der gesamten Neuronenfraktion im Vergleich zur neurit-angereicherten Fraktion.

Alle Primer werden vor RTddPCR-Experimenten validiert. Für jedes Zieltranskript werden mindestens zwei Primer-Sets angeordnet und mit konventioneller PCR auf cDNA getestet, die aus denselben neuronalen Proben erzeugt wurde. Das Primerpaar, das das stärkste und spezifischste Band erzeugt, wird für RTddPCR ausgewählt (Abbildung 3A). Zum Beispiel haben wir für Gap43 das Primer-Set 1 gewählt. Bei mehrdeutigen Ergebnissen, wie sie bei Actγ erhalten werden, führen wir eine Gradienten-PCR zur Optimierung der Annealing-Temperaturen durch (Abbildung 3B). Dies stellt sicher, dass nur gut validierte Primer für die absolute Quantifizierung verwendet werden, was die Wahrscheinlichkeit von Artefakten bei der Tröpfchentrennung verringert.

Das Abkratz- und Abstrichverfahren trennt somatische und neuritische Kompartimente zuverlässig. RNA, die aus den gesamten Neuronenfraktionen isoliert wurde, zeigt eine Anreicherung von Transkripten, wie Actγ 46,47,48,49 (Abbildung 4). Im Gegensatz dazu liefern Axon-/Neuritfraktionen deutlich geringere Gesamt-RNA, was mit ihrem begrenzten Volumen übereinstimmt, zeigen jedoch eine Anreicherung von Transkripten, die bekannt sind, dass sie auf distale Fortsätze lokalisieren, wie Gap43 (Abbildung 4). Minimale Kreuzerkennung von soma-eingeschränkten Transkripten zeigt eine hohe kompartimentale Reinheit, wenn Einsätze sorgfältig behandelt und mit optimaler Dichte plattiert werden.

Positive Ergebnisse zeichnen sich durch folgende Eigenschaften aus: (1) intakte neuronale Morphologie mit klarer axonaler Erweiterung, (2) saubere Trennung der Kompartipartimente ohne Membranruptur, (3) validierte Primer, die eine deutliche Trennung zwischen positiven und negativen Tröpfchen erzeugen, und (4) starke RTddPCR-Signale für axonale Transkripte. Suboptimale Experimente führen zu geringer RNA-Ausbeute, Kreuzkontaminationen, die durch Somamarker in Neuritfraktionen belegt werden, oder zu RTddPCR-Artefakten wie erhöhtem Tröpfchen-"Regen" durch Primer-Dimerisation. Diese Probleme stehen meist im Zusammenhang mit Schäden an der Insertmembran, übermäßigem Abkratzdruck oder unzureichender Temperaturoptimierung der Primer-Annealing.

Abbildung 1
Abbildung 1: Überblick über kompartmentspezifische RNA-Isolierung mittels Membraneinsätze. Nagerneuronen wurden an halbdurchlässigen Einsätzen mit einer Porengröße von 1–3 μm kultiviert, was Neuritenverlängerung ermöglicht und gleichzeitig das Soma einschränkt. Für die Vorbereitung des gesamten Neurons wurden Zellen aus dem oberen Kompartiment mit einem sterilen Zellschaber abgekratzt, pelletiert und dann in TRIzol für RNA-Isolierung, cDNA-Synthese und RTddPCR lysiert. Restzellreste wurden mit einem sterilen Wattestäbchen aus der Insert-Membran entfernt. Zur Neuritpräparation wurde die Einsatzmembran, die nun nur Neurite enthält, invertiert und mit einer Skalpellklinge durchtrennt und direkt in TRIzol eingetaucht, gefolgt von RNA-Isolierung, cDNA-Synthese und RTddPCR. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 2
Abbildung 2: Standard-RNA-Konzentrationskurve mit RiboGreen-Assay. (A) Die Fluoreszenzintensität wurde mit dem RiboGreen-RNA-Quantifizierungstest über eine Verdünnungsreihe von RNA-Standards gemessen. Eine lineare Regressionsanalyse zeigte eine starke Korrelation zwischen RNA-Konzentration und Fluoreszenzsignal (R² = 0,9956). Der R²-Wert nahe eins zeigt eine ausgezeichnete Linearität und Zuverlässigkeit des RiboGreen-Tests für eine genaue RNA-Quantifizierung. (B) Mit der Gleichung (y=19,738x + 14,905) für die in A erhaltene Steigung wurde für jeden Anteil die Gesamt-RNA berechnet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 3
Abbildung 3: Primervalidierung mittels PCR und Agarosegel-Elektrophorese. (A) PCR-Amplifikationsprodukte mit cDNA für Actγ und Gap43 wurden auf einem 2%igen Agarosegel aufgelöst, um die Primer-Spezifität zu bewerten. Für jedes Gen wurden zwei unabhängige Primer-Sets (Satz 1 und Satz 2) getestet. DNA-Größenmarker (Leitern) werden in benachbarten Spuren mit angegebenen Molekulargewichten (10 kb, 0,5 kb, 0,1 kb) angezeigt. Unterschiedliche Einzelbänder der erwarteten Größe bestätigen eine erfolgreiche Verstärkung und Spezifität der ausgewählten Primer-Sets. (B) Die PCR-Amplifikation wurde mit dem Actγ-Primer Set 2 über einen Temperaturgradienten (55–65 °C) durchgeführt, um die optimale Glühtemperatur zu bestimmen. Amplifizierte Produkte wurden auf einem 2%igen Agarosegel neben einer DNA-Leiter (Lane 2, angegebene Größen) aufgelöst. Über den getesteten Bereich wurden konsistente Einzelbänder der erwarteten Größe beobachtet, wobei die stärkste Verstärkung bei 55 °C detektiert wurde, was darauf hindeutet, dass dies die optimale Temperatur für dieses Primer-Set ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 4
Abbildung 4: RTddPCR-Analyse ausgewählter Transkripte und Quantifizierung von mRNA-Kopien. (A,B) Repräsentative eindimensionale Amplitudendiagramme, die Tröpfchentrennung für (A) Actγ und (B) Gap43 zeigen. Jeder Punkt stellt einen einzelnen Tropfen dar, wobei blaue Tröpfchen positive Verstärkung und graue Tropfen negative Verstärkung anzeigen. Die Y-Achse stellt die Amplitude dar, und die X-Achse zeigt die Position des Brunnens in der ddPCR-Platte an. Eine klare Trennung zwischen positiven (blauen) und negativen (grauen) Tröpfchen bestätigt den robusten Nachweis der Zieltranskripte mit den angegebenen Primer-Sätzen. (C) Tabelle, die die Anzahl der Kopien/μL und Kopien pro ng der Gesamt-RNA für Actγ- und Gap43-Transkripte in Ganzneuron- und Neuritfraktionen zusammenfasst. Schätzungen der Kopienzahl wurden durch absolute Quantifizierung mit ddPCR-Tröpfchenzählungen gewonnen (dargestellt in den Panels A,B). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mehrere Schritte sind entscheidend für die Reproduzierbarkeit. Die Einsatzbeschichtung muss einheitlich sein, um neuronale Adhäsion zu fördern; Eine unvollständige Beschichtung führt zu schlechtem Neurit- und Axonwachstum. Die Zellbeschichtungsdichte ist ebenso wichtig, da eine übermäßige Dichte die dendritische Kreuzung erhöht, während spärliche Beschichtung zu unzureichender axonaler RNA führt. Die Abschab-Abstrich-Abstriche muss präzise durchgeführt werden: Zu wenig Druck führt zu einer somatischen Kontamination, während zu viel Druck das Risiko birgt, den Einsatz zu beschädigen.

Die Primer-Validierung stellt einen weiteren entscheidenden Schritt dar. Das Ausführen von zwei unabhängigen Primer-Sets pro Transkript ermöglicht die Auswahl des zuverlässigsten Paares, während Gradient-PCR die Annealing-Temperaturen weiter verfeinern kann. Diese Praxis reduziert die Bildung von Primer-Dimeren, erhöht die Klarheit der Tröpfchen und gewährleistet eine reproduzierbare Quantifizierung über biologische Replikaten. Obwohl dieser Ansatz eine hohe Kompartimentreinheit erreicht, kann Spurenkontamination durch somatische Materialien nicht vollständig ausgeschlossen werden. Axonale RNA-Erträge sind von Natur aus niedrig, was den Umfang der Analysen einschränkt, die hohe Eingaben erfordern, wie zum Beispiel die vollständige Transkriptomsequenzierung. Eine entscheidende Einschränkung dieser Methode ist ihre Unfähigkeit, die Transkriptlokalisierung innerhalb von distalen versus proximalen Axonen zu adressieren. Obwohl gliale oder endotheliale Erweiterungen durch Membranporen unter bestimmten Bedingungen berichtet wurden, minimiert unser Kultursystem diese Möglichkeit. In adulten DRG-Kulturen begrenzt die Zugabe von Cytosin-β-D-arabinofuranosid (Ara-C)5,7 und die Verwendung von serumfreien Medien für andere neuronale Kulturen (kortikal, hippocampal und BFCNs)5,45 die Proliferation von Glial- und Endothelzellen effektiv. Zusätzlich sind die hier verwendeten starren Polycarbonat- oder Polyethylenterephthalatmembranen (PC/PET) nicht-elastisch und nicht zulassend zur aktiven Zellwanderung. Außerdem verwenden wir 3-μm-Porengrößen-Einsätze für DRG-Kulturen, um den Durchgang von Axonen mit großem Durchmesser zu ermöglichen. Im Gegensatz dazu verwenden wir bei kortikalen oder BFCN-Kulturen 1 μm Porengrößen-Einsätze, was die Wanderung der Glia weiter einschränkt. Diese Eigenschaften unterscheiden unser Setup von PDMS-basierten Mikrogeräten, die die Endothelmigration durch flexible Poren unterstützen. Im Einklang mit früheren Berichten 34,35,36,40 bestätigt die molekulare Validierung in dieser Studie eine starke Anreicherung axonaler Transkripte (z. B. Gap43) und einen vernachlässigbaren Nachweis somatischer Marker (z. B. Actγ), was die neuronale Spezifität des durch die Membran laufenden Materials stützt. Da die physikalische Einschränkung die Gliawanderung nicht vollständig aufhebt, sollten die Forscher auch Gfap als negativen Marker verwenden.

Im Vergleich zu mikrofluidischen Geräten ist das Insert-System einfacher, skalierbarer und kompatibel mit routinemäßigen Kultur-Workflows. Es vermeidet spezialisierte Geräte, ermöglicht aber dennoch eine reproduzierbare Trennung von Axon und Soma. Durch die Koppelung von Inserts mit RTddPCR bietet diese Methode sowohl Zugänglichkeit als auch hohe Empfindlichkeit, wodurch eine absolute Quantifizierung von Transkripten ermöglicht wird, die oft unter qPCR-Detektionsschwellen liegen. Dieses Protokoll eignet sich hervorragend zur Untersuchung von Veränderungen in der axonalen Transkriptlokalisierung, zur Bewertung der lokalen Translation als Reaktion auf entwicklungsbedingte, neurotoxische oder verletzungsbedingte Reize sowie zur Untersuchung von RNA-Transportdefekten, die mit neurodegenerativen Erkrankungen oder neuroentwicklungsbedingten Störungen in Verbindung stehen. Zukünftige Verfeinerungen könnten multiplexierte RTddPCR zur gleichzeitigen Quantifizierung mehrerer mRNAs oder Integration mit RNA-Sequenzierungsmethoden mit niedrigem Input zur Erweiterung der Transkriptomabdeckung umfassen. Darüber hinaus könnte die Anpassung dieses Systems für humane iPSC-abgeleitete Neuronen seine Anwendungen auf Krankheitsmodellierung und regenerative Studien ausweiten.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

PKS hält US-Patente für die Verwendung des G3BP1-zelldurchlässigen Peptids zur Axonregeneration und Neurodegeneration. Die anderen Autoren geben keine Interessenkonflikte an.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wurde durch Fördermittel des Merkin Peripheral Neuropathy and Nerve Regeneration Center (an P.K.S.) unterstützt.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Zellkultur-Einsätze für 6-Well-Platten, 1,0 & nbsp; μ m Porengröße, sterilCorning353102Verbrauchsgüter
Zellkultur-Einsätze für 6-Well-Platten, 3,0 & nbsp; μ m Porengröße, sterilCELLTREAT230603Verbrauchsgüter
Zellheber mit schmaler KlingeVWR76036-006Verbrauchsgüter
CELLSTAR 6-Bohrloch GewebekulturplattenVWR82050-842Verbrauchsgüter
ddPCR 96-Well-Platten Bio-Rad12001925Verbrauchsgüter
ddPCR Tropfenlese-Öl Bio-Rad1863004Reagenzien
DG8-Patronen für QX200/QX100 TröpfchengeneratorBio-Rad1864008Verbrauchsgüter
LamininGibco/Fisher Wissenschaftlich23017-015Reagenzien
LunaScript RT SuperMix KitNEBE3010LReagenzien
Mikroplatten für fluoreszenzbasierte, 96-Well, schwarzeThermo FisherM33089Verbrauchsgüter
PCR-Platten mit Heißwasserdichtung, Folie, durchstichbarBio-Rad1814040Verbrauchsgüter
Poly-LysinSigmaP1274Reagenzien
PTC Tempo 96 Thermischer CyclerBio-Rad12015382Ausrüstung
QuantaSoft-SoftwareBio-RadPCR-Datenanalyse-Software
Quant-it RiboGreen-Reagenz und RNA-Assay-KitThermo FisherR11490Reagenzien
QX200 ddPCR EvaGreen SupermixBio-Rad1864034Reagenzien
QX200 Tröpfchengenerierungsöl für EvaGreenBio-Rad1864005Reagenzien
QX200 TröpfchengeneratorBio-Rad17005227Ausrüstung
QX200 TropfenleserBio-Rad17005228Ausrüstung
TRIzol-ReagenzInvitrogen15-596-026Reagenzien

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Agrawal, M., Welshhans, K. Local translation across neural development: A focus on radial glial cells, axons, and synaptogenesis. Front Mol Neurosci. 14, 717170(2021).
  2. Dalla Costa, I., et al. The functional organization of axonal mRNA transport and translation. Nat. Rev. Neurosci. 22 (2), 77-91 (2021).
  3. Sahoo, P. K., Smith, D. S., Perrone-Bizzozero, N., Twiss, J. L. Axonal mRNA transport and translation at a glance. J. Cell Sci. 131 (8), (2018).
  4. Alber, S., et al. PTBP1 regulates injury responses and sensory pathways in adult peripheral neurons. Sci Adv. 9 (30), eadi0286(2023).
  5. Sahoo, P. K., et al. Disruption of G3BP1 granules promotes mammalian CNS and PNS axon regeneration. Proc Natl Acad Sci. 122 (9), e2411811122(2025).
  6. Sahoo, P. K., et al. A Ca2+-dependent switch activates axonal casein kinase 2α; translation and drives G3BP1 granule disassembly for axon regeneration. Curr Biol. 30 (24), 4882-4895.e6 (2020).
  7. Sahoo, P. K., et al. Axonal G3BP1 stress granule protein limits axonal mRNA translation and nerve regeneration. Nat Commun. 9 (1), 3358(2018).
  8. Terenzio, M., et al. Locally translated mTOR controls axonal local translation in nerve injury. Science. 359 (6382), 1416-1421 (2018).
  9. Van Erp, S., et al. Age-related loss of axonal regeneration is reflected by the level of local translation. Exp Neurol. 339, 113594(2021).
  10. Zahavi, E. E., et al. Repeat-element RNAs integrate a neuronal growth circuit. Cell. 188 (16), 4350-4365.e22 (2025).
  11. Rajgor, D., Welle, T. M., Smith, K. R. The coordination of local translation, membranous organelle trafficking, and synaptic plasticity in neurons. Front Cell Dev Biol. 9, 711446(2021).
  12. Oliveira, M. M., Klann, E. A deep dive into local mRNA translation in neurons. Proc Natl Acad Sci. 118 (45), e2117116118(2021).
  13. Sun, C., et al. The prevalence and specificity of local protein synthesis during neuronal synaptic plasticity. Sci Adv. 7 (38), eabj0790(2021).
  14. Castillo, P. E., Jung, H., Klann, E., Riccio, A. Presynaptic protein synthesis in brain function and disease. J Neurosci. 43 (45), 7483-7488 (2023).
  15. Younts, T. J., et al. Presynaptic protein synthesis is required for long-term plasticity of GABA release. Neuron. 92 (2), 479-492 (2016).
  16. Nagano, S., Araki, T. Axonal transport and local translation of mRNA in neurodegenerative diseases. Front Mol Neurosci. 14, 697973(2021).
  17. Altman, T., et al. Axonal TDP-43 condensates drive neuromuscular junction disruption through inhibition of local synthesis of nuclear encoded mitochondrial proteins. Nat Commun. 12 (1), 6914(2021).
  18. Bar Avi, O., Perlson, E. Navigating the pathways: Tar-DNA-binding-protein-43 aggregation, axonal transport, and local synthesis in amyotrophic lateral sclerosis pathology. Neural Regen. Res. 20 (10), 2921-2922 (2025).
  19. Ionescu, A., Altman, T., Perlson, E. Looking for answers far away from the soma-the (un)known axonal functions of TDP-43, and their contribution to early NMJ disruption in ALS. Mol. Neurodegener. 18 (1), 35(2023).
  20. Fallini, C., Bassell, G. J., Rossoll, W. Spinal muscular atrophy: The role of SMN in axonal mRNA regulation. Brain Res. 1462, 81-92 (2012).
  21. Rehorst, W. A., et al. Muscle regulates mTOR dependent axonal local translation in motor neurons via CTRP3 secretion: Implications for a neuromuscular disorder, spinal muscular atrophy. Acta Neuropathol Commun. 7 (1), 154(2019).
  22. Twiss, J. L., Buchanan, C. N. Regulation of subcellular protein synthesis for restoring neural connectivity. Int J Mol Sci. 26 (15), 7283(2025).
  23. Gomes, C., et al. Axonal localization of neuritin/cpg15 mRNA is limited by competition for HuD binding. J Cell Sci. 130 (21), 3650-3662 (2017).
  24. Lee, S. J., et al. hnRNPs interacting with mRNA localization motifs define axonal RNA regulons. Mol Cell Proteomics. 17 (11), 2091-2106 (2018).
  25. Lee, S. J., et al. Selective axonal translation of the mRNA isoform encoding prenylated cdc42 supports axon growth. J Cell Sci. 134 (7), jcs251967(2021).
  26. Merianda, T. T., et al. Axonal amphoterin mRNA is regulated by translational control and enhances axon outgrowth. J Neurosci. 35 (14), 5693-5706 (2015).
  27. Patel, P., et al. Intra-axonal translation of Khsrp mRNA slows axon regeneration by destabilizing localized mRNAs. Nucleic Acids Res. 50 (10), 5772-5792 (2022).
  28. Smith, T. P., Sahoo, P. K., Kar, A. N., Twiss, J. L. Intra-axonal mechanisms driving axon regeneration. Brain Res. 1740, 146864(2020).
  29. Huang, N., Sheng, Z. H. Microfluidic devices as model platforms of CNS injury-ischemia to study axonal regeneration by regulating mitochondrial transport and bioenergetic metabolism. Cell Regen. 11 (1), 33(2022).
  30. Ionescu, A., Perlson, E. Microfluidic neuromuscular co-culture system for tracking cell-to-cell transfer and axonal transport of labeled proteins. Methods Mol Biol. 2431, 145-161 (2022).
  31. Dasgupta, S., et al. Cortical brain injury causes retrograde degeneration of afferent basal forebrain cholinergic neurons via the p75NTR. eNeuro. 10 (8), (2023).
  32. Dasgupta, S., Pandya, M. A., Friedman, W. J. Microfluidic cultures of basal forebrain cholinergic neurons for assessing retrograde cell death by live imaging. Bio-protoc. 15 (1), e5149(2025).
  33. Bi, J., Tsai, N. -P., Lin, Y. -P., Loh, H. H., Wei, L. -N. Axonal mRNA transport and localized translational regulation of κ-opioid receptor in primary neurons of dorsal root ganglia. Proc Natl Acad Sci. 103 (52), 19919-19924 (2006).
  34. Hirai, T., et al. Aberrant plasticity of peripheral sensory axons in a painful neuropathy. Sci Rep. 7 (1), 3407(2017).
  35. Wu, K. Y., et al. Local translation of RhoA regulates growth cone collapse. Nature. 436 (7053), 1020-1024 (2005).
  36. Cox, L. J., Hengst, U., Gurskaya, N. G., Lukyanov, K. A., Jaffrey, S. R. Intra-axonal translation and retrograde trafficking of CREB promotes neuronal survival. Nat Cell Biol. 10 (2), 149-159 (2008).
  37. Chen, H. C. Boyden chamber assay. Methods Mol Biol. 294, 15-22 (2005).
  38. Brown, K. C., et al. An experimental protocol for the Boyden chamber invasion assay with absorbance readout. Bio Protoc. 14 (15), e5040(2024).
  39. Willis, D. E., Twiss, J. L. Profiling axonal mRNA transport. Methods Mol Biol. 714, 335-352 (2011).
  40. Zheng, J. -Q., et al. A functional role for intra-axonal protein synthesis during axonal regeneration from adult sensory neurons. J. Neurosci. 21 (23), 9291-9303 (2001).
  41. Shigeoka, T., et al. On-site ribosome remodeling by locally synthesized ribosomal proteins in axons. Cell Rep. 29 (11), 3605-3619.e10 (2019).
  42. Sun, Y., Joyce, P. A. Application of droplet digital PCR to determine copy number of endogenous genes and transgenes in sugarcane. Plant Cell Rep. 36 (11), 1775-1783 (2017).
  43. Das, A., Das, D., Panda, A. C. Quantification of circular RNAs using digital droplet PCR. J Vis Exp. (187), e64464(2022).
  44. Desai, M., Gulati, K., Agrawal, M., Ghumra, S., Sahoo, P. K. Stress granules: Guardians of cellular health and triggers of disease. Neural Regener Res. 21 (2), 588-597 (2026).
  45. Agrawal, M., et al. Restoring DSCAM expression rescues neuronal morphology and axon guidance deficits in Down syndrome. bioRxiv. , (2025).
  46. Bassell, G. J., et al. Sorting of β-actin mRNA and protein to neurites and growth cones in culture. J Neurosci. 18 (1), 251-265 (1998).
  47. Moradi, M., et al. Differential roles of α-, β-, and γ-actin in axon growth and collateral branch formation in motoneurons. J Cell Biol. 216 (3), 793-814 (2017).
  48. Willis, D. E., et al. Extracellular stimuli specifically regulate localized levels of individual neuronal mRNAs. J Cell Biol. 178 (6), 965-980 (2007).
  49. Zhang, H. L., et al. Neurotrophin-induced transport of a β-actin mRNP complex increases β-actin levels and stimulates growth cone motility. Neuron. 31 (2), 261-275 (2001).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Axonal mRNA IsolationPorous Membrane InsertsDroplet Digital PCRNeuronal CompartmentalizationRNA QuantificationLocal Protein SynthesisNeurite FractionGrowth Cone AnalysisRNA LocalizationSynaptic Plasticity

Related Articles