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Methodenartikel

Entstehung und genetische Manipulation menschlicher zervikaler Organoide

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DOI:

10.3791/69617

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10. März 2026

 ,  ,  , 
1Department of New Biology, DGIST, 2Department of Obstetrics and Gynecology, Kyungpook National University Chilgok Hospital, 3Clinical Omics Institute, Kyungpook National University, 4Department of Obstetrics and Gynecology, Kyungpook National University School of Medicine, 5New Biology Research Center, DGIST, 6Graduate Program in Biomedical Science & Engineering, DGIST

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir präsentieren ein detailliertes Protokoll zur Etablierung und genetischer Manipulation menschlicher zervikaler Organoide.

Zusammenfassung

Gebärmutterhalskrebs ist der vierthäufigste Krebs bei Frauen und betrifft am häufigsten den Gebärmutter-Ectocervix. Der Ectocervix der Gebärmutter ist mit einem geschichteten Plattenepithel ausgekleidet, das aus Basalzellen besteht und parabasale und suprabasale Zellen differenziert. Die Regeneration nach der zervikalen Konisation deutet auf das Vorhandensein einer robusten Stammzellaktivität hin. Unser Verständnis der Identität und regulatorischen Mechanismen zervikaler Stammzellen und ihres bösartigen Transformationsprozesses ist jedoch eingeschränkt, da der Zugang zu menschlichen Zervikalgeweben und das Fehlen optimaler Systeme zur Bewertung der Stammzellaktivität im Gebärmutter-Ectocervix eingeschränkt sind. Kürzlich etablierte menschliche zervikale Organoide können helfen, diese Einschränkungen zu überwinden und neue Möglichkeiten bieten, die Zervikalphysiologie und -pathologie zu erforschen. Es existiert jedoch keine standardisierte Methode zur Isolierung und Etablierung menschlicher zervikaler Organoide. Hier beschreiben wir eine Methode zur Etablierung menschlicher ektocervikaler Organoide. Konkret präsentieren wir ein Protokoll zur Isolierung einzelner Zellen aus dem menschlichen ectocervikalen Epithel. Durch die Inkubation des Gebärmutterhalsgewebes in einer optimierten Enzymlösung lösen wir das Zerviksepithel ab, um die Zellausbeute zu maximieren und gleichzeitig die Fibroblastenkontamination zu minimieren. Wir skizzieren weiter die Bedingungen für die Kultivierung menschlicher zervikaler Organoide mit einer optimierten Medium-Formulierung. Zusätzlich erläutern wir die Verfahren zur Übertragung und genetischer Manipulation von zervikalen Organoiden. Dieses Protokoll bietet einen äußerst effizienten Ansatz zur Etablierung menschlicher zervikaler Organoide und deren Nutzung zur Untersuchung zervikaler Stammzellen und -erkrankungen.

Einleitung

Der Gebärmutter-Ektocervix ist die häufigste Stelle für Gebärmutterhalskrebs 1,2. Obwohl Gebärmutterhalskrebs nach der Einführung der HPV-Impfung in Industrieländern zurückgegangen ist, bleibt er weltweit weiterhin der vierthäufigste Krebs bei Frauen 3,4. Außerdem steigt die Häufigkeit von präkanzerösen Läsionen in einigen Ländern weiterhinan 5,6. Während die niedriggradige Plattenepithelläsion (LSIL) oft von selbst zurückschreitet, birgt eine hochgradige Plattenepithelläsion (HSIL) ein Risiko für eine Progression zu invasivem Krebs und erfordert typischerweise chirurgische Eingriffe, wie Exzision oder Conisation. Diese Eingriffe können den Ectocervix verkürzen und das Risiko für eine Fehlgeburt oder Frühgeburt erhöhen 7,8. Ein tieferes Verständnis der Zervikalbiologie, verbunden mit der Entwicklung regenerativer Therapie, könnte helfen, diese Herausforderungen zu bewältigen, erfordert jedoch robuste und physiologisch relevante Modellsysteme.

Tiermodelle haben unser Verständnis der zervikalen Homöostase, Krankheitsmechanismen und therapeutischen Strategien erheblich verbessert. Ihre inhärenten Unterschiede zur menschlichen Biologie und Pathologie begrenzen jedoch ihren Translationswert. Als Alternative haben sich Organoide als mächtige Plattformen zur Modellierung der menschlichen Biologie und Krankheiten etabliert. Organoide sind von Stammzellen abgeleitete dreidimensionale Mikrostrukturen, die die Histologie und molekularen Signaturen ihres Ursprungsgewebeswiedergeben. Sie wurden eingesetzt, um verschiedene menschliche Gewebestammzellen in verschiedenen Geweben zu identifizieren, darunter Luftröhre, Speiseröhre und Gebärmutterhals 12,13,14. Darüber hinaus ermöglichen Organoide genetische Manipulationen, wodurch die Modellierung der Pathogenese verschiedener Krankheiten, einschließlich Krebs und Fibrose 15,16,17. Darüber hinaus dienen Organoide als effektive Plattform zur Überprüfung der Wirksamkeit und Toxizität von Medikamenten oder Zelltherapien 18,19,20,21.

Kürzlich haben zwei unabhängige Gruppen menschliche zervikale organoide Systeme22,23 etabliert. Aufbauend auf diesen Fortschritten verbesserten wir die Effizienz der cervikalen organoiden Kultur signifikant und identifizierten menschliche zervikale Stammzellen13. Außerdem haben wir durch das Ablösen des zervikalen Epithels die Einbeziehung von Fibroblasten unter dem zervikalen Epithel minimiert. Durch den Einsatz zervikaler Organoide mit genetischer Manipulation haben wir die Rolle mikrobieller Metaboliten und ihrer nachgelagerten Signalwege bei der Aufrechterhaltung der zervikalen Homöostase und der Verhinderung von präkanzerösen Fortschreitungen aufgedeckt. Daher wird ein standardisiertes und optimiertes Protokoll zur Erzeugung, Pflege und genetischen Modifikation zervikaler Organoide ein wesentliches Werkzeug zur Untersuchung der Gebärmutterhalsbiologie und -pathologie darstellen.

In diesem Artikel stellen wir ein detailliertes und optimiertes Protokoll zur Erzeugung und Weitergabe menschlicher Zervikalorganoide vor. Wir beschreiben auch ein Protokoll für ihre genetische Manipulation durch Elektroporation.

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Protokoll

Zellisolierung und Organoidkultur mit menschlichem Gebärmutterhalsgewebe wurden von den internen Prüfungsgremien des DGIST, Daegu, Korea, und des Chilgok Kyungpook National University Hospital, Gyeongsangbuk-do, Korea, genehmigt und gemäß allen relevanten ethischen Vorschriften durchgeführt. Menschliches Ektocervikalgewebe wurde von der Abteilung für Geburtshilfe und Gynäkologie am Chilgok Kyungpook National University Hospital bereitgestellt. Gesundes Gebärmutterhalsgewebe wurden von Patienten gewonnen, die sich einer totalen laparoskopischen Hysterektomie wegen ihrer gutartigen Gebärmuttererkrankungen unterzogen hatten. Von allen Patienten wurde eine informierte Zustimmung eingeholt.

1. Einzelzellige Isolierung aus ektocervikalen Geweben

HINWEIS: Dieses Protokoll beginnt mit einer humanen Ectocervix-Biopsieprobe von etwa 5 mm × 5 mm × 5 mm Größe (Abbildung 1).

  1. Legen Sie das biopsieierte Gewebe in eine 10 cm lange Petrischale und waschen Sie es einmal mit eiskalten DPBS (ohne Kalzium und Magnesium), um Blut und Ablagerungen zu entfernen.
    HINWEIS: Menschliches Gebärmutterhalsgewebe wurde innerhalb von 3 Stunden nach der Operation in eiskalten Advanced DMEM/F12 ins Labor transportiert und sofort nach Ankunft verarbeitet.
  2. Das Gewebe wird in ein 1,5-ml-Rohr mit 1 ml Dispase-Lösung (2,4 U/mL) übertragen und 1 Stunde bei 37 °C mit sanfter Bewegung auf einem Röhrenrotator (20 U/min) inkubiert.
    HINWEIS: Die Dispase-Lösung (2,4 U/mL) wurde unmittelbar vor der Verwendung frisch zubereitet, indem Dispasepulver auf die Arbeitskonzentration in eiskalten DPBS gelöst wurde.
  3. Übertragen Sie die Probe in eine neue 10 cm große Petrischale. Trennen Sie die weiße Epithelschicht vorsichtig mit einer Pinzette vom restlichen Gewebe.
  4. Verwenden Sie scharfe Pinzetten, um die Epitheloberfläche vorsichtig als intaktes Blatt abzuziehen. Übertragen Sie die isolierte Epithelschicht sofort in ein 50-mL-konisches Rohr, das auf Eis gehalten wird.
    HINWEIS: Wenn das Oberflächenepithel nicht leicht abgezogen werden kann, kratzen Sie die Oberfläche mit stumpfen Zangen.
  5. Gib 1 ml einer rekombinanten, trypsinbasierten Dissoziationslösung zur geschälten oder abgekratzten Probe und übertrage die gesamte Mischung in ein 50 mL konisches Rohr.
  6. Bewahren Sie das verbleibende Gewebe vom vorherigen Schritt im anderen 50-mL konischen Rohr auf.
  7. Inkubieren Sie das 50 ml starke konische Rohr mit Zerviksepithel bei 37 °C für 5 Minuten mit sanfter Bewegung auf einem Röhrenrotator (20 U/min).
  8. Fügen Sie 10 ml frisch zubereitetes Ice-Cold Blocking Buffer (PBS mit 2 % Rinderkalberserum (BCS)) zur Zellsuspension hinzu, um die enzymatische Reaktion zu stoppen.
  9. Zentrifugiere das Rohr bei 450 × g für 5 Minuten bei 4 °C. Entferne vorsichtig das Supernatant und entsorge es.
    HINWEIS: Wenn Blut visuell im dissoziierten Gewebe beobachtet wird oder das Gewebe klebrig erscheint, fahren Sie mit folgendem Schritt fort. Ansonsten springe zu Schritt 1.13.
  10. Fügen Sie 1 ml 1x RBC-Lysepuffer und 20 μL DNase (10 U/μL Lager) zum Pellet hinzu. Inkubiere 5 Minuten bei Raumtemperatur, um rote Blutkörperchen zu lysieren und klebrige DNA abzubauen.
  11. Fügen Sie 10 ml Ice-Cold Blocking Buffer (PBS mit 2 % Rinderkalbserum (BCS)) zur Zellsuspension hinzu, um die enzymatische Reaktion zu stoppen.
  12. Zentrifugiere das Rohr bei 450 × g für 5 Minuten bei 4 °C. Entferne vorsichtig das Supernatant und entsorge es.
  13. Waschen Sie das Zellpellet mit einem eiskalten Blocking Buffer (PBS mit 2% Rinderkalbserum (BCS)).
  14. Zentrifugiere das Rohr bei 450 × g für 5 Minuten. Entferne vorsichtig das Supernatant und entsorge es.
  15. Das Zellpellet wird in 200–500 μL Organoid-Kulturmedium wieder suspendiert.
  16. Zählen Sie die Zellzahl mit einem Hämozytometer und einer Trypan-blauen Lösung. Die erwartete Zellausbeute liegt zwischen 50.000 und 500.000 Zellen pro Biopsieprobe.

2. Ektocervicale Organoid-Säung und Kultur

  1. Suspendiere 500–2.000 lebensfähige Zellen in einem Endvolumen von 50 μL organoidem Kulturmedium (Zusammensetzung beschrieben in der Materialliste) in einem 1,5-mL Mikrozentrifugenröhrchen. Die Zelllebensfähigkeit wurde vor der Aussaatung durch Trypan-Blau-Ausschluss bewertet.
  2. Fügen Sie 50 μL einer Basalmembranmatrix (z. B. Matrigel) zur Zellsuspension hinzu. Vorsichtig auf Eis mischen, um Blasenbildung zu vermeiden, und das 100-μL-Gemisch in das Innere eines Zellkultureinsatzes geben, das in einer 24-Well-Platte platziert ist. Alle Verfahren zur Handhabung der Basalmembranmatrix wurden auf Eis oder bei 4 °C durchgeführt, um eine vorzeitige Gelierung zu verhindern, sofern nicht anders angegeben.
  3. Inkubieren Sie die Platte 20–30 Minuten bei 37 °C, bis das Basalmembran-Matrix-Zell-Gemisch erstarrt.
  4. Sobald die Mischung erstarrt ist, geben Sie 400 μL Organoid-Kulturmedium in den Brunnen unterhalb des Einsatzes ein.
  5. Kultivieren Sie die Organoide 1–2 Wochen, bis sie einen durchschnittlichen Durchmesser von 150–250 μm erreichen (der maximale Durchmesser liegt bei etwa 500 μm).
    HINWEIS: Wenn die Organoide eine angemessene Größe erreichen und das konzentrische lamellenartige Muster zwiebelschalenähnlicher Mikrostrukturen zeigen, sollten Sie gegebenenfalls eine Passierung in Betracht ziehen.

3. Organoid-Dissoziation und Neuaussaat

  1. Fügen Sie 1 ml Dispaselösung (2,4 U/mL) auf den Zellkultureinsatz hinzu und dissoziieren Sie vorsichtig die Basalmembranmatrix mit einer Pipette.
  2. Übertragen Sie die Dispase-Basal-Membranmatrixmischung in ein 15-mL-Rohr und inkubieren Sie 1 Stunde bei 37 °C.
  3. Fügen Sie 10 ml frisch zubereitetes Ice-Cold Blocking Buffer (PBS mit 2 % Rinderkalberserum (BCS)) zur Zellsuspension hinzu, um die enzymatische Reaktion zu stoppen.
  4. Zentrifugiere das Rohr bei 450 × g für 5 Minuten bei 4 °C.
  5. Entfernen Sie das Supernatant und lassen Sie das Pellet in 200 μL TrypLE Express wieder suspendieren.
  6. Inkubieren Sie 5 Minuten bei 37 °C.
  7. Fügen Sie 1 ml Eiskalte-Blockierungspuffer (PBS mit 2 % Rinderkalbserum (BCS)) hinzu und pipettieren Sie sanft, um das Enzym zu neutralisieren.
  8. Filtern Sie die Suspension durch ein 40-μm-Zellsieb, um Einzelzellen zu erhalten.
  9. Zentrifugiere das Rohr bei 450 × g für 5 Minuten bei 4 °C. Entferne vorsichtig das Supernatant und entsorge es.
  10. Das Zellpellet wird in 200–500 μL Organoid-Kulturmedium wieder suspendiert.
  11. Zählen Sie die Zellzahl mit einem Hämozytometer und einer Trypan-blauen Lösung. Die erwartete Zellausbeute liegt zwischen 50.000 und 500.000 Zellen pro Bohrloch des 24-Well-Zellkultureinsatzes.
  12. Anschließend werden 500–2.000 Zellen in 50 μL Organoid-Kulturmedium (Zusammensetzung beschrieben in der Materialliste) wieder suspendiert. Fügen Sie 50 μL Basalmembranmatrix zur Zellsuspension hinzu. Sanft mischen, Blasenbildung vermeiden und das 100-μL-Gemisch in das Innere eines Zellkultureinsatzes geben, das in einer 24-Well-Platte platziert ist.
  13. Inkubieren Sie die Platte 20–30 Minuten bei 37 °C, bis das Basalmembran-Matrix-Zell-Gemisch erstarrt.
  14. Sobald die Mischung vollständig erstarrt ist (typischerweise nach 20–30 Minuten bei 37 °C), geben Sie 400 μL Organoid-Kulturmedium in den Brunnen unterhalb des Inserts.
  15. Kultivieren Sie die Organoide 1–2 Wochen lang im Organoid-Kulturmedium (Zusammensetzung beschrieben in der Materialliste) mit einer 3D-Methode der extrazellulären Matrix. Kulturen werden bei 37 °C, 5 % CO₂ in einem befeuchteten Inkubator gehalten. Ersetzen Sie das Medium alle 2-3 Tage und überwachen Sie das Wachstum, bis die Organoide einen durchschnittlichen Durchmesser von 150-250 μm erreichen.
  16. Führen Sie die Organoide für die nächste Runde, wenn sie eine angemessene Größe erreichen, und zeigen Sie bei Bedarf das konzentrische lamellare Muster zwiebelschkallartiger Mikrostrukturen.

4. Genetische Manipulation menschlicher zervikaler Organoide durch Elektroporation

HINWEIS: Dieses Protokoll basiert auf der Verwendung eines Lonza Amaxa 4D-Nukleofektors und des P4 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit (#V4XP-4032).

  1. Nach der Isolierung aus der menschlichen Cervikalzellsuspension werden 100.000 bis 200.000 Zellen auf jedes 1,5-ml-Rohr übertragen.
  2. Zentrifugiere die Röhren bei 450 × g für 3 Minuten bei 4 °C. Entferne vorsichtig das Supernatant und entsorge es.
  3. Setzen Sie das Zellpellet in 20 μL der Nukleofektor-Lösung/Supplement-Mischung aus dem P4 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit wieder auf. Die Mischung wird hergestellt, indem pro Tube 16,4 μL Nukleofektorlösung und 3,6 μL Nahrungsergänzungsmittel kombiniert werden.
  4. Fügen Sie 300 nM entweder Kontroll- oder Ziel-siRNA-Oligo zu jedem Röhrchen mit den resuspendierten Zellen hinzu. Rühren Sie vorsichtig durch Pipetten.
    HINWEIS: Das Volumen des siRNA-Oligos darf 2 μL pro Röhre nicht überschreiten.
  5. Übertragen Sie vorsichtig die Nukleofektionsmischung (20 μL Zellen, die in einer Nukleofektorlösung/Ergänzungsmischung + bis zu 2 μL siRNA resuspendiert sind; insgesamt 20-22 μL) in die Elektroporations-Cuvette-Gefäße aus dem P4 Primary Cell 4D-Nukleofector X Kit.
  6. Klopfen Sie vorsichtig auf die Nukleovuvette-Gefäße, um sicherzustellen, dass die Probe den Boden der Cuvette bedeckt.
  7. Schließe den Deckel der Nukleo-Gefäße und stecke ihn in den Halter einer eingeschalteten 4D-Nukleofektor-Einheit.
    HINWEIS: Stellen Sie die korrekte Ausrichtung der Nukleocuvette-Gefäße im Retainer sicher.
  8. Initiieren Sie den Nukleofektionsprozess. Stellen Sie den EA-125-Impulscode für jede Cuvette mit dem P4-Primärzellenprozess ein.
  9. Nach Abschluss werden die Nukleovuvette-Gefäße vorsichtig aus dem Retainer entfernt.
  10. Inkubieren Sie die Nukleo-Gefäße bei Raumtemperatur für 10 Minuten, damit sich die Zellen stabilisieren können.
  11. Öffnen Sie den Deckel der Nukleovuvette-Gefäße, fügen Sie 180 μL 37 °C vorgewärmtes organoides Kulturmedium zu jeder Cuvette hinzu und übertragen Sie die Zellsuspension vorsichtig in ein neues 1,5-ml-Rohr zur Wiederaufhängung.
  12. Nehmen Sie ein Volumen Zellsuspension mit 500–2.000 Zellen und suspendieren Sie es in einem Organoid-Kulturmedium auf ein Endvolumen von 50 μL.
    HINWEIS: Werfen Sie die verbleibenden Zellen aus Schritt 4.12 nicht weg. Sie werden in Schritt 4.14 verwendet.
  13. Kultivieren Sie die Organoide, indem Sie das Protokoll der Methode 2 befolgen: Ectocervix Organoid-Aussaat und -Kultur. Vergleichen Sie die Effekte der siRNA durch Bewertung verschiedener Faktoren, einschließlich Anzahl, Größe und Struktur der resultierenden Organoide.
  14. Gib die verbleibenden Zellen aus Schritt 4.12 in eine 96-Well-Ultralow-Befestigungsplatte und inkubiere 48 Stunden bei 37 °C.
  15. Nach 48 Stunden werden die Zellen in ein 1,5-ml-Rohr übertragen und 3 Minuten bei 450 × g zentrifugiert. Entsorge das Supernatant.
  16. Verwenden Sie das Zellpellet für Echtzeit-PCR-Experimente, um den Knockdown der Zielgene zu bestätigen und Veränderungen in der Genexpression zu bewerten.
    HINWEIS: Alle menschlichen Gebärmutterhalsgewebe und Zellsuspensionen sollten als potenziell infektiöses Material behandelt werden. Führen Sie alle Verfahren mit primären menschlichen Proben in einem zertifizierten Biosicherheitsschrank gemäß BSL-2-Praktiken und gemäß institutionellen ethischen und Biosicherheitsvorschriften durch. Tragen Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung (Laborkittel, Handschuhe und Augenschutz) und desinfizieren Sie Arbeitsflächen und -ausrüstung nach der Verwendung mit einem von der Institution zugelassenen Desinfektionsmittel. Enzymatische Reagenzien (z. B. Dispase- und Dissoziationsenzyme wie TrypLE Express) können Haut- und Augenreizungen verursachen und während des Pipettierens Aerosole erzeugen; Vermeiden Sie die Produktion von Aerosolen, halten Sie die Röhren wann immer möglich mit Kappen und spülen Sie im Falle eines Kontakts sofort mit Wasser ab, während Sie institutionelle Expositionsverfahren und die SDS-Richtlinien des Herstellers befolgen. Entsorgen Sie alle biologischen Abfälle (einschließlich matrixhaltiger Materialien und kontaminierter Kunststoffe) gemäß institutionellen Richtlinien. Für die siRNA-Elektroporation befolgen Sie die elektrischen Sicherheitsanweisungen des Herstellers: Stellen Sie sicher, dass die Cuvetten richtig sitzen und der Deckel vollständig geschlossen ist, bevor Sie die Impulse auslösen, vermeiden Sie es, das Gerät mit nassen Handschuhen oder nahe Verschüttungen zu benutzen, überprüfen Sie das Gerät und Zubehör auf Schäden und vermeiden Sie direkten Kontakt mit den Cuvette-Elektroden unmittelbar nach dem Pulsieren.

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Ergebnisse

3D-menschliche cervikale Organoidkultur

Frisch isolierte humane Ektocervikale Gewebe wurden in der oben genannten Reihenfolge in einzelne Zellen dissoziiert, die dann auf 24-Well-Zellkultur-Einsätzen verlegt und kultiviert wurden, um zervikale Organoide zu bilden, wie in diesem Protokoll beschrieben (Abbildung 1). Menschliche zervikale Organoide wachsen über 2 Wochen aus einzelnen Zellen bis zu 500 μm Durchmesser ...

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Diskussion

In diesem Manuskript beschreiben wir das Protokoll zur Etablierung und Weitergabe menschlicher zervikaler Organoide. Wir bieten außerdem ein Protokoll zur genetischen Manipulation an, was die Erforschung der Gebärmutterhalsbiologie und -pathologie erheblich voranbringt. Obwohl wir das Protokoll speziell für menschliche Gebärmutterorganoide optimiert haben, kann unser Protokoll mit geringfügigen Modifikationen auch auf andere organoide Systeme angewendet werden.

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Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss des Gesundheits- und Wohlfahrtsministeriums (RS-2024-00439434 für Y. Jeong) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
P4 Primärzell 4D-Nukleofektor X KitLonzaV4XP-4032
96-Well-Ultralow-BefestigungsplatteSPL39796
Zell-Sieb 40 & Mikro; mSPL93040
50 mL konische Röhre 500/KastenSLPSPL50050
15 ml konisches RohrSarstedt62.554.502
CryoPure Tube 1,8 mL -weißSarstedt72,379P
37 & Grad; C, 5 % CO2  InkubatorEppendorf9734IQ905476
Zellkultur-EinsatzSPL37024
Amaxa 4D-NukleofektorLonzaAAF-1003X
Blockpuffer (2 % BCS in DPBS)Gibco / WelgeneBCS: 26010074; DPBS: LB001-02
Dispase-II-PulverGibco17105041
DNAse IEnzynomikM059L
MatrigelCorning356231
RBC-LysepufferBiosesangR2015
TrypLE ExpressGibco12605
Waschpuffer (HBSS)JBIBL003-1
Fortgeschrittenes DMEM/F12Gibco12634028
GlutaMAX-ErgänzungsmittelGibco35050-061
Penicillin– StreptomycinBiowestL0022-100
HEPESGibco15630-080
B27-ErgänzungsmittelGibco17504044
NogginPeproTech118214
N-Acetyl-l-CysteinSigmaA9165
Y-27632STEMCELL-Technologien72307
FGF2PeproTech100-18B-50UG
FGF7PeproTechAF-100-19-250UG
A83-01SelleckchemS7692 
ForskolinSigmaF6886
Neuregulin 1PeproTech100-03-50UG
NGFPeproTechAF-450-01-100UG
R-spondinSinobiologisch11083-HNAS
HGFPeprotech100-39H-250μg
FGF10Peprotech100-26
Petridish 35 mm&nlffel;SPL10035
Organoid-Media-Rezept
NameKompanieKatalognummerKonzentration
Fortgeschrittenes DMEM/F12Gibco12634028
GlutaMAX-ErgänzungsmittelGibco35050-0611x
Penicillin– StreptomycinBiowestL0022-1001x
HEPESGibco15630-08010 mM
B27-ErgänzungsmittelGibco175040441x
ohne Vitamin A
NogginPeproTech118214100 ng/ml
N-Acetyl-l-CysteinSigmaA91651 mM
Y-27632STEMCELL-Technologien7230710 uM
FGF2PeproTech100-18B-50UG50 ng/ml
FGF7PeproTechAF-100-19-250UG25 ng/ml
FGF10Peprotech100-26100 ng/ml
A83-01SelleckchemS7692 500 nM
ForskolinSigmaF688610 & mu; M
Neuregulin 1PeproTech100-03-50UG50 ng/ml
NGFPeproTechAF-450-01-100UG20 ng/ml
R-spondinSinobiologisch11083-HNAS100 ng/ml
HGFPeprotech100-39H-250μg25 ng/ml

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