Serial Killing Assay mit longitudinalimpedanzbasierter Tumorzell-Vitalitätsmessung – Eine nützliche Methode zur Bewertung der Leistung von T-Zellen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll bietet einen impedanzbasierten Echtzeit-Test zur Quantifizierung der Serientötungskapazität und Persistenz von CAR-T-Zellen unter chronischer Antigenstimulation und integriert eine Plattenwaschungsmethode für eine kosteneffiziente Wiederverwendung von Prüfplatten.

Zusammenfassung

Die Chimeren-Antigenrezeptor-(CAR)-Zelltherapie hat die Behandlung spezifischer hämatologischer Malignitäten revolutioniert. Ein erheblicher Teil der Patienten erlebt jedoch Rückfälle aufgrund von Antigenverlust, Antigen-Downregulation oder T-Zell-Erschöpfung. Diese Herausforderungen verdeutlichen die Notwendigkeit funktioneller Tests, die die Tötungsfähigkeit und Persistenz von CAR-T-Zellen unter chronischer Antigenstimulation bewerten können. Serientötungstests, die die Fähigkeit von CAR-T-Zellen messen, Tumorziele wiederholt zu eliminieren, bieten wertvolle Einblicke in die Haltbarkeit und Wirksamkeit der CAR-T-Reaktionen.

Hier präsentieren wir einen impedanzbasierten Test mit dem Real-Time Cell Analysis (RTCA)-System, um CAR-T-Zell-vermitteltes Serial Killing in vitro zu quantifizieren. Tumorzellen werden wiederholt ausgesät und dürfen an assay-spezifischen E-Platten haften, bevor CAR-T-Zellen in definierten Effektor-Ziel-(E:T)-Verhältnissen hinzugefügt werden. Die Plattform überwacht kontinuierlich die Lebensfähigkeit von Tumorzellen ohne Etiketten und erfasst dynamische Zytotoxizität mit hoher zeitlicher Auflösung. Kernwerte umfassen die Zellindex-(KI)-Kinetik, die Tumorzell-Tötungsrate und die Clearance-Zeit bis zum Ziel. Der fortschreitende Rückgang der Tötungsfähigkeit, der bei wiederholten Tumor-Ziel-Engagements beobachtet wird, dient als Marker für eine erworbene CAR-T-Zell-Dysfunktion, oft als T-Cell-Erschöpfung bezeichnet. Zusammen ermöglichen diese Metriken eine präzise Bewertung der CAR-T-Zellfunktion bei verschiedenen E:T-Verhältnissen und ermöglichen einen direkten Vergleich zwischen verschiedenen CAR-T-Zellkonstrukten oder Ko-Behandlungen über die Zeit.

Um die Kosteneffizienz zu steigern, entwickelten wir ein Plattenwaschverfahren, das die Wiederverwendung von Assay-E-Plates ermöglicht, ohne die Testleistung oder die Datenintegrität zu beeinträchtigen. Der optimierte Arbeitsablauf senkt die Assay-Kosten und bewahrt gleichzeitig die analytische Robustheit. Dieser Ansatz ermöglicht eine erschwingliche und skalierbare präklinische Bewertung der CAR-T-Zellfunktion, was Verbesserungen im Design von Zelltherapien ermöglicht.

Einleitung

Die T-Zelltherapie mit chimerischem Antigenrezeptor (CAR) hat die Krebsimmuntherapie mit bemerkenswertem klinischem Erfolg bei mehreren hämatologischen Malignitäten wie chronischer lymphoider Leukämie, akuter lymphoblastischer Leukämie, großem B-Zell-Lymphom und multiplem Myelom 1,2,3,4,5 revolutioniert. Seit den ersten behördlichen Zulassungen hat sich die Anzahl der CAR-T-Zellprodukte und behandelten Patienten stetig um⁶ erhöht. Je nach spezifische....

Protokoll

HINWEIS: Dieses Protokoll wurde für die E-Plate 96 optimiert und benötigt das xCELLigence RTCA-System. Adhärente Tumorzellen werden über Nacht im Voraus ausgesät, um die logarithmische Wachstumsphase zum Zeitpunkt der CAR-T-Zelladdition zu erreichen. Je nach Tumorzelllinie und Aussetzdichte kann dieses Intervall auf 6 bis 9 Stunden verkürzt werden, um eine Effektorzugabe am selben Tag zu ermöglichen. Wenn letzterer Workflow ausgeführt wird, wird der im Protokoll beschriebene nominelle Tages-für-Tag-Zeitplan angepasst, und die Nutzer sollten den Zeitplan entsprechend anpassen. Die Kokulturen werden 48 Stunden lang aufrechterhalten, bev....

Ergebnisse

Eine erfolgreiche Durchführung des Protokolls liefert reproduzierbare, impedanzbasierte Messungen, die die Lebensfähigkeit von Tumorzellen und die zytotoxische Zytotoxizität der CAR-T-Zellen über die Zeit widerspiegeln. Zellwachstum und Zytotoxizität wurden mit dem kommerziellen RTCA-System bewertet. Die Daten wurden als normalisierter Zellindex (NCI) ausgedrückt, berechnet durch Division des KI an jedem Zeitpunkt durch das CI zu einem ausgewählten Normalisierungszeitpunkt. Die Normalisierungszeit wird unmittelbar vor de.......

Diskussion

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Bewertung der CAR-T-Zell-vermittelten Zytotoxizität über mehrere Runden Antigenexposition mittels der xCELLigence RTCA-Plattform. Durch die Ermöglichung der longitudinalen Messung der Lebensfähigkeit von Tumorzellen mittels Impedanz erfasst dieser Ansatz wiederholte zytotoxische Reaktionen – als Serial Killing bezeichnet – in einem etikettenfreien und kontinuierlichen Format. Das Protokoll ist darauf ausgelegt, zu überwachen, wie sich die Funk.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
BxPC3	ATCC	CRL-1687
E-Kennzeichen 96	Agilent	300600910
RTCA Software Pro (Basic)	Agilent	N/A	Version 2.6.1
xCELLigence RTCA MP - (Mehrere Platten)	Agilent	N/A