Transkriptomische Analyse basierend auf Bulk-RNA-seq-Daten

Summary

Das vorliegende Protokoll etabliert eine vollständige Pipeline zur Analyse des Bulk-RNA-Seq-Prozesses von Rohdaten bis zur funktionellen Anreicherungsanalyse.

Abstract

Nichtalkoholische Fettleber (NAFL) gilt üblicherweise als gutartige Erkrankung; sobald es jedoch zu nicht-alkoholischer Steatohepatitis (NASH) überschreitet, besteht ein deutlich erhöhtes Risiko, eine Endstadium-Lebererkrankung zu entwickeln. Viele Studien versuchen, den molekularen Mechanismus hinter dem Übergang von NAFL zu NASH zu klären. Hochdurchsatz-Sequenzierungstechnologien (wie Bulk RNA-seq) haben Forschern ein tieferes Verständnis verschafft, indem sie das Transkriptom untersucht und die Expression von Molekülen, die Aktivierung von Signalwegen und andere Faktoren im Zusammenhang mit dem Krankheitsverlauf aufzeigten. Es gibt eine Fülle von Open-Source-Daten, die Forscher analysieren können, um potenzielle Ziele für die Behandlung von Krankheiten zu identifizieren. Die verwandte Forschung ist jedoch durch das Fehlen eines effizienten und zuverlässigen Verfahrens zur Upstream-Analyse des Transkriptoms eingeschränkt. Hier wird eine hochgradig reproduzierbare und benutzerfreundliche Upstream-Analyse sowie eine daraus resultierende Differentialgenanalyse-Pipeline bereitgestellt, um eine standardisierte Verarbeitung und tiefgehende Parsing privater oder öffentlicher Daten zu erreichen. Die Pipeline ist in vier Schritte unterteilt: (1) Qualitätskontrolle der Daten; (2) Genkartierung; (3) Differentialgenanalyse; und (4) Funktionalanalysis. Dieser Prozess zielt darauf ab, die molekularen Mechanismen der Krankheitstransformation aufzudecken und Forschern durch die Analyse von Bulk RNA-seq-Daten potenzielle Arzneimittelziele und therapeutische Ansätze zu unterstützen.

Introduction

Die nicht-alkoholische Fettlebererkrankung (NAFLD) ist weltweit die am häufigsten verbreitete chronische Lebererkrankung und betrifft mehr als ein Viertel der Bevölkerung. Seine Häufigkeit ist in den letzten Jahrzehnten dramatisch gestiegen, ^1,2,3. Die wachsende Krankheitsbelastung, insbesondere ihre fortgeschrittenere Form, die nichtalkoholische Steatohepatitis (NASH), stellt eine große globale Gesundheitsherausforderung und eine schwere wirtschaftliche Belastung^dar. Die erste Stufe von NAFLD ist die nicht-alkoholische Fettleber (NAFL), die von Entzündungen und Fibrose begleitet wird, die sich zu NASH entwickeln können. Letzteres erhöht das Risiko eines Fortschreitens zu Endstadium-Lebererkrankungen, einschließlich Zirrhose und hepatozellulärem Karzinom (HCC)^5,6,7. HCC-Inzidenz und -Mortalität sind mit einem Anstieg von NASH ^8,9 verbunden, und es wird erwartet, dass NAFLD/NASH bis 2030 die führende Indikation für Lebertransplantationen sein^wird. Der klinische Verlauf von NAFLD ist jedoch hoch heterogen¹¹, was die Entwicklung relevanter^{Medikamente 12} stark behindert und es besonders wichtig macht, die beteiligten molekularen Mechanismen präzise zu untersuchen.

Die massenhafte RNA-Seq-basierte Erfassung zellulärer Zusammensetzungsinformationen kann die Pathogenese verschiedener Krankheiten erheblich aufklären. In den letzten Jahrzehnten wurden zahlreiche Massen-RNA-seq-Studien an Modellorganismen und Menschen durchgeführt, um Genexpressionsunterschiede im NASH-Fortschreiten 13,14,15 aufzuklären und neue therapeutische Ziele für die Intervention zu identifizieren. Basierend auf einer Bulk-RNA-Seq-Analyse fanden Xiong et al. heraus, dass nichtparenchymale Zellen (NPCs) in der Leber an Prozessen wie der Bildung extrazellulärer Matrixen und Zelladhäsion beteiligt sind, die zum Fortschreiten von NASH¹⁶ beitragen. Li et al. zeigten, dass das hepatische Wilms-Tumor-1-assoziierende Protein (WTAP) in Hepatozyten die Eileiterfettakkumulation und Entzündung reguliert und so die NASH-Bildung¹⁷ fördert. Obwohl die Bulk-RNA-Seq-Analyse ein mächtiges Werkzeug zur Aufklärung der Mechanismen von NASH ist, sind ihre Ergebnisse sehr empfindlich gegenüber der Qualität der Upstream-Daten. Die Heterogenität von vorgelagerten experimentellen Operationen und Analyseprozessen kann die Zuverlässigkeit der Daten ernsthaft beeinträchtigen, wodurch echte biologische Informationen verschleiern und die Genauigkeit nachfolgender Analysen beeinträchtigt werden. Daher ist es wichtig, eine Reihe standardisierter Upstream-Analyseverfahren einzurichten.

Im Vergleich zur Single-Cell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) bietet Bulk RNA-Seq mehrere deutliche Vorteile sowohl im experimentellen Design als auch in der praktischen Anwendungen. Während scRNA-seq die Identifizierung zellulärer Heterogenität auf Einzelzellebene ermöglicht und eine präzise Analyse zelltypspezifischer transkriptionaler Merkmale ermöglicht, ist es mit hohen Kosten, komplexen Datenverarbeitungsanforderungen und begrenzter Sensitivität bei der Erkennung von Transkripten mit geringer Häufigkeit verbunden¹⁸. Im Gegensatz dazu bietet Bulk RNA-Seq eine höhere Sequenzierungstiefe, geringere Kosten und einen größeren Probendurchsatz, was es besonders geeignet für populationsebene differenzielle Genexpressionsanalysen und die Erforschung molekularer Mechanismen^{macht 19}. Daher bleibt Bulk RNA-Seq, wenn es von standardisierten analytischen Arbeitsabläufen geleitet wird, ein effizienter, kosteneffizienter und robuster Ansatz zur Untersuchung der molekularen Grundlage komplexer Krankheiten.

Dieses Protokoll ist speziell für Bulk-RNA-Seq-Datensätze entwickelt, die aus menschlichen Geweben mit hoher RNA-Integrität (RIN ≥ 7,0) und ausreichender RNA-Eingabe (≥ 500 ng pro Probe) stammen. Um eine zuverlässige Ausführung von Ausrichtungs- und Quantifizierungsschritten sicherzustellen, wird eine lokale Arbeitsstation empfohlen, die mit mindestens einer 10-Kern-CPU, 32 GB RAM und mindestens 200 GB freiem Festplattenspeicher ausgestattet ist. Aufbauend auf diesen Anforderungen bietet das Protokoll einen effizienten und benutzerfreundlichen analytischen Workflow, einschließlich detaillierter Betriebsanweisungen und standardisierter Parameterkonfigurationen, um den Bedürfnissen von Forschern zu erfüllen, die groß angelegte transkriptomische Daten analysieren.

Protocol

Zu Demonstrationszwecken wurde der öffentlich verfügbare Datensatz PRJNA1023502 von Lan Bai et al. erstellt, um jeden Schritt sowohl der Upstream- als auch Downstream-Analysen²⁰ zu illustrieren. Da dieser Datensatz aus der Open-Access-Datenbank der NCBI SRA stammt, sind keine zusätzlichen Genehmigungen oder ethischen Genehmigungen erforderlich. Siehe die Materialtabelle, um alle erforderlichen Software- und R-Package-Versionen zu überprüfen. Der öffentlich verfügbare Datensatz umfasst PRJNA1023502 6 Nicht-NASH-, 6 NAFL- und 6 NASH-Leber-RNA-seq-Proben. In diesem Protokoll wurde der Datensatz verwendet, um alle Schritte des Bulk-RNA-Seq-Workflows zu demonstrieren, einschließlich Datenabruf aus der SRA-Datenbank, Qualitätskontrolle (fastp), Ausrichtung (HISAT2), Quantifizierung (featureCounts) sowie nachgelagerter Analysen von differenzieller Expression und funktionaler Anreicherung.

1. Installation des SRA-Toolkits

1. Besuchen Sie die offizielle Website des SRA Toolkit und laden Sie Version 3.2.1 herunter.

2. Öffentlicher Datendownload

1. Erhalten Sie die SRA-Nummer.
   1. Zugreifen Sie in der Artikelzulage²⁰, im Bereich Datenverfügbarkeit oder durch Suche nach Schlüsselwörtern in der NCBI SRA-Datenbank.
   2. Geben Sie Prefetch im Terminal ein, um sie herunterzuladen.

3. Erzeugung einer Gen-Zählmatrix

1. Definieren Sie Pfade und Einstellungen wie unten beschrieben:
   REFERENCE=~/reference/human/GRCh38/GRCh38.primary_assembly.genome.fa
GTF=~/reference/human/GRCh38/gencode.v44.annotation.gtf
INDEX=~/reference/human/GRCh38/GRCh38_index
FASTQ_DIR=~/SRA_tutorial/fastq
OUT_FASTP=~/RNAseq/fastp
OUT_HISAT2=~/RNAseq/hisat2
OUT_COUNTS=~/RNAseq/counts
​mkdir -p $FASTQ_DIR $OUT_FASTP $OUT_HISAT2 $OUT_COUNTS
   1. Laden Sie das menschliche Referenzgenom (GRCh38 primäre Assemblierung) und die entsprechende Genannotationsdatei (gencode.v44, umfassende Genannotationssammlung) aus der offiziellen GENCODE-Datenbank (https://www.gencodegenes.org/human/) herunter.
      for f in SRR*; do [[ ! $f =~ \.sra$ ]] && mv "$f" "$f.sra"; done
​for f in SRR*; do [[ ! $f =~ \.sra$ ]] && mv "$f" "$f.sra"; done
2. Umbenennt SRA-Dateien.
   1. Stellen Sie sicher, dass alle SRA-Dateien die .sra-Dateierweiterung verwenden, um eine genaue Erkennung und Verarbeitung durch nachgelagerte Werkzeuge zu erleichtern.
   2. Führe die folgenden Befehle aus:
      for f in SRR*; do [[ ! $f =~ \.sra$ ]] && mv "$f" "$f.sra"; done
3. Führen Sie folgenden Befehl aus, um SRA-Dateien in das FASTQ-Format umzuwandeln:
   for f in *.sra; do fasterq-dump "$f" --split-files -O $FASTQ_DIR - e 20; done
4. Erstelle einen HISAT2-Index aus dem Referenzgenom.
   hisat2-build $REFERENCE $INDEX
5. Verarbeiten Sie FASTQ-Dateien mit visueller Fortschrittsüberwachung.
   for fq in $FASTQ_DIR/*.fastq; do
​sample=$(basename "$fq" .fastq)
   1. Für Daten mit gepaarten Endsequenzierungen führen Sie folgenden Befehl aus
      for fq1 in $FASTQ_DIR/*_1.fastq; do
sample=$(basename "$fq1" _1.fastq)
​fq2=$FASTQ_DIR/${sample}_2.fastq
   2. Führen Sie Qualitätskontrolle und Filterung mit FASTP durch und geben Sie die Ergebnisse in das Verzeichnis $OUT_FASTP aus. Für Single-End-Sequenzierungsdaten führen Sie folgenden Befehl aus:
      fastp \
-i "${fq}" \
-o $OUT_FASTP/${sample}.clean.fastq \
-h $OUT_FASTP/${sample}.html \
-j $OUT_FASTP/${sample}.json \
-w 20
      Für Daten mit gepaarten Endsequenzierungen führen Sie folgenden Befehl aus:
      fastp \
-i "${fq}" \ -I "$fq2" \
-o $OUT_FASTP/${sample}_1.clean.fastq \
-O $OUT_FASTP/${sample}_2.clean.fastq \
-h $OUT_FASTP/${sample}.html \
-j $OUT_FASTP/${sample}.json \
​-w 20
   3. Für jede Probe wird der HTML-Bericht zur visuellen Qualitätskontrolle geprüft und der JSON-Bericht für strukturierte Kennzahlen konsultiert, darunter Lesequalität, GC-Verteilung, Lesevergütung und Adapterkontamination. Stellen Sie sicher, dass alle Proben folgende Qualitätsschwellenwerte erfüllen: Q30 ≥ 85 %, Adapterkontaminationsrate < 5 % und keine abnormen GC-Muster. Speichern Sie alle Ausgabedateien im Verzeichnis $OUT_FASTP.
   4. Führen Sie die Sequenzausrichtung mit HISAT2 durch, generieren Sie SAM-Dateien und geben Sie diese in das Verzeichnis $OUT_HISAT2 aus. Für Single-End-Sequenzierungsdaten führen Sie folgenden Befehl aus:
      hisat2 -p 20 \ -x $INDEX \-U $OUT_FASTP/${sample}.clean.fastq \
-S $OUT_HISAT2/${sample}.sam
      Für Daten mit gepaarten Endsequenzierungen führen Sie folgenden Befehl aus:
      hisat2 -p 20 \-x $INDEX \-1 $OUT_FASTP/${sample}_1.clean.fastq \
-2 $OUT_FASTP/${sample}_2.clean.fastq \
​-S $OUT_HISAT2/${sample}.sam
   5. Führen Sie die HISAT2-Ausrichtung der qualitätsgefilterten Lesungen auf das menschliche Referenzgenom durch und verwenden Sie einen Index, der aus der primären FASTA-Datei der GRCh38 erstellt wird. Geben Sie Beispielbefehle für sowohl Einzelend- als auch für paarweise Sequenzierungsdaten bereit.
   6. Konvertiere SAM in BAM, sortiere und indexiere.
      samtools view -@ 20 -bS $OUT_HISAT2/${sample}.sam \
| samtools sort -@ 20 -o $OUT_HISAT2/${sample}.sorted.bam
samtools index $OUT_HISAT2/${sample}.sorted.bam
​done
   7. Erzeugen Sie für jede Probe eine SAM-Datei und konvertieren Sie sie mit SAMtools in eine sortierte und indexierte BAM-Datei. Für hochwertige humane transkriptomische Proben (RNA-Integritätszahl, RIN ≥ 8,0) sollte die Gesamtausrichtungsrate 85 % überschreiten; Für typische Bulk-RNA-Seq-Proben (RIN ≥ 7,0) betrachten Sie die Ausrichtungsraten ≥ 70 % akzeptabel.
   8. Führen Sie Genquantifizierung mit featureCount durch.
      featureCounts -T 20 -p -s 0 \
-a $GTF \
-o $OUT_COUNTS /${sample}.counts.txt \
$OUT_HISAT2/${sample}.sorted.bam
Done
   9. Überprüfen Sie die tab-getrennte Ausgabedatei (*.counts.txt) und ihren Zusammenfassungsbericht (*.counts.txt.summary), die von featureCounts generiert werden, für jede Stichprobe. Stellen Sie sicher, dass die Lesezuweisungsrate den typischen Schwellenwert von ≥70 % für human bulk RNA-Seq erreicht; Eine deutlich niedrigere Rate kann auf eine unpassende Strangorientierung, Annotationsprobleme oder eine schlechte Ausrichtungsqualität hinweisen. Verwenden Sie den Parameter -s 0 für diesen nicht-strängspezifischen RNA-seq-Datensatz. Für strengspezifische Bibliotheken ersetzt man -s 0 durch -s 1 oder -s 2 im Befehl.
6. Erstellen Sie die unten beschriebene Genzählmatrix.
   1. Initialisieren Sie die Zählmatrix mit Gen-IDs und Zählungen aus der ersten Probe.
      cut -f1 $(ls $OUT_COUNTS/*.counts.txt | head -1) > all_counts.txt
   2. Fügen Sie iterativ die Zählungen jeder Probe zu einer einzigen Matrix zusammen.
      for f in $OUT_COUNTS/*.counts.txt; do
cut -f7 "$f" | paste all_counts.txt - > tmp && mv tmp
all_counts.txt
​done
   3. Füge eine Headerzeile mit Beispiel-IDs zur Zählmatrix hinzu.
      samples=$(ls *.counts.txt | sed 's/.counts.txt//' | paste -sd "\t")
echo -e "Geneid\t$samples" | cat - all_counts.txt > counts_matrix.txt
   4. Extrahiere Genlängen aus der GTF-Datei (Summe der Exonlängen pro Gen).
      awk '$3=="exon"{match($0,/gene_id "([^"]+)"/,a); if(a[1]!=""){len=$5-$4+1; gene_len[a[1]]+=len}} END{print "GENE_ID\tLENGTH"; for(g in gene_len) print g"\t"gene_len[g]}' \$GTF > gene_length.txt

4. Verarbeitung der Rohzählmatrix und Genannotation

1. R-Umgebungsinitialisierung und Laden des entsprechenden R-Pakets.
   1. Verwenden Sie die Funktion install.packages(), um tidyverse, ggplot2, ggrepel, RColorBrewer, ggridges, FactoMineR zu installieren. Das tidyverse-Paket wird für Datenmanipulation und -diagrammierung verwendet; Das ggplot2-Paket wird für die Visualisierung verwendet; Das Ggrepel-Paket wird für nicht überlappende Textbeschriftungen verwendet; das RColorBrewer-Paket wird für Farbpaletten verwendet; Das Ggridges-Paket wird für Ridge-Parzellen verwendet; das FactoMineR-Paket wird für PCA- und multivariate Analysen verwendet.
   2. Verwenden Sie die Funktion BiocManager::install(), um biomaRt, DESeq2 und clusterProfiler zu installieren. Das BiomaRt-Paket wird für Genannotation von Ensembl verwendet; das DESeq2-Paket wird für die Analyse differenzialer Ausdrücke verwendet; das clusterProfiler-Paket wird für funktionale Anreicherungsanalysen verwendet.
   3. Lesen Sie die in Schritt 2 generierte ursprüngliche Zählmatrix, verwenden Sie BiomaRt, um die Ensembl-ID auf den HGNC-Gennamen für die spätere Analyse abzubilden, entfernen Sie die doppelte Geneid-Spalte und erstellen Sie die bereinigte Zählmatrix. Verwenden Sie die ursprüngliche Zählmatrix (counts_matrix.csv) als Eingabe, mit Ensembl-Gen-IDs als Zeilen und Proben als Spalten. Speichere die gereinigte Zählmatrix als Ausgabe (clean_counts_SRA.csv), mit HGNC-Gensymbolen als Zeilen und Proben als Spalten.
      mart <- useMart("ensembl", dataset = "hsapiens_gene_ensembl")
id_map <- getBM(attributes = c("ensembl_gene_id", "hgnc_symbol"),
filters = "ensembl_gene_id",
values = exprSet$GeneID,
mart = mart)
exprSet <- exprSet %>%
left_join(id_map, by = c("GeneID" = "ensembl_gene_id")) %>%
filter(!is.na(hgnc_symbol), hgnc_symbol != "") %>%
distinct(hgnc_symbol, .keep_all = TRUE) %>%
column_to_rownames("hgnc_symbol")

5. Genexpressionsquantifizierung

HINWEIS: Siehe die ergänzende Akte 1 für das detaillierte Skript.

1. Führen Sie folgenden Befehl aus, um Fragmente pro Kilobase des Transkripts pro Million abgebildeter Lesungen (FPKM) und Transkripte pro Million (TPM) zu berechnen.
   counts <- read.csv("output/clean_counts_SRA.csv", header=TRUE, row.names=1)
gene_len <- read.delim("data/gene_length.txt", header=FALSE, col.names=c("gene_symbol","length"))
gene_len <- gene_len %>% distinct(gene_symbol, .keep_all=TRUE)
rownames(gene_len) <- gene_len$gene_symbol
gene_len <- gene_len[match(rownames(counts), gene_len$gene_symbol),]
length_bp <- gene_len$length
fpkm <- (counts / length_bp) * 1e9 / colSums(counts)
write.csv(fpkm, "output/clean_fpkm_SRA.csv")
tpm <- (counts / length_bp) / colSums(counts / length_bp) * 1e6
write.csv(tpm, "output/clean_tpm_SRA.csv")

6. Beispielclustering und Differenzvisualisierung

1. Beurteile die Datenqualität, indem du Stichprobenclustering mittels PCA prüfst. Siehe Supplementary File 1 für das detaillierte Skript.
2. Für die PCA-Visualisierung verwenden Sie den untenstehenden Code.
   gene.pca <- PCA(exprSet, ncp = 2, scale.unit = TRUE, graph = FALSE)
ggplot(pca_sample, aes(x = Dim.1, y = Dim.2)) +
geom_point(aes(color = group)) +
labs(x = paste('PC1:', pca_eig1, '%'),
y = paste('PC2:', pca_eig2, '%'))

7. Analyse differenzialer Expression und Visualisierung der Ergebnisse

HINWEIS: Siehe die ergänzende Akte 1 für das detaillierte Skript.

1. Führe die folgenden Befehle aus, um den DESeq2-Datensatz zu erstellen und die Schwelle festzulegen. Vor der Modellierung wurden nur Gene mit einer Gesamtzahl > 1 über alle Proben hinweg erhalten. Identifizieren Sie differenziell exprimierte Gene (DEGs) anhand der Signifikanzschwellenwerte des angepassten p-Werts < 0,05 und |log2FC| > 0,5.
   dds <- DESeq(DESeqDataSetFromMatrix(countData = exprSet, colData = colData, design = ~group)); sizeFactors(dds); res <- results(dds); dds <- dds[rowSums(counts(dds)) > 1,]
dd1 <- results(dds, contrast = contrast, alpha = 0.05)
dd2 <- lfcShrink(dds, contrast = contrast, res = dd1, type = "ashr")
2. Visualisieren Sie differenziell exprimierte Gene mit einem Vulkandiagramm.
   ggplot(data = data, aes(x = log2FoldChange, y = -log10(padj))) +
geom_point(aes(color = group), alpha = 1, size = 1.2) +
geom_hline(yintercept = -log10(0.05), lty = 4) +
geom_vline(xintercept = c(-0.5, 0.5), lty = 4) +
geom_text_repel(data = subset(data, abs(log2FoldChange) >= 1.5 & padj < 0.05),
aes(label = gene_id))

8. Durchführung von funktionellen Anreicherungsanalysen und Visualisierungen

HINWEIS: Siehe die ergänzende Akte 1 für das detaillierte Skript.

1. Visualisieren Sie die Ergebnisse der KEGG-Anreicherung.
   EGG <- enrichKEGG(gene = gene$ENTREZID, organism = 'hsa',
pvalueCutoff = 0.05, qvalueCutoff = 0.05)
ggplot(symboldata, aes(richFactor, Description)) +
geom_point(aes(color = p.adjust, size = Count))
2. Visualisieren Sie die Ergebnisse der GO-Anreicherung. Passen Sie die Visualisierung an, indem Sie die Bogenauflösung (n=500), Farbabbildungen und die Facettenanordnung gemäß experimentellen Spezifikationen anpassen.
   ego <- enrichGO(gene = gene$ENTREZID, OrgDb = "org.Hs.eg.db", ont = "ALL",
pvalueCutoff = 0.05, qvalueCutoff = 0.05, pAdjustMethod = "BH")
ggplot(df) +
ggforce::geom_link(aes(x = 0, y = Description, xend = -log10(p.adjust),
yend = Description, color = ONTOLOGY), n = 500, show.legend = FALSE) +
facet_wrap(~ONTOLOGY, scales = "free", ncol = 1)
3. Visualisieren Sie die Ergebnisse der Gensatz-Anreicherungsanalyse (GSEA). Passen Sie die Anzahl der Pfade, die Skalierung der Dichtegrate und die Schichttransparenz an, um unterschiedliche Effektgrößenverteilungen zu berücksichtigen.
   genelist <- sort(res$log2FoldChange, decreasing = TRUE)
names(genelist) <- rownames(res)
hallmarks <- read.gmt('resource/h.all.v2023.2.Hs.symbols.gmt')
y <- GSEA(genelist, TERM2GENE = hallmarks, pvalueCutoff = 0.05)
gsearesult <- yd %>% arrange(desc(NES)) %>% slice_head(n = 10)
ggplot(gsearesult, aes(x = logFC, y = Description, fill = -log10(pvalue))) +
geom_density_ridges(alpha = 0.8, scale = 0.8) +
geom_point(aes(size = abs(NES), x = -0.4, color = NES)) +
scale_fill_distiller(palette = 'Spectral') +
scale_color_distiller(palette = 'Reds') +
scale_size_continuous(range = c(2, 6))

Results

Der Upstream-Analyse-Workflow für Bulk RNA-Seq ist in Abbildung 1A dargestellt. Dieser Workflow führt sequentiell folgende Schlüsselschritte auf einer Linux-Plattform aus: Erstens wird eine strenge Qualitätskontrolle der Rohsequenzierungsdaten mittels FASTP durchgeführt, um minderwertige Lese- und Adaptersequenzen zu entfernen; anschließend richtet HISAT2 hochwertige Lesungen auf das Referenzgenom aus, wobei Samtools die Ausrichtungsdateien konvertiert und sortiert; schließlich führt Feature...

Discussion

Die Massenanalyse von RNA-seq-Daten wird als interdisziplinäre Aufgabe charakterisiert, die Genomik, Bioinformatik, Statistik und Informatik integriert. Ein vollständiger analytischer Workflow umfasst mehrere Upstream- und Downstream-Schritte, darunter Rohdatenvorverarbeitung, Qualitätskontrolle, Sequenzausrichtung, Gen-Quantifizierung, Datennormalisierung, Analyse differenzieller Expression und biologische Interpretation. Unter diesen Schritten ist die genaue Umwandlung der Rohsequenzie...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
biomaRt	Bioleiter	2.64.0	Genannotation aus Ensembl
clusterProfiler	Bioleiter	4.16.0	Funktionale Anreicherungsanalyse
DESeq2	Bioleiter	1.48.1	Differentialexpressionsanalyse
FactoMineR	AgroParisTech	2.11.0	PCA und multivariate Analyse
Fastp	OpenGene	1.0.1	Qualitätskontrolle und Filterung von FASTQ-Daten
FeatureCounts	Bioinformatik-Abteilung, Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research	2.0.0	Zähle die Anzahl der Reads, die jedem Gen zur Genexpressionsquantifizierung zugeordnet wurden.
ggplot2	Posit	3.5.2	Datenvisualisierung
ggrepel	Kamil Slowikowski	0.9.6	Nicht überlappende Textbeschriftungen
ggridges	Claus O. Wilke	0.5.6	Erstelle Gratlinien-Diagramme
HISAT2	Johns Hopkins Universität	2.2.1	Richten Sie die gefilterten, hochwertigen Lesungen auf das Referenzgenom aus
R	R Core Team	4.5.0	Eine Umgebung für Datenberechnung, -analyse und -visualisierung
RColorBrewer	Erich Neuwirth	1.1.3	Farbpaletten zum Plotten
Samtools	Arbeitsbereich der großflächigen Genomik	1.22.0	Konvertieren und verarbeiten Sie SAM-Dateien für effiziente Abrufe und Zugriff
SRA-Toolkit	Nationales Zentrum für Biotechnologie-Information	3.2.1	Rohsequenzierungsdaten aus der NCBI SRA-Datenbank abrufen und vorverarbeiten