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Zeckenblut, das durch eine künstliche Membran in einer 3D-gedruckten Kammer in der Ixodid-Zeckenforschung fließt

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DOI:

10.3791/69606

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20. März 2026

 , 
1Department of Entomology, University of Arizona, 2Department of Entomology, Kansas State University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Diese Methode beschreibt die Entwicklung eines in vitro durchgeführten Zeckenblutfütringssystems mit einer 3D-gedruckten Kammer und einer im Labor gefertigten Silikonmembran. Das System ermöglicht künstliche Fütterung von Zecken, ermöglicht eine einfache Probenahme in verschiedenen Fütterungsphasen und nutzt geringe Blutmengen und bietet ein unschätzbares Werkzeug zur Untersuchung von Ixodidenzecken.

Zusammenfassung

Diese Arbeit präsentiert ein detailliertes Protokoll für ein Zeckenfütterungssystem durch eine künstliche Silikonmembran, die eine 3D-gedruckte Kammer aus hochauflösendem Photopolymerharz verwendet. Die Methode umfasst die Gestaltung der Zuführkammer, die Vorbereitung der Silikonmembran, die Montage des Systems und optimierte Bedingungen für die Zeckenfütterung. Zecken sind einer der führenden Krankheitsüberträger in den Vereinigten Staaten und weltweit. Zeckenforschung ist entscheidend, um wirksame Strategien zur Prävention und Verringerung von zeckenübertragenen Krankheiten zu entwickeln. Als obligate hämatophage Ektoparasiten müssen Zecken Blut trinken, um zu überleben und somit Krankheiten zu übertragen, was die Bluternährung zu einem grundlegenden Prozess bei der Untersuchung von Vektor-Wirt-Interaktionen, Pathogenübertragung sowie der Biologie, Physiologie und anatomischen Morphologie von Zecken macht. Zeckenfuttersysteme mit einer Silikonmembran wurden in den letzten Jahrzehnten weit verbreitet eingesetzt und verfeinert. Viele bestehende Systeme sind jedoch auf eine einzelne Zeckenart, Lebensphase oder spezifische Bedingungen zugeschnitten. Das in diesem Protokoll beschriebene Zeckenfütterungssystem wurde erfolgreich verwendet, um sowohl teilweise gefütterte als auch vollständig angeschwollene Exemplare von mehreren der wichtigsten Zeckenvektorarten in den Vereinigten Staaten zu gewinnen, darunter Amblyomma americanum, A. maculatum, Ixodes scapularis und Rhipicephalus sanguineus adult. Das System hat Erfolg bei der Einleitung der Fütterung von erwachsenen Dermacentor variabilis und Nymphen A. americanum gezeigt, wobei die höchsten Fressraten (>85 %) bei adulten A. americanum beobachtet wurden. Daher ist die in dieser Studie entwickelte Futterkammer anpassungsfähig für den Einsatz mit einem geringen Volumen verschiedener Blutmenge bis zu 100 μL, was für die Übertragung von Krankheitserregern und toxikologische Untersuchungen entscheidend ist. Der transparente Deckel mit minimaler Höhe der Kammer erleichterte die Beobachtung der Zecken während der Zeckenfressdauer.

Einleitung

Zecken sind obligate, blutfressende Ektoparasiten, die eine Vielzahl von Krankheitserregern übertragen und übertragen können, darunter Bakterien, Viren und Parasiten, die weltweit Tiere und Menschen Krankheiten verursachen 1,2,3,4. Als der häufigste Krankheitsvektor in den Vereinigten Staaten, nur von Mücken im Rest der Welt übertroffen (2,3,5), können mehrere Zeckenarten krankheitserregerassoziierte Krankheiten übertragen, während andere Arten auch bekannt sind, nicht übertragbare Krankheiten wie das Alpha-Gal-Syndrom (AGS, auch bekannt als Rotfleischallergie) auszulösen, das in den letzten Jahren weltweit zunehmend gemeldet wurde6, 7,8,9,10,11,12,13,14,15,16. Forschung, die darauf abzielt, Zeckenbiologie, Physiologie, Genetik und Vektorkompetenz zu verstehen, ist unerlässlich, um Strategien zur Verringerung der wirtschaftlichen und öffentlichen Gesundheitsbelastung sowohl übertragbarer als auch nicht übertragbarer Zeckenübertragbarer Krankheiten zu verringern. Die Untersuchung der Zecken-Wirt-Interaktionen erfordert oft teilweise gefütterte oder vollständig angeschwollene Zecken, um spezifische Forschungsfragen zu beantworten. Dies kann durch Fütterung lebender Tiere erreicht werden, sodass Zecken ihren gesamten Lebenszyklusabschließen können. Obwohl die Verwendung lebender Tiere zur Zeckenfütterung sehr effektiv für die Entwicklung und Erhaltung von Zeckenkolonienist, kann sie schwierig umzusetzen sein und ist aufgrund von Wirtsverfügbarkeitsbeschränkungen und Einrichtungsvorschriften möglicherweise nicht auf jede Forschungshypothese anwendbar. Am wichtigsten ist, dass die erfolgreiche Umsetzung von in-vitro-Zeckenfütterungssystemen dazu beiträgt, den Einsatz lebender Tiere zu reduzieren, was ein bedeutendes Forschungsziel im Rahmen der "Animal Use Alternative (3Rs)" (ersetzen, reduzieren, raffinieren) ist20.

Es gibt zahlreiche Vorteile, künstliche Membran-Zeckenfütterungssysteme in der Forschung einzusetzen, da sie breite Möglichkeiten bieten, eine Vielzahl wissenschaftlicher Fragestellungen zu beantworten. Diese lassen sich grob in drei Gruppen zusammenfassen; (1) Bewertung des Effekts auf die Blutvariation des Wirts und Vektor-Wirt-Interaktionen unter Verwendung verschiedener Blutquellen, wie z. B. Zecken-Alpha-Gal-Produktion während der Fütterung21, (2) Bewertung der Akarizid-Toxizität durch die Abgabe von Verbindungen mit dem Blut22 und die Rückgewinnung von Zeckensekretierten Verbindungen während der Blutfütterung23, (3) Bewertung der Vektorkompetenz durch natürliche Abgabe von Krankheitserregern während der Blutfütterung24, 25, 26, 27, unter anderem. Darüber hinaus ermöglicht die Art des künstlichen Membranfütterungssystems groß angelegte Tests verschiedener Behandlungen und Konzentrationen, ohne wirtsbezogene Variationen in kleinem Maßstab und Volumen einzuführen, wodurch der Bedarf an lebenden Tieren verringert wird.

Zeckenfütterungssysteme mittels künstlicher Membranen wurden in der Forschung und zur Unterstützung der Zeckenkolonie-Aufzuchteingesetzt, was in einigen Fällen den Abschluss des langen Lebenszyklus der Zeckeermöglicht. Viele Protokolle zur Optimierung der Zeckenfütterungssysteme und ihrer Materialien wurden für verschiedene Zeckenartenberichtet: 32, 33, 34. Dennoch ist allgemein bekannt, dass die In-vitro-Zeckenernährung je nach Systembedingungen, verwendeten Materialien und vor allem Zeckenarten und Stadium34 stark variieren kann. Darüber hinaus sind viele Systeme auf große Blutmengen angewiesen, wie das kontinuierliche Flusssystem27, das zwar sehr effektiv ist, aber aufgrund des hohen Blutvolumens teuer sein kann. Dieses Protokoll beschreibt ein künstliches Membran-Zeckenfuttersystem, das in den Erwachsenenstadien von fünf verschiedenen Zeckenkrankheitsvektorarten in den Vereinigten Staaten erfolgreich ist. Dazu gehören Amblyomma americanum, A. maculatum, Ixodes scapularis, Rhipicephalus sanguineus und Dermacentor variabilis.

Protokoll

Zeckenfütterungsexperimente wurden mit kommerziell erhältlichem defibriniertem Rinderblut (Hemostat Laboratories, CA, USA) und defibriniertem menschlichem Blut (Bioivt, CA, USA) durchgeführt, das Blut gemäß den vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) und dem Institutional Review Board (IRB) genehmigten Protokollen und Richtlinien sammelt und verarbeitet. In dieser Studie wurden keine lebenden Wirbeltiere zur Zeckenfütterung verwendet. Alle Zecken, die in diesem Protokoll verwendet werden, wurden von der Zeckenaufzuchtstätte der Oklahoma State University gekauft. Die Reagenzien und die verwendeten Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Zeckenfutterkammern

  1. Entwerfen Sie die Kammern mit einer kostenlosen 3D-Design-Software, die auf eine 35 mm x 10 mm Petrischale passt. Die Größen der gedruckten Teile (Abbildung 1A) sind wie folgt: Kammerkörper (Teil i) 25 mm (Innendurchmesser) x 20 mm (hoch), mit 3 mm Wanddicke an der Basis und 6 mm Wanddicke am oberen Deckelring (Teil ii) 30 mm (Innendurchmesser) x 5 mm (hoch) sowie 3,5 mm Wanddicke und äußerer Ring (Teil III) 31 mm (Innendurchmesser) x 5 mm (hoch) und 3 mm Wanddicke.
    HINWEIS: Der Deckelring enthält vier kreisförmige Öffnungen von 3 mm (Durchmesser) x 2 mm (Höhe) an der Oberseite, um Magnete zu platzieren. Die Oberseite der Kammer hat ebenfalls gleich große Öffnungen zum Anbringen der Magnete (Abbildung 1B). Das 3D-Modelldesign sollte als .stl-Datei gespeichert werden, das gebräuchlichste 3D-Druckformat. Dateien, die das in diesem Protokoll verwendete 3D-Design enthalten, werden auf Anfrage bereitgestellt.
  2. Druckkammern mit einem 10" 14K LCD 3D-Drucker mit grauen oder weißen Photopolymerharzen (Abbildung 1A) oder einem anderen hochauflösenden 3D-Drucker/Diensten, der 3D-Modelle aus einer .stl-Datei druckt.
    HINWEIS: Dieses Protokoll nutzte die Druckdienstleistungen und Harze der University of Arizona. Die Verwendung hochauflösender Harze sorgt für die Entstehung detaillierter und langlebiger Kammern.
  3. Mit Handschuhen stellen Sie vor der Montage sicher, dass keine Harzrückstände auf den Teilen sind, indem Sie Waschen und gegebenenfalls vorsichtiges Schleifen mit feinem Schleifpapier (180 bis 200 Körnung) abschleifen. Stellen Sie sicher, dass der flache Boden von Teil i (Abbildung 1A) glatt ist. Dies gewährleistet eine ordnungsgemäße Haftung der Silikonmembran und verringert das Risiko von Austritten.
  4. Belichte alle trockenen Teile 10 Minuten lang UV-Licht, um eine vollständige Harzpolymerisation sicherzustellen.
    HINWEIS: Die meisten 3D-Druckdienste, die giftige Harze zum Drucken verwenden, verwenden UV-Licht, um das Harz auszuhärten (die Modelle zu verhärten und die Harzvergiftung zu entfernen); gelegentlich bleibt es jedoch "nicht vollständig ausgehärtet". Ein nicht vollständig ausgehärtetes Modell bleibt leicht klebrig und kann unpolarisiertes Harz tragen, das giftig sein oder bei der Handhabung Reizungen verursachen kann. Zusätzliche UV-Lichteinstrahlung sorgt für eine vollständige Harzhärtung.
  5. Kleben Sie die 3 mm x 2 mm großen runden Magnete mit klarem Epoxidkleber mit klarem Epoxidkleber an die Schlitze an der Oberseite der Kammern und Deckelringe. Lassen Sie es über Nacht bei Zimmertemperatur trocknen (20–25 °C/mindestens 16 H). Stellen Sie sicher, dass die Pole der Magnete in eine Richtung ausgerichtet sind, um der Anziehung der Pole an den Magneten im oberen Teil des Deckelrings zu entsprechen (Abbildung 1A, Teil ii).
  6. Assembleren Sie alle Teile für das Modell, um eine ordnungsgemäße Passform aller Komponenten sicherzustellen, wie in Abbildung 1A–C gezeigt.

2. Membranpräparation

  1. Legen Sie ein 30 cm x 30 cm großes Stück Frischhaltefolie auf eine saubere Oberfläche und stellen Sie sicher, dass es faltenfrei ist, indem Sie es auf einer flachen Fläche spannen und die Ränder mit Klebeband befestigen (Abbildung 2Ai).
  2. Legen Sie 4–5 einzelne Blätter Linsenreinigungspapier auf ein verlängertes Stück Plastik/Frischhaltefolie, das 5 cm auseinander liegt (Abbildung 2Aii).
  3. Bereiten Sie die Silikonmembran mit den unten angegebenen Komponenten und Mengen vor.
    HINWEIS: Die Mengen reichen aus, um 4–5 (7 cm × 12 cm) Membranen herzustellen, die jeweils bis zu 5–6 Zuführkammern aufnehmen, insgesamt 20–30 Kammern.
  4. Bereiten Sie die Silikonmischung vor, indem Sie 15 g Silikon-Klardichtmasse (20–25 Shore A-Härte) kombinieren und 4,5 g Silikonöl (30 % des Gesamtsilikons) sowie 2,9 g Hexan (19,3 % des gesamten Silikons) hinzufügen. Geben Sie die Zutaten in ein Plastikwiegeboot und verrühren Sie vorsichtig mit einem Pfannenwender (Abbildung 2Aiii).
    HINWEIS: Sorgen Sie für minimale Blasenbildung, indem Sie die Zutaten vorsichtig mischen.
  5. Geben Sie 2–3 g Silikonmischung entlang des kleineren Randes des Linsenpapiers, um es an der Frischhaltefolie zu befestigen. Lassen Sie 5–10 Sekunden zu, damit das Silikon durch das Linsenpapier sickert (Abbildung 2Aiv).
  6. Verteilen Sie die Silikonmischung gleichmäßig über das Linsenpapier mit einem geraden Werkzeug wie einem Deckel, Lineal oder Pfannenwender. Stellen Sie sicher, dass das verwendete Objekt die gesamte Fläche des Linsenpapiers abdeckt (Abbildung 2Av). Dies gewährleistet eine Silikonabdeckung mit einem einzigen Zug und verhindert Membranrüssel und Wellen am Rand des Objekts.
  7. Stellen Sie sicher, dass das gesamte Silikongemisch in der Membran verwendet wird, indem Sie das Spreizwerkzeug wieder in die Ausgangsposition zum Streuen bringen. Da etwas Silikonmischung am Spreizwerkzeug zurückbleibt, sorgt das Zurückführen des Werkzeugs dafür, dass das gesamte Silikon verwendet wird, um Lücken zu vermeiden (Abbildung 2Avi).
    HINWEIS: Die Membran sollte gleichmäßig durchscheinend und ohne Wellen erscheinen (Abbildung 2B).
  8. Bereiten Sie Membranen unterschiedlicher Dicke zunächst vor, indem Sie mehr oder weniger Silikonmischung hinzufügen, da die Dicke erst gemessen werden kann, wenn die Membranen trocken sind.
  9. Lassen Sie die Membranen über Nacht bei Raumtemperatur (20–25 °C/mindestens 16 Stunden) an der Luft trocknen.
  10. Messen Sie die Membrandicke mit einem digitalen Messgerät für den Außenmikrometer. Für verschiedene adulte Zeckenarten werden unterschiedliche Membrandicken verwendet, von kurzen Mundwerkzeugen (70 μm Membrandicke) bis zu längeren Mundwerkzeugen (200 μm Membrandicke).
  11. Entferne alle Teile aus zuvor montierten Kammern und trage Silikonkleber auf den unteren Rand der Kammern auf. Für die präzise Kleberplatzierung verwenden Sie eine 1-ml-Spritze und füllen Sie sie mit Silikonkleber (Abbildung 2Ci).
  12. Setzen Sie eine 200 μL Pipettenspitze auf die Spritzenspitze (statt der Nadel) zum Kleberauftragen (Abbildung 2Cii) und schrauben Sie sie wie eine Nadelspitze an das Ende der Spritze (Abbildung 2Ciii). Dadurch kann Feinkleber am unteren Rand jeder Kammer aufgetragen werden (Abbildung 2Civ).
  13. Platzieren Sie die Kammer über der Membran (Abbildung 1, Teil i) mit einem gewichteten Objekt, um das Setzen sicherzustellen. Lassen Sie es über Nacht bei Zimmertemperatur stehen (20–25 °C/mindestens 16 H) (Abbildung 2D,E).
    HINWEIS: Verwenden Sie ein flach gewichtetes Objekt. Dieses Protokoll verwendete ein 2,5 kg schweres Stück Acryl (Abbildung 2E).
  14. Schneiden Sie die überschüssige Membran aus den Kammern mit einer gebogenen Schere ab (Abbildung 3A).
  15. Bevor Sie die Kammer zur Zeckenfütterung verwenden, entfernen Sie die verbleibende Frischhaltefolie (dort, wo die Membran vorbereitet ist (Schritt 2.1) (Abbildung 3B)).
  16. Setzen Sie die Kammerteile wieder zusammen, fügen Sie unten eine 35 mm x 10 mm große Petrischale hinzu und verwenden Sie die Deckel der Schüsseln als Deckel der Kammern, indem Sie sie umdrehen und zwischen die Magnete legen (Abbildung 3C, D).
    HINWEIS: Verwenden Sie die Deckel umgekehrt, da der Deckelhalterring genau zum Deckel passt, wenn er umgekehrt ist (siehe Bauteilbeschreibungen in Abbildung 3C,D).
  17. Weichen Sie die Kammermembran in destilliertes Wasser mit dem unteren Teil von 35 mm x 10 mm Petrischalen ein. Lassen Sie die Membran über Nacht bei Raumtemperatur (20–25 °C/mindestens 16 H) in Wasser stehen. Da die Membran anfangs hydrophob ist, hilft das Einweichen in Wasser vor der Zugabe von Blut, um die Bildung von eingeschlossenen Blasen zu verringern.
    HINWEIS: Das Fehlen von Blasen bestätigt, dass die Hydrophobie entfernt wurde.

3. Zeckenernährung und Blutpräparation

  1. Machen Sie 2–3 kleine Atemlöcher in die Deckel jeder Kammer (aus den 35 mm x 10 mm Petrischalen) (Teil IV in Abbildung 1A), wie in Schritt 2.16 (Abbildung 3E) erwähnt. Verwenden Sie ein erhitztes Metallskalpell oder einen dünnen Metallpfannenwender, um die Atmungslöcher im Deckel zu stechen.
    HINWEIS: Atemöffnungen ermöglichen es, Feuchtigkeit im Kammergehäuse zu internalisieren.
  2. Ergänzen Sie das Blut mit Gentamicinsulfat in einer Endkonzentration von 50 μg/mL. Gib Antibiotika nur dem Blut zu, das innerhalb einer Woche zur Anwendung gedacht ist, und lagere es bei 4 °C. Halten Sie Rinderblut (oder anderes Tierblut) vor und nach der Zugabe von Antibiotika bei 4 °C.
  3. Geben Sie 2–3 ml Blut in eine saubere 35 mm x 10 mm Petrischale und setzen Sie dann die Kammer darauf. Passen Sie die Kammergröße an, um die Blutmenge pro Kammer zu erhöhen oder zu verringern, indem Sie den Einstellring drehen (Teil iii aus Abbildung 1A). Passen Sie die Kammergröße an und lassen Sie einen Abstand von 1–2 mm vom Boden der Petrischale bis zur Membran. Siehe die magentafarbenen Pfeile in Abbildung 4A als Referenz.
    HINWEIS: Das Verstellringdesign der Kammern ermöglicht die Kontrolle des verwendeten Blutvolumens. das heißt, ein größerer Abstand zwischen dem Boden der Petrischale und der Membran erfordert ein größeres Volumen, um den Raum zu füllen.
  4. Platziere ungefütterte Zecken in Kammern mit gleicher Anzahl von Männchen und Weibchen. Stellen Sie sicher, dass beide Geschlechter immer in der Kammer sind, da dies die Fressrate beeinflussen kann (Abbildung 4B zeigt 4 Männchen und 4 Weibchen des adulten A. americanum im Inneren der Kammer). Maximal 10–15 Zecken pro Kammer (im Erwachsenenstadium) werden für eine einfachere Handhabung verwendet.
    HINWEIS: Bei der Arbeit mit unreifen Stadien ist die Anzahl der Zecken höher (20–50 Nymphen pro Kammer, was in diesem Protokoll nicht vorkommt).
  5. Platzieren Sie Kammern in überdachten, trockenen Bädern bei 37 °C ± 1 °C mit einer Feuchtigkeitsquelle (also Wasserbechern), die eine relative Luftfeuchtigkeit von 63 % ± 2 % (Abbildung 4C) unter einem 12:12-Stunden-Hell-Dunkel-Photozeitraum beibehält.
    HINWEIS: Diese Anforderungen können je nach Zeckenart und Laborbedingungen variieren; Probiere bei Bedarf andere Feuchtigkeitseinstellungen aus und prüfe die beste Einrichtung für das Labor.

4. Ersatz von Blut und Kammern

  1. Bereiten Sie zwei Spritzflaschen mit den Lösungen vor, die zum Ausspülen der Membran zwischen den Blutwechsel verwendet werden. In einer Flasche geben Sie 0,005 % Nystatinlösung in destilliertes Wasser; In der zweiten Flasche destilliertes Wasser hinzufügen.
  2. Nach 12–16 Uhr bereiten Sie neue Petrischalen mit frischem Blut vor und stellen Sie sie in das trockene Bad bei 37 °C, bevor Sie die Kammer aufstellen.
  3. Während das frische Blut erwärmt, entferne die Kammer aus dem verwendeten Blut und spüle die Unterseite der Membran 3–5 Sekunden mit destilliertem Wasser ab, dann 3–5 Sekunden mit 0,005 % Nystatinlösung, um eine Pilzkontamination zu verhindern. Spülen Sie die Membran erneut mit destilliertem Wasser, um eventuelle restliche Nystatinrückstände zu entfernen.
    HINWEIS: Dieser Vorgang dauert weniger als 5 Minuten und beeinträchtigt nicht die Fütterung der Zecken, die an der Oberseite der Membran befestigt sind.
  4. Entsorgen Sie das gesamte verwendete Blut und das Spülwasser in einen Behälter mit 0,5 % Natriumhypochlorit-Lösung (10 % Bleichmittel). Blutabfälle werden gemäß dem institutionellen Sicherheitsprotokoll entsorgt.
  5. Nach dem Abspülen wird die Kammer in die neue Petrischale mit Blut gelegt.
    HINWEIS: Verwenden Sie die Kammern bis zu 2–3 Monate vor dem Waschen, sofern keine Verunreinigung und keine Undichtigkeiten vorliegen. Kammern und Membranen werden verschmutzt und laufen Gefahr, über drei Monate ohne Waschen Nutzung hinaus kontaminiert zu werden. Dies führt zu reduzierten Zecken-Fütterungsraten. Verwenden Sie die Kammern bis zu 1,5 Jahre lang (~10 Waschzyklen).
  6. Verwenden Sie die Kammern wieder, indem Sie sie bis zu 30 Minuten in eine 0,5%ige Natriumhypochloritlösung (10% Bleichmittel) geben und dann mit Spülmittel waschen. Setzen Sie die Kammern nicht über längere Zeit (>30 Min) Bleichmittel aus, da der Geruch die Anhaftungsrate verringert und die Harzintegrität mit der Zeit schwächen kann.
    HINWEIS: Eine längere Bleichwirkung macht die Kammer flexibel, wenn sie nass ist, und spröde beim Trocknen, was zu Brüchen führt. Dadurch hält die Kammer nicht länger als 4–5 Waschzyklen, basierend auf wiederholten Beobachtungen. Die kontinuierliche Nutzung derselben Kammer ohne Waschen (bis zu 3 Monate) führt zu einer schnelleren Zeckenbefestigung (1–3 Tage nach dem Einsetzen in die Kammer) im Vergleich zu einer frisch gewaschenen Kammer (oft >7 Tage zum Andocken). Dies liegt wahrscheinlich am Geruch von Frass und anderen Ansammlungspheromonen von Zecken, die in der Kammer fressen, was die Zeckenernährunganregen kann 35,36.

Ergebnisse

Membrandicke für jede Zeckenart.
Die höchsten Zeckenfutterraten wurden bei den folgenden Membrandickenspezifikationen für jede adulte Zeckenart beobachtet: Amblyomma americanum 100–200 μm; A. maculatum 100–250 μm; Rhipicephalus sanguineus 70–100 μm; Ixodes scapularis <150 μm, Dermacentor variabilis <150 μm. Alle Zeckenarten wurden während der Nahrungsaufnahme unter denselben Bedingungen von Luftfeuchtigkeit und Temperatur gehalten (63 % relative Luftfeuchtigkeit und 37 °C) (Tabelle 1).

Zecken und Blutquellen, die in diesem Protokoll verwendet werden,
Alle Zecken wurden aus der Zeckenaufzuchtanlage der Oklahoma State University entnommen und bei einer relativen Luftfeuchtigkeit von >90 % bei 20 °C bei einer Hell-Dunkel-Photoperiode von 12:12 Stunden gehalten. Alle Zecken wurden im Rahmen eines Forschungsprojekts zur Untersuchung von Alpha-gal (αGal)-Spiegeln in verschiedenen Zeckenarten mit defibriniertem Rinder- oder Menschenblut gefüttert. Diese Studie verglich die Auswirkungen der Ernährung auf verschiedenen Blutquellen innerhalb eines umfassenderen Projekts zum Alpha-Gal-Syndrom (AGS), das von der Forschungsgruppe durchgeführt wurde. Die meisten hier beschriebenen Zeckenproben wurden vor der vollständigen Vergrößerung seziert, um αGal-Quantifizierungsanalysen in teilweise gefütterten Zecken (2–5 Tage Fütterung) durchzuführen. Nur eine Teilmenge der Amblyomma americanum-Zecken (jene, die nicht für die αGal-Quantifizierung benötigt werden) durften sich bis zur Ersättigung ernähren. Obwohl hier keine detaillierten Vergleiche zwischen von Rindern und Menschen gefütterten Zeckenfütterungsraten präsentiert werden, ist bemerkenswert, dass die vollständige Aufblähung (d. h. Futtererfolg) bei Zecken, die mit Rinderblut gefüttert wurden, besser erreicht wurde. Unter den Zecken, die über längere Zeit in den Futterstellen bleiben durften (n = 35), erreichten 15 eine vollständige Anfüllung, was einer Fresserfolgsquote von 42,8 % entspricht. Davon wurden 9 mit Rinderblut und 6 mit menschlichem Blut gefüttert (60 % Rindergefütterte gegenüber 40 % Menschengefütterte).

Zwitzfütterungsraten vs. Zeckenfütterungserfolgsraten
Die Fütterungsraten der Zecken in dieser Studie wurden anhand der Erwerbung von teilweise gefütterten Zecken (2–5 Tage Fütterung) bestimmt, während der Erfolg der Fütterung als vollständige Aufwellung definiert wurde, typischerweise angezeigt durch eine Veränderung der Alloscutum-Färbung des Weibchens (Daten nur für Amblyomma americanum verfügbar). Männliche Fütterungsraten wurden als kontinuierliche Fütterung von mehr als 2 Tagen (2–5 Tage) definiert. Die Gesamtfütterungsraten wurden berechnet, indem Daten von Zecken, die mit Rinder- und Menschenblut gefüttert wurden, kombiniert und die Prozentsätze der Zecken berechnet wurden, die 2–5 Tage Fütterung oder eine vollständige Vergrößerung aus Zecken in den Kammern erreichten. Zecken, die sich nicht anhefteten oder nach <2 Tagen Anhaftung starben, wurden bei der Berechnung der Fressraten berücksichtigt. Obwohl keine quantitativen Daten zum Einfluss der Blutquelle auf die Fütterungsraten der Zecken vorliegen, deuten diese Beobachtungsbelege darauf hin, dass bei den meisten Zeckenarten die Anheftung und Fressraten zwischen Rinder- und Menschenblut während der 2–5-tägigen Ernährungszeit nicht wesentlich unterscheiden. Eine Ausnahme wurde bei Rhipicephalus sanguineus beobachtet, der zwischen Tag 3 und 5 eine geringere Fressensrate von menschlichem Blut aufwies als Rinderblut. Die Fütterungsraten aller Zeckenarten, die mit diesem in-vitro-Zeckenfütterungssystem eine teilweise Nahrungsaufnahme und vollständige Vergrößerung erreichten, sind in Tabelle 1 zusammengefasst.

Amblyomma americanum weibliches Gewicht und Nahrungsphasenklassifikation
Teilweise gefütterte Weibchen A. americanum wurden basierend auf den Futtertagen eingeteilt als: (1) ungefüttert, (2) 2–3 Tage teilweise gefüttert, (3) 4–5 Tage teilweise gefüttert und (4) angeschwollen (Abbildung 5). Die angeschwollene Fütterungsphase umfasste Zecken zu Beginn der schnellen Aufwellungsphase (mit Gewichten von 48,9 mg bis 109 mg) und vollständig angeschwollene Zecken (mit Gewichten von 272,7 mg bis 348,7 mg).

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Abbildung 1: Zeckenzuführkammer – 3D-Modell und gedruckte Baugruppe mit Membran. Explodiertes 3D-Modell und fertig zusammengebaute Kammer, die einzelne Komponenten zeigt: (i) Kammerkörper (Zeckengehäuse), (ii) Deckelhalterring, (iii) Höhenverstellring, (iv) 40 mm x 10 mm Petrischalendeckel und (v) 40 mm x 10 mm Petrischale Boden mit Blut (A). Montage des 3D-gedruckten Modells und der einzelnen Bauteilgrößen in mm (B). Zusammengebaute Kammer wurde in grauem 8K-Auflösungsharz (C) gedruckt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 2: Vorbereitung der Silikonmembran und der Kammerbaugruppe. (i) eine 30 cm × 30 cm große Plastikfolie, die mit Klebeband befestigt ist und keine sichtbaren Falten sicherstellt, (ii) einzelne Blätter Linsenreinigungspapier auf die Folie gelegt, etwa 5 cm auseinander, (iii) sanftes Vermischen der Silikonkomponenten mit einem Pfannenwender in kreisenden Bewegungen, (iv) jedes Blatt Linsenpapier wird durch das Auftragen von 1–2 g Silikonmischung an den Rändern befestigt, (v) die Silikonmischung gleichmäßig über das Linsenpapier verteilt mit einem geraden Instrument, das größer als das Papier ist (Bild zeigt den Rand eines Glasdeckels), (vi) die geringere Menge an Silikonmischung während des Streuens beachten, das zurückgehaltene Silikon auf dem Werkzeug wird zurückgegeben und verteilt, um eine gleichmäßige Abdeckung zu gewährleisten (A). Richtig verteilte Membranen zeigten keine Luftblasen oder Lücken (B). Vorbereitung der Spritze für die Anwendung des Leims: (i) eine 1-ml-Spritze, gefüllt mit Silikonkleber, (ii) eine 200 μL Pipettenspitze, die in die Spritzenspitze passt, (iii) die Pipettenspitze wird festgeschraubt, um eine undichte Abdichtung sicherzustellen, und (iv) das Platzieren des Leims am unteren Rand von Teil i (C). Die Kammer wird auf die getrocknete Membran (D) gelegt, und ein gewichtetes Objekt (ein dicker Acrylblock mit einem Gewicht von 2,5 kg; magentafarbener Pfeil) wird darauf gelegt, um eine feste Haftung (E) zu gewährleisten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 3: Abschließende Schritte bei der Kammer- und Membranvorbereitung vor der Nutzung. Beschneiden der Kanten der Membran um die Kammer mit einer kleinen gebogenen Schere (A), Entfernen der Frischhaltefolie vor der Verwendung der Kammer (B), Endmontage des Modells (C), Platzierung der Kammer in eine 40 mm x 10 cm große Petrischale mit Wasser und Verwendung der Petrischale als Kammerdeckel (D) (die Zahlen i-v zeigen die Teile wie in Abbildung 1A angegeben), und Kammerdeckel mit Atemöffnungen (gekennzeichnet durch magentafarbene Pfeilspitzen) (E). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 4: Blutfütterung und Zeckenplatzierung. Die Kammer wird in eine blutgefüllte Schale gelegt, wobei der Höhenverstellring hervorgehoben ist (magentafarbene Pfeile) (A). Innenansicht des Kammergehäuses mit gleicher Anzahl männlicher und weiblicher Zecken (B). Zeckenkammern, die in trockenen Bädern mit einer Feuchtigkeitsquelle platziert sind, wobei eine relative Luftfeuchtigkeit von 63 % ± 2 % (RH) und eine Temperatur von 37 °C ± 1 °C (C) gewährleistet ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 5: Größen- und Gewichtsschwankungen von Amblyomma americanum während der Fütterung. Ungefütterte Zeckengröße und durchschnittliches Gewicht der teilweise gefütterten Zecken werden angezeigt. Die Bilder stellen typische Beispiele dar, die dem durchschnittlichen Gewicht entsprechen, das zu jedem Fütterungsintervall erfasst wird. Die beiliegende Tabelle zeigt Durchschnittsgewichte, Standardabweichungen, die Anzahl der analysierten Zecken, Median und Quartile 1 und 3 für jeden Futterzeitpunkt. Zecken, die 2–3 Tage gefüttert wurden, zeigten einen Gewichtsbereich von 7,4 mg (minimum) bis maximal 19,2 mg. Zecken, die 4–5 Tage gefüttert wurden, lagen zwischen 20,6 mg und 44,8 mg. Zecken zu Beginn der schnellen Aufblähungsphase und vollständig angeschwollene Zecken wogen zwischen 48,9 mg und 348,7 mg. Bild eines angehängten A. americanum-Weibchens, das 4-5 Tage gefüttert wurde (gelber Pfeilkopf) und ein vollständig geschwollenes Weibchen (magentafarbene Pfeilspitze). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Zeckenarten und GeschlechtAnzahl der gefütterten Zecken / Gesamtzahl der Zecken in Kammern (Anzahl der toten Zecken)Fütterungsrate (Zecken sind 2–5 Tage angehängt)Durchschnittsgewicht (mg) (SD)Verwendete Membrandicke (μm)
A. americanum Weibchen85/97 (12)87.60%37.3 (54.40)*100 - 200
A. americanum männliche19/22 (2)86.30%Nicht aufgezeichnet100 - 200
Weibchen von A. maculatum45/66 (21)68.20%122.4 (141.65)100 - 250
A. maculatum männlich36/47 (11)76.60%Nicht aufgezeichnetNicht aufgezeichnet
Weibchen von R. sanguineus34/60 (26)56.60%Nicht aufgezeichnet70 - 100
I. scapularis Weibchen15/23 (8)65.20%Nicht aufgezeichnet<150
*Die Erfolgsquote, die bei einer Teilmenge der mit Rindern gefütterten Aa-Zecken bewertet wurde, beträgt (n=35) bei 42,8 %.

Tabelle 1: Zeckenfutterrate und Durchschnittsgewicht.

Ergänzende Abbildung 1: Niedrigvolumenfütterung (100 μL) der einzelnen Zecken, die bereits an einer Stelle der 3D-Kammer befestigt sind. Ein kleines PCR-Röhrchen, das mit Silikonkleber an der Unterseite der künstlichen Membran befestigt ist, wird mit 100 μL Blut gefüllt. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

Künstliche Membranfütterungssysteme für Zecken sind äußerst effektive Werkzeuge für die Zeckenforschung und werden in vielen Forschungslaboren als praktikable Alternativen zur Fütterung lebender Tiereeingesetzt 28,29. Der Hauptwert dieser Systeme liegt in ihrer Fähigkeit, verschiedene Wirkstoffe über das Blutmehl abzugeben oder zurückzugewinnen, darunter Krankheitserreger, Akariazide, von Zecken abgeleitete Verbindungen und andere modulatorische Moleküle(22,23,25,27). Die Optimierung künstlicher Membranfütterungssysteme könnte die Entwicklung nachhaltiger Zeckenkoloniezucht erleichtern und so die Abhängigkeit von lebenden Tieren verringern.

Das in diesem Protokoll beschriebene in-vitro-Zeckenfütterungssystem war besonders erfolgreich bei adulten Amblyomma americanum und Ixodes scapularis. Die Erfolgsraten der Zeckenfütterung sind definiert als der Anteil (oder Prozentsatz) der Zecken, die ihre Fütterung erfolgreich abschließen und vollständig aufblähen. Teilweise gefütterte Zecken (typischerweise 3–4 Tage nach der Frachterinnahme) reichen jedoch oft aus, um spezifische experimentelle Hypothesen für die meisten Zeckenforschungslabore zu klären, die die Zeckenbiologie oder -physiologie untersuchen. In diesem Protokoll für künstliche Membranfütterung und zur Bearbeitung spezifischer Forschungsziele im Alpha-Gal (αGal)-Projekt wurden die Begriffe "Zeckenfütterungsrate" verwendet, um die Erfassung von teilweise gefütterten Zecken (2–5 Tage Fütterung) und "Zeckenfütterungserfolg" zu bezeichnen, um die vollständige Aufwellung bei A. americanum zu bezeichnen. Die höchsten Fütterungsraten waren bei A. americanum-Weibchen (87,6 %), gefolgt von A. americanum-Männchen (86,3 %), A. maculatum-Weibchen (68,2 %), A. maculatum-Männchen (76,6 %), I. scapularis-Weibchen (65,2 %) und R. sanguineus-Weibchen (56,6 %), während die Fresserfolgsrate bei A. americanum 42,8 % lag (Tabelle 1). Teilweise gefütterte Weibchen A. americanum wurden basierend auf den Futtertagen in 4 Kategorien (Fütterungsphasen) eingeteilt, modifiziert gegenüber früheren Veröffentlichungenwie folgt: (1) ungefüttert, (2) 2–3 Tage teilweise gefüttert, (3) 4–5 Tage teilweise gefüttert und (4) angeschwollen (Abbildung 5). Die angeschwollene Ernährungsphase umfasste Zecken zu Beginn der schnellen Vergrößerungsphase (mit Gewichten von 48,9 mg bis 109 mg) und vollständig angeschwollene Zecken (mit Gewichten von 272,7 mg bis 348,7 mg) (Abbildung 5). Dieses künstliche Membran-Zeckenfütterungssystem hat mehrere Studien innerhalb derselben Forschungsgruppe und derselben Zusammenarbeit ermöglicht, indem es die Erzeugung von teilweise gefütterten Zecken mit Rinderblut ermöglichte, die anschließend zur Befall von Mäusen verwendet und die Übertragungshypothese des Alpha-Gal-Syndroms (AGS), einer durch Zeckenbiss verursachten roten Fleischallergie, sowie für eine N-Glykomik-Studie11,21, 37. Die Bequemlichkeit des individuellen Aufbaus ermöglichte die Nutzung verschiedener Blutquellen, und der klare Deckel sowie die minimale Höhe der Kammer erleichterten die Sichtbarkeit der Zecken während der Ernährungsphase unter einem Stereomikroskop mit ausreichender Arbeitsdistanz.

Jüngste Veränderungen bei der Luftfeuchtigkeit (von Wasserbad, 90 % RH, zu trockenem Bad, 63 % ± 2 % RH), Temperatur (von 37 °C auf 35 °C und wieder auf 37 °C) und Membrandicke (Tabelle 1) haben die erfolgreiche Fütterung mehrerer Zeckenarten ermöglicht. Obwohl Temperatur und relative Luftfeuchtigkeit (RH) wichtige Variablen sind, um die in vitro Zeckenernährung zu kontrollieren, sind Membrandicke und -festigkeit entscheidende Faktoren für eine erfolgreiche Fütterung verschiedener Zeckenarten33,38. Es ist wichtig zu beachten, dass Zecken mit kurzen Mundwerkzeugen, wie Rhipicephalus sanguineus und Dermacentor variabilis, dünnere Membranen benötigen als solche mitlangen Mundwerkzeugen (39), wie Amblyomma spp und Ixodes spp. Die höchsten Zeckenfressraten wurden bei Amblyomma americanum und A. maculatum mit einer Membrandicke von 100–200 μm erreicht; Rhipicephalus sanguineus mit Dicken zwischen 70–100 μm; Ixodes scapularis mit Dicken <150 μm und Dermacentor variabilis <150 μm (Tabelle 1). Ein wichtiger Faktor bei der künstlichen Membran-Zeckenfütterung ist, dass weiterhin Schwankungen in den Fütterungsraten auftreten. In diesem System erhöht oder stellt eine leichte Temperaturänderung, also von 37 °C auf 35 °C und nach ein paar Tagen wieder auf 37 °C zurück, oft die Fütterungsraten der Zecken wieder her. Darüber hinaus ergibt der Wechsel von trockenem Bad zu Wasserbad ähnliche Ergebnisse bei Amblyomma spp. und Ixodes scapularis, jedoch wurde dieser Effekt bei Rhipicephalus sanguineus nicht beobachtet, der bei trockenen Bädern mit 63 % ± 2 % RH besser frisst.

Andere künstliche Zeckenfütterungssysteme, wie jene, die vom fünfteiligen kontinuierlichen Flusssystem von Ueti, M. et al. (USDA-ARS) adaptiert und später von Yamasaki, Y. et al. für zusätzliche Zeckenarten modifiziert wurden, haben eine hohe Effizienz gezeigt und erzielen konstant hohe Zeckenfütterungserfolgsratenvon 27,40. Studien, die häufigen Zugang zum System zur Zerlegung von teilweise gefütterten Zecken erfordern, machen diese Setups jedoch weniger geeignet, da das wiederholte Öffnen und Schließen der Zeckenhauskammer umständlich sein kann. Die in diesem Protokoll beschriebene 3D-gedruckte Kammer verfügt über einen magnetischen Sicherverschlussdeckel und einzelne Petrischalen, was eine einfache Handhabung und eine visuelle Inspektion der Zeckenfütterung ermöglicht, ohne das Setup zu stören. Der transparente Deckel ermöglicht eine visuelle Überwachung ohne Störung und wird sicher über eingebettete Magnete an der Kammer befestigt, im Gegensatz zu den gängigsten Zeckenfütterungssystemen, wie sie durch das ursprüngliche Design von Kröber und Guerin22,29 optimiert wurden, bei denen eine individuelle Visualisierung ohne das Entfernen der Fütterungskammer aus dem Blut nicht möglich ist, da alle Futtereinheiten in einer einzigen Platte integriert sind und die Methoden verwendet werden, um das Entweichen von Zecken zu verhindern Keine Visualisierung zulassen. Darüber hinaus kann dieses in-vitro-Zeckenfütterungssystem weiter verfeinert werden, um kleinere, ortsspezifische Blutmengen zu liefern. Beispielsweise könnte, sobald weibliche Zecken an definierten Fressstätten angebracht sind, die untere Petrischale durch kleine Reservoirs ersetzt werden, wie etwa der obere Teil eines 100-μL PCR-Rohrs, der weniger als 100 μL Blut direkt unter dem Anheftungsbereich enthält (ergänzende Abbildung 1). Dieser Niedrigvolumen-Fütterungsansatz würde detaillierte Studien zur Erwerbsaufnahme und -übertragung von Krankheitserregern sowie Untersuchungen zu den Auswirkungen von Zeckengiftstoffen und wirtsabgeleiteten Antikörpern ermöglichen. Dieses Protokoll hat sich als erfolgreich erwiesen, um teilweise gefütterte Zecken von verschiedenen erwachsenen Zeckenarten zu erhalten. Für diese Studie wurden in diesem Protokoll keine Eiablage und vollständige Aufblähungsraten bewertet; es wird jedoch eine weitere Optimierung durchgeführt, um Zeckennachkommen zu gewinnen, was mit Amblyomma americanum und Ixodes scapularis auf Basis von vorläufigen Beobachtungen erreicht werden könnte. Vielleicht ist die innovativste Eigenschaft dieses Systems seine Flexibilität für kleinmaßstäbige experimentelle Manipulationen, die kontrollierte Variationen von Behandlungen und Umweltbedingungen ermöglicht und gleichzeitig Anwendungen in der Kolonienaufcht unterstützt.

In-vitro-Zeckenernährung ist ein wertvolles Werkzeug für Forscher, die Zeckenbiologie, -physiologie und Vektorkompetenz erforschen. Die künstliche Membran-Zeckenfütterung ist jedoch eine zeitaufwändige und aufwändige Aufgabe. Dieses Protokoll, das eine 3D-gedruckte Kammer mit einem Sure-Lock-System und eine einfache, im Labor gefertigte Membran umfasst, bietet eine einfache Einrichtung, sobald die Kammern gedruckt und die Membranen vorbereitet sind, was eine längere Nutzung ermöglicht. Zusätzlich kann das System durch Anpassung der Membrandicke effektiv an verschiedene Zeckenarten angepasst werden. Weitere Optimierungen, einschließlich Kammergröße und Membrandicke, ermöglichen die Anwendung über verschiedene Lebensphasen der Zecken.

Offenlegungen

Die Autoren geben keine materiellen finanziellen Interessen an, die sich auf die in diesem Artikel beschriebene Forschung beziehen.

Danksagungen

Die Autoren möchten die fleißige Arbeit der Bachelor-Studierenden und -Mitarbeiter Kara Golden, Sydney Ingham und Omayma Jaddou Najma würdigen, die bei der Zeckenfütterung und dem Aufbau der Zeckenkammer und Membran halfen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
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Durchsichtige Lebensmittelfolie (Klebeband)GutCLO00020
Defibriniertes RinderblutHemostat-LaboreDBB100
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Mikropipettenspitzen, 200 μ L Biotix uTIP63300057Für eine Spritze. Silikon-Dichtmasseapplikator
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