Standardisierte, instabilitätsinduzierte Tiermodelle für präklinische Studien zur Arthrose

Zusammenfassung

Dieses Protokoll zielt darauf ab, geeignete Tiermodelle zur Erforschung von Arthrose zu entwickeln.

Zusammenfassung

Als weltweit am häufigsten verbreitete Gelenkerkrankung stellt die Kniearthrose (OA) eine bedeutende globale Gesundheitsbelastung dar, was umfangreiche Forschungen zu ihrer Entstehung und Behandlungsstrategien veranlasst hat. Trotz zahlreicher Studien fehlen standardisierte Methoden zur Modellbildung weiterhin. Um diese Lücke zu schließen, präsentieren wir umfassende, reproduzierbare Protokolle zur Entwicklung von instabilitätsinduzierten Tiermodellen der Arthrose, insbesondere das Destabilization of the Medial Meniscus (DMM)-Modell bei Mäusen und das Medial Meniscus Tear (MMT)-Modell bei Ratten. Darüber hinaus beschreiben wir ein einfaches und leicht umsetzbares Verfahren zur Bewertung postoperativer Schmerzschwellenwerte und räumlicher Gangstabilität, das darauf abzielt, methodische Konsistenz in der präklinischen OA-Forschung zu fördern. Die histologische und verhaltensbezogene Validierung bestätigte den Erfolg beider Modelle, da die Osteoarthritis Research Society International (OARSI)-Scores deutlich erhöht waren, die Schrittlänge signifikant verändert wurde und die mechanischen Schmerzschwellenwerte in den DMM- und MMT-Gruppen im Vergleich zu den Kontrollgruppen deutlich reduziert waren, was auf ausgeprägte Gelenkdegeneration und Überempfindlichkeit hindeutet. Diese Validierungsergebnisse unterstreichen die Reproduzierbarkeit und translationale Relevanz der beiden Modelle. Durch detaillierte Videodokumentation fördert diese Arbeit somit die prozedurale Standardisierung und erleichtert die konsistenz zwischen Laboren, wodurch die Zuverlässigkeit und Vergleichbarkeit der OA-Forschungsergebnisse verbessert werden.

Einleitung

Arthrose (OA) ist eine sehr verbreitete degenerative Gelenkerkrankung und eine der Hauptursachen für Behinderungen weltweit ^1,2. Trotz umfangreicher Forschung ist die Entwicklung wirksamer krankheitsmodifizierender OA-Medikamente (DMOADs) relativ langsam³. Heute ist weithin anerkannt, dass OA eine multifaktorielle Erkrankung ist, die komplexe pathologische Veränderungen in mehreren periartikulären Geweben umfasst, darunter Gelenkknorpel, subchondrales Knochen, Sehnen und Synovium ^4,5. Effektive präklinische Forschung zu den vielfältigen pathologischen Prozessen der OA erfordert den Einsatz gut definierter und geeigneter Tiermodelle. Obwohl eine Vielzahl von OA-Tiermodellen etabliert und berichtet wurde: 6,7,8,9,10,11, verwenden viele Studien weiterhin ungeeignete Tiermodelle, was die translationale Relevanz ihrer Ergebnisse einschränkt. Um dieses Problem zu adressieren, präsentieren wir standardisierte, instabilitätsinduzierte OA-Modelle, darunter reproduzierbare Destabilisierung des Medialen Meniskus (DMM) und Medialen Meniskusriss (MMT)-Prozeduren, in einem Videoformat, um als praktische Referenz für präklinische OA-Forschung und Modellstandardisierung zu dienen.

Wie in früheren Studien berichtet wurde, ist Meniskulinstabilität ein wesentlicher Faktor, der in klinischen Fällen zur Degeneration des Kniegelenks beiträgt. Daher dient die chirurgisch induzierte Meniskusinstabilität bei Mäusen und Ratten als effektiver Ansatz zur experimentellen Induktion von OA. In diesem Zusammenhang präsentieren wir zwei repräsentative, durch Instabilität induzierte OA-Modelle, darunter das DMM-Modell bei Mäusen und das MMT-Modell bei Ratten. Das DMM-Modell bei Mäusen ist besonders wertvoll für die Untersuchung molekularer Mechanismen der Arthrose, da Mäuse für transgene Manipulationen anfällig sind und dieses Modell einen allmählichen und verlängerten Krankheitsfortschritt aufweist, das der menschlichen Arthrose eng ähnelt. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass das DMM-Modell für Studien zu pathologischen Veränderungen im subchondralen Knochen weniger geeignet ist, wo alternative Modelle möglicherweise eine bessere translationale Relevanz bieten.

Darüber hinaus haben wir das MMT-Modell bei Ratten etabliert, um das DMM-Modell der Maus zu ergänzen. Das MMT-Verfahren verursacht umfangreichere strukturelle Schäden, die sowohl den Gelenkknorpel als auch das subchondrale Knochen betreffen, wodurch die fortgeschrittenen pathologischen Merkmale der Arthrose in klinischen Kontexten besser widergespiegelt werden. Dies macht das Ratten-MMT-Modell besonders geeignet für Bioingenieurwesen und translationale Forschung, einschließlich der Bewertung von Biomaterialien, regenerativen Therapien und Arzneimittelabgabesystemen, die auf Gelenkreparaturen abzielen. Obwohl die MMT- und DMM-Operationstechniken in früheren Studien beschrieben wurden, fehlt weiterhin ein umfassendes, schrittweises visuelles Protokoll, das Standardisierung, Reproduzierbarkeit und technische Präzision in allen Forschungslaboren gewährleistet. Um diese Lücke zu schließen, haben wir daher eine detaillierte videobasierte Demonstration entwickelt, die jeden entscheidenden Schritt der Modellbildung von der Tiervorbereitung bis zur postoperativen Versorgung darstellt. Darüber hinaus stellen wir zwei häufig verwendete Methoden der Verhaltensbewertung vor: eine zur Beurteilung der Schmerzschwelle und eine andere zur Analyse der räumlichen Gangstabilität, um einen konsistenten Rahmen für die funktionelle Beurteilung nach der Einleitung der Arthütze zu schaffen. Durch die Integration chirurgischer und verhaltensbezogener Protokolle zielt dieses Manuskript darauf ab, die methodologische Standardisierung in der präklinischen OA-Forschung zu fördern und so die Datenvergleichbarkeit und translationale Relevanz über Studien hinweg zu verbessern.

Protokoll

Alle experimentellen Verfahren wurden gemäß den Richtlinien des Ethical and Welfare Committee of Animal Ethics and Welfare der Chinesischen Medizinischen Universität Zhejiang durchgeführt und unter der Protokollnummer IACUC-20251020-11 genehmigt. Für die DMM-Operation wurden männliche C57BL/6 Mäuse im Alter von 10–12 Wochen eingesetzt, während männliche Sprague-Dawley-Ratten mit einem Gewicht von 200–225 g für das MMT-Verfahren ausgewählt wurden. Alle Tiere wurden unter spezifischen krankheitserregerfreien (SPF) Bedingungen gehalten und hatten vor den Experimenten eine einwöchige Akklimatisierungsphase. Die Standardhaltungsbedingungen wurden aufrechterhalten, wobei Futter, Wasser und Einstreu mindestens zweimal pro Woche ersetzt wurden, um das Tierwohl und die Konsistenz der Versuche zu gewährleisten.

1. Tiervorbereitung

1. Verabreichen Sie vor der Operation eine geeignete Analgesie (z. B. Buprenorphin) gemäß den institutionellen Richtlinien. Betäuben Sie das Tier mit einem Inhalationsanästhetikum (z. B. 2 % Isofluran bei 0,4 L/min bei einem frischen Gasfluss von 4 L/min in einer Induktionskammer) und halten Sie während des gesamten Eingriffs die Anästhesie über einen Nasenkegel aufrecht. Überprüfen Sie die Tiefe der Anästhesie, indem Sie sicherstellen, dass kein Pedalrückzugsreflex vorliegt.
2. Tragen Sie einen 2–3 mm dicken Streifen schmierender Augensalbe in den Bindehautsack des unteren Augenlids auf und massieren Sie das Augenlid sanft, um eine gleichmäßige Verteilung der Salbe über die Augenoberfläche zu gewährleisten.
3. Rasieren Sie das Fell um das rechte Kniegelenk und desinfizieren Sie die Operationsstelle mit einem dreistufigen Reinigungsverfahren mit Povidon-Jod, gefolgt von 70 % Ethanol. Legen Sie das Tier auf einen sterilen Operationstisch.

2. DMM-Operation bei Mäusen

HINWEIS: Dieses Verfahren induziert eine Gelenkdestabilisierung, indem das mediale Meniscotibiament (MMTL), das in Abbildung 1 rot hervorgehoben ist, durchschneidet und normalerweise den medialen Meniskus am Tibiaplateau verankert.

1. Positionieren Sie die betäubte Maus in Rückenlage und machen Sie einen kleinen medialen parapatellaren Hautschnitt (etwa 3–5 mm) über dem rechten Knie.
2. Sezieren Sie vorsichtig die darüber liegenden Weichteile, um die Gelenkkapsel freizulegen. Machen Sie einen Schnitt medial zur Patellarsehne und verschieben Sie die Kniebähle vorsichtig seitlich, um das Kniegelenk sichtbar zu machen. Bestätigen Sie, dass das MMTL als dünnes, ligamentartiges Band erscheint, das das vordere Horn des medialen Meniskus mit dem Tibiaplateau verbindet. Verwenden Sie ein Stereomikroskop, um die Sichtbarkeit zu verbessern und das Risiko einer Schädigung des Gelenkknorpels zu minimieren.
3. Schneiden Sie vorsichtig die Tibia-Befestigung des MMTL mit einer Mikroschere, einer #11-Skalpellklinge oder einer gebogenen Spritzennadel durch. Bei Verwendung einer gebogenen Spritzennadel hilft die stumpfe Kante, das darunterliegende Gelenkknorpel zu schützen. Bestätigen Sie den erfolgreichen Durchschnitt durch Beobachtung der resultierenden Destabilisierung des medialen Meniskus.
4. Schließe die eingeritzte Gelenkkapsel mit 8-0 Absorbierbare Nähte, gefolgt vom Schließen des Hautschnitts mit Wundklammern oder 6-0-Nähten.
   HINWEIS: Achten Sie darauf, während der Naht das Gelenkknorpel nicht zu durchstochen oder zu beschädigen, und stellen Sie sicher, dass die Gelenkenspannung beim Schließen des Schnitts ordnungsgemäß erhalten bleibt.
5. Lassen Sie das Tier sich auf einem Heizkissen erholen und überwachen Sie es genau, bis die volle Mobilität wiederhergestellt ist.

3. MMT-Operation bei der Ratte

HINWEIS: Dieses Verfahren induziert OA, indem nach Durchtrennung des medialen Kollateralbands (MCL) ein vollständiger Riss des medialen Meniskus entsteht, wodurch Gelenkinstabilität und fortschreitende Knorpeldegeneration entstehen.

1. Positionieren Sie die betäubte Ratte angemessen und machen Sie einen medialen parapatellaren Schnitt von etwa 6–8 mm Länge über dem rechten Knie.
2. Führen Sie eine stumpfe Dissektion durch, um die Muskelschichten zu trennen und das MCL klar freizulegen (Abbildung 2).
3. Mit einer chirurgischen Schere wird das MCL vollständig in der Mitte durchquert.
4. Ziehe das durchschnittene MCL vorsichtig zurück, um den darunterliegenden medialen Meniskus freizulegen. Mit feiner Pinzette greifen Sie den Meniskus und führen Sie einen vollständigen Durchschnitt in der engsten Stelle durch, um einen vollständigen Riss zu erzeugen.
5. Stellen Sie das Weichgewebe neu und schließen Sie den Schnitt in Schichten, wobei 5-0 absorbierbare Nähte für Muskel und Faszie verwendet werden, gefolgt von Wundklammern oder 5-0 nicht absorbierbaren Nähten zum Hautverschluss.
6. Lassen Sie das Tier sich erholen, indem Sie das gleiche Verfahren wie in Schritt 2.5 beschrieben befolgen.

4. Verhaltensbewertungen

1. Führen Sie vor der Operation Basisuntersuchungen durch und wiederholen Sie Untersuchungen zu festgelegten postoperativen Zeitpunkten (z. B. 2, 4 und 8 Wochen).
   HINWEIS: Um die Interoperator-Variabilität zu minimieren, wurden Verhaltenstests vom selben ausgebildeten Operator durchgeführt, der für die experimentelle Gruppe blind war. Jede Messung wurde dreimal pro Tier wiederholt, und der Durchschnittswert wurde für die Analyse verwendet.
   1. Vereinfachter mechanischer Rückzugsschwellwert
      1. Platzieren Sie die Mäuse in einzelne Fächer auf einer erhöhten Drahtgitterplattform und lassen Sie sie sich mindestens 30 Minuten vor dem Test akklimatisieren. Die mechanische Schmerzempfindlichkeit wird anschließend mit einem elektronischen von-Frey-Anästhesometer bewertet.
      2. Mit einem Von-Frey-Filament wird die Sonde auf die Plantaroberfläche der rechten Hinterpfote der Maus gelegt und die Kraft schrittweise^{um 12} erhöht.
      3. Nimm die Reaktion auf und stelle fest, dass eine positive Reaktion durch plötzlichen Pfotenrückzug, Zucken oder Lecken angezeigt wird. Bewerten Sie das Vorhandensein oder Fehlen einer konsistenten Reaktion, um Veränderungen der Sensibilität im Laufe der Zeit zu bewerten.
   2. Gangartanalyse
      1. Nutzen Sie ein automatisiertes Ganganalysesystem zur Bewertung.
      2. Erlauben Sie dem Tier, freiwillig über den Glasgang des Geräts zu gehen. Definieren Sie einen gültigen Versuch als einen, bei dem sich das Tier in einem gleichmäßigen Tempo bewegt, ohne zu pausieren. Warten Sie, bis die Systemsoftware automatisch Pfotenabdrücke identifiziert und mehrere Gangparameter berechnet. Analysieren Sie wichtige Kennzahlen für das rechte (operierte) Hintergliedmaß, einschließlich Dauer der Standphase, Schwunggeschwindigkeit und Pfotendruck, und vergleichen Sie diese mit denen der kontralateralen Gliedmaßen- und Scheinsteuerungen.
         HINWEIS: Alle Tiere wurden mit täglichen Trainingseinheiten vor der Basisbeurteilung an das Testgerät gewöhnt. Für jedes Tier wurden pro Zeitpunkt drei Läufe aufgezeichnet, und nur Versuche, bei denen das Tier eine konstante Geschwindigkeit ohne Pause hielt, galten als gültig. Alle Messungen wurden von geschulten Bedienern unter einem doppelblinden Design durchgeführt, um die Variabilität zwischen den Bedienern zu minimieren, und wiederholte Durchläufe wurden gemittelt, um die Reproduzierbarkeit der Daten sicherzustellen.

Ergebnisse

Charakterisierung und Validierung des DMM OA-Mausmodells
Nach einer einwöchigen Akklimatisierungsphase wurde das DMM-induzierte Arthrose (OA)-Modell bei Mäusen nach dem in Abbildung 1 dargestellten Verfahren etabliert. Zwei Wochen nach der Operation wurden pathologische und verhaltensbezogene Untersuchungen durchgeführt. Wie in Abbildung 2A gezeigt, waren die ausgeprägtesten degenerativen Veränderungen auf das mediale femorotibiale Gelenk lok...

Diskussion

Dieses Protokoll bietet einen standardisierten Rahmen für die Induktion und Bewertung zweier weit verbreiteter chirurgischer OA-Modelle. Diese Modelle sind besonders wertvoll, da sie die pathophysiologischen Merkmale der menschlichen posttraumatischen OA eng replizieren und somit eine starke translationale Relevanz bieten. Das DMM-Modell beinhaltet die Durchtrennung des medialen Meniscotibusbands, während das MMT-Modell einen direkten Riss des medialen Meniskus beinhaltet. In unserem Lab...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Ganganalyse-System	Shanghai Xin Ruan Information Technology Co., Ltd	XR-FP202
Liposic			Augensalbe
Mäuse	Nanjing Institut für Modelltiere	c57/bl6
Schmerztestsystem	Shanghai Xin Ruan Information Technology Co., Ltd	XR-XZD	elektronisches von-Frey-Anästhesiometer
Ratte	Nanjing Institut für Modelltiere	S/D