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Forschungsartikel
Die Exposition von PM2.5 induziert eine verzögerte Hodenschädigung in Rattenmodellen durch anhaltende Entzündungsreaktionen, verstärkte Keimzellapoptose, Downregulation von Connexin-43/Occludin und Signalübertragungen, die mit der Aktivierung des JNK-Signalwegs übereinstimmen, was ihre langfristige Bedrohung für die männliche Fortpflanzungsgesundheit hervorhebt.
Feinstaub (PM2.5) wird zunehmend mit männlicher Fortpflanzungsstörung in Verbindung gebracht. Da die meisten Forschungen jedoch weiterhin akut, verzögert, anhaltend oder progressiv nach der Exposition sind, sind Hodenschäden – die für die langfristige Risikobewertung entscheidend sind – weiterhin schlecht verstanden. Wir entwickelten ein zeitaufgelöstes Rattenmodell, um festzustellen, ob die Verletzung nach der Exposition anhält oder sich verschlechtert. Zweiundsiebzig männliche Sprague-Dawley-Ratten wurden zufällig in neun Gruppen eingeteilt (Kontrollgruppe; Fahrzeug bei 24 Stunden, 1, 2 und 4 Monaten; PM2,5 zu gleichen Zeitpunkten) und erhielt intranasale PM2,5 mit 5 mg/kg/Tag für 7 Tage. Wir quantifizierten Spermienqualität und Reproduktionsorganindizes, untersuchten Hodenhistologie und Ultrastruktur, maßen Serumtestosteron, FSH, LH und E2, profilierten entzündliche Zytokin-mRNAs (IL-1β, IL-6, TNF-α, IFN-γ), untersuchten Keimzellapoptose mittels TUNEL und bewerteten junctionale sowie stressbezogene Proteine (Connexin-43, Occludin, JNK). Die Exposition bei PM2.5 führte zu anhaltenden Rückgängen der Spermienkonzentration und -beweglichkeit sowie zu verstärkten Fehlbildungen sowie Hoden- und Nebennebensäulenatrophie, die sich über die vier Monate nach der Exposition nicht erholten. Die Histologie zeigte eine fortschreitende Verdünnung des seminiferen Epithels und eine ultrastrukturelle Degeneration. Auch endokrine Störungen zeigten sich, mit reduziertem Testosteron und veränderten Gonadotropinen. Mechanistisch hielt die PM2.5-Exposition eine erhöhte Expression von IL-1β und IL-6 aufrecht, förderte die Keimzellapoptose und senkte Connexin-43 sowie Occludin, während sie Muster zeigte, die mit der Aktivierung des JNK-Weges übereinstimmen. Zusammen zeigen diese Ergebnisse eine verzögerte und fortschreitende Hodentoxizität nach dem Ende der PM2,5-Exposition und deuten darauf hin, dass die Erhaltung der junctionalen Integrität und die gezielte Zielsetzung von JNK langfristige Fortpflanzungsschäden mindern können.
PM2.5, ein komplexes Gemisch feiner Feinstaubstoffe mit einem aerodynamischen Durchmesser von ≤2,5 μm, stammt aus industriellen Emissionen, Fahrzeugabgasen und Biomasseverbrennung und hat sich als bedeutender globaler Umweltschadstoffetabliert. Epidemiologische Studien verbinden die Exposition von PM2.5 mit Atemwegs- und Herz-Kreislauf-Erkrankungen2 sowie Beeinträchtigungen des Fortpflanzungssystems3. Die Auswirkungen auf die männliche Fruchtbarkeit sind besonders besorgniserregend, da Hinweise darauf liegen, dass Luftverschmutzung die Spermienqualität verringern kann4. Männliche Faktoren tragen weltweit zu mehr als der Hälfte der Unfruchtbarkeitsfälle bei, und mehrere Studien berichten über signifikante Rückgänge der Spermienparameter in den letzten Jahrzehnten5. Jüngste globale Analysen bestätigen zudem weitreichende Rückgänge der Spermienqualität in mehreren Regionen6. Während Faktoren wie Rauchen, Alkoholkonsum, Strahlung und Chemikalienexposition festgestellte Risiken7 sind, hat sich PM2.5 als zusätzlicher fortpflanzungstoxischer Stoff etabliert, der die Hoden8 anspricht.
Die Hoden sind aufgrund ihrer einzigartigen physiologischen Struktur und kontinuierlichen spermatogenen Aktivität sehr empfindlich gegenüber Umweltgiftstoffen. Frühere Forschungen haben gezeigt, dass eine PM2.5-Exposition Hodenschäden durch mehrere Wege hervorrufen kann, wie oxidativen Stress, entzündliche Reaktionen und die Störung der Blut-Hoden-Schranke9. Diese akuten Effekte zeichnen sich durch eine verminderte Spermienqualität, eine abnormale Hodenhistologie und hormonelle Ungleichgewichteaus. Die meisten Studien konzentrieren sich jedoch auf unmittelbare Verletzungen, sodass die langfristigen oder verzögerten Effekte schlecht charakterisiert sind.
Aktuelle PM2.5-Expositionsmodelle haben inhärente Einschränkungen: Die Ganzkörperinhalation ähnelt die natürliche Exposition, erfordert jedoch spezielle Ausrüstung und fehlt an Dosispräzision11, während intratracheale Instillation eine Dosiskontrolle gewährleistet, aber invasiv ist und die physiologische Partikelablagerung12 nicht repliziert. Unser zeitaufgelöstes intranasales Modell vermeidet diese Nachteile – seine nicht-invasive Verabreichung passt zu den Ablagerungsmustern der oberen Atemwege, ermöglicht eine präzise Dosisregelung und unterstützt langfristige Mehrzeitpunktproben, um verzögerte Verletzungen zu erfassen, die die Kapazität der akut fokussierten traditionellen Modelleübersteigt.
Unsere 5 mg/kg/Tag PM2,5-Dosis entspricht den subakuten Nagetierexpositionsparadigmen, die nachweislich reproduktive Reaktionen hervorrufen, und entspricht durch Körperoberflächenumwandlung einer menschlichen Äquivalentdosis, die ~6-mal höher ist als die Umgebungswerte für die Beschleunigung von Langzeittoxizitätsmanifestationen14. Artenüberlegungen gelten: Während Ratten eine konservierte Hodenphysiologie mit dem Menschen teilen, kann ihr kürzerer spermatogenes Zyklus den Verletzungsfortschritt beschleunigen, der in unseren Zeitpunkten15 beobachtet wurde, und die intranasale Absetzung unterscheidet sich von der menschlichen Ablagerung der unteren Atemwege, obwohl die systemische Toxinverteilung in Hoden bestätigt ist.
Die verzögerten Effekte der Umweltbelastung sind entscheidend für die Bewertung langfristiger Fortpflanzungsrisiken, da sie irreversible Schäden offenbaren können, die in kurzfristigen Beobachtungen nicht erkennbar sind16. Beispielsweise können einige Giftstoffe latente Verletzungen der Hoden verursachen, die sich allmählich manifestieren oder verschlechtern, selbst nach Ende der Exposition, und möglicherweise zu chronischen Fortpflanzungsstörungenführen. Angesichts der Allgegenwart und Persistenz von PM2.5 istes entscheidend zu bestimmen, ob seine Fortpflanzungstoxizität nach der Exposition anhält oder sich verschlechtert.
Anhaltende Entzündungen, oxidativer Stress und beeinträchtigte Reparaturmechanismen sind plausible Treiber verzögerter Wirkungen. Die PM2.5-induzierte Hochregulation von IL-1β, IL-6 und TNF-α kann chronische Entzündungen aufrechterhalten, die Spermatogenese stören und die Keimzellapoptose19 fördern. Schäden an Schlüssel-Übergangsproteinen wie Connexin-43 und Occludin beeinträchtigen die Blut-Hoden-Schranke und können die funktionelle Erholungverhindern. Die Aktivierung des c-Jun N-terminalen Kinase-(JNK)-Weges, eines Vermittlers von Stress und apoptotischer Signalübertragung, wurde ebenfalls in Verbindunggebracht 21.
Trotz der zunehmenden Erkenntnis der Fortpflanzungstoxizität von PM2.5 gibt es eine erhebliche Wissenslücke über die zeitliche Dynamik von Hodenschäden nach Einstellung der Exposition. Konkret bleibt unklar, wie lange die Hodenverletzungen anhalten, ob sie sich im Laufe der Zeit verschlimmern und welche molekularen Wege diese verzögerten Effekte antreiben22. Die Bewältigung dieser Fragen ist entscheidend, um gezielte präventive und therapeutische Strategien zur Minderung von PM2.5-induzierten männlichen Fortpflanzungsschäden zu entwickeln.
Signifikante Lücken bestehen hinsichtlich der Dauer, des Verlaufs und der Mechanismen der PM2.5-induzierten Hodenschäden nach der Expositionsaufhörung. Diese Studie adressiert diese Lücken, indem sie reproduktive Endpunkte bewertet; Histopathologie; Hormonprofile – speziell follikelstimulierendes Hormon (FSH), luteinisierendes Hormon (LH) und Estradiol (E2); Entzündung; Apoptose; und die Expression von Barriereproteinen zu mehreren Zeitpunkten nach der Exposition. Die Ergebnisse geben Einblicke in die langfristigen Fortpflanzungsrisiken von PM2.5 und informieren öffentliche Gesundheitsstrategien zum Schutz der männlichen Fruchtbarkeit.
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Alle Tierverfahren wurden gemäß den institutionellen Vorschriften durchgeführt und vom Tierethikkomitee des Fujian Health College genehmigt (Projektgenehmigungsnummer: DW2024-01).
Sicherheit und gefährliche Abfälle
Giftige Reagenzien, darunter Formalin, Osmiumtetroxid und Chloroform, wurden in einer zertifizierten Abzughaube unter Verwendung geeigneter persönlicher Schutzausrüstung behandelt. Halogenierte organische Abfälle und osmiumhaltige Lösungen wurden in ausgewiesenen Behältern gesammelt und gemäß institutionellen Vorgaben entsorgt. Pentobarbital-Natrium wurde als kontrollierte Substanz protokolliert, und Spitzen wurden während der gesamten Studie sicher behandelt.
PM2.5-Material und Handhabung
Für die Dosierung wurde ein PM2.5-Standardreferenzmaterial verwendet. Nach festgelegten Partikelvorbereitungsverfahren wurde das trockene Pulver in sterilem PBS in der erforderlichen Konzentration suspendiert und unmittelbar vor der Anwendung 10–15 Minuten in einem Wasserbad ohne Tensid soniziert. Funktionierende Aufhängungen wurden jeden Tag frisch vorbereitet. Die Endotoxinwerte wurden mit einem Limulus-Amobozytenlysat-Test bewertet und waren nicht nachweisbar. Bei Bedarf wurden Polymyxin-B-Kontrollen eingebaut, um LPS-gesteuerte Effekte auszuschließen.
Konstruktion von Tiermodellen in vivo
Zweiundsiebzig männliche Sprague-Dawley-Ratten (2 Monate alt, 190 ± 10 g) wurden unter Standardbedingungen untergebracht und in neun Gruppen (n = 8 pro Gruppe) randomisiert, bestehend aus einer Kontrollgruppe, Fahrzeuggruppen bei 24 Stunden, 1, 2 und 4 Monaten sowie PM2,5-exponierten Gruppen zu gleichen Zeitpunkten. PM2.5 wurde intranasal mit 5 mg∙kg-1∙tag-1 in 10-20 μL pro Naris unter leichter Isofluran-Anästhesie einmal täglich für 7 Tage verabreicht. Nach der Verabreichung wurden die Ratten für 1–2 Minuten in Rückenlage gelegt, um das Einatmen zu erleichtern. Die Tiere wurden bis zur Euthanasie zu den festgelegten Zeitpunkten nach der Exposition gehalten, und die Körpermasse wurde für die Berechnung des Organkoeffizienten erfasst. Zu den Endpunkten gehörten Organkoeffizienten, Spermienqualität, Histologie und Ultrastruktur, Serumreproduktionshormone und molekulare Tests.
Morphologie der Fortpflanzungsorgane und Bewertung der Spermienqualität
Hoden und Epididymide wurden unter tiefer Pentobarbitalanästhesie seziert, abgetupft und gewogen, um die Organkoeffizienten zu berechnen. Die Spermien wurden aus der Cauda epididymis durch Zerkleinerung in vorgewärmtem Puffer bei 37 °C entnommen. Die Konzentration wurde mit einem Hämozytometer bestimmt. Die Beweglichkeit wurde durch die Untersuchung von mindestens 200 Spermien über fünf oder mehr nicht überlappende Felder auf vorgewärmten Objektträgern bewertet. Die Morphologie wurde nach Fixierung, Verschmieren und Färbung mit Eosin-Nigrosin oder Diff-Quik bewertet, wobei pro Ratte mindestens 200 Spermien bewertet wurden. Alle Bewertungen wurden blindisiert, und technische Replikate wurden gemittelt, um pro Tier einen Wert zu erhalten.
Histologische und ultrastrukturelle Analyse des Hodengewebes
Die Hoden wurden in 10 % neutral-gepuffertem Formalin fixiert, mit gradiertem Ethanol und Xylen verarbeitet, in Paraffin eingebettet und bei 5 μm für die HE-Färbung sektioniert. Färbte Schnitte wurden systematisch mit zufälliger Stichprobe bewertet, wobei Ausschlüsse für schräge Schnitte, Artefakte oder schlechte Fixierung angewendet wurden. Die Rohrdurchmesser wurden aus orthogonalen Achsen berechnet, und die Epitheldicke an gleichmäßig verteilten Punkten. Die Analysen wurden verblindet, und mindestens 10 Röhren pro Ratte wurden bewertet.
Für TEM wurden kleine Gewebeblöcke in Glutaraldehyd fixiert, in Osmiumtetroxid nachfixiert, dehydriert, mit Harz infiltriert und polymerisiert. Ultradünne Schnitte wurden mit Uranylacetat und Bleicitrat gefärbt und bei 60–120 kV unter konstanten Einstellungen untersucht. Die QC umfasste die Bewertung der Membran- und Mitochondrienintegrität sowie das Vermeiden von Extraktionsartefakten.
Enzymgekoppelter Immunsorbent-Test (ELISA)
Blut wurde unter Betäubung innerhalb eines festen morgendlichen Fensters aus der Bauchaorta entnommen, um die zirkadiane Schwankung zu kontrollieren. Nach Gerinnung und Zentrifugation wurde das Serum aliquotiert und bei −80 °C gelagert. Testosteron, FSH, LH und E2 wurden mittels einer validierten Immunoassay-Plattform quantifiziert. Die Proben wurden doppelt mit geeigneten Kontrollen durchgeführt, und die Genauigkeit der Prüfverfahren entsprach den Spezifikationen der Plattform. Hämolysierte oder lipämische Proben wurden ausgeschlossen.
Echtzeit-quantitative Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR)
Die gesamte RNA wurde aus dem Hodengewebe mittels Phenolchloroform extrahiert und durch Isopropanol-Fällung und Ethanolwäsche gereinigt. Die RNA-Qualität wurde spektrophotometrisch überprüft. cDNA wurde synthetisiert, und RT-qPCR wurde mit farbstoffbasierter Chemie unter Standardzyklischen Bedingungen durchgeführt, gefolgt von einer Analyse der Schmelzkurve. Die Expressionswerte wurden mit der 2−ΔΔCq-Methode auf GAPDH normalisiert.
Western-Blot-Analyse
Proteinlysate wurden im RIPA-Puffer mit Proteaseinhibitoren hergestellt, durch einen BCA-Test quantifiziert und im Lastpuffer denaturiert. SDS-PAGE- und PVDF-Transfer wurden unter kontrollierten Bedingungen durchgeführt. Die Membranen wurden blockiert, mit primären Antikörpern für Connexin-43, Occludin, JNK und GAPDH inkubiert, gefolgt von HRP-konjugierten sekundären Antikörpern. Die Bänder wurden durch Chemilumineszenz nachgewiesen, und die Densitometrie beinhaltete Hintergrundsubtraktion, Normalisierung zu GAPDH und Skalierung zur Kontrollgruppe.
Statistische Analyse
Die Daten wurden als Mittelwert ± SD angegeben. Einweg-ANOVA mit Tukey's Post-hoc-Test oder Student's t-Test wurde, wo angebracht, verwendet, wobei nichtparametrische Daten mit dem Mann-Whitney U-Test analysiert wurden. Ein p-Wert < 0,05 galt als signifikant.
Fertigstellung und Säuberung
Alle gefährlichen chemischen Abfälle wurden erfasst und ordnungsgemäß entsorgt. Rohdaten, einschließlich Instrumentenausgaben und Analysedateien, wurden mit entsprechenden Notizen archiviert, um die Rückverfolgbarkeit sicherzustellen.
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Anhaltende Verschlechterung der männlichen Fortpflanzungsfunktion bei Ratten, gekennzeichnet durch verminderte Spermienqualität und beeinträchtigte Fortpflanzungsorganentwicklung durch PM2,5-Exposition
Um die Auswirkungen von PM2.5 auf die männliche Fortpflanzungsfunktion, Spermienqualität, Koeffizienten der Fortpflanzungsorgane und verwandte Indikatoren zu untersuchen, wurden neun Gruppen männlicher Ratten untersucht. Analysen wurden relativ zum Zeitpunkt von 24 Stunden nach ...
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Kurzzeit-PM2.5-Exposition wurde von einer progressiven, postexpositionellen Verschlechterung der männlichen Fortpflanzungsfunktion über 1–4 Monate gefolgt. Diese Ergebnisse bestätigen eine zeitabhängige Reproduktionstoxizität, die nach Einstellung der Dosierung anhält, und erweitern die vorherigen Beobachtungen der PM2.5-assoziierten Fortpflanzungsstörung23.
Um die Reproduzierbarkeit zu verbessern, standardisierten wir vier Elemente. Er...
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Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären.
Diese Arbeit wurde von der Natural Science Foundation der Provinz Fujian, China, unterstützt (Zuschussnummer: 2023J01170).
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| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 1 % Osmiumtetroxid | TCI, China | O0308 | Für die Postfixation in der TEM-Analyse des Hodengewebes |
| 10 % neutrales Formalin | Solarbio, China | PC0020 | Zur Fixierung von Hodengewebeproben bei der HE-Färbung |
| 2,5 % Glutaraldehyd | Solarbio, China | G1102 | Zur Fixierung von Hodengewebeproben in der TEM-Analyse |
| 75 % Ethanol | Acros Organics, USA | 61509-0040 | Zur Reinigung von ausgefällter RNA in RT - qPCR |
| Automatischer Chemilumineszenz-Imager | Bio-Rad, USA | ChemiDoc | Verwendet zur automatischen Bildgebung chemilumineszenter Signale im Western-Blotting. |
| BCA-Protein-Assay-Kit | Solarbio, China | PC0020 | Zur Bestimmung der Gesamtproteinkonzentration in der Western-Blot-Analyse |
| Blockpuffer | Nicht spezifiziert | T7131A | Verwendet in der Western-Blot-Analyse zur Eliminierung nicht-spezifischer Bindung |
| Chloroform | Acros Organics, USA | 327270010 | Verwendet bei der RNA-Trennung während RT - qPCR |
| Connexin - 43 | Abcam, USA | ab11370 | Erkennt die Expression und Verteilung eines wichtigen Blut-Testis-Barriereproteins, um die Integrität der Barriere zu bewerten |
| ECL-Trikot | Biosharp, China | BL520B | Zur Visualisierung von Proteinbändern in der Western-Blot-Analyse |
| ELISA-Kits (für Testosteron, FSH, LH, E2) | Abcam, Großbritannien | ab108666; ab108702; ab108651; ab108667 | Zum Nachweis von Serum-Fortpflanzungshormonen |
| Eosin | Solarbio, China | G1002 | Verwendet bei der HE-Färbung von Hodengewebe |
| Epoxidharz | Solarbio, China | GP2001 | Zur Einbettung von Hodengewebeproben in der TEM-Analyse |
| GAPDH | Abcam, USA | ab128915 | Bewertet die Apoptose von durch PM2.5 induzierten Hodenzellen und liefert eine morphologische Grundlage für die Untersuchung ihres Einflusses auf die Apoptose der Hodenzellen |
| Hämatoxylin | Solarbio, China | G1077 | Verwendet bei der HE-Färbung von Hodengewebe |
| Bildbildsystem | Nikon, Japan | Nikon DS-U3 | Wird für Bildgebung von Proben unter dem Mikroskop verwendet. |
| Isopropanol | Acros Organics, USA | AC447080025 | Verwendet bei der RNA-Präzipitation während RT - qPCR |
| JNK | Abcam, USA | ab124956 | Untersucht den molekularen Mechanismus der durch PM2.5 verursachten Hodenschäden und identifiziert die Zelltypen, in denen es aktiviert wird. |
| Mikroplattenleser | MOLEKULARE GERÄTE, USA | SpectraMax iD3 | Verwendet zur Erkennung von Signalen in Mikroplatten (z. B. Absorption, Fluoreszenz). |
| Occludin | Abcam, USA | ab31721 | Versteht den Schadensgrad der Blut-Hoden-Schranke und untersucht die Wechselwirkungen zwischen relevanten Proteinen |
| Optisches Mikroskop | Chongqing Opto – Elektronisches Instrument, China | BDS200 | Verwendet für allgemeine optische mikroskopische Beobachtungen. |
| Pathologisches Mikrotom | Shanghai Kaiyu Instrument, China | RM2016 | Wird zum Schneiden von Abschnitten pathologischer Gewebe verwendet. |
| Pentobarbitalnatrium | Solarbio, China | G1102 | Verwendet zur intraperitonealen Injektion bei Ratten vor der Blutentnahme |
| PM2.5 Standardreferenz | Nationales Institut für Metrologie, China | GBW13643 | Für PM2,5-Exposition in der experimentellen Gruppe |
| Polyvinyliden-Difluorid-(PVDF)-Membran | Thermo Fisher, USA | 88585 | Verwendung in der Western-Blot-Analyse für den Proteintransfer |
| PrimeScript RT Reagenz-Kit | TAKARA, Japan | RR037Q | Für cDNA-Synthese in RT – qPCR |
| Echtzeit-PCR-System | Roche, Schweiz | LightCycler 480 | Verwendet für die Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion zur Genexpressionsanalyse. |
| RIPA-Lysepuffer | TAKARA, Japan | RR9161 | Zur Extraktion von Proteinen in der Western-Blot-Analyse |
| Shaker | Thermo, USA | MAXQ-4000 | Verwendet zum Schütteln von Proben in Experimenten. |
| SPSS | IBM, USA | 28 | Für Datenanalyse |
| Sterile Kochsalzlösung | Solarbio, China | S8160 | Verwendung in der Fahrzeuggruppenbehandlung |
| TB Green Premix Ex Taq II Kit | TAKARA, Japan | RR820S | Verwendet in RT - qPCR |
| Transmissionselektronenmikroskop (TEM) | Hitachi, Japan | HT7800/HT7700 | Verwendet für ultrastrukturelle Beobachtungen auf Nanoskala. |
| Trizolreagenz | Ambion, China | 15596018 | Zur Extraktion der Gesamt-RNA in RT - qPCR |
| Ultramikrotom | Leica, Deutschland | Leica UC7 | Verwendet zum Schneiden von ultra-dünnen Schnitten für TEM. |
| Universelles Proteintransfersystem / Proteintransfer-Blot-Maschine | Bio-Rad, USA | Trans-Blot Turbo | Wird für den Proteintransfer im Western Blotting verwendet. |
| Oprechtes optisches Mikroskop | Nikon, Japan | Nikon Eclipse E100 | Verwendet für die oprechte optische mikroskopische Beobachtung. |
| Uranylacetat | Merck, Deutschland | 201030 | Zur Färbung ultradünner Schnitte in der TEM-Analyse von Hodengewebe |
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