Verfahren zur Identifizierung von SARS-CoV-2-Eintrittsinhibitoren als potenzielle antivirale Mittel mittels MLV-basierten Pseudoviren

Zusammenfassung

Dieser Artikel beschreibt die Methodik zur Erzeugung von SARS-CoV-2-Pseudotyp-Partikeln mit einem Luciferase-Reporter-System und deren Anwendung zur Identifizierung von Einstiegsinhibitoren. Diese Protokolle werden mit zwei verschiedenen Entry-Inhibitoren demonstriert, einem rekombinanten humanen ACE2-Fc-Fusionsprotein und der kleinmolekularen Verbindung Arbidol.

Zusammenfassung

Das SARS-CoV-2-Virus ist ein aufkommender, zoonotischer Erreger, der seit seinem Aufkommen im Jahr 2019 weltweit eine enorme Krankheits- und Sterblichkeitslast verursacht hat. Sichere und zugängliche Plattformen zur Bewertung des viralen Eintritts und potenzieller antiviraler Verbindungen bleiben für die fortlaufende Arzneimittelforschung gegen aufkommende Varianten unerlässlich. Dieser Artikel beschreibt ein hochgradig optimiertes Protokoll zur Erzeugung von auf dem Maus-Leukämievirus (MLV) basierenden pseudotypisierten Partikeln, die das SARS-CoV-2-Spike-Protein exprimieren und ein Luciferase-Reporter-Gen tragen, was die Untersuchung des Viruseintritts unter Biosicherheits-Level-2-Bedingungen ermöglicht. Die beschriebenen Methoden beschreiben den Einsatz optimierter Zelllinien, eine hohe Transfektionseffizienz mit kostengünstigen Reagenzien, die Produktion hochwirksamer Pseudoviren und die Titration der Infektivität zur Bestimmung des minimalen viralen Inputs für Screening-Assays. Repräsentative Ergebnisse zeigen eine robuste Luciferase-Aktivität in infizierten Zellen im Vergleich zu nicht-infizierten Kontrollen, während Kontroll-Spike-lose und VSV-G-Pseudoviren die Assay-Spezifität bestätigen. Darüber hinaus unterstützt das System das Compound-Screening, indem es hemmende Effekte beim Viruseintritt quantifiziert und die Zytotoxizität mittels eines MTT-Viabilitätstests bewertet. Insgesamt bietet dieses reproduzierbare und skalierbare Protokoll eine zuverlässige Plattform für das Screening neuartiger viraler Eintrittshemmer mit mittlerer bis hoher Durchsatzgeschwindigkeit, trägt zur Identifizierung antiviraler Kandidaten und zur Weiterentwicklung der Forschung zu SARS-CoV-2-Eintrittsmechanismen bei.

Einleitung

Das Auftreten des Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) Ende 2019 führte zu einer globalen Pandemie, die weltweit Millionen von Todesfällen verursachte und weiterhin durch neue Varianten mit erhöhter Übertragbarkeit und Immunentweichungspotenzial^eine Bedrohung darstellt. Als umhülltes RNA-Virus aus der Familie der Coronaviridae nutzt SARS-CoV-2 sein trimerisches Spike-(S)-Glykoprotein, um den Eintritt in Wirtszellen zu vermitteln, indem es an den Angiotensin-konvertierenden Enzym 2 (ACE2)-Rezeptor bindet und die proteolytische Aktivierung durch TMPRSS2 und andere Wirtsproteasen ^2,3 durchläuft. Obwohl mehrere Behandlungsoptionen zur Behandlung der COVID-19-Symptome entwickelt wurden, unterstreicht die fortschreitende Entwicklung und schnelle Entwicklung viraler Varianten den dringenden Bedarf an sicheren und skalierbaren Systemen zur Untersuchung des Viruseintritts und zur Bewertung neuer antiviraler Verbindungen, die auf diesen frühen Infektionsschritt abzielen⁴.

Das SARS-CoV-2-Virus wird in einigen Gebieten aufgrund seines hohen Übertragungspotenzials weiterhin als Biosicherheits-Faktor 3 Wirkstoff⁵ klassifiziert. Daher erfordert jede replikative Laborarbeit eine hocheindämmende BSL-3-Anlage, was die Fähigkeit der meisten Labore im Feld erschwert, wissenschaftliche Forschung mit diesem Virus durchzuführen. Pseudotypisierte, virenbasierte Systeme, auch bekannt als Pseudoviren (PVs), bieten eine praktische Alternative, die virale Einstiegsstudien in Biosicherheits-Level-2-Laboren (BSL-2) ermöglicht und so die Zugänglichkeit für globale^{Forschungsbesitzungen} erweitert. Die pseudotypisierten Partikel mit dem SARS-CoV-2-Spike-Protein sind nicht replizierend, was sie zu einem sicheren Ersatz macht, um den Viruseintritt zu bewerten und auf Kleinmolekülinhibitoren^zu screenen. Diese Partikel können so konstruiert werden, dass sie ein Luciferase- oder fluoreszierendes Reporter-Gen tragen, was eine schnelle, quantitative Erkennung einer Infektion durch Messung des Reportersignals in infizierten Zellen ermöglicht. Systeme, die auf dem Rückgrat des Mausleukämievirus (MLV) oder Lentivirus basieren, wurden häufig zur Untersuchung des Eintritts von SARS-CoV, MERS-CoV, SARS-CoV-2, Ebolavirus und anderen 8,9,10,11 eingesetzt.

In diesen Protokollen beschreiben wir die Erzeugung von MLV-basierten PVs mit einem Drei-Plasmid-System, basierend auf den Arbeiten von Millet und Whittaker⁸. Zu den verwendeten Plasmiden gehören ein Verpackungsplasmid, das die MLV-Kerngene Gag-Pol (pCMV-MLVgagpol) codiert, ein Transfervektor, der das Reporter-Gen Lucziferase codiert, sowie ein Plasmid, das das SARS-CoV-2-Spike-Glykoprotein exprimiert, das der ursprünglichen Wuhan-Hu-1-Variante entspricht. Zusätzlich werden Pseudoviren auch mit dem G-Glykoprotein des vesikulären Stomatitis-Virus (VSV-G) erzeugt, das später als Gegenscreening potenzieller Treffer verwendet werden kann. Pseudoviren werden in HEK293-abgeleiteten Zellen produziert und eingesetzt, um hochanfällige Zellen zu infizieren, wodurch hACE2 und TMPRSS2 stabil exprimiert werden. Die Transfektionseffizienz wird zunächst mit einem grünen fluoreszierenden Protein (GFP)-exprimierendes Plasmid bewertet. Anschließend werden unter optimierten Transfektionsbedingungen PVs erzeugt, indem diese drei Plasmide ko-transfiziert werden, gefolgt von der Titration der resultierenden Viren. Mit der entsprechenden Menge PVs wird in 96 Well-Platten ein Assay durchgeführt, um Verbindungen zu finden, die das Eindringen der Viren hemmen können. Dieses Protokoll verwendet verzweigtes Polyethylenimin (PEI) als kostengünstiges Transfektionsreagenz, was die Durchführung der Verfahren erleichtert.

Protokoll

1. Hocheffiziente Transfektion von HEK293T-abgeleiteten Zellen mit verzweigtem Polyethyleneimin (PEI)

HINWEIS: Führen Sie alle Schritte in einem Biosicherheitsschrank mit der standardisierten aseptischen Technik und BSL-2-Verfahren durch. Verwenden Sie HEK293T-abgeleitete Zellen zur Transfektion und Erzeugung von pseudotypisierten Viren. Bei dieser Methode werden die Zellen in zellkulturbehandelten 6 Wellplatten transfiziert. Die PEI-Lagerlösung wird wie zuvor von Yang und Kollegen (2017)¹² beschrieben hergestellt. Bevor man mit der Dreifachtransfektion zur Erzeugung des Pseudovirus beginnt, ist es ratsam, das beste PEI-Plasmid-DNA-Verhältnis zu optimieren, um eine hohe Transfektionseffizienz (mehr als 70–80 %) zu gewährleisten. Diese Optimierung sollte durch Transfektion eines grün fluoreszierenden Proteins (GFP)-exprimierendes Plasmids erfolgen und anschließend den Anteil der fluoreszierenden Zellen mit einem Fluoreszenzmikroskop überprüfen. Für diese Optimierung sollte die Plasmid-DNA konstant bei 2,5 μg pro Bohrloch gehalten und mehrere Mengen PEI im Bereich von 1–20 μL getestet werden. Hier sind die besten Bedingungen für diese Zellgruppen und PEI, bestehend aus 5 μL PEI-Stocklösung (1 mg/mL) und 2,5 μg GFP-exprimierendem Plasmid pro Bohrloch in einer 6-Well-Platte.

1. Samen 7,5 x 10⁵ HEK293-abgeleitete Zellen pro Bohrloch in einer 6-Well-Gewebekulturplatte, in einem Gesamtvolumen von 2 mL pro Bohrloch des vollständigen Mediums (DMEM-C: Dulbeccos modifiziertes Eagle's Medium ergänzt mit 10 % hitzeinaktiviertem fetalem Rinderserum (FBS), 20 mM 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonsäure (HEPES), 100 IU/mL Penicillin und 100 μg/mL Streptomycin) 24 Stunden vor der Transfektion.
   HINWEIS: Beim Aussäen von Zellen sollten Sie vermeiden, die Gewebekulturplatte in kreisenden Bewegungen zu bewegen, da dies zu einer Zellaggregation im Zentrum der Bohrungen führen kann, was zu einer unregelmäßigen Zellverteilung und folglich zu einer geringeren Transfektionseffizienz führt. Eine 6-Well-Platte reicht für ein Experiment aus, einschließlich eines Brunnens und einer Zellkontrolle (nicht transfektiert), und der Rest der Platte für die Untersuchung mehrerer Anteile der PEI-Plasmid-DNA.
2. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 37 °C mit 5 % CO₂. Am nächsten Tag stellen Sie sicher, dass die Zellen etwa zu 50-60 % zusammenfließen.
3. Am Tag der Transfektion werden die PEI-Plasmid-DNA-Komplexe in sterilen 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhren vorbereitet.
   1. Für jedes Bohrloch bereiten Sie ein PEI-Lösungsrohr vor, das 5 μL PEI-Material (1 mg/mL) in 50 μL reduziertem Serummedium enthält, und ein DNA-Lösungsrohr mit 2,5 μg des GFP-expressiven Plasmids in 50 μL desselben Mediums.
   2. Wenn mehrere Bohrlöcher transfectiert werden sollen, können Lösungen entsprechend skaliert werden. Jede Röhre kurz im Vortex mischen und dann für 5 Sekunden abdrehen. Röhrchen 10 Minuten bei Raumtemperatur (RT) inkubieren.
4. Während dieser Inkubation wird das Medium vorsichtig aus jedem Brunnen der 6-Well-Platte entfernt, um eine Störung der Zellmonoschicht zu vermeiden. Ersetze vorsichtig durch 1 ml pro Bohrl, vollständiges Transfektionsmedium (DMEM-T, wie DMEM-C, aber ohne Antibiotika).
5. Bereite den Transfektionskomplex vor. Nach der 10-minütigen Inkubation wird die 50 μl des DNA-Lösungsrohrs in das PEI-Lösungsrohr gegeben. Mische schnell, indem du sechs Mal auf und ab pipettiere und genau 3 Minuten bei RT inkubiere. Fügen Sie sofort Komplexe tropfweise den Zellen in jedem entsprechenden Brunnen hinzu.
6. Dichten Sie die Ränder der Platte mit Parafilm ab und zentrifugieren Sie bei 1.000 x g für 30 Minuten bei RT, ohne Bremse, mit einer Schwenkscheibe und einem Scheibenschaufel.
7. Nach der Zentrifugation wird der Parafilm vorsichtig entfernt und die Platte bei 37 °C, 5 % CO₂ für 3 Stunden inkubiert.
8. Nach der Inkubation werden das Transfektionsmedium vorsichtig aus jedem Brunnen entfernt und langsam durch 2 ml vorgewärmtes DMEM-C pro Bohrloch ersetzt.
9. Inkubieren Sie transfektierte Zellen bei 37 °C mit 5 % CO₂ für 48 Stunden.
10. Bewertung der Transfektionseffizienz mittels GFP-Expression mittels Fluoreszenzmikroskopie. Die Frequenz der fluoreszierenden Zellen sollte höher als 70–80 % sein (Abbildung 1). Dies ist entscheidend für die Effizienz der nächsten Methode in Abschnitt 2.

2. Erzeugung von SARS-CoV-2-Spike- und VSV-G-Pseudotyp-Pseudoviralpartikeln

HINWEIS: Diese Methode verwendet dasselbe Verfahren wie Abschnitt 1, mit dem Unterschied, dass statt des GFP-Plasmids die Zellen mit den drei Plasmiden co-transfektiert werden, die zur Erzeugung von pseudotypisierten Viren erforderlich sind, wobei die optimalen Transfektionsbedingungen genutzt werden, um eine hohe Transfektionseffizienz zu gewährleisten. Das Protokoll verwendet außerdem HEK293T-abgeleitete Zellen in 6-Well-Platten, die für die folgenden drei erforderlichen Bedingungen ausreichen: a) nicht transfizierte Zellen (ein Brunnen), b) Zellen, die nur mit dem MLV-Verpackungsplasmid und dem Luciferase-Reporter-Transfervektor transfektiert werden (ein Brunnen; spike-lose Pseudoviren) und c) Zellen, die mit diesen beiden Plasmiden und dem spike-exprimierenden Plasmid transfektiert werden, um SARS-CoV-2-pseudotypisierte Viren zu erzeugen (vier Wellen). Das hier verwendete spike-exprimierende Plasmid kodiert für den Spike des SARS-CoV-2, Wuhan-Stammes, und enthält Sequenzmodifikationen, um eine effiziente Präsentation des Proteins in PVs zu ermöglichen. Das spike-lose Pseudovirus wird später während Infektionen als Kontrolle benötigt, um den spike-abhängigen Eintritt in permissiven Zellen zu validieren. Ähnlich werden VSV-G-PVs mit demselben experimentellen Design erzeugt, um später als Gegenscreening potenzieller inhibitorischer Verbindungen verwendet zu werden. Wenn ein größeres Volumen an Pseudoviren erforderlich ist, kann das Protokoll auf zwei 6-Well-Platten skaliert werden, was auch für den Plattenzentrifugationsschritt praktisch sein kann.

1. Am Tag vor der Transfektion werden Zellen HEK293T abgeleiteten Zellen in zwei 6-Well-Platten ausgesät, wie in Abschnitt 1 beschrieben. Verwenden Sie eine Platte für die Erzeugung von Spike-PVs und die andere für die VSV-G-PVs.
2. Am Tag der Transfektion bereiten Sie die Transfektionsmischungen wie in Tabelle 1 gezeigt, nach Schritt 1.3, vor.
   HINWEIS: PEI-Lösung wird wie zuvor berichtet^{vorbereitet 12}. Die Plasmide pCMV-MLVgagpol und pTG-Luc wurden aus Millet und Whittaker⁸ gewonnen. Plasmid pVSV-G wurde von Gee et al. 2020¹³ gewonnen. Alle Plasmide sollten im Voraus als hochwertige Vorbereitungen und frei von Endotoxinen vorbereitet werden. Es wird empfohlen, kommerziell erhältliche Maxiprep-Kits zu verwenden, mit einem letzten Schritt der sterilen Filtration durch einen niedrigbindenden 0,2 μm Spritzenfilter.
3. Jede Röhre wie in Abschnitt 1 beschrieben mischen und 10 Minuten bei RT inkubieren.
4. Während dieser Inkubation wird das Medium vorsichtig aus jedem Brunnen der 6-Brunnenplatten entfernt, um eine Störung der Zellmonoschicht zu vermeiden. Ersetze langsam durch 1 ml vorgewärmtes DMEM-T-Medium pro Brunnen, wobei das Medium die Wand des Brunnens hinunterläuft und nicht direkt auf die Zellen.
5. Bereite Transfektionskomplexe wie in Abschnitt 1 beschrieben vor und transfektiere Zellen mit dem zuvor beschriebenen Protokoll.
6. Nach der 48-stündigen Inkubation nach der Transfektion werden die Supernatanten gesammelt, in 50 mL sterile konische Zentrifugenröhren übertragen und bei 290 x g für 7 Minuten bei 4 °C zentrifugiert. Sammeln Sie das zellfreie Überdachungsmittel auf und filtern Sie es mit einer sterilen 0,45 μm oberen Flaschenfiltereinheit mit Polyvinylidenfluorid (PVDF). Bereite Aliquots von 1 ml vor und lagere sie bei -80 °C.
   HINWEIS: Pseudotypisierte Partikel bleiben mehrere Monate bei -80 °C stabil. Vermeiden Sie wiederholte Gefrier-Tau-Zyklen, um die Infektivität zu erhalten.

	Für SARS-CoV-2 Spike-PVs (pro Bohrloch)	Für VSV-G-PVs (pro Brunnen)	Für Spike-lose PVs (pro Brunnen)
PEI-Lösung:
PEI (1 mg/ml)1	5 μL	5 μL	5 μL
Reduziertes Serummedium	45 μL	45 μL	45 μL
Plasmid-DNA-Lösung:2
pCMV-MLVgagpol	0,79 μg	0,79 μg	0,79 μg
pTG-luc	0,92 μg	0,92 μg	0,92 μg
pUNO1-Spike	0,79 μg	-	-
pVSV-G	-	0,79 μg	-
Reduziertes Serummedium	bis 50 μL	bis 50 μL	Bis 50 μL

Tabelle 1: Herstellung von Transfektionsmischungen zur Erzeugung von PVs.

3. Titration von SARS-CoV-2- und VSV-G-Pseudotyp-Teilchen

HINWEIS: Dieser Schritt ist unerlässlich, um zu bestätigen, dass die erzeugten pseudotypisierten Partikel infektiös sind und um das minimale effektive Volumen zu bestimmen, das für nachgelagerte Anwendungen wie das Wirkstoffscreening erforderlich ist. Die Titration sollte für jede neue Charge des Pseudovirus durchgeführt werden. Zu diesem Zweck werden Zellen, die sehr anfällig für eine SARS-CoV-2-Infektion (HSI-Zellen) sind, mit abnehmenden Mengen der pseudotypisierten Viren infiziert. Der Eintritt der Pseudoviren, vermittelt durch die Spike-Mensch-ACE2-Interaktion oder durch VSV-G mit anderen zellulären Rezeptoren, wird 72 Stunden später durch den Nachweis der Luziferaseaktivität in einem Lumineszenztest überwacht.

1. Am Tag vor der Transduktion werden 2,5 x 10 HSI-Zellen pro Bohrloch in einer 96-Well-Gewebekulturplatte in 50 μL vollständigem Medium (DMEM-C) gesät. Bereiten Sie für jede Menge des Pseudovirus drei Bohrlöcher vor, um sie zu testen, und fügen Sie Brunnen für Infektionen ein, ebenfalls mit spike-losen Pseudoviren, sowie für nicht infizierte Zellen. Die Platte über Nacht bei 37 °C mit 5 % CO₂ inkubieren.
2. Am Tag der Transduktion taut man von jeder Pseudoviruscharge einen Aliquot auf, um ihn auf Eis zu testen, und mischt ihn sanft durch Inversion. Fügen Sie auch einen Aliquot der spitzenlosen Kontrolle hinzu. Fügen Sie jedem Bohrloch direkt mehrere Mengen der Pseudoviruspräparation hinzu (100, 50, 25, 12,5, 6,2, 3,1, 1,5 und 0,8 μL). Stellen Sie die Volumina aller Wells mit DMEM-C auf 150 μL ein.
3. Dichte die Platte mit Parafilm ab und zentrifugiere bei 2.500 × g für 45 Minuten bei RT, ohne Bremse.
4. Entfernen Sie die Parafilm-Dichtung und inkubieren Sie die Platte 72 Stunden bei 37 °C, 5 % CO₂.
5. Nach der Inkubation bereiten Sie sich auf den Luciferase-Test gemäß den Anweisungen des Herstellers vor. Taue das Luciferase-Substrat auf (bei -80 °C gelagert) und 5-fachen Luciferase-Assay-Lysepuffer (bei -20 °C gelagert) und gleich bei RT (10–15 Min.) aus.
6. Verdünne den Luciferase-Assay-Lysepuffer auf 1x mit sterilem Wasser. Bereite mindestens 3 ml vor.
7. Langsam und vorsichtig aspirieren und entsorgen Sie den Supernatant jedes Brunnens mit einer Mehrkanalpipette.
8. Fügen Sie jedem Bohrloch mit einer Mehrkanalpipette 30 μL 1x Lysispuffer hinzu. Setzen Sie die Platte für 10 Minuten bei 150 U/min in einen Plattenschüttler bei RT. Überprüfen Sie die vollständige Lyse unter einem umgekehrten Mikroskop (alle Zellen sollten lysiert und bei der visuellen Untersuchung nicht erkennbar sein).
   HINWEIS: Bereiten Sie den Mikroplattenleser im Voraus darauf vor, die Lumineszenzerkennung unmittelbar nach der Substratzufügung durchzuführen, um Konsistenz zu gewährleisten und Signalabfall zu vermeiden.
9. Übertragen Sie die Lysate auf eine undurchsichtige, weiße 96-Well-Platte.
10. Fügen Sie jedem Brunnen 50 μL Luziferasesubstrat hinzu und mischen Sie kurz, indem Sie die Platte in einer kreisenden Bewegung bewegen. Setzen Sie die Platte in das Luminometer und messen Sie die Lumineszenz.
11. Analysieren Sie die erhaltenen Daten.
    1. Überprüfen Sie, dass die Regler die erwarteten Lumineszenzwerte liefern. Stellen Sie sicher, dass die nicht infizierten Zellen sehr niedrige Hintergrundlumineszenzwerte liefern.
       HINWEIS: Zellen, die mit dem spike-losen Pseudovirus infiziert sind, sollten Werte auf der Ebene der nicht infizierten Zellen angeben, und Zellen, die mit abnehmenden Mengen des spike-präsentierenden Pseudovirus infiziert sind, sollten hohe, dosisabhängige Lumineszenzwerte zeigen (Abbildung 2). Die von den VSV-G-PVs erzeugten Lumineszenzwerte sind in der Regel deutlich höher als die von Spike-PVs, etwa ein oder zwei Größenordnungen.
    2. Für nachfolgende Screenings wählen Sie die Menge des Pseudoviras aus, die ein Signal erzeugt, das mindestens hundert- bis tausendmal so hoch ist wie die nicht infizierten Zellen.

4. Screening von Verbindungen auf die Hemmung des pseudoviralen Eintritts mittels Spike-PVs

1. Säe 2,5 x 10 HSI-Zellen^{pro Bohrloch} in 50 μL vollständigem Medium (DMEM-C) in einer 96-Well-Platte, wie in Abschnitt 3 beschrieben. Über Nacht bei 37 °C, 5 % CO₂ inkubieren.
   1. Betrachten Sie ein Plattendesign, das die Spalten 1 bis 11 für Verbindungen plus Pseudovirus und Spalte 12 für Kontrollen umfasst. In Spalte 12 werden vier Brunnen zur Virusbekämpfung (nur Pseudovirus) und vier für nicht infizierte, nicht behandelte Zellen zugewiesen.
2. Am nächsten Tag bereiten Sie serielle Verdünnungen (1:3) der zu testenden Verbindungen vor, beginnend bei 50 μM (Endkonzentrationen bei Infektionen: 50, 16,6, 5,5, 1,8, 0,6, 0,2 und 0,06 μM), in DMEM-C mit 0,5 % DMSO.
   1. Zur Bequemlichkeit bereiten Sie Verdünnungen in einer separaten 96-Well-"Verdünnungsplatte" vor, bei der zunächst serielle Verdünnungen durchgeführt und dann (50 μL) auf die Platte mit den Zellen übertragen werden.
   2. Wenn die Anzahl der Verbindungen sehr groß ist, also in der Größenordnung von Hunderten oder mehr, reduzieren Sie diese erste Verdünnungsreihe auf etwa 4 Punkte, wobei pro Verdünnungspunkt ein einzelnes Bohrloch verwendet wird, und betrachten Sie ein Vorscreening. Anschließend werden die Potentialtreffer erneut mit 7-Punkt-Serienverdünnungen 1:3 getestet, mit drei Replikaten, beginnend bei derselben Konzentration von 50 μM.
3. Sobald die Verdünnung der Verbindungen fertig ist, wird das Zellmedium vorsichtig mit einer Mehrkanalpipette aspiriert und 50 μL Verbindungsverdünnungen zu den entsprechenden Bohrlöchern hinzugefügt. Inkubieren Sie 1 Stunde bei 37 °C, 5 % CO₂. Für Steuerungen in Spalte 12 fügen Sie nur DMEM-C hinzu.
4. Ohne die Verbindungen zu entfernen, wird zu jedem Brunnen die vorgegebene Menge des pseudotypisierten SARS-CoV-2-Pseudovirus in einem Volumen von 50 μL vollständigen Mediums hinzugefügt, das die Verbindungen in denselben Konzentrationen enthält. Versiegeln Sie die Platten mit Parafilm.
5. Zentrifugiere die Platte bei 2.500 × g für 45 Minuten bei RT ohne Bremsen, entferne dann den Parafilm und inkubiere bei 37 °C, 5 % CO2_für 72 Stunden.
6. Fahren Sie mit der luciferasebasierten Infektivitätsquantifizierung wie in Abschnitt 3 beschrieben fort.
7. Führen Sie Datenanalysen durch.
   1. Lumineszenzwerte in eine Tabelle exportieren, um die Daten für den späteren Import in Datenanalyse- und Grafiksoftware zu formatieren.
   2. Stellen Sie Balkendiagramme vor, die den Mittelwert jedes Konzentrationspunktes darstellen, einschließlich des Standardfehlers der Mittelbalken. Zeichnen Sie auch die Werte dar, die aus positiven (nur PVs) und negativen Kontrollen (nicht infizierte Zellen) erhalten werden.
      HINWEIS: Die Ergebnisse des Tests gelten als gültig, wenn 1) nicht infizierte Zellen sehr niedrige Werte zeigen, 2) PVs-Kontrollen hohe Werte zeigen, 3) eine positive Kontrolle der Hemmung (d. h. Arbidol oder hACE2-Fc) eine dosisabhängige Hemmung der Infektion zeigt (Abbildung 3A, B).
   3. Anschließend werden die von unbekannten Verbindungen erzeugten Werte beobachtet, um zu beurteilen, ob eine Hemmung vorliegt und ob ein dosisabhängiger Effekt vorliegt. Falls ja, unterziehen Sie diese Verbindungen weiteren bestätigenden Analysen.
      HINWEIS: Für weitere Bestätigungen möglicher Treffer folgen Sie den nächsten Schritten. Testen Sie zunächst die potenziellen Trefferverbindungen erneut, wie in Schritt 4.2 vorgeschlagen. Wenn der Dosis-Antwort-Effekt bestätigt ist, führen Sie ein Gegenscreening mit derselben Verdünnungsserie durch, aber mit den VSV-G-PVs infiziert. Dieser Test ist wichtig, um zu überprüfen, ob die Hemmung des Eintritts spezifisch für die Spike-ACE2-Interaktion ist und nicht auf eine Interferenz in einem anderen späteren Schritt während der Produktion der Luziferase in den infizierten Zellen zurückzuführen ist (Abbildung 3A, B). Hier sollte die positive Verbindung keine hemmende Aktivität gegen die VSV-G-PVs zeigen. Falls dies der Fall ist, sollte dieselbe Konzentrationsreihe auf Zytotoxizität mit einem Zellviabilitätstest (MTT-Assay, siehe Abschnitt 5) getestet werden. Zusammenfassend sollte eine potenzielle Treffersubstanz eine Hemmung von SARS-CoV-2-Spike-PVs aufweisen, keine oder weniger Hemmung von VSV-G-PVs sowie keine oder zumindest eine deutlich schwächere Hemmung der Lebensfähigkeit der Zellen. Die Anpassung einer Dosis-Antwort-Kurve anhand der Lumineszenzdaten ermöglicht die Schätzung der halbmaximalen inhibitorischen Konzentration (IC₅₀) für die Hemmung der PVs und einer halbmaximalen zytotoxischen Konzentration (CC₅₀) aus dem Viabilitätsassay. Das Verhältnis CC₅₀ / IC₅₀ wird verwendet, um den Selektivitätsindex (SI) zu berechnen, der ein wichtiger Indikator für den potenziellen Nutzen der positiven Verbindung ist. Für die Analyse der Dosis-Antwort-Kurven und die Schätzung von IC₅₀ und CC₅₀ wurden sehr detaillierte Verfahren beschrieben:¹⁴.

5. MTT-basierter Zellviabilitätstest

1. Säe 2,5 x 10,⁴ HSI-Zellen pro Bohrloch in 50 μL DMEM-C in einer 96-Well-Platte. Die Platte über Nacht bei 37 °C, 5 % CO₂ inkubieren. Stellen Sie sicher, dass die Zellen am nächsten Tag etwa zu 50 % konfluenziert sind. Bereiten Sie genügend Brunnen vor, wobei alle unterschiedlichen Konzentrationen der zu untersuchenden Verbindung berücksichtigt werden, unbehandelte Zellen und leere Bohrungen, die nur Medium in dreifacher Form enthalten. Testen Sie die potenziellen Trefferverbindungen bei denselben Konzentrationen, die im PV-Eintrittshemmungstest bewertet wurden.
2. Nach der Inkubation wird das Medium vorsichtig entfernt und durch 100 μL vollständiges Medium mit unterschiedlichen Konzentrationen der Verbindung ersetzt, um es in 0,5 % DMSO zu bewerten.
3. Zentrifugieren Sie die Platte bei 2.500 × g für 45 Minuten bei RT ohne Bremsen und inkubieren Sie 72 Stunden bei 37 °C, 5 % CO₂. Dieser Schritt ist enthalten, um die Zellen genau wie im vorherigen Abschnitt zu behandeln, mit Ausnahme der Hinzufügung der PVs.
4. Bereiten Sie eine 0,5 mg/mL MTT-Lösung mit DMEM vor. Sterilisieren Sie durch 0,2 μm Filtern und im Dunkeln bleiben.
   HINWEIS: 3-(4,5-Dimethyl-2-Thiazolyl)-2,5-Diphenyl-2H-Tetrazoliumbromid (MTT) ist lichtempfindlich. Es sollte eingefroren bleiben, im Dunkeln.
5. Entferne das Medium vorsichtig aus jedem Brunnen und ersetze es durch 100 μL MTT-Lösung. Inkubiere 2 Stunden bei 37 °C, 5 %_CO2.
6. Während dieser Inkubation wird eine Solubilisierungslösung mit 40 mM HCl in Isopropylalkohol hergestellt.
7. Entferne die MTT-Lösung vorsichtig mit einer Mehrkanalpipettette, ohne die Formazan-Kristalle am Boden jedes Bohrlochs zu stören.
8. Fügen Sie jedem Bohrloch 100 μL der Lösungslösung hinzu. Wickle die Platte in Alufolie und lege sie für 15 Minuten auf einen Plattenschüttler bei 150 U/min.
9. Rekordabsorption bei 570 nm und 630 nm.
10. Führen Sie Datenanalysen durch.
    1. Mit den Rohwerten der optischen Dichte subtrahieren Sie die bei 630 nm erhaltenen Werte von denen bei 570 nm für jedes Bohrloch. Dann wird die korrigierten Werte der unbehandelten Zellbrunnen gemittelt. Betrachten Sie diese unbehandelten Zellen als 100 % lebensfähig.
    2. Dann normalisiere die Werte der behandelten Zellen mit den Brunnen der unbehandelten Zellen unter Verwendung der Formel:
       Lebensfähigkeit (%) =
11. Darstelle Viabilitätsprozentsätze als Balken, die den Mittelwert der Replikate ±± Standardfehler des Mittelwerts darstellen. Führen Sie weitere statistische Analysen durch, um Gruppen mit Verfahren zu vergleichen, die in einer Datenanalyse- und Grafiksoftware implementiert sind, wobei die Wirksamkeiten bei unterschiedlichen Konzentrationen mit der Kontrolle unbehandelter Zellen verglichen werden.
12. Vergleichen Sie die Mittelwerte jedes Konzentrationspunktes mit denen der nur DMSO-behandelten Zellen mit nichtparametrischem Kruskal-Wallis und Dunn nach dem Test (Unterschiede werden bei p-Werten < 0,05 als signifikant angesehen). Um eine Dosis-Antwort-Kurve zu zeichnen und den CC₅₀ aus OD-Werten zu schätzen, überprüfen Sie das gemeldete Verfahren anderswo¹⁴.

Ergebnisse

Mehrere Transfektionsmethoden wurden als PVs gemeldet, darunter Calciumphosphat¹⁵, lipidbasierte Methoden¹⁶ und PEI, sowohl linear als auch verzweigt. Dieser Artikel zeigt, dass die Transfektion von HEK293T-abgeleiteten Zellen mit verzweigtem PEI eine hocheffiziente Transfektion ermöglicht (Abbildung 1), die üblicherweise mit Transfektionsmethoden mit kommerziell erhältlichen lipidbasierten Transfektionsmitteln...

Diskussion

Diese Vielseitigkeit des MLV-Systems zur Erzeugung von Pseudotypen für andere Viren wurde von anderen wichtigen Viren berichtet, wie Ebola-Virus¹⁸, MERS-CoV⁸, SARS-CoV¹⁹, La Crosse^{Virus 20}, Hantavirus²⁰, Vishna-Virus²¹, Arenavirus²², Influenzavirus²³ und anderen. Diese Pseudotypen waren sehr nützlic...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
0.2 &Mikro; m Low protein-bindende Spritzenfilter	Thermowissenschaftlich	720-1320	Spritzenfilter (0,2 & mu; m,13 mm, PES, steril)
0,25 % Trypsin-EDTA 1X-Lösung	Gibco	25200-056	Trypsin-EDTA (0,25 %), Phenolrot
0,45 &Mikro; m PVDF-Flaschendeckel-Filtereinheiten	Avantor	514-1045	Flaschenverschluss-Vakuumfiltersysteme (PVDF, 250 ml, 50 mm, 0,45 & Mikro; m)
1,5 mL sterile Mikrozentrifugenröhren	Eppendorf	30123611	Safe-Lock  Röhren
100 x Penicillin-Streptomycin-Lösung	Corning	30-002-CI	Penicillin-Streptomycin-Lösung, 100x
5 X Luciferase-Assay-Lysepuffer	Promega	E2650	Teil des Promega Bright-Glo Luciferase Assay System
50 mL sterile konische Röhren	Corning	352070	50 mL hochklares PP-Zentrifugenrohr, konischer Boden, steril
6-Well-Gewebekulturplatten	Thermowissenschaftlich	140675	Zellkulturbehandelte Multidishes
96-Well-Gewebekulturplatten	Thermowissenschaftlich	168055	Nunk und Handel; MicroWell™ 96-Well, Nunclon Delta-behandelte, flache Mikroplatte
Arbidolhydrochlorid	Sigma-Aldrich	SML0860
Verzweigtes Polyethylenimin, 25 kDa	Sigma-Aldrich	408727
Konfokales Lasermikroskop   (FV 3000)	Olympus Co.	SKU: FV3000
Dimethylsulfoxidid (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418
DMEM (Dulbeccos modifiziertes Adlermedium) mit: hohem Glukosespiegel, L-Glutamin, Phenolrot, Natriumpyruvat)	Gibco	11995-065
Fetales Rinderserum (FBS)	Gibco	26140-079	Hitzeinaktiviert (56°F; C, 30 min.)
HEK293T-abgeleitete Zellen (Lenti-X 293T-Zelllinie)	Takara-Biografie	632180	Hoch transfektierbarer Subklon der HEK293-Zelllinie und unterstützt hohe Mengen an viraler Proteinexpression
HEPES-Puffer	Gibco	15630-080
Hochanfällige Zellen für eine Infektion (293T-ACE2. TMPRSS2 (mCherry) Zelllinie)	BEI-Ressourcen	NR-55293	HEK293T Zelllinie modifiziert, um ACE2 und TMPRSS2 stabil auszudrücken
Salzsäure & nbsp;	Sigma-Aldrich	H1758-500ML
Invertiertes Phasenkontrastmikroskop	Olympus Co.	SKU: 2404040005
Isopropanol	Sigma-Aldrich	I9516-500ML
Luciferase-Substrat	Promega	E2650	Teil des Bright-Glo Luciferase-Assay-Systems
Mikroplattenleser mit Lumineszenzdetektion	Agilent BioTek	BTH1MG
MTT [3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazoliumbromid]	Sigma-Aldrich	M2128
Undurchsichtige weiße 96-Well-Platten	Corning	3917	96-Well-Solid-White-Flat-Bottom-Polystyrol-TC-behandelte Mikroplatten
Parafilm	Bemis	PM999
pcDNA3-EGFP-Plasmid	Addgene	13031	pcDNA3-EGFP war ein Geschenk von Doug Golenbock (Addgene Plasmid # 13031 ; http://n2t.net/addgene:13031 ; RRID:Addgene_13031)
pCMV-MLVgagpol-Plasmid	-	-	Freundlicherweise gespendet von Dr. Gary Whittaker
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung ohne Ca2+ und Mg2+ (PBS)	Corning	21-040-CV	Phosphatgepufferte Kochsalzlösung, 1x ohne Kalzium und Magnesium
Promega PureYield Plasmid Maxiprep System	Promega	A2393
pTG-Luc-Plasmid	-	-	Freundlicherweise gespendet von Dr. Gary Whittaker
pUNO1-SARS-CoV-2 Spike (Wuhan) Plasmid	Invivogen	p1-Spike
pVSV-G-Plasmid	Addgene	138479	pVSV-G war ein Geschenk von Akitsu Hotta (Addgene Plasmid # 138479 ; http://n2t.net/addgene:138479 ; RRID:Addgene_138479)
Rekombinantes humanes ACE2-Fc-Fusionsprotein	Invivogen	fc-hace2
Reduziertes Serummedium (Opti-MEM)	Gibco	31985-070	Opti-MEM reduziertes Serummedium