Methodenartikel

Serial Killing Assay mit longitudinalimpedanzbasierter Tumorzell-Vitalitätsmessung – Eine nützliche Methode zur Bewertung der Leistung von T-Zellen

DOI:

10.3791/69623

⸱

30. Dezember 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Clinical Pharmacology, LMU University Hospital, 2Department of General, Visceral and Transplantation Surgery, LMU University Hospital, 3German Cancer Consortium (DKTK), Partner Site Munich, a partnership between the DKFZ and the University Hospital of the LMU, 4German Center for Lung Research (DZL), 5Einheit für Klinische Pharmakologie (EKLiP), Helmholtz Zentrum München - German Research Center for Environmental Health Neuherberg

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieses Protokoll bietet einen impedanzbasierten Echtzeit-Test zur Quantifizierung der Serientötungskapazität und Persistenz von CAR-T-Zellen unter chronischer Antigenstimulation und integriert eine Plattenwaschungsmethode für eine kosteneffiziente Wiederverwendung von Prüfplatten.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Chimeren-Antigenrezeptor-(CAR)-Zelltherapie hat die Behandlung spezifischer hämatologischer Malignitäten revolutioniert. Ein erheblicher Teil der Patienten erlebt jedoch Rückfälle aufgrund von Antigenverlust, Antigen-Downregulation oder T-Zell-Erschöpfung. Diese Herausforderungen verdeutlichen die Notwendigkeit funktioneller Tests, die die Tötungsfähigkeit und Persistenz von CAR-T-Zellen unter chronischer Antigenstimulation bewerten können. Serientötungstests, die die Fähigkeit von CAR-T-Zellen messen, Tumorziele wiederholt zu eliminieren, bieten wertvolle Einblicke in die Haltbarkeit und Wirksamkeit der CAR-T-Reaktionen.

Hier präsentieren wir einen impedanzbasierten Test mit dem Real-Time Cell Analysis (RTCA)-System, um CAR-T-Zell-vermitteltes Serial Killing in vitro zu quantifizieren. Tumorzellen werden wiederholt ausgesät und dürfen an assay-spezifischen E-Platten haften, bevor CAR-T-Zellen in definierten Effektor-Ziel-(E:T)-Verhältnissen hinzugefügt werden. Die Plattform überwacht kontinuierlich die Lebensfähigkeit von Tumorzellen ohne Etiketten und erfasst dynamische Zytotoxizität mit hoher zeitlicher Auflösung. Kernwerte umfassen die Zellindex-(KI)-Kinetik, die Tumorzell-Tötungsrate und die Clearance-Zeit bis zum Ziel. Der fortschreitende Rückgang der Tötungsfähigkeit, der bei wiederholten Tumor-Ziel-Engagements beobachtet wird, dient als Marker für eine erworbene CAR-T-Zell-Dysfunktion, oft als T-Cell-Erschöpfung bezeichnet. Zusammen ermöglichen diese Metriken eine präzise Bewertung der CAR-T-Zellfunktion bei verschiedenen E:T-Verhältnissen und ermöglichen einen direkten Vergleich zwischen verschiedenen CAR-T-Zellkonstrukten oder Ko-Behandlungen über die Zeit.

Um die Kosteneffizienz zu steigern, entwickelten wir ein Plattenwaschverfahren, das die Wiederverwendung von Assay-E-Plates ermöglicht, ohne die Testleistung oder die Datenintegrität zu beeinträchtigen. Der optimierte Arbeitsablauf senkt die Assay-Kosten und bewahrt gleichzeitig die analytische Robustheit. Dieser Ansatz ermöglicht eine erschwingliche und skalierbare präklinische Bewertung der CAR-T-Zellfunktion, was Verbesserungen im Design von Zelltherapien ermöglicht.

Einleitung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die T-Zelltherapie mit chimerischem Antigenrezeptor (CAR) hat die Krebsimmuntherapie mit bemerkenswertem klinischem Erfolg bei mehreren hämatologischen Malignitäten wie chronischer lymphoider Leukämie, akuter lymphoblastischer Leukämie, großem B-Zell-Lymphom und multiplem Myelom 1,2,3,4,5 revolutioniert. Seit den ersten behördlichen Zulassungen hat sich die Anzahl der CAR-T-Zellprodukte und behandelten Patienten stetig um6 erhöht. Je nach spezifischem Produkt und klinischer Indikation liegen die typischen Infusionsdosen von etwa 2 × 106bis 5 × 108CAR+ T-Zellen proPatient 7. Hohe Infusionsdosen sind notwendig, um eine effektive Tumorbeseitigung und langfristige Krankheitskontrolle zu erreichen, sind jedoch mit klinischen und praktischen Herausforderungen verbunden. Große Zellzahlen können das Risiko schwerwiegender Nebenwirkungen wie Zytokinfreisetzungssyndrom (CRS) und Immuneffektorzell-assoziiertes Neurotoxizitätssyndrom (ICANS) erhöhen, die beidedosisabhängig sein können. Darüber hinaus ist die Herstellung ausreichender funktioneller CAR-T-Zellen bei stark vorbehandelten oder lymphodepleierten Patienten eine Herausforderung, und der Prozess kann logistisch anspruchsvoll und kostspielig für Behandlungszentrensein.

Trotz dieser Herausforderungen erreichen CD19-gezielte CAR-T-Zelltherapien 70–90 % vollständige Remissionsraten bei Patienten mit rezidiven oder refraktären B-Zell-Malignitäten und zeigen damit eine transformative klinische Wirkung 10,11,12. Die CAR-T-Zelltherapie steht jedoch vor relevanten Herausforderungen, die ihre langfristige Wirksamkeit einschränken. Wichtige Hindernisse sind Antigenverlust oder -herunterregulierung, unzureichende Persistenz der CAR-T-Zellen und funktionelle Erschöpfung9. Die Erschöpfung der CAR-T-Zellen – gekennzeichnet durch verminderte Proliferationskapazität, beeinträchtigte Antitumoraktivität und mangelnde Persistenz – stellt eine wesentliche Ursache für Nichtreaktion und Rückfall13 dar. Erschöpfte CAR-T-Zellen gehen mit verminderter Effektorfunktion, anhaltender Expression inhibitorischer Rezeptoren und mangelhafter Zytokinproduktion aufgrund chronischer Antigenexposition und immunsuppressiver Tumor-Mikroumgebungenauf. Klinische Studien haben gezeigt, dass der Verlust der funktionellen CAR-T-Zellpersistenz mit einem erhöhten Rückfallrisiko assoziiert ist. Da anhaltende In-vivo-Aktivität ein wesentlicher Prädiktor für den therapeutischen Erfolg zu sein scheint, ist das Verständnis der Haltbarkeit und anhaltenden Tötungsfähigkeit von CAR-T-Zellprodukten ein wichtiges Ziel sowohl in der präklinischen als auch in der translationalen Forschung. Besonders interessant ist die Fähigkeit der CAR-T-Zellen, Tumorzellen über längere Zeiträume wiederholt zu erkennen und zu lysieren – das sogenannte 'Serienmord' –, da diese Eigenschaft ein funktionelles Maß für Persistenz und Widerstand gegen Erschöpfungbietet.

Dieser Artikel bietet ein detailliertes Protokoll zur Durchführung von Serien-Killing-Assays mit der xCELLigence Real-Time Cell Analysis (RTCA)-Impedanzplattform, einschließlich eines optionalen Waschverfahrens, das die Wiederverwendung von Prüfplatten, auch als E-Platten bezeichnet, ermöglicht, wodurch die Kosteneffizienz verbessert wird, ohne die Prüfleistung zu beeinträchtigen. Die Begründung für die Entwicklung eines solchen Protokolls ergibt sich aus den Einschränkungen herkömmlicher Zytotoxizitätstests, die typischerweise nur statische Endpunktanzeigen bieten. Gängige Ansätze wie Chrom-51-Freisetzung, Laktatdehydrogenase-(LDH)-Assays oder Durchflusszytometrie-basierte Viabilitätstests erfordern Etiketten, erfordern arbeitsintensive Arbeitsabläufe und sind auf definierte Zeitpunkte 18,19 beschränkt. Noch wichtiger ist, dass sie die dynamische Tötungskinetik über längere Stimulation oder mehrere Antigenexpositionen nicht leicht erfassen können – eine Situation, die direkt mit der Persistenz der CAR-T-Zellen und funktioneller Erschöpfung18 zusammenhängt.

Die xCELLigence RTCA-Plattform schließt diese Lücken, indem sie eine labelfreie, Echtzeit-kinetische Überwachung der Vitalität der Zielzellen mittels elektrischerImpedanz 20 bietet. Adhärente Tumorzielzellen werden auf goldbeschichteten Mikroelektroden-E-Platten ausgesät, deren Anheftung und Proliferation die gemessene Impedanz erhöhen, die als Zellindex (CI)21 berichtet wird. Bei CAR-T-vermittelter Tötung werden Zielzellen getötet und lösen sich ab, was zu einem schnellen Abfall derImpedanz von 20 führt. Diese Echtzeit-Anzeige ermöglicht eine kontinuierliche Bewertung der Zytotoxizität über Stunden oder Tage hinweg, ohne dass zusätzliche Etiketten oder Reagenzien erforderlich sind22. CAR-T-Zellen, die nicht anheften, tragen nicht zum Impedanzsignal bei, was eine saubere Trennung von Effektor- und Zielanzeigenermöglicht. Da die Daten kontinuierlich aufgezeichnet werden, können Forscher Mehrrunden-Stimulationsprotokolle durchführen, bei denen CAR-T-Zellen wiederholt übertragen und mit frischen Tumorzielzellen ausgesetzt werden, was eine direkte Messung der Entwicklung der Tötungskapazität im Laufe der Zeitermöglicht. Dies ahmt die wiederholten Antigenbegegnungen nach, die CAR-T-Zellen in vivo erleben, und liefert eine funktionelle Anzeige ihrer zytotoxischen Fähigkeiten.

Dieser impedanzbasierte Serientötungstest eignet sich ideal für Forscher, die die Funktion von CAR-T-Zellen in präklinischen Umgebungen bewerten, einschließlich Konstruktoptimierung, funktionellen Vergleichen und Potenztests. Dieses Protokoll erfordert das xCELLigence RTCA-System und die Verwendung von E-Plate 96. Obwohl es breit auf adhärente Tumormodelle anwendbar ist, eignet es sich nicht direkt für Suspensionskulturen ohne Immobilisierungs- oder Tethering-Strategien. Da Impedanzmessungen allein nur die Adhärenz und Lebensfähigkeit der Zielzellen widerspiegeln, werden komplementäre Analysen wie Durchflusszytometrie oder Zytokintests empfohlen, um die Aktivierung, Proliferation und Erschöpfung von CAR-T-Zellen vollständig zu charakterisieren. Das Protokoll enthält festgelegte Schritte, die die Entnahme von Zellen und Supernatanten für diese zusätzlichen Auslesungen ermöglichen, was eine umfassendere Bewertung der Funktionalität der CAR-T-Zellen ermöglicht.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HINWEIS: Dieses Protokoll wurde für die E-Plate 96 optimiert und benötigt das xCELLigence RTCA-System. Adhärente Tumorzellen werden über Nacht im Voraus ausgesät, um die logarithmische Wachstumsphase zum Zeitpunkt der CAR-T-Zelladdition zu erreichen. Je nach Tumorzelllinie und Aussetzdichte kann dieses Intervall auf 6 bis 9 Stunden verkürzt werden, um eine Effektorzugabe am selben Tag zu ermöglichen. Wenn letzterer Workflow ausgeführt wird, wird der im Protokoll beschriebene nominelle Tages-für-Tag-Zeitplan angepasst, und die Nutzer sollten den Zeitplan entsprechend anpassen. Die Kokulturen werden 48 Stunden lang aufrechterhalten, bevor CAR-T-Zellen auf frisch verplattente Tumorzellen übertragen werden, wobei zwei Plattenpositionen auf dem xCELLigence-Instrument erforderlich sind und alle zwei Tage abwechselnd Tumorzellplatten und Effektorzufügungen hinzugefügt werden. CAR-T-Zellen sollten gemäß institutionellen SOPs oder etablierten Protokollen erzeugt werden. Kurz gesagt: Periphere Blut-T-Zellen werden nach genehmigten ethischen Standards isoliert, unter geeigneten Biosicherheitsbedingungen transduziert und auf Transduktionseffizienz sowie Lebensfähigkeit mittels Durchflusszytometrie oder gleichwertigen QC-Assays bewertet. xCELLigence-Assays sollten nicht durchgeführt werden, wenn die CAR-Transduktionseffizienz unter 20 % liegt, da geringere Wirkungsgrade zu erhöhtem Hintergrund und unspezifischem Absterben durch untransduzierte Zellen führen können, was die Wachstumskurven des Tumors verzerren kann. Alle Zellhandhabungen sollten unter sterilen Bedingungen in einer laminaren Flusshaube erfolgen. Medien können nach dem Standard des Labors oder wie vom Lieferanten empfohlen verwendet werden. Sofern nicht anders angegeben, werden die Zellen bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % CO₂ inkubiert. Obwohl sie für CAR-T-Zellen optimiert ist, kann diese Methode auch auf andere federungsbasierte Effektorzellen und haftende Ziele angewendet werden.

1. Vorbereitung und Blanking (Tag 1)

  1. Plattenvorbereitung
    1. Fügen Sie 50 μL Tumormedium an den Boden jedes Brunnens der E-Platte 96 hinzu.
      HINWEIS: Achte darauf, den Boden des Brunnens nicht zu zerkratzen, da dies die Platte beschädigen könnte.
    2. Setzen Sie die E-Platte in den Inkubator und positionieren Sie sie auf denselben Automatenschlitz, der für die Messungen verwendet wird.
    3. Inkubieren Sie die E-Platte 30 Minuten bei 37 °C, um sie auf die geeignete Testtemperatur und -pH-Temperatur zu bringen.
  2. Instrumentenaufbau
    1. Starten Sie währenddessen die RTCA Software Pro (Version 2.6.1) und wählen Sie einen Dateipfad aus, um das Experiment zu speichern.
    2. Geben Sie den Namen des Experiments im Feld "RTCA Operator" ein und speichern Sie.
    3. Wählen Sie die zu messenden Brunnen aus.
    4. Setze Zellnamen unter dem Reiter Zell und Behandlungstypen unter dem Reiter Behandlung .
  3. Messplan
    1. Stellen Sie den Zeitplan mit folgenden Schritten zusammen:
      Schrittname = Leer ; Sweeps = 1 ; Intervall = 1 ; Dauer = 0:00
      Schrittname = Tumorzellen ; Sweeps = 250-300 ; Pause = 15 Minuten; Dauer = mindestens 24 Stunden
      Schrittname = Behandlung ; Sweeps = bis zu 2500 ; Pause = 5 Minuten; Dauer = mindestens 72 Stunden
    2. Drücken Sie auf Anwenden und stellen Sie sicher, dass für keinen Schritt Auto ausgewählt ist.
  4. Blanking-Schritt
    1. Nach der 30-minütigen Inkubation der E-Platte bei 37 °C drücken Sie PLAY/RUN, um den Blank-Schritt zu starten.
    2. Warte, bis die Software den Schritt als ERLEDIGT markiert (ca. 1–2 Minuten).
    3. Entriege die Wiege und entferne die E-Platte nur, wenn du bereit bist, mit dem Zell-Saaten fortzufahren.

2. Runde 1: Tumorzell-Seedung (Tag 1)

  1. Aussäen von Tumorzellen
    1. Bereiten Sie eine Suspension von Tumorzellen in 50 μL geeignetem Medium pro Bohrloch vor.
    2. Entferne die E-Platte aus dem Inkubator und säe die Zellen in dreifachen Schichten.
  2. Anfangsmessung
    1. Bringen Sie die E-Platte sofort zurück in die Maschine und verriegeln Sie die Wiege.
    2. Warte 5–10 Minuten vor der ersten Messung, um die Temperatur und den pH-Wert der E-Platte auszugleichen, und klicke dann auf den PLAY/RUN-Button , um die Messung zu starten (Schritt 2 des Zeitplans = Tumorzellen).
    3. Inkubieren Sie die E-Platte über Nacht, um die Zelladhärenz zu ermöglichen. Überwachen Sie den nicht-normalisierten Zellindex (CI). Wenn der CI in die Wachstumsphase der Logarithmus-Phase eintritt, wird zum nächsten Schritt übergefahren. Diese Phase hängt von der verwendeten Zelllinie ab und kann durch die Anzahl der gesamenten Zellen beeinflusst werden. BxPC3-Zellen (ATCC CRL-1687) wurden mit 20.000 Zellen pro Bohrloch ausgesaat, wobei das Wachstum in der Logaritam-Phase typischerweise nach 6–18 Stunden erreicht wurde.

3. Runde 1: CAR-T-Zellbehandlung (Tag 2)

  1. Vorbereitung und Aussäung von T-Zellen
    1. Bereite die erforderliche Anzahl von CAR-T-Zellen in 100 μL/Bohrloch im menschlichen T-Zellmedium ohne Expansionszytokine (z. B. IL-2, IL-7, IL-15 usw.) vor.
      HINWEIS: Die Transduktionseffizienz von CAR wird zu Beginn des Experiments einmal gemessen. Das gewünschte Effektor-Ziel-Verhältnis (E:T) wird anhand der Anzahl der CAR⁺-T-Zellen relativ zu den ursprünglich plattierten Tumorzellen festgelegt. Zum Beispiel sollten für ein 1:1 E:T-Verhältnis mit 50 % CAR⁺ T-Zellen und 20.000 BxPC3-Tumorzellen insgesamt 40.000 T-Zellen plattiert werden. Das E:T-Verhältnis bezieht sich daher auf die Anfangsbedingung zu Beginn des Serienmord-Tests; sofern keine weiteren Messungen durchgeführt werden, bleiben Änderungen des E:T während späterer Runden unbekannt. Veränderungen der T-Zellproliferation oder des Überlebens im Laufe der Zeit und damit im E:T-Verhältnis werden als Teil der Serientötungsanzeige betrachtet. Wenn T-Zellen zwischen Runden aufgeteilt werden, wird das E:T proportional neu berechnet (z. B. eine 1:1-Aufteilung nach Runde 3 reduziert ein anfängliches 2:1 E:T auf 1:1 für Runde 4). Wenn E:T-Dynamiken zwischen Runden von Interesse sind, können optionale zusätzliche Bohrungen für Zwischenmessungen des CAR-Prozentsatzes oder der Effektorfunktion verschichtet werden. Das Entfernen von Anti-CD3/CD28-T-Zellstimulationskugeln durch magnetische Trennung kann helfen, unspezifische Tötungen zu reduzieren. Es wird außerdem empfohlen, T-Zellen in der logarithmischen Wachstumsphase (typischerweise zwischen 5 und 20 Tagen nach der Stimulation) zu verwenden und die Zellen mindestens zwei Tage vor dem Assay mit Zytokinen zu erweitern, statt am Tag davor.
    2. Passen Sie die CAR-Transduktionseffizienz zwischen experimentellen Gruppen auf den niedrigsten gemeinsamen Prozentsatz an, indem Sie mit untransduzierten T-Zellen mischen, basierend auf der Transduktionseffizienzanalyse.
      HINWEIS: Wenn alle Gruppen die gleiche Transduktionseffizienz aufweisen, ist keine Anpassung erforderlich. Wenn die CAR⁺-Prozentsätze unterschiedlich sind, wird die Anzahl der T-Zellen berechnet, die man platten soll, sodass jede Gruppe mit derselben effektiven Anzahl von CAR⁺-Zellen und CAR-Zellen beginnt. Dies geschieht, indem die gewünschte CAR⁺-Zellzahl (basierend auf dem E:T-Verhältnis und der Tumoraussaatung) mit 100 multipliziert und durch den gemessenen CAR⁺-Prozentsatz für jede Gruppe geteilt wird, wobei bei Bedarf nicht transduzierte T-Zellen hinzugefügt werden, um die Gesamtzahl der T-Zellen zu erreichen. Wenn beispielsweise eine Gruppe 50 % CAR⁺ T-Zellen hat, werden 40.000 T-Zellen plattiert (20.000 CAR⁺ + 20.000 CAR-), während eine Gruppe mit 60 % CAR⁺ T-Zellen 33.333 T-Zellen plattieren würde, um 20.000 CAR⁺-Zellen zu erzeugen, wodurch 6.667 untransduzierte T-Zellen hinzugefügt werden, um der Gesamtzahl der ersten Gruppe (insgesamt 40.000) zu entsprechen.
    3. Optional, wenn das Zytokin oder die Verbindungsbehandlung untersucht werden soll, fügen Sie 20 μL einer Lösung hinzu, die aus humanem T-Zell-Medium und dem gewünschten Zytokin oder der Verbindung mit dem 11-fachen der beabsichtigten Endkonzentration besteht. Dieses Volumen wird zu den bereits vorhandenen Standard-200 μL in jedem Bohrloch hinzugefügt (50 μL für Blanking, 50 μL für Tumorzell-Seeding und bis zu 100 μL für T-Zell-Addition). Laut Hersteller unterstützt die E-Plate 96 ein maximales Volumen von 243 μL ± 5 μL pro Bohrloch, sodass ein Gesamtvolumen von 220 μL für solche optionalen Behandlungen akzeptabel ist.
  2. T-Zell-Seeding und Messung
    1. Entfernen Sie die E-Platte, indem Sie die Halterung entriegeln, nur wenn Sie bereit sind, T-Zellen hinzuzufügen.
    2. Samen präparierten T-Zellen direkt auf die Tumorzellen.
    3. Verriegeln Sie die Wiege im Messgerät und brechen Sie Schritt 2 in der RTCA-Software ab.
      HINWEIS: Wenn Schritt 2 nicht abgebrochen wird, misst das System den vorherigen Schritt weiter und stoppt erst, wenn dieser Schritt abgeschlossen ist, was zum Verlust von Datenpunkten führt.
    4. Warte, bis Schritt 2 als FERTIG markiert wird.
    5. Klicken Sie auf den PLAY/RUN-Button, um Schritt 3 (Behandlung) zu starten, und bestätigen Sie die Aufforderung mit OK.
      HINWEIS: Eine Gleichgewichtsphase von 15–30 Minuten nach der Behandlung (z. B. nach Aussaat oder Zelltransfer) vor Beginn des nächsten Messschritts (vor Schritt 3.2.5) hilft, die anfängliche Durchbiegung durch Temperatur- oder pH-Schwankungen in den Wachstumskurven zu minimieren.

4. Runde 2: Tumorzell-Seedung (Tag 3)

  1. Bereiten Sie eine neue 96-Well-xCELLigence-E-Platte vor, wie in den Schritten 1.1 und 1.4 beschrieben.
  2. Säe frische Tumorzellen wie in Schritt 2 beschrieben.
  3. Inkubieren Sie die E-Platte über Nacht, um die Zelladhärenz zu ermöglichen.

5. Runde 2: Übertragung der CAR-T-Zelle auf die zweite E-Platte (Tag 4)

  1. Übertragen Sie den Inhalt jedes Bohrlochs mit einer Mehrkanalpipette in eine entsprechende Mulde einer U-unteren 96-Bohrloch-Platte. Seien Sie vorsichtig, die Elektroden am unteren Rand der E-Platte nicht zu berühren.
  2. Zentrifugiere bei Raumtemperatur, 400 × g für 5 Minuten.
  3. Aspirieren Sie das Supernatant vorsichtig und bewahren Sie es bei Bedarf für den enzymgebundenen Immunsorbent-Test (ELISA) auf.
  4. Suspendieren Sie das Zellpellet in 100 μL frischem Medium ohne Expansionszytokine.
    HINWEIS (optional): T-Zellen können nun gespalten werden (z. B. 50 μL = 1:2 Spaltung) und für weitere Analysen verwendet werden, wie etwa die Durchflusszytometrie. Die Spaltung von T-Zellen passt ihre Proliferation während des xCELLigence-Killing-Tests an. Es hilft, die notwendige Anzahl der Zyklen zu reduzieren, bis die Erschöpfung sichtbar wird. Es wird empfohlen, das Teilverhältnis zwischen 2 und 4 zu testen.
  5. Fügen Sie 100 μL/Well-T-Zellen zur E-Platte des zweiten Tumors hinzu (50 μL bei 1:2-Teilung), um sicherzustellen, dass Medium und, falls zutreffend, Zytokin/Verbindung vollständig aufgefüllt sind.

   

6. Fortsetzung des Serienmord-Assays (Tage 5–10 und darüber hinaus)

  1. Wiederholen Sie die Schritte 4 und 5 für weitere Tötungsrunden bei Bedarf mit 48-Stunden-Intervallen.
  2. Überwachen Sie die Tötungsaktivität und die Persistenz der T-Zellen in jeder Phase mithilfe von xCELLigence-Anzeigen und ergänzenden Assays wie ELISA oder Durchflusszytometrie.

7. Datenerhebung und E-Platten-Handhabung

  1. Nach der gewünschten Messdauer drücken Sie in der Software auf STOP .
  2. Exportiere die Daten normalisiert bis zum Zeitpunkt der Effektorzelladdition und nicht gemittelt, um eine genaue Mittelwert-± SEM-Plotting in der Analysesoftware (R, GraphPad Prism usw .) zu ermöglichen. Exportiere den gemittelten Datensatz, falls gewünscht.
  3. Entriege und entferne die E-Platte. Veröffentlichen Sie das Experiment in der Software.
  4. Reinigen oder lagern Sie die E-Platte im Inkubator für weitere Analysen (z. B. Supernatant für ELISA oder Zellentnahme für Durchflusszytometrie).

8. Optional: E-Platten-Waschen zur Wiederverwendung

HINWEIS: Dieser optionale Schritt ermöglicht die Wiederverwendung von xCELLigence E-Platten, um die Versuchskosten zu senken. Eine Wiederverwendung wird nur empfohlen, wenn die elektrischen Eigenschaften der E-Platte über Experimente hinweg stabil bleiben und bis einzelne Bohrlöcher im akzeptablen Basisbereich liegen. Beachten Sie alle Sicherheitsvorschriften, insbesondere beim Umgang mit Natriumhydroxid (NaOH). Überprüfen Sie die E-Platten nach dem Waschen visuell, um mögliche Fehler in den Elektroden zu erkennen.

  1. Entsorgen Sie den gesamten Inhalt der E-Platte, ohne die Unterseite der E-Platte zu berühren.
  2. Waschen Sie jeden Brunnen dreimal mit 200 μL deionisiertem Wasser.
  3. Fügen Sie jedem Bohrloch 200 μL 0,1 M NaOH hinzu.
    VORSICHT: NaOH ist korrosiv. Stellen Sie sicher, dass lokale Sicherheitsrichtlinien eingehalten werden. Tragen Sie Handschuhe, Mantel und Schutzbrille. Handhabe 1 M NaOH in einem Sicherheitsschrank. Entsorgen Sie NaOH-Abfälle in die Spüle und laufen Sie Wasser, um eine ordnungsgemäße Verdünnung sicherzustellen. Mische niemals konzentrierte Säuren und Basen. Gib kein Wasser zur Säure; Nur Säure zu Wasser.
  4. Inkubieren Sie die E-Platte bei Zimmertemperatur für 5 Minuten.
  5. Waschen Sie jeden Brunnen mindestens dreimal mit deionisiertem Wasser, wobei alle verbleibenden NaOH entfernt sind.
  6. Trocknen Sie die E-Platte, indem Sie sie sanft auf ein Taschentuch klopfen, gefolgt vom Lufttrocknen.
  7. Sterilisieren Sie die E-Platte mindestens 1 Stunde lang unter UV-Licht in einem Biosicherheitsschrank oder einem UV-Bestrahlungsgerät.
    HINWEIS: Positioniere die E-Platte so, dass die Bohrlöcher direkt nach oben zeigen. UV-Licht dringt nicht durch den Boden des Kunststoffschachts hinein.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eine erfolgreiche Durchführung des Protokolls liefert reproduzierbare, impedanzbasierte Messungen, die die Lebensfähigkeit von Tumorzellen und die zytotoxische Zytotoxizität der CAR-T-Zellen über die Zeit widerspiegeln. Zellwachstum und Zytotoxizität wurden mit dem kommerziellen RTCA-System bewertet. Die Daten wurden als normalisierter Zellindex (NCI) ausgedrückt, berechnet durch Division des KI an jedem Zeitpunkt durch das CI zu einem ausgewählten Normalisierungszeitpunkt. Die Normalisierungszeit wird unmittelbar vor de...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Bewertung der CAR-T-Zell-vermittelten Zytotoxizität über mehrere Runden Antigenexposition mittels der xCELLigence RTCA-Plattform. Durch die Ermöglichung der longitudinalen Messung der Lebensfähigkeit von Tumorzellen mittels Impedanz erfasst dieser Ansatz wiederholte zytotoxische Reaktionen – als Serial Killing bezeichnet – in einem etikettenfreien und kontinuierlichen Format. Das Protokoll ist darauf ausgelegt, zu überwachen, wie sich die Funk...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SK hat Honorarien von Plectonic, TCR2 Inc., Miltenyi, Galapagos, Cymab, Novartis, Regeneron, BMS und GSK erhalten. SK ist Erfinder mehrerer Patente im Bereich der Immunonkologie. SK erhielt Lizenzgebühren von TCR2 Inc und Carina Biotech. SK erhielt Forschungsunterstützung von TCR2 Inc., Tabby Therapeutics, Catalym GmbH, Plectonic GmbH und Arcus Bioscience für Arbeiten, die nicht mit dem Manuskript zu tun hatten. Alle anderen Autoren geben keine konkurrierenden Interessen an.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

TT, SM und NTTN erhielten Fördermittel von der Else-Kröner Fresenius Stiftung (IOLIN). Das NTTN erhielt zusätzliche Fördermittel von der Friedrich-Baur-Stiftung und der Deutschen Krebshilfe (AvantCAR.de). MPT wird von der Monika Kutzner Foundation und dem European Research Council (MSCA Fellowship 101106951) unterstützt. SK wird unterstützt vom internationalen Promotionsprogramm 'i-Target: immunotargeting of cancer' (gefördert vom Elite-Netzwerk Bayern), dem Bayerischen Krebsforschungszentrum (BZKF) (TANGO to S.K.), der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG, Fördernummer: KO5055-2-1 und KO5055/3-1), der Melanom-Forschungsallianz (Fördernummer 409510), dem Marie Sklodowska-Curie Training Network zur Optimierung der adoptiven T-Zell-Therapie von Krebs (gefördert vom Horizon 2020-Programm der Europäischen Union; Fördermittel 955575), Marie Sklodowska-Curie Ausbildungsnetzwerk zur Verfolgung und Kontrolle therapeutischer Immunzellen bei Krebs (finanziert vom Horizon-Programm der EU, Fördermittel 101168810), Else Kröner-Fresenius-Stiftung (IOLIN), Deutsche Krebshilfe (AvantCAR.de), Wilhelm-Sander-Stiftung, Ernst Jung Stiftung, Institutionelle Strategie LMUexcellent der LMU München (im Rahmen der Deutschen Exzellenzinitiative), die Go-Bio-Initiative, der m4-Preis des Bayerischen Wirtschaftsministeriums, Bundesministerium für Bildung und Forschung, das EUROSTAR-Programm, European Research Council (Starting Grant 756017, PoC Grant 101100460 und CoG 101124203), durch die SFB-TRR 338/1 2021-452881907, Fritz-Bender-Stiftung, Deutsche José Carreras Leukämie Stiftung, Hector-Stiftung, Baycellator-Stiftung, Monika-Kutzner-Stiftung, Bruno- und Helene-Jöster-Stiftung (360° CAR), Dr. Rurainski-Stiftung sowie Brigitte- und Dr. Konstanze-Wegener-Stiftung

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
BxPC3ATCCCRL-1687
E-Kennzeichen 96Agilent 300600910
RTCA Software Pro (Basic) Agilent N/AVersion 2.6.1
xCELLigence RTCA MP - (Mehrere Platten)Agilent N/A

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia. N Engl J Med. 365 (8), 725-733 (2011).
  2. Grupp, S. A., et al. Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia. N Engl J Med. 368 (16), 1509-1518 (2013).
  3. Neelapu, S. S., et al. Axicabtagene ciloleucel CAR T-cell therapy in refractory large B-cell lymphoma. N Engl J Med. 377 (26), 2531-2544 (2017).
  4. Brudno, J. N., et al. T cells genetically modified to express an anti-B-cell maturation antigen chimeric antigen receptor cause remissions of poor-prognosis relapsed multiple myeloma. J Clin Oncol. 36 (22), 2267-2280 (2018).
  5. Gauthier, J., et al. Phase 1 study of CD19 CAR T-cell therapy harboring a fully human scFv in CAR-naïve adult patients with B-ALL. Blood Adv. 9 (8), 1861-1872 (2025).
  6. Mitra, A., et al. From bench to bedside: The history and progress of CAR T-cell therapy. Front Immunol. 14, 1188049(2023).
  7. Rotte, A., et al. Dose-response correlation for CAR-T cells: A systematic review of clinical studies. J Immunother Cancer. 10 (12), e005678(2022).
  8. Foster, M., et al. Cross-study safety analysis of risk factors in CAR T-cell clinical trials: An FDA database pilot project. Mol Ther Oncolytics. 27, 182-194 (2022).
  9. Sterner, R. C., Sterner, R. M. CAR-T cell therapy: Current limitations and potential strategies. Blood Cancer J. 11 (4), 69(2021).
  10. Turtle, C. J., et al. CD19 CAR-T cells of defined CD4+:CD8+ composition in adult B-cell ALL patients. J Clin Invest. 126 (6), 2123-2138 (2016).
  11. Maude, S. L., et al. Tisagenlecleucel in children and young adults with B-cell lymphoblastic leukemia. N Engl J Med. 378 (5), 439-448 (2018).
  12. Cappell, K. M., et al. Long-term follow-up of anti-CD19 chimeric antigen receptor T-cell therapy. J Clin Oncol. 38 (32), 3805-3815 (2020).
  13. Zugasti, I., et al. cell therapy for cancer: Current challenges and future directions. Signal Transduct Target Ther. 10 (1), 210(2025).
  14. Tao, Z., et al. Impact of T-cell characteristics on CAR-T cell therapy in hematological malignancies. Blood Cancer J. 14 (1), 213(2024).
  15. Wittibschlager, V., et al. T-cell persistence correlates with improved outcome in patients with B-cell lymphoma. Int J Mol Sci. 24 (6), 5688(2023).
  16. Myers, R. M., et al. Humanized CD19-targeted chimeric antigen receptor (CAR) T cells in CAR-naive and CAR-exposed children and young adults with relapsed or refractory acute lymphoblastic leukemia. J Clin Oncol. 39 (27), 3044-3055 (2021).
  17. Gardner, R. A., et al. Intent-to-treat leukemia remission by CD19 CAR T cells of defined formulation and dose in children and young adults. Blood. 129 (25), 3322-3331 (2017).
  18. Kiesgen, S., Messinger, J. C., Chintala, N. K., Tano, Z., Adusumilli, P. S. Comparative analysis of assays to measure CAR T-cell-mediated cytotoxicity. Nat Protoc. 16 (3), 1331-1342 (2021).
  19. Peper, J. K., et al. An impedance-based cytotoxicity assay for real-time and label-free assessment of T-cell-mediated killing of adherent cells. J Immunol Methods. 405, 192-198 (2014).
  20. Cerignoli, F., et al. In vitro immunotherapy potency assays using real-time cell analysis. PLoS One. 13 (3), e0193498(2018).
  21. Xing, J. Z., Zhu, L., Gabos, S., Xie, L. Microelectronic cell sensor assay for detection of cytotoxicity and prediction of acute toxicity. Toxicol In Vitro. 20 (6), 995-1004 (2006).
  22. Lee, E. H. J., et al. Antigen-dependent IL-12 signaling in CAR T cells promotes regional to systemic disease targeting. Nat Commun. 14 (1), 4737(2023).
  23. Lisby, A. N., Carlson, R. D., Baybutt, T. R., Weindorfer, M., Snook, A. E. Evaluation of CAR-T cell cytotoxicity: Real-time impedance-based analysis. Methods Cell Biol. 167, 81-98 (2022).
  24. Sahoo, P., et al. Mathematical deconvolution of CAR T-cell proliferation and exhaustion from real-time killing assay data. J R Soc Interface. 17 (162), 20190734(2020).
  25. Li, N., Zhang, W. Calculation principles of Agilent xCELLigence RTCA software. , Agilent Technologies. (2022).
  26. Pampusch, M. S., Skinner, P. J. Transduction and expansion of primary T cells in nine days with maintenance of central memory phenotype. J Vis Exp. (157), e60400(2020).
  27. Brezinger-Dayan, K., et al. Impact of cryopreservation on CAR T production and clinical response. Front Oncol. 12, 1024362(2022).
  28. Foulke, J. G., et al. Optimizing ex vivo CAR-T-cell-mediated cytotoxicity assay through multimodality imaging. Cancers (Basel). 16 (14), (2024).
  29. Cadinanos-Garai, A., et al. High-dimensional temporal mapping of CAR T cells reveals phenotypic and functional remodeling during manufacturing. Mol Ther. 33 (5), 2291-2309 (2025).
  30. Stefanowicz-Hajduk, J., Adamska, A., Bartoszewski, R., Ochocka, J. R. Reuse of E-Plate cell sensor arrays in the xCELLigence real-time cell analyzer. Biotechniques. 61 (3), 117-122 (2016).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Schlagwörter

Impedanzbasierter AssayCAR T ZellenEchtzeit ZellanalyseT Zell Ersch pfungZytotoxizit tsmessungEffektor Zielzell Verh ltnisWiederverwendung von E PlatesZellindex Kinetik

Verwandte Artikel