Transkriptomische Analyse basierend auf Bulk-RNA-seq-Daten

Summary

Das vorliegende Protokoll etabliert eine vollständige Pipeline zur Analyse des Bulk-RNA-Seq-Prozesses von Rohdaten bis zur funktionellen Anreicherungsanalyse.

Abstract

Nichtalkoholische Fettleber (NAFL) gilt üblicherweise als gutartige Erkrankung; sobald es jedoch zu nicht-alkoholischer Steatohepatitis (NASH) überschreitet, besteht ein deutlich erhöhtes Risiko, eine Endstadium-Lebererkrankung zu entwickeln. Viele Studien versuchen, den molekularen Mechanismus hinter dem Übergang von NAFL zu NASH zu klären. Hochdurchsatz-Sequenzierungstechnologien (wie Bulk RNA-seq) haben Forschern ein tieferes Verständnis verschafft, indem sie das Transkriptom untersucht und die Expression von Molekülen, die Aktivierung von Signalwegen und andere Faktoren im Zusammenhang mit dem Krankheitsverlauf aufzeigten. Es gibt eine Fülle von Open-Source-Daten, die Forscher analysieren können, um potenzielle Ziele für die Behandlung von Krankheiten zu identifizieren. Die verwandte Forschung ist jedoch durch das Fehlen eines effizienten und zuverlässigen Verfahrens zur Upstream-Analyse des Transkriptoms eingeschränkt. Hier wird eine hochgradig reproduzierbare und benutzerfreundliche Upstream-Analyse sowie eine daraus resultierende Differentialgenanalyse-Pipeline bereitgestellt, um eine standardisierte Verarbeitung und tiefgehende Parsing privater oder öffentlicher Daten zu erreichen. Die Pipeline ist in vier Schritte unterteilt: (1) Qualitätskontrolle der Daten; (2) Genkartierung; (3) Differentialgenanalyse; und (4) Funktionalanalysis. Dieser Prozess zielt darauf ab, die molekularen Mechanismen der Krankheitstransformation aufzudecken und Forschern durch die Analyse von Bulk RNA-seq-Daten potenzielle Arzneimittelziele und therapeutische Ansätze zu unterstützen.

Introduction

Die nicht-alkoholische Fettlebererkrankung (NAFLD) ist weltweit die am häufigsten verbreitete chronische Lebererkrankung und betrifft mehr als ein Viertel der Bevölkerung. Seine Häufigkeit ist in den letzten Jahrzehnten dramatisch gestiegen, ^1,2,3. Die wachsende Krankheitsbelastung, insbesondere ihre fortgeschrittenere Form, die nichtalkoholische Steatohepatitis (NASH), stellt eine große globale Gesundheitsherausforderung und eine schwere wirtschaftliche Belastung^dar. Die erste Stufe von NAFLD ist die nicht-alkoholisch....

Protocol

Zu Demonstrationszwecken wurde der öffentlich verfügbare Datensatz PRJNA1023502 von Lan Bai et al. erstellt, um jeden Schritt sowohl der Upstream- als auch Downstream-Analysen²⁰ zu illustrieren. Da dieser Datensatz aus der Open-Access-Datenbank der NCBI SRA stammt, sind keine zusätzlichen Genehmigungen oder ethischen Genehmigungen erforderlich. Siehe die Materialtabelle, um alle erforderlichen Software- und R-Package-Versionen zu überprüfen. Der öffentlich verfügbare Datensatz umfasst PRJNA1023502 6 Nicht-NASH-, 6 NAFL- und 6 NASH-Leber-RNA-seq-Proben. In diesem Protokoll wurde der Datensatz ve....

Results

Der Upstream-Analyse-Workflow für Bulk RNA-Seq ist in Abbildung 1A dargestellt. Dieser Workflow führt sequentiell folgende Schlüsselschritte auf einer Linux-Plattform aus: Erstens wird eine strenge Qualitätskontrolle der Rohsequenzierungsdaten mittels FASTP durchgeführt, um minderwertige Lese- und Adaptersequenzen zu entfernen; anschließend richtet HISAT2 hochwertige Lesungen auf das Referenzgenom aus, wobei Samtools die Ausrichtungsdateien konvertiert und s.......

Discussion

Die Massenanalyse von RNA-seq-Daten wird als interdisziplinäre Aufgabe charakterisiert, die Genomik, Bioinformatik, Statistik und Informatik integriert. Ein vollständiger analytischer Workflow umfasst mehrere Upstream- und Downstream-Schritte, darunter Rohdatenvorverarbeitung, Qualitätskontrolle, Sequenzausrichtung, Gen-Quantifizierung, Datennormalisierung, Analyse differenzieller Expression und biologische Interpretation. Unter diesen Schritten ist die genaue Umwandlung der Rohsequenzie.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
biomaRt	Bioleiter	2.64.0	Genannotation aus Ensembl
clusterProfiler	Bioleiter	4.16.0	Funktionale Anreicherungsanalyse
DESeq2	Bioleiter	1.48.1	Differentialexpressionsanalyse
FactoMineR	AgroParisTech	2.11.0	PCA und multivariate Analyse
Fastp	OpenGene	1.0.1	Qualitätskontrolle und Filterung von FASTQ-Daten
FeatureCounts	Bioinformatik-Abteilung, Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research	2.0.0	Zähle die Anzahl der Reads, die jedem Gen zur Genexpressionsquantifizierung zugeordnet wurden.
ggplot2	Posit	3.5.2	Datenvisualisierung
ggrepel	Kamil Slowikowski	0.9.6	Nicht überlappende Textbeschriftungen
ggridges	Claus O. Wilke	0.5.6	Erstelle Gratlinien-Diagramme
HISAT2	Johns Hopkins Universität	2.2.1	Richten Sie die gefilterten, hochwertigen Lesungen auf das Referenzgenom aus
R	R Core Team	4.5.0	Eine Umgebung für Datenberechnung, -analyse und -visualisierung
RColorBrewer	Erich Neuwirth	1.1.3	Farbpaletten zum Plotten
Samtools	Arbeitsbereich der großflächigen Genomik	1.22.0	Konvertieren und verarbeiten Sie SAM-Dateien für effiziente Abrufe und Zugriff
SRA-Toolkit	Nationales Zentrum für Biotechnologie-Information	3.2.1	Rohsequenzierungsdaten aus der NCBI SRA-Datenbank abrufen und vorverarbeiten