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Diese Studie nutzte öffentlich zugängliche, de-identifizierte klinische und transkriptomische Daten aus dem Cancer Genome Atlas und dem Gene Expression Omnibus. Alle beitragenden Studien hatten eine vorherige Genehmigung des institutionellen Prüfungsausschusses und eine informierte Einwilligung. Da nur eine sekundäre Analyse anonymisierter Daten durchgeführt wurde, war keine zusätzliche ethische Genehmigung erforderlich. Die verwendeten Datenbanken und Software sind in der Materialtabelle aufgeführt.
1. Datendownload
Die Forschung nutzte den EC-Datensatz10 (TCGA-Uterine Corpus Endotrial Carcinoma (TCGA-UCEC)), der aus 589 Proben besteht, darunter 554 Tumorgewebeproben von UCEC-Patienten (UCEC-Gruppe) und Sequenzierungsdaten von 35 benachbarten normalen Geweben (normale Gruppe). Die UCSC-Xena-Datenbank wurde verwendet, um die entsprechenden klinischen Daten11 wiederherzustellen, wobei solche, die keine vollständigen klinischen Daten besitzen, ausgeschlossen wurden. Letztlich standen 577 Proben mit klinischen Daten zur Analyse zur Verfügung. Detaillierte Basisinformationen finden sich in Tabelle 1.
Zusätzliche Datensätze zu EC, GSE115810 und GSE6367812 wurden mit dem GEOquery-Paket13 heruntergeladen. Der GSE115810-Datensatz und GSE63678 wurden zusammengeführt, um die Combined Datasets für weitere Analysen zu erstellen (Tabelle 2).
NAD+-stoffwechselbezogene Gene (NMRGs) werden nach dem GeneCardsrecord14 und der relevanten Literatur15 positioniert. Mit "Niacinamid-Metabolismus" als Suchbegriff in GeneCards identifizierten 345 NMRGs mit Relevanzpunkten über 4. Das Kombinieren und Entfernen von Duplikaten aus den 42 in der Literatur gefundenen NMRGs ergab insgesamt 371 NMRGs (Ergänzende Tabelle 1). Klinische Daten wurden als .tsv phänotypische Dateien erhoben; die Daten wurden im HTSeq-FPKM-Format heruntergeladen. Ausgeschlossene Stichproben hatten mehr als 20 % ihrer klinischen Daten fehlend. FPKM wurdelog-2-transformiert und in TPM (Transkripte pro Million) umgewandelt. Sonden-IDs wurden Gensymbolen für GEO-Datensätze zugeordnet, und doppelte Sonden wurden gemittelt.
2. Differentiell exprimierte Gene des Nikotinamid-Stoffwechsels
Die Forschung begann mit der Anwendung desR-Set-sva16, um Set-Possessions nach den GSE115810- und GSE63678-Datensätzen auszuschließen, was zu einem gegenseitigen Datensatz führte, der 31 EC (UCEC) und 8 benachbarte normale Stichproben enthält. Als nächstes wird Limma-Set17 verwendet, um eine Genexpressionsanalyse der Diskrepanz auf dem TCGA-UCEC-Datensatz durchzuführen.
Die Schnittstelle von DEGs aus der TCGA-UCEC-Analyse mit 337 NMRGs zur Identifizierung von DEGs, die mit dem Nikotinamidstoffwechsel verbunden sind. Dies führte zu einer Liste von Niacinamid-stoffwechsel-bezogenen differenziell exprimierten Genen (NMRDEGs), die in einer Illustration von Venn abgebildet wurden. Die Ergebnisse der Untersuchung zum Erscheinungsbild der Diskrepanz wurden durch das ggplot2 R-Paket18 illustriert, während eine Heatmap der NMRDEGs mit dem Pheatmap-Set19 erstellt wurde. Die Varianz zwischen den Datensätzen wird durch Batch-Korrektur mit ComBat (empirischer Bayes) eliminiert. Das limma-empirische Bayes-Linearmodell-Framework wurde in der DEG-Analyse verwendet. Explizit angewandte differentielle Ausdrucksschwellen:
|log2FC| ≥ 1
FDR unter 0,05.
Die NMRG-Liste überschnitt nur DEGs, die beide Anforderungen erfüllten. Diagramme von Vulkanen und Heatmaps, erstellt mit ggplot2 und pheatmap.
3. NMRDEG-Funktion (GO), Signalweg-(KEGG) Enhancement-Untersuchung
Die Verbesserungstests von GO20 und KEGG21wurden vom clusterProfiler-Set 22 durchgeführt. Für beide Analysen wurden Signifikanzschwellenwerte bei p. adjustiert< 0,05 und FDR (q-Wert) < 0,25 erkannt. Die Forschung integrierte auch logFC-Werte in die Anreicherungsanalyse, wodurch die Ergebnisse in Kreis- und Akkordendiagrammen dargestellt wurden. Schwellenwerte für die Anreicherungssignifikans: p-Wert angepasst < 0,05 FDR < 0,25 (q-Wert). Cluster Profiler wurde für GO- und KEGG-Studien verwendet. Die Genrichtung wird durch Chord- und Kreisdiagramme dargestellt,die Daten zur zweifachen Veränderung von Logarithmus enthalten.
4. Gen-Satz-Anreicherungsanalyse (GSEA)
Die Art der vererbbaren Faktormengen, die am meisten zum Phänotyp beigetragen haben, kann mit GSEA23 identifiziert werden. Für diese Analyse wurde der TCGA-UCEC-Datensatz anhand von logFC-Werten bewertet und eine Verbesserungsprüfung mit dem clusterProfiler-Paket durchgeführt. Wichtige Einschränkungen umfassten einen Seed-Wert von 2022 und 10.000 Permutationen. Der MSigDB-Gensatz "c2.all.v2022.1.Hs.symbols.gmt" wurde24 Jahre lang verwendet. Die am stärksten angereicherten Bahnen, darunter durch Manalo-Hypoxie induzierte Gene, oxidativ-stressinduzierte Senezenz-, Glykolyse- und Apoptose-Bahnen, wurden mit einem Gebirgsplot visualisiert. Vor GSEA wurden Gene nach logaritgem2-facher Veränderung geordnet. 10.000 Permutationen wurden in der Analyse verwendet. c2.all.v2022.1.Hs.symbols.gmt ist die MSigDB-Sammlung, die verwendet wurde. Zur Reproduzierbarkeit wurde ein fester zufälliger Seed (2022) verwendet. Signifikante Wege waren solche mit p < 0,05 und q < 0,25.
5. Cox-Modellkonstruktion und damit verbundene Prognoseuntersuchung
Um den prädiktiven Wert von nicotinamid-stoffwechselgekoppelten differenziell exprimierten Genen (NMRDEGs) im Endometriumkarzinom (UCEC) zu bestimmen, nutzten Forscher eine Univariate Cox-Regressionsanalyse, um zunächst vererbbare Faktoren des Bewerbers zu klassifizieren; solche mit einem Risikoanteil (HR) > 1 und p-Wert < 0,1 wurden als geeignet für das multivariate Cox-Relativrisiko-Framework eingestuft.
Kriterien für die Univariate Cox-Auswahl: p < 0,10 und HR > 1.Log 2-TPM-normalisierte Ausdruckswerte wurden im multivariaten Cox-Modell verwendet. Eine lineare Kombination von Cox-Koeffizienten × Genexpression wird verwendet, um den Risikoscore zu bestimmen. 1-, 3- und 5-Jahres-OS-Wahrscheinlichkeiten wurden bei der Nomogrammkalibrierung verwendet.1-, 3- und 5-Jahres-OC-Werte wurden in zeitabhängigen ROC verwendet. Der surv_cutpoint Max-Statistik-Ansatz wurde verwendet, um Überlebensgrenzwerte zu ermitteln. Sowohl KM- als auch ROC-Analysen verwendeten dieselben Schwellenwerte.
Ein Nomograph wurde aus dem multivariaten Cox-Modell konstruiert, um dessen Genauigkeit oder Prädiktionsfähigkeit zu bewerten und die Wahrscheinlichkeit einer Gesamtexistenz von 1, 3 und 5 Jahren zu berechnen. Standardisierungsbögen werden verwendet, um die Stabilität zwischen prognostizierten Prognosen und realen Konsequenzen zu bewerten, und die Entscheidungskurvenanalyse (DCA) wurde eingesetzt, um die medizinische Nützlichkeit der Strukturzu messen.
mRNA-Expressionsniveaus wurden als normalisierte log₂-transformierte Datensätze pro Million (TPM)-Werte mittels des DESeq2-Pakets bestimmt. TPMs berücksichtigten die Sequenzierungskomplexität und Genmessung, um robuste und unverzerrte Schätzungen der Expressionsniveaus zwischen den Proben zu liefern.
Anhand der Koeffizienten des multivariaten Cox-Modells wurde die prognostische Hazard-Bewertung jedes Patienten wie folgt bestimmt:
riskScore = Σi Koeffizient (Geni) *mRNA-Expression (Geni) (1)
Kaplan-Meier-(KM)-Existenzbögen wurden erstellt, um die allgemeine Ausdauer von Hoch- und Niedriggefährdenclustern zu bewerten, die auf bestimmten Gefahrenstufen gebildet wurden. Zeitabhängige Empfänger-Funktionsbögen (ROC) wurden bei der Evaluierung von Frameworks bei 1-, 3- und 5-Jahres-Phasen erzeugt – Ideen26,27.
Um die Genexpression nach Hoch- und Niedrigexpressionssammlungen für die Überlebensstratifizierung zu kategorisieren, wird die Nutzung der surv_cut Punkt-Rolle nach dem Survminer-R-Paket verwendet. Diese Funktion bestimmt den größten Grenzwert, indem sie die standardisierte Log-Rang-Statistik maximiert und so einen unvoreingenommenen, statistisch optimalen Grenzwert ergibt.
Die für jedes prognostischen Gen erhaltenen Grenzwerte werden in den ROC-Kurven als gestrichelte Linien angegeben. Die Forschung wandte dieselben Schwellenwerte für alle Überlebens- und ROC-Analysen an.
TCGA RNA-seq wurde im HTSeq-FPKM-Format heruntergeladen; klinische Daten wurden als TSV-Phänotypdateien importiert; FPKM wurde in TPM umgewandelt und log₂-transformiert; GEO-Datensätze wurden von Sonden-IDs zu Gensymbolen mithilfe von Plattformannotationen abgebildet; Duplikatproben wurden für einen einzelnen Genwert gemittelt; Proben mit mehr als 20 % fehlenden klinischen Informationen wurden ausgeschlossen; ComBat (empirische Bayes) wurde für die Batchkorrektur von GSE-Datensätzen verwendet; PCA und Boxplots wurden verwendet, um zu überprüfen, dass die Batch-Korrektur erfolgreich war. TPM-Normalisierung mit Standard-Ausdruckstransformationstechniken; Batchkorrektur mit ComBat und Datensatzursprung als Batch-Variable; differentielle Expression berechnet mittels Limma-Linearmodellierung (Tumor- vs. Normaldesign-Matrix); rangierte Genlisten, die aus log₂-Fold-Änderungen für GSEA-Eingaben generiert werden; sowie univariate und multivariate Cox-Regressionen, die mit Überlebensanalysetools durchgeführt wurden
6. Gen-Set-Variationsanalyse (GSVA)
GSVA28 wurde verwendet, um die Verbesserungen zwischen den Clustern zu messen. Im TCGA-UCEC-Datensatz wurden 50 typische Pfade angereichert, von denen 41 wichtige Veränderungen zwischen den binären Assemblies zeigten. GSVA wurde zusammen mit typischen Gensets verwendet, um die Signalwegaktivität pro Probe zu bestimmen; STRING-Proteininteraktionsdaten wurden in Cytoscape importiert; der MCC-Algorithmus wurde verwendet, um Hub-Gene zu identifizieren; Risikowerte wurden als Summe der Genexpressionswerte multipliziert mit ihren Cox-Koeffizienten berechnet; zeitabhängige ROC-Kurven wurden mit Überlebenszeit-ROC-Routinen erzeugt. Für jede Stichprobe berechnete GSVA die Anreicherungswerte auf Pfadniveau. Der Wilcoxon-Rangsummentest wird verwendet, um Unterschiede in der Aktivität der Hallmark-Pfade zu bewerten. Von den fünfzig Signaturpfaden waren einundvierzig signifikant unterschiedlich (angepasst p < 0,05).
7. Protein-Protein-Interaktionssystem (PPI)
Ein PPI-System, das die wichtigen Gene (AURKA, CDKN3, FOXM1, CDKN2A, TK1 und CDK1) enthält, wurde mit der STRING-Datei29 und einem Kommunikationswertschwelle von 0,70 erstellt, was auf eine hohe Zuverlässigkeit hinweist. Dieses Netzwerk wurde mit Cytoscape30 geschaffen und hebt Interaktionen hervor, die eine entscheidende Rolle bei der UCEC-Pathogenese spielen könnten. Die Maximal-Clique-Zentralität (MCC) Methode31 war nützlich, um den vererbbaren Faktor zu bewerten, der auf ihren Interaktionswerten im Netz erzeugt wurde. Die oberen 10 Proteinsequenzen mit den höchsten Interface-Werten wurden anerkannt, darunter CDK2, CDK4, CCNA2, CCNB1, CCNE1, CDK1, TP53 und FOXM1. Diese Gene wurden weiter hinsichtlich ihrer Beteiligung an kritischen biologischen Prozessen analysiert. Die GeneMANIA-Plattform32 wurde außerdem verwendet, um zusätzliche Proteininteraktionen vorherzusagen und einen breiteren Kontext für die Schlüsselrollen der Schlüsselgene im UCEC-Fortschreiten zu bieten. Schwelle für STRING-Konfidenzwert: >0,70 (hohe Sicherheit). Cytoscape zeigt das Netzwerk an. Die Maximal-Clique-Zentralität (MCC)-Technik wird verwendet, um Hub-Gene zu bewerten. Das MCC-Ranking wurde verwendet, um die wichtigsten interagierenden Gene (CDK2, CCNA2, TP53 usw.) zu identifizieren. Zusätzliche Interaktionsvorhersagen werden mit GeneMANIA gemacht.
8. Technologie-Fahrplan
Der gesamte Arbeitsablauf und die in dieser Studie verwendeten Methoden sind in der in Abbildung 1 dargestellten Technologie-Roadmap zusammengefasst. Diese Roadmap beschreibt die Schritte von der Datensatzerfassung und der Analyse differenzieller Expression bis hin zur Erstellung prognostischer Modelle und Anreicherungsanalysen.
9. Statistische Analyse
Datenverarbeitung und statistische Schätzungen wurden mit dem R-Programm (v4.3.0) durchgeführt. Der Mann-Whitney U-Test oder der Independent Student's t-Test wurde für Zweigruppenvergleiche verwendet; der Kruskal-Wallis-Test wurde für drei oder mehr Baugruppen eingesetzt. Die deskriptiven Daten wurden mit Chi-Quadrat- oder Fisher-Exakt-Test bewertet. Darüber hinaus wurden die Spearman-Korrelation und die Kaplan-Meier-Überlebensanalyse durchgeführt; p < 0,05 wurde als signifikant angesehen.
Anwendung statistischer Tests entsprechend der Datenverteilung: Normale Daten mit dem T-Test des Schülers. Mann-Whitney U-Test auf Daten, die nicht normal sind. Kruskal-Wallis testen für mehr als drei Gruppen. Fishers exakte und Chi-Quadrat-Werte für kategoriale Daten. Die statistische Signifikanz ist definiert als p < 0,05.
Die Datenzuverlässigkeit wird durch die Pretreatment-Checkpoints aufrechterhalten, wobei Boxplots eine konsistente Ausdrucksvarianz über Proben hinweg zeigen sollten und PCA-Plots das Fehlen batch-spezifischer Cluster nach ComBat-Anpassung zeigen sollten. Heatmaps, die die Tumor-Normal-Gruppierung zeigen, und Vulkandiagramme, die die Gen-Up/Down-Regulation klar veranschaulichen, sind für die DEG-Validierung notwendig. Für das Projektionsmodell Cox sollten Kalibrierungsdiagramme das vorhergesagte und tatsächliche Überleben übereinstimmen, die ROC-AUC-Werte sollten größer als 0,65 betragen und KM-Bögen einen erheblichen Überlebensunterschied zeigen. Verschiedene Routenaktivitäten zwischen Risikogruppen sollten durch GSVA-Analyse nachgewiesen werden, entsprechend etablierten Mechanismen wie Expansions- oder Zellzyklusrouten. Um die Netzwerkresilienz zu überprüfen, müssen hochgekoppelte Knoten im PPI-Netzwerk zentral erscheinen, und Hub-Gene, die durch MCC bestimmt sind, sollten physiologisch signifikanten Regulatoren übereinstimmen.