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Methodenartikel

Untersuchung der Glykolyse in primären Mikroglia mittels extrazellulärem Flussassay

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DOI:

10.3791/69638

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10. April 2026

 , 
1Division of Biomedical Sciences, Faculty of Medicine, Memorial University of Newfoundland

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine kosteneffiziente Methode zur Durchführung eines Glykolyse-Stresstests zur Quantifizierung der metabolischen Umprogrammierung in primären Maus-Mikroglia. Nach Isolierung und entzündlicher Stimulation wird die extrazelluläre Versauerungsrate (ECAR) mit frisch hergestellten, pH-angepassten Reagenzien gemessen, gefolgt von einer Proteinnormalisierung, um eine genaue und reproduzierbare Bewertung glykolytischer Verschiebungen zu ermöglichen.

Zusammenfassung

Mikroglia, die ansässigen Makrophagenzellen des zentralen Nervensystems, verändern ihre Stoffwechselprogramme dynamisch als Reaktion auf physiologische und pathologische Signale. Das Verständnis dieser Stoffwechselverschiebungen ist entscheidend, um ihre Rolle bei Entzündungen zu klären. Hier präsentieren wir ein detailliertes Protokoll zur Bewertung des glykolytischen Profils primärer Mikroglia, die aus neonatalen Maushirnkortex isoliert wurden, mittels eines Glykolyse-Belastungstests auf einem extrazellulären Flussanalysator. Dieser Test ermöglicht die Echtzeitmessung von ECAR, einem Indikator für glykolytische Aktivität im Zusammenhang mit niedrigem pH-Wert wie Laktat. Unser Ansatz besteht darin, kultivierte Mikroglia unter verschiedenen Bedingungen zu behandeln, um zu untersuchen, wie sich die Stoffwechselwege als Reaktion auf verschiedene Reize, einschließlich proinflammatorischer Reize, verändern. Einzigartig bereitet unser Labor frische Lagerlösungen verschiedener Reagenzien her, darunter Glukose, Oligomycin und 2-Deoxyglucose (2DG), um die verschiedenen Aspekte des Weges gezielt anzusprechen, wobei der pH-Wert für jedes Reagenz sorgfältig angepasst wird, um experimentelle Genauigkeit und Reproduzierbarkeit sicherzustellen. Diese Methode bietet eine robuste Grundlage zur Untersuchung der Glykolyse in primären Mikroglia und bietet Einblicke in deren Funktionszustände unter entzündlichen oder krankheitsrelevanten Bedingungen.

Einleitung

Zellen im zentralen Nervensystem verändern ihre Energieproduktion als Reaktion auf normale und Krankheitszustände 1,2. Zu den wichtigsten metabolischen Signalwegen gehören Glykolyse und oxidative Phosphorylierung (OXPHOS) zu den wichtigsten Signalwegen, die die Funktionen der Immunzellen regulieren – sie durchlaufen entweder eine robuste und unmittelbare Reaktion auf proinflammatoriske bzw. entzündungshemmende Erkrankungen 3,4. Daher können Immunzellen als Reaktion auf Entzündungssignale zwischen Stoffwechselwegen wechseln und funktionelle Zustände5. Mikroglia sind, wie ihre myeloiden Gegenstücke, metabolisch an ihre Funktionen gebunden und passen sich schnell an verschiedene Signalwege als alternativer metabolischer Treibstoff an, was die metabolische Flexibilität 6,7 zeigt. Mikroglia durchlaufen während der Entzündung eine schnelle metabolische Umprogrammierung, wobei die verbesserte Glykolyse als zentrales metabolisches Signatur pro-inflammatorischer Zustände8 dient. Daher ermöglichen Tests, die die zelluläre Abhängigkeit von einem metabolischen Phänotyp identifizieren, die Untersuchung ihrer funktionellen Zustände unter verschiedenen Bedingungen. Im aktuellen Protokoll wollen wir feststellen, ob primäre Mikroglia während proinflammatorischer Erkrankungen auf erhöhte Glykolyse angewiesen sind. Dafür führen wir routinemäßig Glykolyse-Belastungstests durch. Während der Seahorse XFe24-Analysator (extrazellulärer Flussanalysator) weit verbreitet zur Messung von ECAR in immortalisierten Zelllinien und transformierten Zellen verwendet wurde, stellen primäre Mikroglia einzigartige technische Herausforderungen dar, darunter begrenzte Zellausbeute, variable Adhärenzeigenschaften und hohe Empfindlichkeit gegenüber Kulturbedingungen, die die Stoffwechselmessungen erschweren können. Darüber hinaus ermöglicht es eine Echtzeitmessung von ECAR, was eine präzise Bewertung der laktatgetriebenen Glykolyse an mehreren Zeitpunkten ermöglicht, die nicht allein durch Endpunkt-Laktattests erfasst werden kann. Extrazelluläres fluxbasiertes Stoffwechselprofiling wurde in der Stoffwechselforschung weit verbreitet verwendet, um zellbiologische Energetik zu charakterisieren, was dieses Protokoll gut geeignet für Studien zur Untersuchung von Stoffwechselverschiebungen in Zellen während der Aktivierung, Krankheitsmodellierung oder Arzneimitteltests macht. Leser können die Eignung anhand ihres Bedürfnisses an dynamischen, hochauflösenden glykolytischen Messungen in Primärzellen beurteilen.

Glukose wird durch Glykolyse zu Pyruvat umgewandelt und dann entweder in Laktat im Zytoplasma oder in Mitochondrien zu CO₂ und Wasser umgewandelt. Die Umwandlung von Glukose in Laktat führt zur Freisetzung von Protonen in den extrazellulären Raum, was zu einer Versauerung des Mediums führt. Der extrazelluläre Flussanalysator quantifiziert diese Versauerung als ECAR9. Im Glykolyse-Stresstest werden die Zellen zunächst in einem glukose- und pyruvatfreien Medium inkubiert, und ihr Ausgangs-ECAR wird erfasst. Die erste Injektion liefert eine sättigende Menge Glukose, die die Zellen über Glykolyse zu Pyruvat metabolisieren, wodurch ATP, NADH, Wasser und Protonen produziert werden. Die erhöhte Protonfreisetzung erhöht ECAR und spiegelt die 'Glykolyse' wider. Anschließend wird Oligomycin hinzugefügt, um die mitochondriale ATP-Synthese zu hemmen und zwingt die Zellen, sich ausschließlich auf die Glykolyse zu verlassen. Diese Änderung des Protonengradienten erhöht das ECAR weiter und wird als maximale glykolytische Kapazität der Zelle gemessen. Schließlich wird 2DG, ein Glukose-Analogon, eingeführt. Es hemmt die Hexokinase kompetitiv, blockiert die Glykolyse und reduziert das ECAR. Dieser Rückgang bestätigt, dass das vorherige ECAR glykolyseabhängig war. Der Unterschied zwischen der maximalen glykolytischen Kapazität und dem Glykolyseniveau definiert die glykolytische Reserve. Das anfängliche ECAR vor der Glukosezugabe stellt eine nicht-glykolytische Versauerung durch andere zelluläre Prozesse dar (Abbildung 1).

Wir führten einen Glykolyse-Belastungstest mit dem extrazellulären Flussanalysator durch. Die rohen ECAR-Werte wurden zur Analyse in Excel exportiert. Für jede Erkrankung identifizierten wir die Zeitpunkte, die dem basalen ECAR (vor der Glukosezufügung), der Glykolyse (nach der Glukoseinjektion) und der glykolytischen Kapazität (nach der Oligomycinbehandlung) entsprechen. ECAR-Werte aus den relevanten Zeitpunkten innerhalb jeder Phase und über die vier technischen Replikate hinweg wurden gemittelt, und die Glykolyse wurde als Anstieg des ECAR nach Glukosezusatz berechnet. Die glykolytische Kapazität wurde als Anstieg des ECAR nach Oligomycin-Zugabe berechnet. Die glykolytische Reserve wurde als Abnahme des ECAR nach der 2DG-Injektion berechnet. Diese Durchschnittswerte wurden dann verwendet, um metabolische Reaktionen zwischen den Gruppen zu vergleichen.

Andererseits ist der mitochondriale Belastungstest (Agilent) zur Beurteilung der Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) und zur Bewertung mitochondrialer Funktionen der Standardansatz, der Parameter wie basale Atmung, ATP-gebundene Atmung, Protonenleck, maximale Atmung, Reserve Respiratory capacity und nicht-mitochondriale Atmung misst. Diese Messungen werden durch sequentielle Injektion spezifischer mitochondrialer Inhibitoren, Oligomycin (ATP-Synthaseinhibitor), FCCP (Carbonylcyanid-4 (Trifluoromethoxy) Phenylhydrazon), einem Entkoppler zur maximalen Atmung und Rotenon/Antimycin A (komplexe I/III-Inhibitoren) erhalten, was eine quantitative Bewertung der mitochondrialen Gesundheit und Bioenergetikaermöglicht.. ECAR- und OCR-Assays werden daher unter unterschiedlichen Bedingungen durchgeführt.

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Protokoll

Alle Tierverfahren wurden gemäß den Richtlinien des Canadian Council on Animal Care durchgeführt und erhielten die Genehmigung des Animal Care Committee der Memorial University of Newfoundland gemäß Protokollnummer 22-01-DK.

1. Vorbereitungen vor Beginn der Experimente

  1. Bereiten Sie die Dissektionslösung vor, indem Sie 10 mM HEPES zu 1x HBSS ohne Ca2+ und Mg2+ hinzufügen.
  2. Bereiten Sie die Verdauungslösung (pro 2–3 Gehirne) vor, indem Sie 1 ml 2,5 % Trypsin (10-fach Lager, unverdünnt), 2 ml Dissektionslösung und 200 μL DNase I (1 mg/mL) kombinieren.
  3. Bereite gemischte Glia-Medium vor, indem du DMEM mit 10 % FBS, 1x Glutamax und 1x Antibiotikum/Antimykotikum supplementierst.
  4. Bereite Mikroglia-Medium vor, indem du DMEM mit 10 % FBS, 1x Glutamax, 1x MEM NEAA, 1x Natriumpyruvat und 1x Penicillin/Streptomycin supplementierst.

2. Beschichtung für gemischte Gliakulturen (Abbildung 2A)

  1. Am ersten Tag:
    1. Entnehmen Sie postnatale Tages-P2-Welpen von C57BL/6C-Mäusen, entnehmen Sie die Kortex mit einem Stereomikroskop und entfernen Sie die Meningen. Anschließend werden die Kortex in winzige Stücke in einer Sektionslösung zerlegt und in ein 15-mL konisches Rohr übertragen. Lassen Sie das Gewebe am Boden des Rohrs absinken.
    2. Dekantieren Sie die Sektionslösung und ersetzen Sie sie durch 3 ml Verdauungslösung pro 2–3 Gehirne. Triturieren Sie vorsichtig mit einer 2-ml-serologischen Pipette, um das Gewebe zu dissoziieren.
    3. Platzieren Sie die Röhren auf einen Rotor in einem Inkubator bei 37 °C und mischen Sie alle 8 Minuten mit einer 2-ml-serologischen Pipette durch Trituration, insgesamt etwa 24 Minuten.
    4. Nach der Gewebeverdauung zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 x g für 5 Minuten bei Raumtemperatur (RT). Anschließend entsorgt man den Überstandsstoff und suspendiert den Pellet in 5 ml gemischtem Glia-Medium.
    5. Mit einer 18-G-Nadel in einer 5-mL-Spritze triturieren Sie die Zellen und führen Sie sie dann durch ein 70 μm Nylonzellsieb. Zentrifugiere die gesammelten Zellen erneut bei 300 x g für 5 Minuten bei RT.
    6. Zunächst wird das Pellet in 1 ml gemischtes Gliamedium wieder suspendiert und mehrmals trituriert, um Zellverklumpungen zu entfernen, und dann erneut in einem größeren Volumen wieder suspendiert, sodass bis zu 12 ml pro T75-Kolben enthalten werden (2–3 Hirnkortex pro Kolben werden empfohlen)
      HINWEIS: Eine Beschichtung der Flasche mit Poly-D-Lysin oder einem anderen Reagenz ist nicht erforderlich.
  2. Am zweiten Tag wechselst du das gesamte Medium und fügst frisches, gemischtes Glia-Medium hinzu.
  3. Am dritten Tag ersetzen Sie etwa zweiDrittel des Mediums durch frisches, gemischtes Glia-Medium. Lassen Sie die Zellen weitere sieben Tage wachsen, insgesamt 10 Tage.
    HINWEIS: An diesem Punkt kann eine Astrozytenschicht beobachtet werden.
  4. Am Tag 6 ersetzen Sie zwei Drittel des Mediums durch frisches, gemischtes Gliamedium. Bestätigen Sie das Vorhandensein einer konfluenten Astrozytenschicht.

3. Erhalt der reinen primären Mikroglia (Abbildung 2A)

HINWEIS: Um Tag 10 sind kleine, runde Zellen, die auf der Astrozytenschicht schwimmen, sichtbar; diese sind überwiegend Mikroglia (Abbildung 2B).

  1. Schütteln Sie den Kolben bei 250 U/min für 2 Stunden bei 37 °C. Sammeln Sie das gesamte Medium mit den schwimmenden Zellen in ein 15-mL konisches Rohr und zentrifugieren Sie bei 300 x g für 10 Minuten.
  2. Das Pellet in Mikroglia-Medien wieder suspendieren und etwa 250.000 Zellen pro Bohrloch in den Zellkultur-Mikroplatten des extrazellulären Flussanalysators aufblasen.
    HINWEIS: Etwa 3–4 Millionen Zellen pro ml werden aus drei T75-Kolben gewonnen; Die Beschichtung der Zellkulturplatten mit Poly-D-Lysin oder anderen Reagenzien ist keine Voraussetzung.
  3. Inkubieren Sie die Mikroplatte bei 5 % CO2für 30–45 Minuten. Danach wird das Medium erneut gewechselt, um eine reine Mikroglia-Kultur zu erhalten und eventuelle noch schwimmende Oligodendrozyten zu entfernen. Die Zellen sind bereits am nächsten Tag bereit für die Behandlung (Abbildung 2C).
  4. Schließen Sie die vier als 'Hintergrundkontrollen' bezeichneten Wells aus der Zellaussetzung aus: jeweils einen in jeder Zeile (Abbildung 3C). Diese Brunnen erhalten Prüfmittel.
    HINWEIS: Füllen Sie die ungenutzten Brunnen mit sterilem Wasser oder PBS, um die Verdunstung der Medien zu verhindern, und verplatten Sie die Zellen in einem zufälligen Muster statt in festen Reihen oder Spalten, um die plattenbasierte Variabilität zu minimieren.

4. Behandlung primärer Mikroglia mit proinflammatorischen Reizen

  1. Am 11. Tag behandeln Sie die Zellen mit 100 ng/mL Lipopolysaccharid (LPS) für 24 Stunden. Randomisiere Kontroll- und LPS-behandelte Brunnen, um Positionseffekte auszuschließen.
    HINWEIS: Die Behandlungsdauer kann je nach experimentellen Bedingungen variieren und erfordert eine vorherige Optimierung.

5. Vorbereitung auf den extrazellulären Flusstest einen Tag vor Durchführung des Experiments

  1. Am Tag 11 wird in allen Bohrlöchern 1 mL-Kaliberpuffer auf die Kalibrierungsplatte (24-Brunnen-Format; extrazelluläres Flussassay-Kit) hinzugefügt. Lassen Sie den Teller über Nacht bei 37 °C ohneCO2 aufbewahren.
    HINWEIS: Die Kalibrierungsplatte besteht aus 4 Injektionsbohrungen. Für den Glykolyse-Stresstest wird Glukose an Port A gegeben, Oligomycin an Port B und 2DG in Port C injiziert (siehe Abbildung 4A).
  2. Bereite Glukose- und 2DG-Lagerlösungen vor
    1. Glukose – 90 mg Glukose in 2 ml extrazelluläres Fluss-Testmedium auflösen (Materialtabelle). Zunächst in etwa 1,9 ml auflösen, sodass bei der Anpassung des pH-Werts am nächsten Tag mit 1N NaOH das Endvolumen 2 ml nicht überschreitet, was entscheidend ist, um die Molarität aufrechtzuerhalten.
    2. 2DG – 328 mg in 2 mL extrazelluläres Flux-Assay-Medium auflösen.
      HINWEIS: Lagere sowohl die Glukose als auch die 2DG über Nacht bei 4 °C
  3. Verwenden Sie 30–40 ml Prüfmedium in einem 50 ml konischen Rohr und lagern Sie bei 4 °C für die Durchführung der Tests am nächsten Tag.

6. Extrazellulärer Flusstest (Tag 12)

  1. Am 12. Tag erwärmen Sie die vorgefertigte Glukose 2DG und die alizitierten Prüfmedien bei 37 °C. Passen Sie den pH-Wert von Glukose und 2DG sowie den der aliquotierten Prüfmedien auf 7,4 an, indem Sie 1N NaOH in Schritten hinzufügen (z. B. 5 μL, dann 10 μL).
  2. Vortex kurz zur gleichmäßigen Mischung, bis der pH-Wert über 7 liegt.
    HINWEIS: pH-Indikatorstreifen werden für eine konsequente pH-Überwachung empfohlen.
  3. Fügen Sie 2 μL Standardlösung von 10 mM Oligomycin in 2 mL pH-angepasstes Testmedium hinzu.
    1. Herstellungslösung von 10 mM Oligomycin: Rekonstituiert ein 10 mg Fläschchen Oligomycin in 1 ml sterilem DMSO, wobei eine Konzentration von 10 mg/ml erreicht wird, und bei -80 °C bis zur weiteren Verwendung gelagert wird.
  4. Entnehmen Sie die Zellen aus dem Inkubator (ab Schritt 4) und sammeln Sie das Medium in 1,5-mL-Mikrozentrifugenröhren und zentrifugieren Sie bei 300 x g für 5 Minuten.
  5. Sammeln Sie das Supernatant ein (entsorgen Sie das Pellet, um Zellen/Ablagerungen zu entfernen) und lagern Sie es bei -80 °C für die Laktatmessungen, wie in Schritt 8 erwähnt.
  6. Waschen Sie die Zellen sehr vorsichtig mit 1 ml pH-angepasstem Testmedium, um ein Abheben der Zellen zu vermeiden.
  7. Entsorgen Sie das Prüfmedium und fügen Sie 500 μL pH-angepasstes Prüfmedium hinzu und inkubieren Sie bei 37 °C (ohneCO2) für 45 Minuten bis 1 H.
  8. In der Zwischenzeit fügen Sie alle erforderlichen Inhibitoren an die Kalibrierungsplatte des extrazellulären Flussanalysators in ihren jeweiligen Ports hinzu – 55 μL Glukose an Port A oben links in allen Wells, 60 μL Oligomycin in Port B an den oberen rechten Wells und 65 μL 2DG in Port C an den unteren linken Wells (einschließlich Hintergrundwellen) (siehe Abbildung 4A).
    HINWEIS: Die Volumenerhöhung bei jedem Schritt ist erforderlich, um die Molarität aufrechtzuerhalten, da die Volumina mit der vorherigen Zugabe von Glukose und Oligomycin zunimmt.
  9. Nach dem Hinzufügen der Inhibitoren richten Sie einen Glykolyse-Stresstest mit der Agilent Seahorse Wave-Software ein (siehe Abbildung 3). Dann führe ich die Kalibrierungsplatte aus, sobald sie aufgefordert wird.
    HINWEIS: Entfernen Sie die obere Abdeckung von der Platte und die rosa Abdeckung zwischen den Platten, bevor Sie die Kalibrierungsplatte in die Maschine einsetzen. Während dieses Schrittes werden die pH-und O2-Sensoren getestet und die Qualitätskontrolle überprüft.
  10. Sobald die Kalibrierung abgeschlossen ist, fordert die Maschine auf, die Kalibrierungsplatte zu entladen und die Kulturplatte zu laden.
    1. Schritt I: Wählen Sie die Prüfvorlage aus (Abbildung 3A)
      1. Öffnen Sie die Wave-Software und wählen Sie im Bereich Vorlagen die passende Testvorlage für das Experiment aus.
      2. In diesem Fall wählen Sie "XF Glycolysis Stress Test" auf dem extrazellulären Flussanalysator.
    2. Schritt II: Gruppen und Injektionsstrategien definieren (Abbildung 3B)
      1. Gehe zum Reiter Gruppendefinitionen und erstelle experimentelle Gruppen (z. B. Hintergrund, Steuerung und LPS).
      2. Definieren Sie die Injektionsstrategie , indem Sie die zu injizierenden Verbindungen in jedem Port auswählen (z. B. Glukose, Oligomycin, 2DG für den Glykolyse-Stresstest; diese Einstellungen sind standardmäßig von der Software voreingestellt, überprüfen Sie entsprechend).
    3. Schritt III: Gruppen der Plattenkarte zuweisen (Abbildung 3C)
      1. Öffnen Sie die Plattenkartenansicht und weisen Sie jeder Gruppe Bohrungen zu, indem Sie die Gruppennamen (z. B. Hintergrund = schwarz, Control = grün, LPS = rot) auf das Plattenlayout ziehen.
      2. Stellen Sie sicher, dass leere/hintergründige Brunnen für eine genaue Normalisierung vorgesehen sind.
    4. Schritt IV: Protokoll einrichten (Abbildung 3D)
      1. Unter dem Reiter Protokoll programmieren Sie die Messzyklen und Injektionen. Typische Sequenz für den Glykolyse-Stresstest umfasst nichtglykolytische Versauerung, Injektion von Glukose (Port A) → die Glykolyse misst, Injektion von Oligomycin (Port B) → die glykolytische Kapazität, Injektion von 2-DG (Port C) → Messung der glykolytischen Reserve
      2. Definieren Sie die Anzahl der Messzyklen nach jeder Injektion und passen Sie das Timing an (z. B. 3 Zyklen mit 3-minütiger Mischung, 2 Minuten Wartezeit, Messen für 3 Minuten).
        HINWEIS: Für unsere Experimente verwenden wir die Standardeinstellungen der Software.
      3. Überprüfen Sie die gesamte Prüfzeit, bevor Sie den Assay durchführen.
    5. Schritt V: Normalisierung (Abbildung 3E)
      1. Normalisieren Sie Daten mit Proteinkonzentrationswerten, die aus dem Bicinconininsäure-(BCA)-Test in der Wave-Software gewonnen werden, mithilfe der integrierten Normalisierungsoption (z. B. nach Proteingehalt, Zellzahl oder anderen verfügbaren Methoden). Proteinkonzentrationsmessungen sind in Tabelle 1 dargestellt.
        HINWEIS: Das Protokoll zur Isolierung des Proteins für den BCA-Test nach ECAR-Messung wird im folgenden Schritt 7 beschrieben.

7. Sammlung von Zellen zur Datenquantifizierung und Normalisierung

  1. Sobald der extrazelluläre Flusstest abgeschlossen ist, entferne die Kulturplatte und beginne entweder sofort mit der Proteinextraktion oder lagere die Platte bei -80 °C, bis sie bereit zur Proteinextraktion ist.
    HINWEIS: Protein-Assays ermöglichen es uns, Werte über verschiedene Behandlungsbedingungen hinweg zu normalisieren (sie sind eine der Methoden zur Normalisierung der Daten, nicht die einzige).
  2. Zur sofortigen Proteinisolierung wird das Prüfmedium aus den Bohrlöchern entfernt und einmal mit 500 μL RT PBS (1x) gewaschen (eine sanfte Ein-Spülung wird empfohlen, um die Störung der Zellmonoschicht zu minimieren).
  3. Um Zellen zu sammeln, die sich während dieses Prozesses ablösen könnten, zentrifugieren Sie die Platte einmal bei 300 × g für 5 Minuten, entsorgen Sie das PBS und setzen Sie das resultierende Pellet erneut in den RIPA-Puffer, um eine genaue Gesamtproteinmessung sicherzustellen.
  4. Fügen Sie etwa 75–100 μL RIPA-Puffer zu jedem der Brunnen hinzu und legen Sie die Platte für 30 Minuten (RT) auf einen Shaker (niedrige bis mittlere Rotation). Anschließend wird der Inhalt in ein frisches 1,5-ml-Mikrozentrifugenrohr übertragen.
    HINWEIS: Triturieren und gut innerhalb der Bohrungen mischen, bevor der RIPA-Puffer in das 1,5-ml-Mikrozentrifugenrohr übertragen wird.
  5. Inkubieren Sie das Mikrozentrifugenröhrchen etwa 30 Minuten auf einem Rotator bei RT zur richtigen Zelllyse. Während dieser Zeit wird die Zentrifuge auf 4 °C vorgekühlt.
  6. Zentrifugieren Sie das Zelllysat bei 16.000 x g für 15 Minuten bei 4 °C. Entsorge das Pellet, da es Zellreste enthält.
  7. Sammeln Sie das Supernatant zur Proteinquantifizierung mit dem BCA-Test (oder einer anderen bevorzugten Methode). Entweder werden Sie sofort fortgesetzt oder lagern Sie die Lysate nach Entfernung aller Prüfmedien bei -20 °C (für Kurzzeitlagerung) oder -80 °C (für Langzeitlagerung).
  8. Beim Neustart nach der Lagerung der Proben bei -20 °C oder -80 °C tauen Sie sie etwa 20–30 Minuten auf Eis, lassen Sie sie kurz vortexen/drehen und setzen Sie dann das Standard-BCA-Protokoll fort.
  9. Alternativ können Sie die Zellen pro Bohrloch mit einem Hämozytometer oder einem Durchflusszytometer zählen und in die Normalisierungsstrategien integrieren. In diesem Fall fügen Sie unmittelbar nach Abschluss des Tests und dem Entfernen des Prüfmediums etwa 100–200 μL Trypsin (vorgewärmt auf 37 °C) hinzu und inkubieren Sie bei 37 °C für 5 Minuten. Sammeln Sie die Zellen, indem Sie 100–200 μL 10 % FBS hinzufügen, um die Wirkung von Trypsin zu neutralisieren.
    1. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 x g für 5 Minuten, entfernen Sie das Supernatant und suspendieren Sie das Pellet in etwa 1 ml von 10 % FBS, bevor Sie mit einem Hämozytometer zählen. Alternativ können die Zellen mit 4 % PFA für 15 Minuten fixiert werden, bevor mit der flowzytometriebasierten Zellzählung fortgesetzt wird.
      HINWEIS: Wenn Sie sofort mit der Zellzählung beginnen, ist eine PFA-basierte Fixierung nicht erforderlich.
  10. Normalisieren Sie ECAR-Werte mit der Proteinkonzentration aus Schritt 7.8 oder Zellzählungen aus Schritt 7.9.1 in jedem Bohrloch mit der Wave-Software wie in Schritt 6.10.5.1. Die resultierenden Werte sind die normalisierten Werte für den Glykolyse-Stresstest-Test.
  11. Generiere die Ergebnisse und den Graphen mit der Option "Export", gefolgt von der Option "Graph Pad Prism" und "Excel-Tabelle" für jeden Datenpunktwert zur Quantifizierung.
    HINWEIS: In der Zellkulturplatte ist die Wahl zwischen vier festgelegten Leerbrunnen flexibel und kann vom Experimentator festgelegt werden. Die Standard-Leerplatzanordnung ist in Abbildung 3C dargestellt.

8. Laktatmessungen aus Kultursupernatanten

  1. Tauen Sie allmählich die überlagerten Aliquoten auf Eis, die am Tag 12 gesammelt und ab Stufe 6,5 bei −80 °C gelagert wurden.
  2. Bestimmen Sie die L-Laktat-Konzentrationen mit dem L-Laktat-Assay-Kit im fluorometrischen Modus nach dem Protokoll des Herstellers.
    Hinweis: Der fluorometrische Modus ist deutlich empfindlicher als der kolorimetrische Test.
  3. Erstelle von Standards durch serielle Verdünnung des bereitgestellten Laktatstandards, um eine Kalibrierungskurve von 0 bis 0,1 nmol/Bohrloch zu erzeugen.
  4. Fügen Sie Proben und Standards doppelt zu einer klaren 96-Well-Mikroplatte hinzu und fügen Sie dann die Reaktionsmischung mit Laktatenzymmischung und Fluoreszierend Sonde zu jedem Brunnen hinzu.
  5. Inkubiere 30 Minuten lang im RT, geschützt vor Licht. Messung der Fluoreszenzintensität mit einem Fluoreszenzmikroplatten-Leser mit Anregungs-/Emissionswellenlängen auf 535/587 nm.
  6. Berechnen Sie die Laktatkonzentrationen in Proben aus der Standardkurve und drücken Sie sie als pM aus. Laktatspiegel aus Supernatanten unbehandelter (Kontroll-) und LPS-behandelter primärer Mikroglia sind in Tabelle 2 dargestellt.

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Ergebnisse

Der extrazelluläre fluxbasierte Glycolyse-Belastungstest misst erfolgreich das glykolytische Profil der primären Mikroglia. Der Test misst die Basalglykolyse, also die Glykolyse nach Glukoseinjektion, die glykolytische Kapazität nach der Oligomycin-Injektion und die Hemmung der Glykolyse nach der 2DG-Injektion. Für unser Experiment verglichen wir Kontroll- (unbehandelte) und LPS-behandelte primäre Mikroglia. Wir beobachteten leichte morphologische Veränderungen zwischen Kontroll- und LPS...

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Diskussion

Die mikrogliale Reaktion während der Neuroinflammation wird von einer tiefgreifenden metabolischen Neuverdrahtung begleitet, die es diesen Zellen ermöglicht, die energetischen und biosynthetischen Anforderungen ihres Funktionszustands zu erfüllen. Der extrazelluläre fluxbasierte Glykolyse-Belastungstest bietet eine sensible und Echtzeit-Methode zur Messung des glykolytischen Flusses, sodass wir analysieren können, wie primäre Mikroglia ihren Stoffwechsel unter proinflammatorischen Beding...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keinen Interessenkonflikt zu erklären.

Danksagungen

Die Arbeit wird durch einen CIHR-Projektzuschuss an DKK finanziert. Die RTI an Dr. Craig Moore für den Seahorse Assay XFe24-Analysator wird sehr anerkannt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1M HEPES-LösungSigma AldrichH0887
1X HBSSGibco   14175-079
2,5 % TrypsinGibco   15090-046
2DGMillipore sigma D6134
Antibiotikum/Antimykotikum Gibco15240-062
D & Strich; (+)Glukose, wasserfrei & nbsp;Thermowissenschaftlich   A16828.36
DMEMGibco  11965-092
DNase IMillipore sigma 11284932001- Roche
FBSFisherbrandFB12999102
GlutamaxGibco   35050-061
L-Laktat-KitAbcamab65330
LPS Sigma Aldrich  L4391
MEM NEAA Gibco   11140-050
Oligomycin AMillipore sigma 495455
Penicillin/StreptomycinGibco   15240-062
pH-AnzeigestreifenFisherbrand13-640-516
Seahorse XFe24Agilent TechnologienN/AGenerischer Name: Extrazellulärer Flussanalysator
Seahorse 24 V7 PS Zellkultur-MikroplattenAgilent Seepferdchen100777-004Gattungsname: Extrazelluläre Fluxzellkultur-Mikroplatten
Seepferdchen-Assay XF Calibrant-Puffer (pH 7,4)Agilent Seahorse   100840-000Generischer Name: Extrazellulärer Flux-Kalibrantpuffer
Seepferdchen-Test XF DMEM-Medien (pH 7,4)Agilent Seahorse     103575-100Generischer Name: Extrazelluläres Flux-Testmedium
Seahorse Extrazelluläres Flussassay-KitAgilent Seahorse 102342-100Generischer Name: Extrazelluläre Flusskalibrierungsplatte 
Natriumpyruvat Gibco   11360-070

Referenzen

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  3. Wang, Z., et al. Glycolysis and oxidative phosphorylation play critical roles in natural killer cell receptor-mediated natural killer cell functions. Front. Immunol. 11, 202(2020).
  4. Soto-Heredero, G., Gómezde Las Heras, M. M., Gabandé-Rodríguez, E., Oller, J., Mittelbrunn, M. Glycolysis-a key player in the inflammatory response. FEBS J. 287, 3350-3369 (2020).
  5. O'Neill, L. A., Kishton, R. J., Rathmell, J. A guide to immunometabolism for immunologists. Nat. Rev. Immunol. 16, 553-565 (2016).
  6. Bernier, L. P., et al. Microglial metabolic flexibility supports immune surveillance of the brain parenchyma. Nat. Commun. 11, 1559(2020).
  7. Bernier, L. P., York, E. M., MacVicar, B. A. Immunometabolism in the brain: How metabolism shapes microglial function. Trends Neurosci. 43, 854-869 (2020).
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