Charakterisierung von Stomatal- und Epidermalmerkmalen mittels Peels, Clearing und KI-basierter Bildanalyse

Liisa Kübarsepp; Mait Rungi; Ülo Niinemets; Vivian Kuusk; Riccardo Scodeller; Tiina Tosens

doi:10.3791/69615

Methodenartikel

Charakterisierung von Stomatal- und Epidermalmerkmalen mittels Peels, Clearing und KI-basierter Bildanalyse

DOI:

10.3791/69615

⸱

27. März 2026

Liisa Kübarsepp¹ , Mait Rungi² , Ülo Niinemets²^,³ , Vivian Kuusk² , Riccardo Scodeller² , Tiina Tosens²

¹Centre of Estonian Rural Research and Knowledge, ²Institute of Agricultural and Environmental Sciences, Estonian University of Life Sciences, ³Estonian Academy of Sciences

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieses Protokoll bietet eine vergleichende Methode zur Bewertung von Stomatal- und Epidermalmerkmalen bei zwei verschiedenen Arten mittels epidermaler Peelings, Clearing-Techniken und KI-unterstützter Bildanalyse. Das Ziel ist es, eine hochdurchgängige, reproduzierbare Quantifizierung zellulärer Strukturen, die der Funktion der Spaltöffnungen zugrunde liegen, für landwirtschaftliche Anwendungen und breite Pflanzenforschung zu ermöglichen.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eine genaue Charakterisierung der Stomatalmorphologie und der umgebenden epidermalen Merkmale ist entscheidend, um die Funktion der Spalthaut zu verstehen. Ein vergleichendes Protokoll wird mit zwei komplementären Techniken – Epidermalschalen und Laubräumung – durchgeführt, um die Größe, Form und Dichte von Spaltöffnungen und Epidermiszellen bei zwei ökologisch unterschiedlichen Dikotenarten, Fraxinus excelsior und Taraxacum officinale, zu bestimmen. Das Protokoll umfasst detaillierte Schritte zur Probenvorbereitung, Bildgebung und Merkmalsquantifizierung mittels kosten- und arbeitseffizienter manueller Messungen (Gewebebereinigung und -peeling) sowie KI-unterstützte Bildanalyse, die das Potenzial haben, Anwendungen mit hoher Durchsatzrate zu ermöglichen. Drei Segmentierungswerkzeuge – ein YOLOv8-basiertes Stomatal-Detektionsmodell, ein generalistisches Deep-Learning-Tool für Zellsegmentierung und ein pixelbasierter Klassifikator – wurden hinsichtlich ihrer Genauigkeit und Eignung über verschiedene Methoden hinweg bewertet. Signifikante Unterschiede in Spaltöffnungs- und Epidermalmerkmalen werden sowohl in manuellen als auch in KI-Analysen konsequent zwischen Schäl- und Reinigungstechniken beobachtet. KI-Tools ermöglichten reproduzierbare Quantifizierung, wobei das auf YOLOv8 basierende Stomatal-Detektionsmodell (StoManager1) am besten für Stomatalmerkmale abschneidet, und ein generalistisches Deep-Learning-Tool für Zellsegmentierung (Cellpose) für die epidermale Segmentierung. Die KI-basierte Merkmalserkennung war bei T. officinale sehr konsistent, aber bei F. excelsior begrenzt; die Ergebnisse unterschieden sich dennoch von manuellen Messungen und zeigten, wie artspezifische Anatomie und Bildqualität die Methodeneignung beeinflussen. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass KI-unterstützte Analysen zwar einen nützlichen Rahmen für die Quantifizierung von Stomatal- und Epidermalmerkmalen bieten, aber Expertenvalidierung und Pilottests vor einer breiteren oder hochdurchsatzfähigen Anwendung unerlässlich bleiben.

Einleitung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Spaltöffnungen sind mikroskopisch kleine Poren in der Epidermis, die eine entscheidende Rolle bei der Regulierung des Pflanzengasaustauschs und der Transpiration spielen. Daher ist das Verständnis der morphologischen Grundlage der Spaltöffnungsfunktion entscheidend zur Verbesserung der Ernteleistung¹. Während sich die meisten Studien zur Spaltöffnungsstruktur und -funktion ausschließlich auf die Spaltöffnungsmorphologie konzentrieren, erfordert ein vollständiges Verständnis der Spaltöffnungsreaktion auch eine Charakterisierung der Größe und Form der umliegenden Epidermiszellen. Eine genaue Quantifizierung dieser Eigenschaften ist grundlegend, um die Struktur-Funktions-Beziehungen, die dem Gasaustausch und der Ernteentwicklung zugrunde liegen, zu verstehen.

Da die Pflanzenentwicklung zunehmend auf fortschrittliche Gen-Editierungsmethoden setzt, ist es entscheidend, die wichtigsten morphologischen Merkmale – wie Spaltöffnungen – zu verstehen, die die Photosynthese, die intrinsische Wassernutzungseffizienz und die Kohlenstoffgewinnung beeinflussen. Dieser Bedarf ist besonders drängend angesichts der anhaltenden Umweltveränderungen, da die Nachfrage nach widerstandsfähigen Pflanzen, die sowohl die Photosynthesekapazität als auch den Ertrag erhalten, angesichts häufigerer Dürren und Hitzewellen ^2,3 wächst. Daher besteht ein großer Bedarf an standardisierten Bildgebungs- und Analyseprotokollen. Das Schälen von Spaltöffnungen mit Lack/Nagellack ist die einfachste Methode, um Blattoberflächenabdrücke zu erhalten, um die Größe, Form und Dichte von Spalthaut und Epidermal zu messen ^4,5,6. Ihr Verfahren ist schnell, zerstörungsfrei und ermöglicht eine schnelle Verarbeitung der Proben. Die Gewebereinigungsmethode ist eine alternative Methode, die eine gleichzeitige Charakterisierung des Venennetzes und möglicherweise eine umfassendere Charakterisierung der Blatthydraulik ermöglicht.

Die chemische Reinigung macht Gewebe optisch weich und transparent, sodass Stomata und Epidermiszellen in situ bildgebung ohne mechanische Störung durchgeführt werden kann. Clearing ist breit anwendbar für verschiedene Gewebetypen, einschließlich getrockneter oder empfindlicher Proben, und kann nicht nur für die Stomatalbildgebung, sondern auch zur Visualisierung von Venationsnetzwerken, Fluoreszenzbildgebung und inneren anatomischen Strukturen verwendet werden^. 7,8,9,10,11,12 , wodurch Stomatalmerkmale zusammen mit anderen funktionellen Merkmalen analysiert werden können. Es existieren verschiedene Reinigungsmethoden, darunter organische Lösungsmittel, wässrige Lösungen, Hyperhydratation oder Hydrogel-Einbettung 13,14,15. Diese unterscheiden sich in Dauer, Bildkompatibilität und Verfügbarkeit von Reagenzien. Das hier verwendete Protokoll ist einfach, kosteneffizient und erfordert keine speziellen Fähigkeiten. Beide Techniken sind kostengünstig und schneller als arbeitsintensivere Methoden wie Lichtmikroskopie oder Rasterelektronenmikroskopie, die chemische Fixierung, Einbettung und Schnitt der Proben erfordern.

Traditionelle Methoden zur Analyse von Stomatal- und Epidermalmerkmalen basieren oft auf manueller Segmentierung von Mikroskopiebildern, was arbeitsintensiv, zeitaufwendig und von Beobachterverzerrungen anliegt, was den Durchsatz begrenzt und die Effizienz der Analysepipeline¹⁶ verringert. Darüber hinaus stellen anatomische Merkmale wie Trichome und unregelmäßige Zellwände zusätzliche Herausforderungen für die konsistente Merkmale-Quantifizierung dar. Während automatisierte Bildanalysetools großes Potenzial für die Hochdurchsatzdatenextraktion bieten, sind sie für spezifische Pflanzengewebe optimiert und nicht leicht auf Blatttypen und Vorbereitungsmethoden übertragbar. Zum Beispiel bietet StoManager1 (ergänzende Abbildung 1) eine hohe Genauigkeit bei der Spaltöffnungserkennung mit einem YOLOv8-basierten Objekterkennungsmodell, ist jedoch speziell für Spaltöffnungsmerkmale trainiert. Cellpose (ergänzende Abbildung 2) ist ein großes, vortrainiertes, generalistisches Segmentierungsmodell, das gut funktioniert, wenn die Eingabedaten den vortrainierten Modellen (z. B. cyto, cyto2) ähneln, die ursprünglich auf tierischen Zellen und Organellen basieren. Ilastik (ergänzende Abbildung 3) ist ein pixelbasiertes Klassifikationstool, das auf benutzerdefinierten Annotationen basiert. Sowohl Cellpose als auch Ilastik sind benutzerfreundlich, aber jeder kann umtrainiert oder feinabgestimmt werden müssen, um Unterschiede in Bildqualität, Hintergrundartefakten und gewebespezifischen Funktionen zu berücksichtigen.

Darüber hinaus zeigen die Stomatal- und Epidermalmorphologie eine hohe Variabilität zwischen Art¹⁷. Merkmale wie Spaltöffnungsdichte und -größe sind besonders variabel, sind jedoch typischerweise umgekehrt verwandt und bestimmen zusammen Artunterschiede in der Stomatalkinetik. Größere Spaltöffnungen können eine geringere Dichte teilweise ausgleichen, zeigen aber im Allgemeinen langsamere Kinetik⁵, was bei immer häufigeren Hitzewellen nachteilig sein kann, da schnelle Spaltöffnungsreaktionen entscheidend sind, um die Kohlenstoffaufnahme aufrechtzuerhalten und übermäßigen Wasserverlust zu verhindern. Insgesamt erschwert diese Variabilität die Messung der Stomatalmerkmale und kann die Validität des ausgewählten Protokolls sowie die Robustheit der KI-basierten Ergebnisse beeinträchtigen.

Dieses Protokoll integriert zwei klassische Vorbereitungstechniken – epidermale Peelings und chemische Clearings – mit moderner künstlicher Intelligenz (KI) und maschinellem Lernen (ML) für die Segmentierung und Messung von Merkmalen. Mit zwei gängigen lichtintensiven Dikozytenarten mit kontrastierenden ökologischen Strategien (F. excelsior und T. officinale) untersuchten wir die Variabilität der Stomatal- und Epidermalmerkmale, um zu beurteilen, wie sich drei Methoden vergleichen und wo potenzielle Ungenauigkeiten auftreten können. Die Leistung von drei KI-Werkzeugen: StoManager1 (ein YOLOv8-basiertes Deep-Learning-Modell zur Stomatal-Erkennung), Cellpose (ein generalistisches Deep-Learning-Segmentierungstool) und ilastik (ein pixelbasierter Klassifikator für epidermales Gewebe) wurden bewertet. Dieser integrative Ansatz ermöglicht eine reproduzierbare, hochdurchsetzbare Quantifizierung von Spaltöffnungs- und Epidermalmerkmalen und bietet einen robusten und skalierbaren Rahmen für phänotypische Analysen sowohl in ökologischer als auch in der landwirtschaftlichen Forschung. Anatomische Merkmale wie dichte Trichome, dicke Nagelhaut oder niedriger Zellgrenzkontrast können jedoch die Segmentierungsgenauigkeit verringern und sollten bei der Auswahl zwischen Peeling- und Clearing-Methoden sowie bei der Anwendung KI-basierter Quantifizierung berücksichtigt werden.

Soweit wir wissen, ist dies das erste Schritt-für-Schritt-Protokoll, das direkt Epidermalpeeling und chemische Clearing-Ansätze in Kombination mit mehreren KI-basierten Segmentierungstools für die Quantifizierung sowohl der Spalthaut als auch der epidermalen Merkmale vergleicht. Durch die Verbindung klassischer Mikroskopietechniken mit zugänglichen ML-Arbeitsabläufen reduziert das Protokoll die Nutzerverzerrung, erhöht den Durchsatz und erleichtert reproduzierbare Phänotypisierung über Arten hinweg. Dies macht den Ansatz breit anwendbar für Ökologie, Pflanzenentwicklung und Klimaforschung und bildet eine Grundlage für die kontinuierliche Erweiterung der Werkzeuge durch Modellumschulung oder Transferlernen.

Protokoll

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HINWEIS: Für die Sammlung von Blättern von T. officinale und F. excelsior waren keine spezifischen Genehmigungen oder Genehmigungen erforderlich, da diese nicht geschützten Arten aus öffentlich zugänglichen Gartenbereichen entnommen wurden. Die Entnahme aller Proben entsprach institutionellen und lokalen Richtlinien.

1. Sammlung von Pflanzenmaterialien

Wählen Sie gesunde Blätter für vergleichende Analysen aus. Für das aktuelle Experiment wurden gesunde, sonnenexponierte reife Blätter von zwei Dicot-Arten mit kontrastierender Spaltöffnungsverbreitung ausgewählt: der hypo-stomatöse Baum F. excelsior, der nur auf der unteren Blattoberfläche Spaltöffnungen zeigt, und das amphistomatöse, mehrjährige Kraut T. officinale.
Für jeden Probentyp/-standort nehmen Sie 3-5 replizierte Blätter.
Lösen Sie das Blatt mit einer sauberen Schere oder einer Rasierklinge. Geben Sie das geschnittene Blatt sofort ins Wasser, um eine Dehydrierung zu vermeiden.
Nach der Sammlung tauchen Sie den Blattstiel vollständig in Wasser und lagern Sie ihn bei 4°C.
Führen Sie die Protokollabschnitte 2 oder 3 innerhalb von 48 Stunden durch.

2. Vorbereitung und Betrachtung von Spaltöffnungenabdrücken

HINWEIS: Alle während des Räumungsprotokolls entstandenen chemischen Abfälle wurden gemäß institutionellen und lokalen Sicherheitsvorschriften behandelt. Glutaraldehydhaltige Lösungen wurden separat gesammelt und als gefährliche chemische Abfälle entsorgt. Natriumhydroxid (NaOH)-Lösungen wurden vor der Entsorgung, sofern erlaubt, auf einen pH-Wert von 6-8 neutralisiert. Verdünnte Bleichmittel- und Ethanollösungen wurden mit großen Mengen kaltem Wasser in den Abfluss entsorgt, wo es durch institutionelle und kommunale Vorschriften erlaubt war. TBO-Lösungen wurden gemäß den lokalen Richtlinien gesammelt und als chemischer Abfall entsorgt. Nutzer sollten sich an ihr Institut für Sicherheit wenden, um genehmigte Entsorgungsverfahren zu erhalten.

Falls nötig, spülen Sie die ausgewählte Blattoberfläche vorsichtig mit Wasser ab, um Staub oder Schmutz zu entfernen. Tupfen Sie die Blattoberfläche sofort trocken mit Filterpapier oder einem weichen Küchenpapier, um überschüssige Feuchtigkeit zu entfernen. Nicht an der Luft trocknen, da dies zu einer Schrumpfung des Gewebes führen kann, was zu ungenauen Größenmessungen von Spaltöffnungen und Epidermiszellen führen kann.
Beschriften Sie den Mikroskop-Objektträger mit Probendetails (z. B. Art, Blattseite und Vorbereitungsdatum) mit einem permanenten Marker, um die Rückverfolgbarkeit jeder Probe während der Bildgebung, Analyse und Dateninterpretation sicherzustellen und eine ordnungsgemäße Lagerung der Probe für die zukünftige Verwendung zu ermöglichen.
Bei Arten mit nicht-drüsenartigen (behaarten) Trichomen werden die Trichome vor der Peel-Vorbereitung mit einer Rasierklinge von der Blattoberfläche entfernt, da ihre Anwesenheit Zellgrenzen verdecken und die Bildqualität verringern kann (Abbildung 1).
Mit einem kleinen Pinsel tragen Sie eine dünne, gleichmäßige Schicht transparenten, nicht dehnbaren Nagellacks auf (vermeiden Sie "Stretch"- oder "Peel-off"-Formeln) auf den Zielbereich. Wählen Sie immer den mittleren Teil des Blattes für die Schalenvorbereitung aus und vermeiden Sie Spitze und Basis.
Lass den Nagellack vollständig trocknen (typischerweise 2–5 Minuten bei Zimmertemperatur). Eine längere Exposition kann zu Gewebeverfärbungen führen (z. B. roter Schimmer auf weicheren Blättern), die im finalen Peeling sichtbar sein können und nachgelagerte Analysen beeinträchtigen, die eine einheitliche Färbung erfordern.
Nach dem Trocknen kleben Sie einen Streifen transparentes Klebeband auf die beschichtete Fläche. Beginnen Sie an einem Rand des Nagellacks und legen Sie das Klebeband allmählich über die Oberfläche, wobei Sie vorsichtig drücken, um eine gute Haftung zu gewährleisten und Luftblasen oder Falten zu vermeiden. Tragen Sie Nitrilhandschuhe, um Fingerabdrücke zu vermeiden.
Ziehe vorsichtig das Klebeband zusammen mit dem Nagellackfilm ab (Hautabdruck).
Legen Sie das Klebeband (mit der klebrigen Seite nach unten) auf einen sauberen Objektträger und vermeiden Sie Falten oder Überlappungen.
Lagere vorbereitete Objektträger bei Zimmertemperatur, geschützt vor Staub und direktem Sonnenlicht.
Untersuchen Sie den Objektträger unter einem Compound-Lichtmikroskop mit 400-facher Vergrößerung. Speichern Sie die Bilder gemäß der Softwareanleitung und der entsprechenden Größenordnung.

3. Vorbereitung und Betrachtung geräumter Abschnitte

Schneide Blattstücke von etwa 1 cm² ab. Führen Sie alle Schritte mit Nitrilhandschuhen aus und arbeiten Sie unter einer Abzugshaube.
Die Proben in ein beschriftetes Fläschchen übergeben, sie mit Fixierende Lösung abdecken (4 % glutarisches Aldehyd in 0,1 m Phosphatpuffer, pH = 6,9) (VORSICHT) und 24 Stunden bei 4°C lagern (Tabelle 1, zur Herstellung der Fixierungslösung).
Entfernen Sie die Fixierungslösung mit einer Pipette und decken Sie die Proben mit destilliertem Wasser ab. Lass sie 30 Minuten gehen. Dreimal wiederholen (Abbildung 2A-C).
Entfernen Sie das Wasser und decken Sie die Proben mit einer 1 M NaOH-Lösung ab (20 g NaOH in 0,5 L destilliertem Wasser auflösen).
Während des Blattbeseitigungs wird die NaOH-Lösung grün. Ersetze die NaOH-Lösung einmal täglich durch eine frische. Machen Sie 3 bis 4 Tage weiter, oder bis die Proben blassgelb werden und die NaOH-Lösung klar bleibt (Abbildung 2D-F).
Entferne die NaOH-Lösung und decke die Proben mit Bleichmittel (5 % NaClO) ab. Gewerbliches Haushaltsbleichmittel mit dieser Konzentration ist geeignet.
Die Proben 1-2 Minuten in Bleichmittel inkubieren. Die Proben werden weiß und durchscheinend (Abbildung 2G-I).
Entferne die vorherige Lösung und decke die Proben für 2 Minuten mit destilliertem Wasser ab. Dehydrieren Sie die Proben durch eine graduierte destillierte Wasser-Ethanol-Serie wie folgt: 75:25, 50:50, 25:75 und 100 % Ethanol.
Entfernen Sie das Ethanol und bedecken Sie die Proben mit einer 3% alkoholischen Lösung von Toluidin Blue O (TBO, 3 g TBO in 100 mL 100% Ethanol auflösen). Über Nacht weggehen.
Entferne die Färbelösung und decke die Proben für 2 Minuten mit 100% Ethanol ab. Wiederholen Sie diesen Schritt mit einer graduierten destillierten Wasser-Ethanol-Serie wie folgt: 25:75, 50:50, 75:25 und schließlich destilliertes Wasser (Abbildung 2J-L). Siehe Abbildung 3 für häufige Fehler und Schritte zur Fehlerbehebung im Zusammenhang mit dem Clearing-Prozess.
Bewahren Sie die Proben in destilliertem Wasser bei 4°C auf, bis Sie sie betrachten.
Übertragen Sie die Proben auf einen Glasträger, fügen Sie einen Tropfen destilliertes Wasser hinzu und decken Sie mit einem Glasdeckmantel für mikroskopische Betrachtung und Bildgebung ab.
Untersuchen Sie den Objektträger unter einem Compound-Lichtmikroskop mit 400-facher Vergrößerung. Speichern Sie die Bilder gemäß der Softwareanleitung und der entsprechenden Größenordnung. Weitere Informationen finden Sie in der Materialtabelle .

4. Bildanalyse und Messungen

Verwenden Sie Fiji²³ (ImageJ-Distribution, Version 1.54p) für die Bildverarbeitung und -analyse.
Mit dem Linienwerkzeug zeichnen Sie eine Linie über der Skalaleiste, wählen Sie dann Analysieren > Maßstab setzen, ändern Sie den bekannten Abstand auf die Länge der Skala und ändern Sie die Längeneinheit auf μm.
Geh zu analysieren > Set-Messungen. Stellen Sie sicher, dass die Flächen- und Durchmesseroptionen von Feret überprüft werden.
Verwenden Sie das Polygon-Auswahlwerkzeug , um das interessante Objekt zu umrissen. Zeichnen Sie die Messung auf, indem Sie die M-Taste drücken.
Missen Sie die folgenden Stomatal- und Epidermalmerkmale in Fidschi und berechnen Sie sowohl für gekleinigte Proben als auch für Stomatalschalen (Abbildung 3).
Berechnen Sie die Anzahl der Spaltöffnungen (Ns).
1. Bestimmen Sie die durchschnittliche Spaltöffnungsfläche (As).
2. Bestimme die durchschnittliche Spaltöffnungsbreite (Ws): mit Ferets minimalem Durchmesser.
3. Berechnen Sie die Spaltöffnungsdichte (SD) nach folgender Formel:
  
  ; pro Einheit Ia (die für die Messungen ausgewählte Blattfläche, mm²).
4. Bestimmen Sie die durchschnittliche epidermale Zellfläche (Ae).
5. Bestimmen Sie die epidermale Zelldichte (ECD) mit folgender Formel:

5. Statistiken

Verwenden Sie den HSD-Post-hoc-Test von ANOVA und Tukey, um Unterschiede zwischen Stichprobengruppen zu testen.
Führen Sie alle statistischen Analysen in R²¹ durch.
Analysieren Sie insgesamt 3 replizierte Blätter pro Art und betrachten Sie 3 Schalen pro Blatt.

6. KI-unterstützte Analyse

Wählen Sie Werkzeuge für maschinelles Lernen zur Segmentierung aus.
1. Wählen Sie geeignete maschinell-learningbasierte Segmentierungswerkzeuge basierend auf der Zielstruktur (Spaltöffnungen oder Epidermiszellen), Bildqualität und Analysezielen aus.
2. Verwenden Sie ein stomataspezifisches Deep-Learning-Modell zur automatisierten Erkennung und Messung von Spaltöffnungsmerkmalen und verwenden Sie generalistische Deep-Learning- oder pixelbasierte Segmentierungstools für die Segmentierung von Epidermiszellen.
3. Siehe den Abschnitt Maschinelle Lernwerkzeuge und -software für spezifische Softwareimplementierungen (Ergänzungsdatei).
4. Führen Sie Pilottests an einer Teilmenge von Bildern vor einer großflächigen Analyse durch, um die Segmentierungsleistung zu bewerten und potenzielle Quellen von Fehlalarmen zu identifizieren.
Bereite die Computerumgebung vor.
1. Verwenden Sie eine Arbeitsstation mit einem 8-12-Kern-Prozessor, mindestens 32 GB RAM und einer NVIDIA CUDA-fähigen GPU mit mindestens 24 GB VRAM.
2. Verwenden Sie ein hochauflösendes Display (vorzugsweise 4K), um Annotation und visuelle Inspektion zu erleichtern.
3. Installieren Sie alle ausgewählten Softwarewerkzeuge gemäß den Anweisungen der Entwickler und zeichnen Sie Softwareversionen auf, um die Reproduzierbarkeit sicherzustellen.
Bereite Bilder für die maschinelle Lernanalyse vor.
1. Importieren Sie Mikroskopiebilder im TIFF- oder PNG-Format, wobei möglichst 8- oder 16-Bit-Graustufenbilder verwendet werden.
2. Stellen Sie sicher, dass jedes Bild einen sichtbaren Maßstabsbalken enthält oder vor der Analyse räumlich kalibriert wurde.
3. Wählen Sie interessante Bereiche mit minimalen Ablagerungen, Falten oder Luftblasen, gleichmäßiger Beleuchtung und klar definierten Zellgrenzen aus.
4. Schließen Sie Bilder mit verschwommenen Rändern, starken Schatten oder niedrigem Kontrast aus, da dies die Segmentierungsgenauigkeit verringert.
Führen Sie Spaltöffnungssegmentierung durch.
1. Laden Sie Bilder in das stomata-spezifische Deep-Learning-Modell (ergänzende Datei Abschnitt 1).
2. Konfigurieren Sie Erkennungsparameter, einschließlich Objektgrößenbeschränkungen und Konfidenzschwellen, entsprechend Art und Bildauflösung.
3. Führen Sie automatisierte Erkennung durch, um Spaltöffnungskomplexe zu segmentieren und Ausgabemetriken wie Spaltöffnungszahl, Fläche und Feret-Durchmesser zu extrahieren.
4. Exportieren Sie Segmentierungsmasken und Messtabellen für die nachgelagerte Analyse. Segmentierungsüberlagerungen visuell inspizieren und bei Bedarf fehlerhaft erkannte Objekte manuell ausschließen.
Führen Sie eine Segmentierung der Epidermiszellen durch.
1. Laden Sie Bilder in ein generalistisches Deep-Learning-Segmentierungstool oder einen pixelbasierten Klassifikator (ergänzende Dateiabschnitte 2 - 4).
2. Trainieren oder feinjustieren Sie das Modell mit repräsentativen Bildern mit manuell annotierten Beispielen von Epidermiszellen, Zellgrenzen und Hintergründen.
3. Segmentierung ausführen, um Objektmasken zu generieren, und die Masken für die Nachbearbeitung in ImageJ/Fiji oder einer gleichwertigen Bildanalysesoftware exportieren.
4. Wenden Sie größenbasierte oder quantilbasierte Filterung an, um kleine falsch-positive Objekte zu entfernen und die Segmentierungsgenauigkeit durch visuelle Inspektion zu überprüfen, bevor epidermale Zellmetriken wie Zellfläche und Zelldichte extrahiert werden.
Dokumentieren Sie Parameter und führen Sie Qualitätskontrolle durch.
1. Alle Softwareversionen, Parametereinstellungen, Filterschwellenwerte und während der Analyse verwendete Hardwarespezifikationen aufzeichnen.
2. Behalten Sie repräsentative Segmentierungsüberlagerungen bei, um die Segmentierungsqualität zu dokumentieren.
3. Visuelle Validierung automatisierter Segmentierungsausgaben vor statistischer Analyse oder Datenberichterstattung.
Bildvorbereitung für alle ML-Verarbeitungen
1. Probenbildgebung
  HINWEIS: Da ML-basierte Segmentierung auf Intensitätsgradienten, Kantenkontinuität und konsistenter Objektgeometrie statt auf biologischem Kontext basiert, bestimmen Bildvorverarbeitung und Regionenauswahl entscheidend die Modellleistung und die Fehlerstruktur.
  1. Nehmen Sie hochauflösende Bilder von geklärten oder abgeblätterten Blattflächen mit sichtbarer Skalenleiste auf. Für gute maschinelle Lern-Workflows sollten die messbaren Objekte im gesamten Bild scharf, kontinuierlich und kontrastreich sein.
2. Regionsauswahl und Bildqualität
  HINWEIS: Nach der Bildaufnahme in Abschnitt 6.7.1 werden die Bilder visuell inspiziert und, sofern die Bildmaßstab es erlaubt, werden artefakfreie, interessante Bereiche manuell für die nachgelagerte Segmentierung ausgewählt. Wählen Sie interessante Bereiche mit minimalen Artefakten aus (z. B. Trümmer, Falten, Luftblasen, ungleichmäßige Beleuchtung). Für Stomatalmodelle (z. B. StoManager1) sollten Sie klare Porensicht und eine klar definierte Guard-Cell-Silhouette priorisieren. Für epidermale Modelle (z. B. Cellpose, Ilastik) sollten stabile Intensitätsgradienten entlang der Zellkonturen sichergestellt werden; diskontinuierliche oder kontrastarme Kanten verringern die Segmentierungsleistung erheblich. Bilder mit schlecht definierten Grenzen sollten vor der Segmentierung ausgeschlossen oder neu verarbeitet werden.
3. Dateiformat
  Speicherdateien im TIFF- oder PNG-Format (8- oder 16-Bit-Graustufen empfohlen für Segmentierung).
4. Optionale Bildaufwertung
  1. Kontrast verbessern oder den Hintergrund in ImageJ/Fiji entfernen, wenn die Grenzen schwach sind.
  2. Konzentrieren Sie sich auf die Kantengeometrie, da diese falsche Verläufe erzeugen können, die als Zellgrenzen interpretiert werden.
  3. Wenden Sie solche Anpassungen konsistent auf allen Bildern innerhalb eines Datensatzes an.
    HINWEIS: Besondere Aufmerksamkeit sollte auf die Kantengeometrie gelegt werden, da Schatten, Halos oder ungleichmäßige Hintergrundgradienten künstliche Intensitätsübergänge erzeugen können, die ML-Modelle fälschlicherweise als Zellgrenzen interpretieren könnten.
StoManager1 (v1.0.0 GUI-Version)
HINWEIS: StoManager1 ermöglicht automatisierte Hochdurchsatz-Erkennung, Messung und Analyse von Pflanzenblatt-Spaltöffnungen mithilfe von konfaltionellen neuronalen Netzwerken (YOLOv8-seg-x). Das Tool quantifiziert wichtige Spaltöffnungsmetriken (Fläche, Dichte, Poren-/Guard-Zellverhältnis, Aggregationsindizes usw.) aus verschiedenen Bildtypen, reduziert manuellen Aufwand und Verzerrungen und erleichtert groß angelegte ökologische und physiologische Studien. Eine benutzerfreundliche Windows-App ist verfügbar, die keine Programmierkenntnisse außer optionaler Nachbearbeitung erfordert (Zusatzdatei Abschnitt 1)²³.
1. StoManager1 ausführen: installieren und konfigurieren
  1. Zugriff erfolgt über GitHub (https://github.com/JiaxinWang123/StoManager1) oder die eigenständige Windows-Anwendung ((Ergänzende Datei Abschnitt 1)(https://zenodo.org/doi/10.5281/zenodo.7686022)²³.
  2. Sicherstellen kompatibler Bibliotheksversionen (Python-Abhängigkeiten); Konflikte können auftreten, wenn andere ML-/Image-Software installiert ist.
2. Starte StoManager1 über die grafische Benutzeroberfläche oder die Kommandozeile.
3. Wählen Sie Ihr Eingabeverzeichnis mit Blattbildern aus.
4. Modellauswahl; Prüfen Sie das YOLOv8-seg-x-Modell für segmentierungsbasierte, detailliertere Metriken. Lassen Sie es für das Begrenzungsbox-Modell (YOLOv3) unaktiviert, weniger Metriken.
5. Parameterabstimmung; Passe Erkennungsschwellen, Bildauflösung, Maskenerweiterung und Objektgrößengrenzen je nach Bedarf für deine Bildgebungsmodalität/Art an. Bitte verwenden Sie Standardparameter, wenn einige Stomata-Objekte unentdeckt bleiben, hauptsächlich (1) senken Sie die Erkennungskonfidenz, um mehr echte Stomata wiederherzustellen, während auf Fehlalarmerkennung geprüft wird; und (2) die Bildauflösung erhöhen, da ein höherer Wert die Detektion kleiner Spaltöffnungen auf Kosten höherer Rechenanforderungen verbessern kann.
6. Laufsegmentierung:
  1. Klicken Sie auf " Prozess starten", um Spaltöffnungen und ganze Spaltöffnungen zu erkennen, zu segmentieren und zu messen.
  2. Klicken Sie auf " Statistische Analyse", um Gruppenstatistiken zu verarbeiten.
7. Sammeln Sie Ergebnisse. Die Ausgabe wird in YOUR_OUTPUT_PATH/Predict-output/Output_csv/ (Segmentierungsmodus) oder direkt in YOUR_OUTPUT_PATH (Begrenzungsbox-Modus) gespeichert. CSV-Dateien enthalten Pro-Objekt- und Zusammenfassungsmetriken; Masken und Ergebnisbilder werden ebenfalls generiert.
8. Starten Sie die Batch-Verarbeitung.
9. Nach Abschluss sammeln Sie die Ausgabe: Segmentierungsmasken und pro-bildbezogene CSV-Ergebnisdateien. Die Ergebnisse pro Bild umfassen: Stomatalzahl und Stomatalfläche, Feret-Durchmesser (max/min), Schutzzellmetriken, Aggregations-/Gleichheits-/Divergenzindexe sowie Poren-/Guardzell-Verhältnisse.
10. Überprüfen Sie die Ergebnisse mit Excel, R oder Python für weitere Statistiken und Visualisierungen.
11. Qualitätskontrolle; Inspizieren Sie Masken und Überlagerungen visuell. Entfernen Sie Ausreißerobjekte nach Größe, Form oder manueller Kuratierung bei Bedarf (siehe unten).
  HINWEIS: Detaillierte Protokolle und Nachbearbeitungsschritte für Cellpose und ilastik sind in der Ergänzungsdatei bereitgestellt. Für optimale Leistung mit großen Datensätzen und komplexen Bildern empfehlen wir ein System mit einem 8-12-Kern-Prozessor, mindestens 32 GB RAM und einer NVIDIA CUDA-fähigen GPU mit mindestens 24 GB VRAM. Ein großes, hochauflösendes Display (vorzugsweise 4K) wird ebenfalls dringend für effiziente Annotation und Visualisierung empfohlen.

Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vergleich der Ergebnisse zwischen Peeling und Clearing

Sowohl T. officinale als auch F. excelsior zeigten Variabilität in den Spaltöffnungs- und Epidermalmerkmalen, abhängig davon, ob die Proben entfernt oder geschäilt wurden (Abbildung 4). Freigegebene Proben lieferten in der Regel schärfere Zellgrenzen und eine klarere Visualisierung der Form der Schutzzelle und der Porenöffnung, obwohl sich überlappende Gewebeschichten gelegentlich kleinere Spaltöffnungen und verzerrte Größenschätzungen nach oben verdeckten. Bei F. excelsior waren die durchschnittliche Spaltöffnungsfläche und Spaltöffnungsbreite in geklärten Proben signifikant höher als in Schalen, während bei T. officinale keine signifikanten Unterschiede festgestellt wurden. Die Stomatendichte war bei geschälten Proben von F. excelsior signifikant höher, während bei T. officinale kein Methodeneffekt nachgewiesen wurde. Die epidermale Zellfläche unterschied sich bei beiden Arten nicht zwischen den Methoden, aber die epidermale Celldichte war bei geschälten Proben von F. excelsior etwas höher.

Insgesamt waren die methodabhängigen Unterschiede merkmale- und artspezifisch, was darauf hindeutet, dass das Schuppen eine verlässliche Option für Stomatalmessungen bietet, insbesondere wenn die Spaltöffnungen in der Größe variieren (z. B. in sich entwickelnden Blättern), während epidermale Merkmale weitgehend unbeeinträchtigt blieben (Abbildung 5).

KI-Ergebnisse und wie sie mit Peeling- und Clearing-Methoden in Resonanz stehen

Das stomata-spezifische Modell StoManager1 erkannte Stomata zuverlässiger auf geschälten Bildern (Abbildung 6), während die Leistung bei klaren Proben deutlich zurückging (Abbildung 7). Um die Leistung von StoManager1 über verschiedene Präparationsmethoden hinweg weiter zu bewerten, verglichen wir die Erkennung von Stomatalmerkmalen bei T. officinale und F. excelsior mit sowohl Peels als auch freigegebenen Bildern (Abbildung 8). Bei T. officinale erkannte das Modell zuverlässig die Präsenz und Dichte von Spaltöffnungen in allen Zubereitungsmethoden. Die resultierenden Werte unterschieden sich jedoch deutlich von manuellen Messungen (Tabelle 2 und Abbildungen 5 und 8). Die meisten Spaltöffnungsmerkmale unterschieden sich signifikant (s. < 0,05) zwischen geschälten und freigegebenen Proben (Abbildung 8), was darauf hindeutet, dass KI-Detektionspipelines sehr empfindlich auf Präparationsmethoden reagieren und eine sorgfältige Validierung vor großflächiger Anwendung erfordern. Im Gegensatz dazu war bei F. excelsior die Detektion aufgrund des Fehlens von adaxialen Spaltöffnungen auf die abaxiale Oberfläche beschränkt, und bei klaren Proben war die Detektion inkonsistent mit häufigen Fehlalarmen (Abbildung 8). Diese Ergebnisse unterstreichen den starken Einfluss artspezifischer anatomischer Merkmale und Bildqualität auf die Wirksamkeit KI-basierter Analysen. Generalistische ML-Werkzeuge wie Cellpose (Abbildung 9A) und Ilastik (Abbildung 9B) segmentierten epidermale Zellen effektiver auf abgeblätterten als auf geklärten Bildern. Beide Werkzeuge erzeugten jedoch zahlreiche falsche Alarme mit beiden Vorbereitungstechniken (Peeling und Clearing), insbesondere unter kontrastarmen Bedingungen oder bei unscharfen Zellkonturen. In solchen Fällen wurden undeutliche Spaltöffnungs- oder Epidermiskonturen oft übersegmentiert in mehrere winzige Objekte, fälschlicherweise als einzelne Epidermiszellen klassifiziert (siehe Abbildung 10). Daher ist die Nachbearbeitung unerlässlich, nicht nur die Entfernung von Ausreißern, sondern auch die Filterung nach oberen Quantilen, um zuverlässig identifizierte Zellen zu erhalten.

Abbildung 1: Spaltöffnungsschalen von F. carica-Blättern vor und nach der Entfernung der Trichome mit einer Rasierklinge. Große Trichome können Abdrücke auf der Peel hinterlassen, wodurch Luftblasen entstehen, die zu unebenen Oberflächen führen und eine gleichmäßige Fokussierung behindern (sichtbar als große graue Punkte). F. carica wurde als Ausreißer aufgenommen, um das Protokoll auf behaarte Blätter auszuweiten. (A) Bei 200-facher Vergrößerung ist das Bild vor der Trichomentfernung teilweise durch die Trichomabdrücke verdeckt. (B) Die Bildqualität verbessert sich nach der Entfernung von Trichomen. (C) Bei einer 400-fachen Vergrößerung ist das Bild vor der Entfernung des Trichomens größtenteils durch Trikomabdrücke verdeckt. (D) Die Verstopfung im Bild ist nach der Entfernung des Trichomens mit einer Rasierklinge minimal. Skalenbalken 100 μm (A, B) und 50 μm (C, D). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 2: Aufeinanderfolgende Schritte des Clearing-Protokolls. Repräsentative Bilder von T. officinale, F. excelsior und F. carica zeigen aufeinanderfolgende Stadien des Clearing-Protokolls. (A-C) Frische Blätter. (D-F) geht nach Abklärung mit NaOH. (G-I) verlässt nach dem Bleichen mit NaClO. (J-L) verlässt nach dem Flecken mit Toluidinblau O. Dieses visuelle Hilfsmittel zeigt das erwartete Erscheinungsbild der Probe vor dem nächsten Schritt und hebt die Protokollvariabilität zwischen den Arten hervor. F. carica wurde als Ausreißerart aufgenommen, um die Anwendbarkeit des Protokolls über ein breiteres Spektrum von Blatt- und Venenmorphologien zu demonstrieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 3: Beispielmessungen von Stomatal- und Epidermalmerkmalen. Gemessene Merkmale sind auf dem Bild wie folgt dargestellt: As = Spaltöffnungsfläche; Ls = Spaltöffnungslänge; Ws = Spaltöffnungsbreite; Ae = epidermale Zellfläche. Die Spaltöffnungsdichte und die Epidermiszelldichte wurden innerhalb des markierten Bereichs berechnet, wie im Protokoll beschrieben. Bild mit 400-facher Vergrößerung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 4: Vergleich der mit Clearing-Protokoll und Peeling-Protokoll gewonnenen Bilder. Repräsentative Bilder von T. officinale und F. excelsior , die Clearing- und Stomatalschalenbilder vergleichen, die die Sichtbarkeit und Variabilität von Spaltöffnungs- und Epidermis-Zellgröße und -dichte zeigen. Leiste im Maßstab 50 μm, und die Bilder werden mit 400-facher Vergrößerung aufgenommen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 5: Unterschiede in den manuellen Merkmalsmessungsergebnissen zwischen Clearing- und Peeling-Protokoll. Box-Diagramme, die Unterschiede in Spaltöffnungs- und Epidermalmerkmalen zwischen Clearing- und Epidermispeel-Methoden bei T. officinale und F. excelsior zeigen. (A) Durchschnittliche Spaltöffnungsfläche (B) durchschnittliche Spaltöffnungsbreite (C), Spaltöffnungsdichte (D), durchschnittliche Fläche der Epidermiszellen und (E) Dichte der Epidermiszellen. Asterisken zeigen statistische Signifikanz an (P < 0,05; *P < 0,01; **P < 0,001). Die statistische Signifikanz wurde mittels Einweg-ANOVA bewertet, gefolgt vom HSD-Post-hoc-Test von Tukey. Stichprobengröße pro Gruppe: n = 3-5. Abkürzungen: As = Spaltöffnungsfläche; Ws = Spaltöffnungsbreite; SD = Spaltöffnungsdichte; Ae = Epidermiszellfläche; ECD = epidermale Zelldichte. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 6: Beispiel für Segmentierungsergebnisse unter Verwendung eines Spaltöffnungs-Detektionsmodells auf einer Schalenprobe. StoManager1-Segmentierungsergebnis für eine geschälte Probe von T. officinale (untere Seite eines reifen, schattenfreiliegenden Blattes), was eine gute Nachweisgenauigkeit zeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 7: Beispiel für ein Segmentierungsergebnis mit einem Stomatal-Detektionsmodell auf einer freigegebenen Probe. StoManager1-Segmentierungsergebnis für eine geklärtete Probe von T. officinale (untere Seite eines ausgewachsenen, schattenfreiliegenden Blattes), das eine geringere Nachweisgenauigkeit im Vergleich zu geschälten Proben zeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 8: Unterschiede in KI-unterstützten Merkmalsmessungsergebnissen zwischen Clearing- und Peeling-Protokoll. Boxdiagramme zeigen KI-abgeleitete Messungen anatomischer Merkmale der Spalthaut aus Bildern, die von StoManager1 in T. officinale und F. excelsior verarbeitet wurden. Zu den Merkmalen gehören die Spaltöffnungsfläche (As), Spaltöffnungsbreite (Ws), Spaltöffnungslänge (Ls) und Spaltöffnungsdichte (Ds). Die Einheiten sind wie in Abbildung 5 aufgeführt. Die statistische Signifikanz wurde mittels Einweg-ANOVA bewertet, gefolgt vom HSD-Post-hoc-Test von Tukey. Asterisken zeigen statistische Signifikanz an (P < 0,05; *P < 0,01; **P < 0,001). Stichprobengröße pro Gruppe: n = 3-5. Abkürzungen: As = Spaltöffnungsfläche; Ws = Spaltöffnungsbreite; Ls = Spaltöffnungslänge; Ds = Spaltöffnungsdichte. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 9: Screenshots, die Segmentierung mit einem generalistischen Deep-Learning-Tool und pixelbasiertem Klassifikator zeigen. Geschälte F.-excelsior-Probe (abaxiale Blattoberfläche) Segmentierungen mit (A) generalistischem Deep-Learning-Tool (Cellpose (cyto2)) und (B) pixelbasiertem Klassifikator (ilastik). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 10: Ilastik-Segmentierungsmaske für eine abgeschälte Probe von F. excelsior (abaxiale Seite eines Blattes), mit zahlreichen falsch-positiven Ergebnissen. Winzige Punkte werden fälschlicherweise als eigenständige Epidermiszellen klassifiziert. Während der Nachbearbeitung ist eine manuelle (visuelle) Inspektion erforderlich, um größenbasierte Schwellenwerte zu setzen und Fehlalarme effektiv auszublenden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Lösung	Zubereitung	Letzter Band
Basis für Puffer 1	7,12 g (Na₂HPO₄ *2H₂O) in 200 mL Dist. H₂O	200 mL
Basis für Puffer 2	7,12 g Na₂HPO₄ *2H₂O) in 200 mL Durchmesser. H₂O	200 mL
Phosphatpuffer	Mischen Sie 36 ml Base 1, 14 ml Base 2 + 50 mL Dist. H₂O	100 mL
Fixative Lösung	Mischen Sie 9,25 ml 5 % Glutaraldehyd mit 12,5 ml Phosphatpuffer und 28,25 ml Dist. H₂O	50 mL

Tabelle 1: Rezept zur Fixierungslösung²⁴. Zusammensetzung der in dieser Studie verwendeten Lösungen.

Arten	Seite	Methode	Man (As)	KI (AS)	Mann (Ws)	KI (Ws)	Mann (Ls)	KI (Ls)
Fraxinus	Abaxial	Peel	177.43	9.32	12.71	2.85	17.58	3.58
Taraxacum	Abaxial	Freigegeben	408.09	18.84	20.1	4.19	26.14	5.39
Taraxacum	Abaxial	Peel	262.54	13.93	15.18	3.47	22.2	4.68
Taraxacum	Adaxial	Freigegeben	414.48	14.91	20.11	3.44	26.09	5.71
Taraxacum	Adaxial	Peel	258.72	11.37	15.72	3.3	21.15	4.08

Tabelle 2: Indikative Vergleiche zu manuellen Messungen und KI. ML (StoManager1) skalierte Ergebnisse. Mensch und KI zeigen entsprechend manuelle und KI-(StoManager1)-Ergebnisse an. Die Einheiten sind wie in Abbildung 5 aufgeführt. Manuelle und KI-Messungen unterscheiden sich erheblich. Einige Vergleiche sind aus verschiedenen Gründen nicht verfügbar, darunter fehlende Spaltöffnungen (z. B. adaxialer F. excelsior) oder fehlgeschlagener Nachweis (z. B. waren Spaltöffnungen in klaren Proben aufgrund unscharfer Zellkonturen schwerer nachzuweisen).

Ergänzende Abbildung 1: Beispiele für häufige Fehler beim Blattentfernen, die die Ergebnisse beeinflussen. Zu Fehlerbehebungszwecken gezeigte Bilder: (A) ungleichmäßige Färbung aufgrund unvollständiger Rehydrierung der Probe während Abschnitt 3.10; (B) mechanische Schäden durch den unsachgemäßen Umgang mit der chemisch verarbeiteten, sehr empfindlichen Probe; (C) grüner Farbton in der Mitte der Probe aufgrund unvollständiger Entfernung von Chlorophyll während Abschnitt 3.5. Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 2: Beispiel für die Benutzeroberfläche von StoManager1. Screenshot der StoManager1-Benutzeroberfläche, der die Eingabe-Einrichtung und die Ergebnistabelle (links) sowie Mikroskopansichten mit Originalbildern (oben rechts) und Stomatal-Erkennungs-Overlay (unten rechts, adaxiale Oberfläche einer T. officinale-Musterprobe ) zeigt. Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 3: Beispiel für eine Cellpose-Benutzeroberfläche. Screenshot der Cellpose-Segmentierung im Gange über die GUI mit einstellbaren Parametern (z. B. Modellauswahl – empfohlenes vortrainiertes Cyto2-Modell oder ein individuell trainiertes Modell, Schwellenwerte und Kalibrierung des Zelldurchmessers). Überwachte manuelle Annotation der Epidermiszellen hebt jede Zelle in einer einzigartigen Farbe hervor, um die Modellkalibrierung zu steuern. Die Überlagerung zeigt die Segmentierung eines F. excelsior abaxialen epidermalen Peelings. Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 4: Ilastik-Segmentierungsprozess. Overlay zeigt eine pixelbasierte Klassifikation auf einem Bild der F. excelsior abaxialen epidermalen Peeling. (A) Screenshot der laufenden Ilastik-Segmentierung, der überwachtes Training mit manuell beschrifteten Klassen zeigt: epidermale Zellen (gelb), Zellkonturen (blau) und nicht-epidermale Hintergründe wie Trichome (rot). (B) Screenshot, der nur die Epidermis-Klasse (gelb) zeigt, der zeigt, wie der Klassifikator einzelne Epidermiszellen isoliert. Beachten Sie das Vorhandensein mehrerer falsch-positiver "winziger" Detektionen, insbesondere in Bereichen mit geringem Kontrast oder ungleichmäßiger Beleuchtung. (C) Screenshot, der nur die Konturklasse (blau) zeigt und zeigt, wie der Klassifikator Zellgrenzen vom umgebenden epidermalen Gewebe isoliert. Beachten Sie, dass einige Konturen diskontinuierlich sind und mehrere falsch-positive "winzige" Detektionen auftreten, insbesondere in Bereichen mit geringem Kontrast oder ungleichmäßiger Beleuchtung. (D) Screenshot zeigt die Hintergrundklasse. Die Maske hebt Stomatalkomplexe, drüsentrichome und verschiedene Ablagerungen (rot) hervor, während epidermale Zellkörper ausgeschlossen werden. Zahlreiche kleine falsch-positive "winzige" Nachweise sind in den epidermalen Bereichen sichtbar, die durch Graustufenartefakte und texturbasierte Fehlklassifizierung entstehen. Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 5: Zellpose-Trainingseinstellungen. Beispiel für Cellpose-Trainingseinstellungen (GUI) für eine freigegebene T. officinale-Probe (beide Blattoberflächen), die Standardmodellparameter vor der Anpassung anzeigen. Das vortrainierte cyto2-Modell wird ausgewählt, mit einer Lernrate von 0,1 und 100 Trainingsepochen (Standardwerte), die jeweils die Aktualisierungsgeschwindigkeit der Modellgewichte und die Anzahl der Trainingsdurchgänge bestimmen. Diese Standardwerte werden häufig modifiziert (z. B. Lernrate = 0,15; Epochen = 12), um die Trainingszeit zu verkürzen und das Modell an die Pflanzenepidermalmorphologie anzupassen; allerdings können niedrigere Epochenzahlen die Erkennungsleistung verringern und Fehlalarme erhöhen. Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 6: Cellpose-"Labels"-Maske. Anwendung der Cellpose-"Labels"-Maske für eine abgepeelte F.-excelsior-Probe (abaxiale Blattoberfläche), die das Ergebnis überwachten Trainings zeigt, bei dem jedem segmentierten Objekt eine eindeutige Identifikation zugewiesen wird. Epidermiszellen (markiert e) dominieren, während auch Stomatal-Schutzzellpaare (markiert g) nachgewiesen werden. Falsch-positive Werte treten auf, wenn Trichome fälschlicherweise als Epidermiszellen (oben links) oder Spaltöffnungen (untere zentrale) klassifiziert werden, sowie bei falsch-negativen Ergebnissen, bei denen Epidermiszellen in Teilen des Bildes unmarkiert bleiben. Dieser Maskentyp wird für die nachgelagerte Quantifizierung und Verfeinerung überwachter Modelle verwendet. Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 7: Quantifizierung segmentierter Epidermiszellen in ImageJ/Fiji. Screenshots, die die segmentierte Quantifizierung der epidermalen Zellen nach der Ilastik-Pixelklassifikation für eine geschälte F.-excelsior-Probe (abaxiale Blattoberfläche) zeigen. (A) In der exportierten Maske entspricht jeder detektierte Pixelcluster einem einzelnen Partikel, was eine automatisierte Extraktion von objektebenen Metriken ermöglicht (z. B. Fläche, Umfang, Feret-Durchmesser). Das Ergebnisfenster (unten) zeigt rohe Messungen für Tausende von Objekten an; Beachten Sie die außergewöhnlich hohe Anzahl kleiner Partikel, die durch "winziges" Punktrauschen und fragmentarische Konturen entstehen, was auf zahlreiche Fehlalarme hinweist. Diese Artefakte erfordern eine anschließende, biologisch informierte Filterung, um echte epidermale Zellen vor der nachgelagerten statistischen Analyse zu isolieren. (B) Flächenbasierte Filterung von ilastik-segmentierten epidermalen Objekten in ImageJ/Fiji. Kleine Fragmente und Rauschen werden ausgeschlossen, indem ein minimaler Flächenschwellenwert von 150–350 μm² angewendet wird, wodurch die Anzahl der detektierten Teilchen um etwa eine Größenordnung (zehnfach) relativ zur ungefilterten Maske in Panel A reduziert wird. Obwohl dieser Filterschritt winzige Fehlalarme weitgehend entfernt, bleibt eine unvollständige Klassifikation bestehen: fragmentierte Konturen und verbliebene nicht-epidermale Elemente bleiben erhalten und erfordern zusätzliche Verfeinerungen, wie etwa Zirkularitätsschwellenwerte oder biologisch informierte Nachuntersuchungen. Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 8: Nachbearbeitung einer Cellpose-"Labels"-Maske in ImageJ/Fiji. Durch die Verwendung des Labels to ROIs-Plugins für eine abgeschälte F.-excelsior-Probe (abaxiale Blattoberfläche) wird jedes segmentierte Objekt in der Maske in eine Interessenregion (ROI) umgewandelt, was eine individuelle Inspektion und Messung von Epidermiszellen und Stomatal-Guard-Cellkomplexen ermöglicht. ROIs werden auf das Originalmikroskop (links) gelegt, während das Ergebnisfenster (unten rechts) Zellebene-Metriken (z. B. Fläche, Feret-Durchmesser, Umfang) anzeigt. Dieser Schritt ermöglicht eine biologisch fundierte Kuratierung, sodass Nutzer überprüfen können, ob jeder ROI einer echten epidermalen Zelle entspricht und Artefakte wie Trichome oder fehlsegmentierte Spaltöffnungen, die nach dem Schwellenwert bestehen, verwerfen können, wodurch weitere Analyseschritte unterstützt werden. Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen.

Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Für konsistente Spaltöffnungsmessungen sollten Schalen von der zentralen Lamina entnommen werden, um standardisierte Ergebnisse zu erhalten, wobei große Venen vermieden werden, da die Spaltöffnungsdichte eine starke Schwankung innerhalb des Blattes zeigt, die zur Blattbasis, Spitze und Kante hin^25,26 abnimmt. Frische Blätter liefern die zuverlässigsten Peels, vorausgesetzt, es werden nicht schrumpfender, transparenter Nagellack und hochwertiges transparentes Klebeband verwendet, um Verzerrungen oder Artefakte zu vermeiden. Verzögerungen über ~12 Stunden verringern die Konturklarheit durch Dehydrierung. Da Peels vorübergehend montiert werden und Luft einschließen können, wird eine frühe Bildung empfohlen, aber die Qualität bleibt auch nach einem Monat akzeptabel.

Es existieren verschiedene Clearing-Methoden für spezifische Gewebetypen, Bildgeberziele und Sicherheitsaspekte 13,14,15. Die chemische Reinigung erfolgte mit einem wässrigen NaOH-basierten Protokoll aufgrund ihrer Zugänglichkeit, geringen Toxizität und breiten Anwendbarkeit über Blatttypen hinweg. Da die Gewebereaktionen je nach Spezies variieren, sind Tests und Optimierungen erforderlich. Sklerophylle Blätter können ≥2 Wochen benötigen, und verbleibendes grünes Gewebe kann die Färbung beeinträchtigen und anatomische Merkmale verschleiern (ergänzende Abbildung 1C). Für eine schnellere Reinigung kann die NaOH-Konzentration auf 2,5 M oder 5 M erhöht werden. Weiche Blätter werden nach dem Bleichen zerbrechlich (Abschnitt 3.7; Ergänzende Abbildung 1B), und eine Überexposition gegenüber Natriumhypochlorit (NaClO) kann Gewebe abbauen oder eine Abspaltung der Epidermisschicht verursachen. Während 30 Sekunden bis 2 Minuten Bleichen für die meisten weichen Blätter ausreichen, benötigen robustere Arten bis zu 1 Stunde^{und 27} Stunden. Obwohl die Reinigung langsamer ist als die Vorbereitung der Schäle, erfordert ~5 Tage und keine spezielle Ausbildung, kann sie für verschiedene Arten angepasst werden. Abgerissene und gefärbte Proben können in destilliertem Wasser bei 4°C gelagert werden, wobei eine dauerhafte Befestigung für eine langfristige Erhaltung empfohlen wird^{bei 15,27}.

Stomata-spezifischer StoManager1 erkannte Stomatalkomplexe zuverlässig über die meisten Bildtypen hinweg (ergänzende Abbildung 2), wobei Detektionsergebnisse im Allgemeinen mit manueller Annotation für peel-basierte Methoden übereinstimmen. Messungen der Spaltöffnungsfläche unterschieden sich jedoch systematisch von manuellen Messungen (Tabelle 2), was eine Kalibrierung auf Basis einer kleinen manuell gemessenen Teilmenge (z. B. 10–20 Spaltöffnungen pro Art) vor einer großflächigen Analyse erforderlich machte. StoManager1 erhöht den Durchsatz erheblich, wobei in nicht standardisierten Fällen manuelle Verifikation erforderlich ist.

Die gleichzeitige Segmentierung von Spaltöffnungen und Epidermis ist schwierig, da die optimale Schärfe unterschiedlich ist und Heterogenität in Morphologie und Membranklarheit zu Segmentierungsfehlern führt. Genauso verliert Training auf großen Bildsätzen (z. B. adaxiale/abaxiale Flächen, abgepeelt/cleared) an Spezifität. Es existiert kein vortrainiertes Cellpose-Modell für Pflanzenepidermis; Die Standardmodelle "Cyto" und "Cyto2", die hauptsächlich auf Tierzellen trainiert sind, schneiden bei epidermalen Bildern schlechter ab. Für die Zuverlässigkeit ist daher eine individuelle Schulung erforderlich (Ergänzender Abschnitt 2). Auch nach dem Training bleiben Übersegmentierung und falsch-positive Ergebnisse häufig, insbesondere bei kontrastarmen oder nicht geklärten Bildern (ergänzende Abbildung 3).

In ilastik (ergänzender Abschnitt 3, ergänzende Abbildung 4) sollten Objektmasken für die Zielzellklassen (z. B. Klasse 1 für die Epidermis) generiert werden, während Klassenmasken für Auditing und manuelle Korrektur beibehalten werden. Batchverarbeitung und anschließende ImageJ/Fiji-Workflows können Zeit sparen und manuelle Fehler reduzieren. Eine konsistente Filterung nach Fläche, Standardabweichung oder Quantilen ist unerlässlich, um Rauschen und falsche Detektionen zu unterdrücken. Nach der Filterung nähern sich die mittleren Zellflächen- und Zellzählungen manuellen Werten. Das Benchmarking mit manuellen Messungen und alternativen ML-Tools (Weka, RootPainter) bleibt essenziell, um Parameter abzustimmen und die Segmentierungsqualität zu bewerten. ML-Batch-Verarbeitung ist ressourcenintensiv. Stabiles Training und großflächige Batch-Segmentierung erfordern eine NVIDIA CUDA-fähige GPU und ≥32 GB RAM. Auf Mittelklassesystemen (z. B. 16 GB RAM mit integrierter Grafik) erfordert überwachtes Training typischerweise ~5–10 Minuten für <10 Bilder und stürzte häufig ab, wenn mehrere Annotationsklassen oder heterogene Bildtypen verwendet wurden. CUDA erhöhte die Verarbeitungsgeschwindigkeit um ~10- bis 20-fach im Vergleich zur CPU- oder integrierten GPU-Ausführung.

Leistungsunterschiede zwischen Cellpose, ilastik und StoManager1 resultieren aus ihren unterschiedlichen Merkmalsrepräsentationen. Cellpose sagt Vektorströmungsfelder in Richtung Objektzentren voraus und ist empfindlich gegenüber optischen Halos und abrupten brechungsbezogenen Grenzen, die den Fluss stören und Cluster von falsch positiven Ergebnissen im freigegebenen F. excelsior erzeugen. Ilastik, als von Menschen geführter Pixelklassifikator, übersegmentiert hochrelief Zellwände oder Halos auf dem Gehweg, sofern sie nicht ausdrücklich als Hintergrund gekennzeichnet sind. StoManager1 erkennt Spaltöffnungskomplexe mithilfe von objektebenen Formmustern (gepaarte Schutzzellen mit zentraler Pore) und funktioniert gut bei Peel-Präparationen, einschließlich F. excelsior²⁸; Halo-induzierte Unschärfe beeinflusst jedoch die Porensichtbarkeit beim Clearing und erzeugt falsch negative Ergebnisse statt Fehlklassifizierung (ergänzende DateiAbschnitt 1 und 3). Dementsprechend arbeiten Cellpose und StoManager1 als automatisierte Segmentierer, während ilastik als menschengesteuerter Klassifikator fungiert (ergänzendeDateiabschnitte 1-3)²⁸^.

Die artspezifische Zellarchitektur moduliert die KI-Leistung. Bei T. officinale entsprechen glatte, elliptische Wächterzellen der StoManager1-Trainingsverteilung, was die Detektion an abgezogenen Proben ermöglicht (ergänzende Abbildung 2), während generalistische Werkzeuge häufig Schutz- und Pflasterzellen verwechselten. Bei F. excelsior führen zurückgezogene Spaltöffnungen und hochreliefige Gehwegzellen zu falsch negativen Ergebnissen auf klaren Bildern. Diese Abweichungen spiegeln die art- und präparationsabhängige Bildgebungsgeometrie wider. Systematische Unterschiede zwischen manuellen und KI-basierten Messungen ergeben sich aus zwei Quellen: dem Fehlen einer maßstabsbasierten Kodierung aus dem Bild durch KI und präparierungsinduzierten optischen Artefakten. Minderungsstrategien umfassen die visuelle Triage von Unschärfen und Halos aus der Gewebevorbereitung, bevorzugte Verwendung von Peels unter oben beschriebenen Bedingungen sowie manuelle Kalibrierung mit linearer Korrektur an einer kleinen Teilmenge der Spaltöffnungen (manuell = a + b × AI). Weitere Strategien umfassen taxonspezifische Augmentation und das Design von Hilfsklassen für das Training (allerdings bleiben eigene trainierte Modelle auf großen, vielfältigen Datensätzen wahrscheinlich niedriger als vortrainierte Modelle) sowie postsegmentierte obere Quantile filtern.

Da KI-Segmentierungsfehler systematisch und nicht zufällig sind, ist die Nachbearbeitung unerlässlich. Bildqualitätsdiagnosen können einem einfachen Entscheidungsbaum folgen. Beginnen Sie damit, den epidermalen Kontrast und die Schärfe zu überprüfen: Wenn scharf, gehen Sie zu falsch positiven Ergebnissen über; Bei Unschärfe rechnen Sie mit kleinen hochfrequenten Artefakten und Anpassungsfiltern. Wenn Fehlalarme (z. B. Punkte, Trümmer) minimal sind, reicht ±2–3 SD-Ausreißerfilterung meist aus. Wenn kleine Artefakte dominieren, verwenden Sie quantilbasierte Filterung. Dann vergleichen Sie die Eigenschaftsverteilungen (z. B. Median A e) mit biologischen Erwartungenoder manuellen Daten. Verfeinerung der Schwellenwerte bei Bedarf – das Behalten von nur oberen 10–50%-Quantilen in artefaktreichen Datensätzen gewährleistet sinnvolle Ergebnisse (ergänzendeAbbildungen 7 und 8). Aufgrund der hohen falsch-positiven Raten, die durch epidermale ML-Tools erzeugt werden, konnten zuverlässige Schätzungen der Spaltöffnungsdichte nicht automatisch abgeleitet werden, während StoManager1 präzise Spaltöffnungsmessungen²⁸ lieferte, wenn die Grenzen klar waren (siehe Abbildungen 6 und 7). Für den epidermalen Median erwies sich Ae als robust und war weniger empfindlich gegenüber kleinen falsch-positiven Ergebnissen als der Durchschnitt.

Die Methodenwahl beeinflusste die Merkmalserkennung. Das Schälen war besser als die Spaltöffnungsdichte, indem die Spaltöffnungen vollständig freigelegt wurden (Abbildung 3), während das Entfernen oft kleinere Spaltöffnungen in geschichteten oder pigmentierten Geweben verdeckte, obwohl sie manchmal die Spaltöffnungsform²⁷ besser erhalten konnten. Unter den KI-Tools lieferte StoManager1 durchgehend robuste Spaltöffnungsmessungen mit minimaler Kuration, insbesondere bei Schalenvorbereitungen²³, und das Peeling verbesserte zudem die Epidermalmessungen, indem es korrekt identifizierte Zellen und Bildabdeckung verbesserte². Zukünftige Gewinne werden höchstwahrscheinlich aus großen, taxonomisch vielfältigen vortrainierten Modellen zur Integration in automatisierte Bildgebungspipelines für Ökophysiologie und Pflanzenverbesserung entstehen.

Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren erkennen das H2020-Programm der Europäischen Union an (Projekt GAIN4CROPS, GA Nr. 862087). Das Exzellenzzentrum AgroCropFuture Agroecology und neue Kulturen in zukünftigen Klimazonen (Estnisches Bildungs- und Forschungsministerium), Estnischer Forschungsrat (PRG 3201 sowie PRG 2207 und TARISTU24-TK28).

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Desinfektions-Flüssigreiniger NaClO < 5%	Domestos, GB	H000023244	Hautverbrennungen
Dinatriumwasserstoffphosphatdihydrat (Na₂HPO₄^, 2H₂O)	PENTA, CZ	10028-24-7	NA
Ethanol, abs. 100 % a.r.	Chem-Lab NV, BE	CL00.0505.1000	Hoch entflammbar
Glasfläschchen 2 ml	VWR Life Science, USA	548-0045
Glutaraldehyd 50%-Lösung	VWR Life Science, USA	23H2856331	Tödlich beim Einatmen. Toxisch, wenn man sie schluckt. Tragen Sie Schutzhandschuhe, Kleidung, Brille.
Objektträger mit dem Mikroskop	Normax, PT	5470308A	NA
Nagelpflege-Decklack trocknet schnell	BK (INEZA), LT	LT-02244	NA
Nikon Eclipse E600 und Nikon DS0Fi1 5 MP	Nikon Corporation, JP	https://www.microscopyu.com/museum/eclipse-e600	NA
Pipetten- und Pipelettenspitzen	Thermo-Wissenschaft, FI	KJ16047	NA
Einschneidige Stahlklingen	Oxford-Instrumente	51-1625-0182	NA
Natriumdihydrogenphosphatdihydrat (NaH₂PO₄^, 2H₂O) rein	PENTA, CZ	13472-35-0	NA
Natriumhydroxidpellets (NaOH) rein	Merck KGaA, DE	1310-73-2	Schwere Verbrennungen.
Briefpapier-Klarband	FOROFIS, LV	91231	NA
Toluidin-Blau, Allzweckqualität	ThermoFisher Scientific, GB	2045836	NA