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Forschungsartikel
Diese Studie untersucht das therapeutische Potenzial von Calceolarioside A im Gliom und zeigt seine Fähigkeit, die PI3K/Akt-Signalübertragung zu hemmen und den Nrf2-Abbau zu fördern, wodurch Ferroptose induziert und das Tumorprogression sowohl in vitro als auch in vivo unterdrückt wird.
Dieses Protokoll demonstriert den experimentellen Arbeitsablauf zur Untersuchung der Auswirkungen von Calceolarioside A (CaA) auf die Ferroptoseinduktion und Modulation des Phosphatidylinositol-3-Kinase (PI3K)/Protein-Kinase-B-(Akt)/Nuklearfaktor-erythroid-2-bezogenen Faktor-2-(Nrf2)-Wegs in Gliommodellen. Die Verfahren umfassen eine Reihe zellbasierter Tests in humanen Gliomlinien von U251 und U87, um die Lebensfähigkeit der Zelle, Proliferation und Chemosensitivität nach der CaA-Behandlung zu bewerten. Ferroptoose-assoziierte Veränderungen werden durch Messung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS), Glutathion (GSH), Malondialdehyd (MDA) und labilen Eisenwerten sowie der Expression ferroptosebezogener Proteine wie Glutathionperoxidase 4 (GPX4), Cystein/Glutamat-Antiporter-Subunit (xCT) und Ferritin mittels Western Blot bewertet. Zur Bewertung der Signalwegbeteiligung beschreibt das Protokoll qRT-PCR, Western Blot und immunpräzipitationsbasierte Assays für Nrf2-Expression und Ubiquitination. Nrf2-Überexpressionsexperimente sind enthalten, um ihre Rolle bei der Ferroptose-Regulation zu bestätigen. Das Protokoll demonstriert zudem die Verwendung eines Maus-Xenograft-Modells, bei dem U87-Zellen subkutan implantiert werden, gefolgt von intraperitonealer CaA-Verabreichung zur Bewertung des in vivo Tumorwachstums und der Toxizität. Eine histologische Analyse der Hauptorgane wird durchgeführt, um die systemische Sicherheit zu beurteilen. Zusätzlich wird molekulares Andocken verwendet, um direkte Bindung zwischen CaA und der PI3K p110α-Untereinheit (PIK3CA) vorherzusagen. Zusammen bieten diese Verfahren einen reproduzierbaren Rahmen zur Untersuchung von Ferroptosismechanismen und der therapeutischen Wirksamkeit natürlicher Verbindungen in der Gliomforschung.
Gliome, insbesondere hochgradige Glioblastome, stellen eine der tödlichsten Formen von Hirntumoren dar und zeichnen sich durch schnelle Vermehrung, Behandlungsresistenz und schlechte Prognoseaus. In den letzten Jahren wurden verschiedene Antigliom-Mittel erforscht, darunter traditionelle Chemotherapeutika wie Temozolomid und eine Reihe natürlicher Verbindungen wie Curcumin2, Resveratrol3 und Epigallocatechingall4. Diese Wirkstoffe wirken durch verschiedene Mechanismen, darunter die Induktion der Apoptose, die Hemmung der Angiogenese und die Modulation der oxidativen Stresswege. Viele dieser Verbindungen haben jedoch Einschränkungen wie schlechte Bioverfügbarkeit oder unvollständige mechanistische Charakterisierung. Dies unterstreicht die dringende Notwendigkeit umfassender Methoden, die nicht nur die antitumorale Aktivität bestätigen, sondern auch systematisch die zugrunde liegenden pharmakologischen Mechanismen analysieren. Die Etablierung solcher mechanistischer Arbeitsabläufe ist besonders wichtig, um die Entwicklung neuartiger Antigliom-Verbindungen von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung zu beschleunigen.
Um dieses Ziel zu unterstützen, integrieren zunehmend Studien fortschrittliche rechnergestützte und experimentelle Werkzeuge zur Verbesserung der mechanistischen Auflösung 5,6. Strukturbasierte Arzneimitteldesign- und KI-Modelle – wie AlphaFold3 und molekulares Andocken – erleichtern die Identifikation vielversprechender Wirkstoff-Ziel-Interaktionen mit beispielloser Geschwindigkeit und Genauigkeit 7,8. Diese Werkzeuge ergänzen experimentelle Methoden, indem sie Bindungsaffinitäten vorhersagen und potenzielle molekulare Ziele vor der Laborvalidierung identifizieren. Gleichzeitig ermöglichen die Entstehung von weitembasierten funktionellen Assays, Live-Cell-Bildgebung und hochauflösenden proteomischen Techniken Forschern, die zelluläre Wirkung neuer Verbindungen über mehrere regulatorische Achsen hinweg zu bewerten, einschließlich oxidativer Stressreaktionen, Signaltransduktionskaskaden und Zelltodsmodalitäten wie Ferroptose 9,10,11.
Zu den in der Gliombiologie beteiligten Signalwege gehören die Phosphatidylinositol-3-Kinase (PI3K)/Protein-Kinase B (Akt) und der nukleäre Faktor erythroid 2-bezogenen Faktor 2 (Nrf2)-Signalwege aufgrund ihrer Rolle im Tumorwachstum, der Redoxhomöostase und der Therapieresistenz12,13 von besonderem Interesse. Die PI3K/Akt-Signalübertragung fördert das Überleben, die Proliferation und die metabolische Anpassung in Gliomzellen, während Nrf2 als Hauptregulator der antioxidativen Antwort fungiert und den ferroptotischen Zelltod14 unterdrückt. Die anhaltende Aktivierung dieser Signalwege trägt zur Behandlungsvermeidung bei und macht sie zu attraktiven Zielen für pharmakologische Interventionen15. Konventionelle Methoden zur Signalweganalyse umfassen Western-Blotting für Total- und phosphorylierte Proteine sowie qRT-PCR für Genexpressionsanalyse. Eine tiefgehende Analyse der Nrf2-Signalübertragung erfordert jedoch weitere Assays, die die Proteinstabilität, die Kerntranslokation und posttranslationale Modifikationen wie Ubiquitination bewerten. Diese vielschichtigen Detektionsstrategien sind unerlässlich, um zu verstehen, wie bestimmte Verbindungen die Redoxregulation und die ferroptotische Kontrolle stören oder verstärken.
Calceolariosid A (CaA), ein Derivat von Hydroxycinnaminsäure, bietet einen doppelten Mechanismus, indem es gleichzeitig die PI3K/Akt-Signalübertragung hemmt und den proteasomalen Abbau von Nrf2 fördert, wodurch die ferroptotische Empfindlichkeit verbessert wird. Diese Dual-Targeting-Strategie könnte die Reproduzierbarkeit und mechanistische Tiefe gegenüber bestehenden Wirkstoffen wie Erastin oder RSL3 verbessern, die stromabwärts an antioxidative Abwehrmechanismen wirken. Dieses Protokoll präsentiert einen integrierten experimentellen Ansatz zur Untersuchung des pharmakologischen Mechanismus von CaA, der molekulare Andockungen zur Identifizierung von PI3K-Bindungsstellen, Immunblotting und Immunpräzipitation zur Erkennung von Nrf2-Expression und Ubiquitination sowie Ferroptosismarker wie reaktive Sauerstoffspezies (ROS), Glutathion (GSH) und Malondialdehyd (MDA) umfasst. Darüber hinaus wird ein Xenograft-Mausmodell verwendet, um die therapeutische Wirksamkeit und systemische Sicherheit von CaA zu bewerten. Dieser umfassende Arbeitsablauf bietet eine reproduzierbare und informative Plattform zur Untersuchung des Wirkmechanismus von Krebshemmern, mit Schwerpunkt auf der Integration der Signalwegmodulation und Zelltodregulation.
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Zellkultur und Behandlung
Neuronale Zellen von murinen HT22 sowie humane Gliom-U87- und U251-Zelllinien wurden in Dulbeccos Modified Eagle Medium kultiviert, ergänzt mit 10 % fetalem Rinderserum und 4 mM L-Glutamin, unter befeuchteten Bedingungen bei 37 °C und 5 % CO₂. Um die experimentelle Konsistenz zu optimieren, wurden alle Zellbehandlungen standardisiert und hier beschrieben. Dieser Abschnitt beschreibt die spezifischen Bedingungen in jeder Behandlungsgruppe sowie die entsprechenden nachgelagerten Assays.
CaA-Behandlung:
HT22-Zellen wurden mit steigenden CaA-Konzentrationen (0, 0,1, 0,5, 1, 10, 50, 100, 250 und 500 μM) für 72 Stunden behandelt. U87- und U251-Gliomzellen wurden mit CaA in Konzentrationen von 5, 20 oder 50 μM für 24 Stunden für die meisten Experimente behandelt, oder mit 50 μM für 0, 6, 12 oder 18 Stunden für Zeitverlaufsstudien. Diese Behandlungen wurden in folgenden Analysen eingesetzt: Western Blotting für Cystein/Glutamat-Antiporter-Subunit (xCT), Glutathionperoxidase 4 (GPX4), Ferritin (FTH1), Glutaminase und PI3K/Akt/säugetierisches Ziel von Rapamycin (mTOR)/eukaryotischen Initiationsfaktor 4B (EIF4B) (Gesamt- und phosphorylierte Spiegel); Echtzeit-quantitative Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR) für Nrf2 und das Kelch-ähnliche ECH-assoziierte Protein 1 (Keap1); ROS-Messung mit 2′,7′-Dichlordihydrofluoreszein-Diacetat (DCFH-DA); GSH- und MDA-Quantifizierung; FerroOrange-basierte Fe2+ -Erkennung; 5-Ethynyl-2′-Deoxyuridin (EdU) Proliferationstest; Koloniebildungs-Assay; 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazoliumbromid (MTT) Zellviabilitätstest.
Liproxstatin-1 (Lip1) Begleitbehandlung:
Die Zellen wurden mit 50 nM Lip1 für 2 Stunden vorbehandelt, bevor 50 μM CaA hinzugefügt wurde. Diese Bedingungen wurden im MTT-Assay verwendet (0, 24, 48, 72 H); Koloniebildungsanalyse; EdU-Analyse; Annexin V/PI Apoptose-Test (mit/ohne 20 nM Cisplatin).
MG132-Kobehandlung:
Die Zellen wurden allein mit 10 μM MG132 behandelt oder mit 50 μM CaA für 24 Stunden kombiniert. Dies wurde auf Western Blotting für die Nrf2-Proteinstabilisierung (total und nuklear) angewendet; Immunopräzipitationstests (IP) für ubiquitinierte Nrf2 und Keap1.
Cisplatin-Kobehandlung:
Die Zellen wurden mit 20 nM Cisplatin allein oder in Kombination mit 20 μM CaA für 24 Stunden behandelt. Diese Behandlungen wurden im Apoptose-Assay mit Annexin V/Propidiumiodid (PI) eingesetzt.
Nrf2-Überexpression :
Die Zellen wurden mit 2,5 μg Nrf2-Überexpressionsplasmid oder leerem Vektor mit Transfektionsmittel für 18 Stunden transfiziert und anschließend 24 Stunden mit 50 μM CaA behandelt. Diese Erkrankung wurde im Western Blotting für xCT, GPX4, FTH1 und Glutaminase verwendet; ROS-, MDA- UND GSH-Analysen; FerroOrange-Färbung für intrazelluläres Eisen.
Ein Workflow-Diagramm (Ergänzende Abbildung S1) fasst die oben genannten experimentellen Bedingungen und die entsprechenden Analysen zusammen. Diese Abbildung verknüpft jedes Behandlungsprotokoll visuell mit seinen spezifischen nachgelagerten Assays für verbesserte Klarheit und Reproduzierbarkeit.
Bewertung der Zelllebensfähigkeit
Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde mit der konventionellen MTT-Kolorimetriemethode bewertet, wie zuvorbeschrieben 16. HT22-, U251- und U87-Zellen wurden in 96-Well-Kulturplatten plattiert und über Nacht inkubiert, um die Haftung zu gewährleisten. Nach Abschluss der Behandlungsphase wurden 15 μL MTT-Lösung in jede Bohrung eingebracht und die Platten wurden 4 Stunden bei 37 °C inkubiert. Das Medium wurde dann entsorgt und 150 μL Dimethylsulfoxid (DMSO) hinzugefügt, um die gebildeten Formazankristalle zu lösen. Die Absorption wurde anschließend mit 490 nm mit einem Mikroplattenmesser gemessen. Höhere Absorptionswerte deuten auf eine größere Zelllebensfähigkeit hin, während eine Verringerung der Absorption zytotoxische Effekte andeutet.
EdU-Inkorporationsassay
Zur Bewertung der DNA-Synthese und Zellproliferation wurden EdU-Inkorporationstests mit einem EdU-Bildgebenden Kit durchgeführt, wie zuvor beschrieben17. Kurz gesagt wurden U251- und U87-Gliomzellen in 24-Well-Platten ausgesät. Nach der Behandlung wurden die Zellen mit EdU (10 μM Endkonzentration) inkubiert und weitere 24 Stunden kultiviert. Nach dem Inkubationsschritt wurden die Zellen mit 4 % Paraformaldehyd fixiert, anschließend mit 0,5 % Triton X-100 permeabilisiert und gemäß den Kit-Anweisungen gefärbt. Der Prozentsatz der EdU-positiven Zellen (proliferierende Zellen) wurde mittels Fluoreszenzmikroskopie quantifiziert und auf insgesamt 4′,6-diamidino-2-phenylindol (DAPI)-gefärbte Kerne normalisiert.
Koloniebildungs-Assay
Für den Koloniebildungstest wurden U251- und U87-Gliomzellen in 3,5 cm dicken Schalen mit niedriger Dichte (500 Zellen pro Schale) plattiert. Nach der Behandlung wurde das Kulturmedium gegen frisches, medikamentenfreies Medium ausgetauscht, und die Zellen wurden weitere 14 Tage erhalten, um die Koloniebildung zu ermöglichen, wobei alle drei Tage ein Mediumwechsel durchgeführt wurde. Die resultierenden Kolonien wurden anschließend mit 4 % Paraformaldehyd fixiert, mit 0,1 % Kristallviolett gefärbt und manuell unter dem Mikroskop gezählt. Haufen mit einem Durchmesser von 75 μm wurden als Kolonien bewertet. Jedes Experiment wurde dreimal durchgeführt und wiederholt. Dieser Test folgte allgemein akzeptierten Protokollen zur Bewertung der langfristigen Proliferationskapazität18. Kolonien sollten als dichte, kreisförmige Gruppen erscheinen; Weniger und kleinere Kolonien deuten auf eine verringerte Vermehrungskapazität hin.
Beurteilung der Zellapoptose
Apoptotischer Zelltod wurde mit demzuvor beschriebenen Apoptose-Detektionskit FITC-Annexin V bewertet. U87- und U251-Gliomzellen wurden mit 20 nM Cisplatin in Anwesenheit oder Abwesenheit von 20 μM CaA für 24 Stunden vor der Färbung behandelt. Für Experimente mit Ferroptose-Hemmung wurden die Zellen mit 50 nM Lip1 für 2 Stunden vorbehandelt, gefolgt von einer Kotherapie mit 20 μM CaA und 20 nM Cisplatin für weitere 24 Stunden. Nach den angegebenen Behandlungen wurden die Zellen entnommen (300 × g, 5 min) und gemäß den Anweisungen des Herstellers mit Annexin V-FITC und PI gefärbt. Nach der Kennzeichnung wurden die Proben mit einem Durchflusszytometer untersucht. Die Datenerfassung erfolgte über FL1 (FITC) und FL2 (PI) Kanäle, wobei Kompensationseinstellungen zur Minimierung spektraler Überlappungen angewendet wurden. Der Anteil der Annexin-V-positiven Zellen wurde anschließend berechnet, um den Ausmaß der Apoptose zu bestimmen.
Western-Blot-Analyse
Das Western-Blotting erfolgte gemäß den festgelegtenVerfahren 19,20. Kurzzeitig wurden nach den angezeigten Behandlungen die Zellen in einem RIPA-Puffer mit Protease- und Phosphataseinhibitoren lysiert, und die Proteinwerte wurden mittels des Bradford-Tests bestimmt. Für Experimente zur Bewertung der Nrf2-subzellulären Verteilung wurden Kern- und zytoplasmatische Proteine mit einem kommerziellen nuklearen Extraktionskit gemäß den Anweisungen des Herstellers extrahiert.
Insgesamt wurden 40 μg Protein aus jeder Probe auf einem 10%igen SDS-PAGE-Gel aufgelöst und anschließend auf PVDF-Membranen übertragen. Die Membranen wurden mit 5 % fettfreier Milch blockiert, die in PBST (PBS mit 0,1 % Tween-20) für 1 Stunde bei Zimmertemperatur zubereitet wurde, gefolgt von einer nächtlichen Inkubation mit primären Antikörpern bei 4 °C. Nach dem Waschen wurden HRP-konjugierte sekundäre Antikörper (1:5.000) für 1 Stunde bei 37 °C aufgetragen, und die Signale wurden mit einem verbesserten Chemilumineszenzsystem (ECL) detektiert.
Die Expressionswerte von xCT, Glutaminase, GPX4 und FTH1 wurden gemessen, wobei Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAPDH) als Belastungskontrolle diente. Phosphorylierte Proteine (p-PI3K, p-Akt, p-MTOR und p-EIF4B) wurden relativ zu ihren jeweiligen Gesamtproteinwerten quantifiziert, während die Gesamtproteine gegen GAPDH normalisiert wurden. Nukleares Nrf2 wurde auf Lamin B normalisiert. Erwartete Ergebnisse umfassen eine dosis- und zeitabhängige Reduktion von Nrf2 und p-PI3K/Akt/mTOR/EIF4B sowie eine Downregulation der ferroptosebezogenen Marker in CaA-behandelten Zellen.
Für Ubiquitinationstests wurden die Zellen mit MG132 (10 μM) mit oder ohne CaA (50 μM) für 24 Stunden behandelt. Nach der Lyse wurden Proteinkomplexe mit Anti-Nrf2- oder Anti-Keap1-Antikörpern immunpräzipitiert; normales Kaninchen-IgG wurde als Negativkontrolle verwendet. Die Immunpräzipitate wurden anschließend mit Anti-Ubiquitin-Antikörpern untersucht, um ubiquitinierte Formen nachzuweisen, während die Gesamtzahl der Lysate ebenfalls auf Nrf2 und Kelch-ähnliche ECH-assoziierte Protein-1 (Keap1)-Werte untersucht wurde, um die Eingabe zu bestätigen.
RNA-Extraktion und quantitative Echtzeit-PCR (qRT-PCR)
RNA-Extraktion und qRT-PCR wurden gemäß Standardprotokollen21 durchgeführt. Kurz gesagt wurden U87- und U251-Gliomzellen mit oder ohne 50 μM CaA für unterschiedliche Dauern (6 und 18 Stunden) behandelt. Total-RNA wurde isoliert und durch Reverse-Transkription in cDNA umgewandelt. Quantitative Echtzeit-PCR (qRT-PCR) wurde mit einem SYBR Green qPCR Master Mix auf einer Echtzeit-PCR-Plattform durchgeführt. Die relative Genexpression wurde mittels der 2-ΔΔCt-Berechnung bestimmt. Die für Nrf2, Keap1 und das Housekeeping-Gen GAPDH verwendeten Primer-Sequenzen waren wie folgt:
Nrf2 vorwärts, 5′-CACATCCAGTCAGAAACCAGTGG-3′;
Nrf2 umgekehrt, 5′-GGAATGTCTGCGCCAAAAAGCTG-3′
Keap1 vorwärts, 5′-CAACTTCGCTGAGCAGATTGGC-3′;
Keap1 Rückwärtsgang, 5′-TGATGAGGGTCACCAGTTGGCA-3′
GAPDH vorne, 5′-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGG-3′;
GAPDH rückwärts, 5′-AGCCTTCTACATGGTGGTGAAGAC-3′
Nrf2-Transduktion
U251- und U87-Gliomzellen wurden vorübergehend entweder mit einem Nrf2-Überexpressionsplasmid oder einem entsprechenden leeren Kontrollvektor unter Verwendung des lipidbasierten Transfektionsreagens transfektiert; Das Verfahren basierte auf konventionellen transienten Transfektionsmethoden22. Kurz gesagt wurden die Zellen in 6-Well-Platten mit einer Dichte von 3 × 10⁵ Zellen pro Bohrloch ausgesät und über Nacht kultiviert, um etwa 70–80 % Konfluenz zum Zeitpunkt der Transfektion zu erreichen. Für jedes Bohrloch wurden 2,5 μg Plasmid-DNA in 125 μL reduziertes Serummedium verdünnt und mit 5 μL des Transfektionsreagens vermischt. Separat wurden 3,75 μL des Transfektionsreagens in weiteren 125 μL des reduzierten Serummediums verdünnt. Die verdünnten DNA- und Transfektionsreagenzmischungen wurden dann kombiniert, sanft vermischt und bei Raumtemperatur 10–15 Minuten inkubiert, um die Komplexbildung zu ermöglichen. Die resultierenden Transfionskomplexe (Gesamtvolumen 250 μL) wurden tropfenweise zu jedem Brunnen hinzugefügt, der Zellen in frischem vollständigem Medium enthielt.
Nach 18 Stunden Inkubation bei 37 °C in einem CO₂-Inkubator wurde das Transfektionsmedium durch ein frisches Kulturmedium ersetzt. Anschließend wurden die Zellen untersucht, darunter Western Blotting, ROS-Analyse, MDA/GSH-Quantifizierung und Eisenakkumulationsstudien. Dieses Protokoll folgt weithin anerkannten transienten Genexpressionsverfahren und ermöglicht eine robuste Nrf2-Expression innerhalb von 24–48 Stunden nach der Transfektion.
Messung des intrazellulären Eisens
Die intrazellulären Fe2+- Spiegel wurden mit dem fluoreszierenden Indikator FerroOrange gemessen. Kurze U251- und U87-Gliomzellen wurden in 24-Bohrlochplatten ausgesat und mit unterschiedlichen CaA-Konzentrationen (5, 20 und 50 μM) behandelt. Um die Wirkung der Nrf2-Überexpression auf die Ferroptose zu bewerten, wurden U87- und U251-Zellen mit einem Nrf2-Expressionsplasmid oder einem leeren Vektor transfektiert. Nach 18 Stunden wurde das Medium ersetzt und die Zellen mit 50 μM CaA für 24 Stunden behandelt. Anschließend wurden die Zellen 1 μM FerroOrange in serumfreiem Medium ausgesetzt und 30 Minuten lang bei 37 °C inkubiert, bevor die Analyse durchgeführt wurde. Nach der Inkubation wurden die Zellen gespült und unter einem Fluoreszenzmikroskop mit einem TRITC-Filtersatz (Anregung ~543 nm, Emission 560–600 nm) beobachtet, wobei die erhöhte Intensität der orangefarbenen Fluoreszenzintensität auf höhere Konzentrationen von labilem Fe2+ hinweist, die typischerweise im Zytoplasma lokalisiert sind. Diese Methode wurde aus etablierten fluoreszierenden Sonden-basierten Eisen-Assays23 adaptiert.
Messung von GSH und MDA
Die intrazellulären GSH- und MDA-Werte wurden nach standardisierten Bewertungsprotokollen zur Bewertung des oxidativen Stressesbestimmt 24. Kurze U251- und U87-Gliomzellen wurden in 24-Bohrlochplatten ausgesat und mit unterschiedlichen CaA-Konzentrationen (5, 20 und 50 μM) behandelt. Um die Wirkung der Nrf2-Überexpression auf die Ferroptose zu bewerten, wurden U87- und U251-Zellen mit einem Nrf2-Expressionsplasmid oder einem leeren Vektor transfektiert. Nach 18 Stunden wurde das Medium ersetzt und die Zellen mit 50 μM CaA für 24 Stunden behandelt. Anschließend wurden die Zellen im RIPA-Puffer lysiert, und die Gesamtproteinkonzentration wurde mit einem BCA-Proteinquantifizierungskit gemessen. GSH- und MDA-Inhalte wurden anschließend mit kommerziellen Detektionskits gemäß den Protokollen der Hersteller analysiert.
ROS-Assay
Die intrazelluläre ROS-Erzeugung wurde mit der fluoreszierenden Sonde DCFH-DA gemäß den etablierten Protokollen25 bewertet. Kurze U251- und U87-Gliomzellen wurden in 24-Bohrlochplatten ausgesat und mit unterschiedlichen CaA-Konzentrationen (5, 20 und 50 μM) behandelt. Um die Wirkung der Nrf2-Überexpression auf die Ferroptose zu bewerten, wurden U87- und U251-Zellen mit einem Nrf2-Expressionsplasmid oder einem leeren Vektor transfektiert. Nach 18 Stunden wurde das Medium ersetzt und die Zellen mit 50 μM CaA für 24 Stunden behandelt. Anschließend wurden die Zellen mit 5 μM DCFH-DA bei 37 °C für 1 Stunde behandelt, gefolgt von PBS-Waschungen, um überschüssige Farbstoffe zu entfernen. Fluoreszenzsignale wurden mit einem invertierten Fluoreszenzmikroskop visualisiert, das mit einem FITC-Filter ausgestattet war (Anregung 488 nm, Emission 525 nm), und zur Analyse wurden Bilder aufgenommen. Eine erhöhte grüne Fluoreszenzintensität entspricht erhöhten intrazellulären ROS-Werten.
Tierversuche
Alle Tierversuche wurden strikt gemäß den Empfehlungen im Leitfaden für die Pflege und Nutzung von Labortieren der National Institutes of Health durchgeführt. Das Protokoll wurde vom Institutional Animal Care and Use Committee des Weifang Peoples Hospital unter der Genehmigungsnummer [2025SDL579] genehmigt. Zur Erstellung des Gliom-Xenograft-Modells wurden 2 × 106 U87-Zellen in 0,2 mL PBS resuspendiert und subkutan in die linke Flanke 4 Wochen alter männlicher BALB/c-Nacktmäuse geimpft. Nachdem die Tumorentwicklung 7 Tage lang durfte, wurden die Mäuse zufällig in drei Gruppen eingeteilt (n = 8 pro Gruppe): unbehandelte Kontrollgruppe, CaA-behandelt (2,5 mg/kg) und CaA (2,5 mg/kg) kombiniert mit Lip1 (10 mg/kg). Die Behandlungen wurden über tägliche intraperitoneale Injektionen über 14 aufeinanderfolgende Tage verabreicht. Die Tumormaße wurden alle 3 Tage mit Schieberschiebern gemessen, und die Volumina wurden mit der Formel berechnet: Volumen = (Länge × Breite²) / 2. Am 21. Tag wurden alle Mäuse eingeschläfert, Tumore entfernt und für weitere Analysen fotografiert.
RNA-Sequenzierung und KEGG-Signalweganalyse
Die RNA-Sequenzierung wurde durchgeführt, um transkriptionelle Veränderungen nach CaA-Exposition zu profilieren. Die RNA-Integrität wurde durch die Verwendung eines Mikrovolumen-UV-VIS-Spektrophotometers und eines kapillarbasierten Elektrophoresesystems vor der Sequenzierung auf der Illumina-Plattform bestätigt. Saubere Reads wurden mit HISAT2 auf das menschliche Referenzgenom (GRCh38) abgebildet, und die Genexpression wurde als FPKM quantifiziert. Differenziell exprimierte Gene wurden mittels DESeq2 identifiziert (FDR < 0,05, |log₂FC| ≥ 1), und die funktionelle Anreicherung wurde mittels KEGG-Weganalyse bewertet (angepasst P < 0,05).
Molekulare Andockanalyse
Molekulares Andocken wurde eingesetzt, um die Wechselwirkung zwischen CaA und dem PI3K/Akt-Signalweg vorherzusagen. Die Kristallstruktur der humanen PI3K-katalytischen Untereinheit p110α (PIK3CA) wurde aus der Protein Data Bank (PDB ID: 8BFU) gewonnen. Die Struktur von CaA wurde aus PubChem abgerufen und mit molekularer Modellierungssoftware energieminimiert. Mit molekularer Andockvorbereitungssoftware wurden alle Wassermoleküle und nicht essentiellen Liganden aus der PIK3CA-Struktur entfernt und Wasserstoffatome hinzugefügt. Ein Andockgitter wurde um den aktiven Standort von PIK3CA definiert (basierend auf bekannten Bindungskoordinaten), und ein Andockalgorithmus wurde verwendet, um das Andocken durchzuführen. Die höchstwertenden Bindungsposen von CaA wurden nach Bindungsaffinität (kcal/mol) ausgewählt und auf Schlüsselwechselwirkungen untersucht. Protein-Ligand-Interaktionen, wie Wasserstoffbrücken und hydrophobe Kontakte, wurden mit molekularer Visualisierungssoftware und einem 2D-Interaktionskartierungstool visualisiert.
Sicherheit und Abfallentsorgung
Alle Experimente mit chemischen Reagenzien wie DMSO, fluoreszierenden Farbstoffen (DCFH-DA, FerroOrange) und Fixativen wurden in einer Abzugshaube mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (PSA) einschließlich Handschuhen und Schutzbrillen durchgeführt. DMSO- und fluoreszierende Sonden wurden mit Vorsicht behandelt, da sie die Haut durchdringen und möglicherweise zytotoxisch sind. Kontaminierte Materialien, darunter Pipettenspitzen, Kulturplatten und Handschuhe, wurden in ausgewiesenen Behältern für gefährliche Abfälle entsorgt. Tiergewebe und Kadaver wurden als biologisch gefährlicher Abfall behandelt und gemäß institutionellen Biosicherheitsvorschriften und lokalen Umweltrichtlinien verbrannt oder autoklaviert.
Statistische Analyse
Alle Ergebnisse werden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) präsentiert. Die Unterschiede zwischen zwei Gruppen wurden mit einem zweiseitigen Schüler-t-Test bewertet. Für Analysen mit mehreren Gruppen wurde eine Einseits-ANOVA gefolgt von geeigneten Post-hoc-Vergleichen (wie dem Tukey-Test) angewendet. Ein p-Wert unter 0,05 galt als Hinweis auf statistische Signifikanz.
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Proliferationsunterdrückung und erhöhte Chemosensitivität von U251- und U87-Zellen in vitro durch CaA
Abbildung 1A veranschaulicht die Struktur von CaA. Zunächst untersuchten wir die zytotoxischen Effekte von CaA mit einem MTT-Test an normalen Maus-HT22-Neuronalzellen sowie humanen Gliom-U251- und U87-Zellen. Im Vergleich zu unbehandelten Zellen (0 μM CaA) hatte CaA nur minimale Auswirkungen auf die Lebensfähigkeit der HT22-Zell...
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CaA zeigt eine überzeugende antitumorwirkende Wirkung beim Glioblastom, indem es zwei kritische Überlebensachsen eindeutig moduliert: den PI3K/Akt/mTOR-Weg und den Nrf2-Ferroptose-Abwehrmechanismus. Der PI3K/Akt-Weg wird häufig im Glioblastoma multiforme (GBM, verändert in bis zu ~88–90 % der Fälle) aufgrund von PTEN-Verlust oder RTK-Aktivierung hyperaktiviert, was die Proliferation und Therapieresistenz26 vorantreibt. Dennoch hat allein die gezielte Steuerung die...
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Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären.
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Agilent 2100 Bioanalyzer | kapillarbasiertes Elektrophoresesystem | ||
| Annexin V-FITC Apoptose-Kit | Roche Diagnostics | 11858777001 | N/A |
| AutoDock Tools 1.5.7 (AutoDock Vina) | molekulare Docking-Vorbereitungssoftware (Docking-Algorithmus) | ||
| Calceolarioside A (CaA) | Sigma-Aldrich | SMB00246 | N/A |
| Chem3D | molekulare Modellierungssoftware | ||
| cDNA-Synthese-Kit | Vazyme Biotech | R223 | N/A |
| DCFH-DA | Sigma-Aldrich | D6883 | N/A |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | N/A |
| DMSO | Merck | D8418 | N/A |
| FerroOrange-Sonde | Dojindo | F374 | N/A |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F2442 | N/A |
| Fluozytometer | BD Biosciences | FACSAriaIII Flow Cytometry | Instrument zur Analyse von Annexin V gefärbten Zellen |
| Fluoreszenzmikroskop | Olympus | IX73 | Instrument zur Beobachtung von FerroOrange- und DCFH-DA-Fluoreszenz |
| FTH1-Antikörper | Abcam | ab75973 | AB_1310150 |
| GAPDH-Antikörper | Abcam | ab8245 | AB_2107448 |
| GLS-Antikörper | Abcam | ab93434 | AB_10563527 |
| GPX4-Antikörper | Abcam | ab125066 | AB_10972289 |
| HT22 murine neuronale Zelllinie | AddexBio | C0011008 | CVCL_0321 |
| jetPRIME-Transfektionsreagenz | Polyplus-transfection | 114-07 | polymerbasiertes Transfektionsreagenz |
| Keap1-Antikörper | Abcam | ab139729 | AB_2732852 |
| L-Glutamin (200 mM) | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | N/A |
| LigPlot+ | 2D-Interaktions-Mapping-Tool | ||
| Lipofectamine 3000 | Thermo Fisher Scientific | lipidbasiertes Transfektionsreagenz | |
| Liproxstatin-1 | Selleck | S7699 | N/A |
| MG132 | Selleck | S2619 | N/A |
| Mikroplatten-Reader | Thermo Fisher Scientific | H1M | Instrument zur Messung der Absorption bei MTT-Assay (bei 490 nm) |
| MTT | Sigma-Aldrich | M5655 | N/A |
| NanoDrop | Mikrovolumen-UV-Vis-Spektrophotometer | ||
| Nrf2-Antikörper | Abcam | ab62352 | AB_945626 |
| Nude BALB/c Mäuse | Vital River, China | N/A | IMSR_CRL:028 |
| OptiMeM reduziertes Serummedium | |||
| PyMOL | molekulare Visualisierungssoftware | ||
| QuantStudio 5 Echtzeit-PCR-System | |||
| SYBR Green Master Mix | Vazyme Biotech | Q711 | N/A |
| TRIzol Reagenz | Thermo Fisher | 15596026 | N/A |
| U251 humane Gliomzelllinie | CLS Cell Lines Service | 300385 | CVCL_0021 |
| U87 humane Gliomzelllinie | ATCC | HTB-14 | CVCL_0022 |
| Ubiquitin-Antikörper | Abcam | ab7780 | AB_306981 |
| xCT/SLC7A11 Antikörper | Abcam | ab175186 | AB_2715513 |
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