Genomweite Kartierung von Histonmodifikationen und Bindungsstellen von Transkriptionsfaktoren in neuroendokrinen kleinzelligen Lungenkrebszelllinien mittels CUT&RUN

Zusammenfassung

Ein optimiertes Cleavage Under Targets and Release Using Nuclease gefolgt von Next-Generation-Sequenzierungsprotokoll (CUT&RUN-seq) wird für neuroendokrine kleinzellige Lungenkrebszelllinien beschrieben. Es ermöglicht eine genomweite Kartierung verschiedener Histonmodifikationen und Bindungsstellen von Transkriptionsfaktoren (z. B. E2F7), um epigenetische und transkriptionelle Deregulation in der SCLC-Pathobiologie zu untersuchen.

Zusammenfassung

Chromatin-Remodeling-Proteine und Transkriptionsfaktoren (TFs) spielen eine entscheidende Rolle in der Tumorbiologie des kleinzelligen Lungenkrebses (SCLC). Eine genomweite Charakterisierung von histon-posttranslationalen Modifikationen (PTMs) und TF-Bindungsstellen ist essenziell, um regulatorische DNA-Elemente und Genwege zu identifizieren, die zu einem tieferen mechanistischen Verständnis des SCLC und zur Nominalierung von Zielen für therapeutische Interventionen führen. Cleavage Under Targets and Release Using Nuclease gefolgt von Next-Generation-Sequenzierung (CUT&RUN-seq) ist eine leistungsstarke Methode zur Kartierung spezifischer Histonmodifikationen und zur Bestimmung der DNA-Bindungsprofile einer Vielzahl von Proteinen in situ im zellulären Genom. Bei CUT&RUN wird die mikrokokkale Nuklease (MNase), die mit Protein A/G fusioniert ist, über Antikörper an die genomischen Orte chromatinassozoziierter Proteine rekrutiert, wo die zugrunde liegenden DNA-Fragmente bei Aktivierung und Spaltung von MNase-Masschromatin freigesetzt werden. Diese lokalisierte Verdauung erzeugt kleine, locusspezifische DNA-Fragmente, die für die Sequenzierung geeignet sind.

Hier präsentieren wir ein detailliertes Protokoll zur Profilierung der Histonmodifikationen H3K4me3 (assoziiert mit aktiven oder offenen Promotoren) und H3K4me1 (assoziiert mit aktiven Enhancern) sowie des Transkriptionsfaktors E2F7 im SCLC. Dieses Protokoll wurde für neuroendokrine (NE) SCLC-Zelllinienmodelle optimiert, die typischerweise durch große Kerne, spärliches Zytoplasma und Wachstum als nicht-adhärente Aggregate in Suspension gekennzeichnet sind.

Einleitung

Histon-posttranslationale Modifikationen (PTMs) und Transkriptionsfaktoren (TFs) sind zentrale Regulatoren der Genexpression. Histon-PTMs, wie Acetylierung, Methylierung, Phosphorylierung und Ubiquitinierung, beeinflussen hauptsächlich an ihren N-terminalen Schwänzen die Chromatinstruktur ^1,2. Bei Krebs sind Histon-PTMs oft dysreguliert, was zu einer aberranten Aktivierung von Onkogenen oder zum Schweigen von Tumorsuppressorgenen³ führt. TFs binden spezifische DNA-Sequenzen an Promotoren oder Enhancern, um Zielgene zu aktivieren oder zu unterdrücken, oft indem sie histonmodifizierende Enzyme rekrutieren, die die Chromatin-Remodellierung^{koordinieren 4}. Enzyme, die Histonmarkierungen schreiben, löschen oder lesen, wie Histonacetyltransferasen (HATs), Histondeacetylasen (HDACs) und Methyltransferasen (HMTs), sind bei Krebs häufig mutiert oder dysreguliert, was sie zu attraktiven therapeutischen Zielen^macht.

Im SCLC sind epigenetische Veränderungen und lineage-definierende Transkriptionsfaktoren (LDTFs) zentrale Treiber der Tumorbiologie⁶. Im Gegensatz zu genetischen Mutationen regulieren epigenetische Veränderungen, einschließlich DNA-Methylierung und Histonmodifikationen, die Genexpression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern. Diese Modifikationen können Tumorsuppressorgene zum Schweigen bringen oder Onkogene aktivieren, was das aggressive Verhalten des SCLC befeuert. Zum Beispiel wird die Histonmethyltransferase KMT2D häufig mit einer Alterationshäufigkeit von 12,9 % in einer großen realen SCLC-Patientenkohorte 7 mutiert^{und ist} verantwortlich für die Histon-H3-Lysin-4-Monomethylierung (H3K4me1), ein Zeichen, das mit aktiven Enhancer-Regionen im Genom assoziiert ist. SCLC ist eine molekular heterogene Erkrankung. SCLC werden in molekulare Subtypen klassifiziert, basierend auf der differenziellen Expression von vier LDTFs: Achaete-Scute-Homolog 1 (ASCL1), neurogener Differenzierungsfaktor 1 (NEUROD1), yes-assoziiertes Protein 1 (YAP1) und POU-Klasse-2-Homeobox 3 (POU2F3). Die neuroendokrinen (NE) Subtypen, darunter ASCL1 und NEUROD1, machen etwa 70–80 % der SCLC-Fälle^aus. Daher kann die Untersuchung der Verteilung und der Profile verschiedener Histon-PTMs und TF-Bindungsstellen in den verschiedenen SCLC-Subtypen aufklären, dass subtypspezifische Genprogramme anfällig für therapeutische Interventionen sind.

Die traditionelle Methode zur Identifizierung von Histon-PTMs und den Bindungsstellen sequenzspezifischer regulatorischer Proteine auf genomweiter Ebene ist die Chromatin-Immunpräzipitationssequenzierung (ChIP-seq)⁹. Allerdings benötigt ChIP-seq eine große Anzahl von Eingabezellen und liefert oft einen hohen Hintergrund im gesamten Genom. Daher benötigt ChIP-seq ein hohes Maß an Anreicherung des Zielproteins, um echtes Signal von Rauschen zu unterscheiden, und benötigt eine tiefe Sequenzierung für eine effektive Datenanalyse. Zusätzlich kann das in ChIP-seq verwendete Formaldehyd-Crosslinking Epitope maskieren und falsch-positive Bindungsstellen^{erzeugen 10}. Spaltung unter Zielen und Freisetzung mit Nuklease, gefolgt von Next-Generation-Sequencing (CUT&RUN-seq), ist eine hochauflösende Alternative zur Kartierung von Histon-PTMs und TF-Bindungsstellen in situ innerhalb intakter Zellen. Bei dieser Methode werden permeabilisierte Zellen mit einem Antikörper inkubiert, der auf das chromatinassoziierte Protein abzielt, gefolgt von der Bindung eines Protein-A(G)-Mikrokokkalnuklease-(MNase)-Fusionsproteins. Die gezielte DNA-Verdauung, die das Protein flankiert, wird dann unter Bedingungen mit hohem Kalzium- und Salzarm induziert, wobei spezifische DNA-Fragmente zur Reinigung freigesetzt werden. Die gereinigten DNA-Fragmente werden verwendet, um barcodebasierte Sequenzierungsbibliotheken zu erstellen, die für Hochdurchsatzsequenzierungen 11,12,13,14 zusammengelegt werden können. Im Vergleich zu ChIP-seq benötigt CUT&RUN deutlich weniger Zellen als Eingabe, erzeugt weniger Hintergrundrauschen, vermeidet Crosslinking-Artefakte und benötigt weniger Sequenzierungslesungen – was es besonders geeignet macht, dynamische Chromatinzustände bei Krebs kosteneffizient zu untersuchen.

Die CUT&RUN-Technologie wurde entwickelt, um die genomischen Standorte der chromatin-interagierenden Proteine zu untersuchen, einschließlich Histonmodifikationen, TF-Bindungsstellen und chromatinassoziierter Komplexe, wodurch epigenetische regulatorische Landschaften^11,12 aufgedeckt werden. Diese Technik ermöglichte detaillierte Analysen der Enhancer-Promotor-Architektur, der Regulierung des transkriptionalen Netzwerks und der Chromatinzustandsdynamik während der Entwicklung und des Krankheitsverlaufs¹⁵. In der Krebsforschung ermöglicht CUT&RUN eine präzise Kartierung von Histonmarken^16,17 und der Besetzung des onkogenen Transkriptionsfaktors und hilft dabei, linienspezifische Regulationsprogramme und potenzielle therapeutische Ziele^{zu identifizieren 15,16}. Darüber hinaus kann CUT&RUN in situ in Zellen durchgeführt werden, einschließlich CD8+ T-Zelle¹⁷, sowie an Gewebeproben^18,19.

Um die genomische Position von PTMs und Transkriptionsfaktor-E2F7-Bindungsstellen in SCLC-Subtypen nachzuweisen, haben wir CUT&RUN-seq auf vier SCLC-NE-Zelllinienmodelle angewendet: H146 und DMS79 (ASCL1-Subtyp) sowie H446 und H82 (NEUROD1 Subtyp), mit oder ohne KMT2D-Mutationen. Wir profilierten das Histonzeichen H3K4me1, eine mit einem Enhancer assoziierte Modifikation, die hauptsächlich durch KMT2D katalysiert wird, und E2F7, das als Kofaktor von ASCL1²⁰ nachgewiesen wurde. Das Histonzeichen H3K4me3, das mit aktiven Promotoren assoziiert ist, diente als positive Kontrolle, während IgG als negative Kontrolle diente.

Hier präsentieren wir ein detailliertes CUT&RUN-seq-Protokoll für SCLC NE-Zelllinien, basierend auf Folgendem: einem kommerziell erhältlichen CUT&RUN-Kit (siehe Materialtabelle), der Originalarbeit von Skene und Henikoff 11,12,13 sowie unseren eigenen Laboroptimierungen.

Protokoll

HINWEIS: Dieses Protokoll (Abbildung 1) bietet Schritt-für-Schritt-Anweisungen zur Durchführung von CUT&RUN-seq in SCLC NE-Zelllinien, die typischerweise als nicht anheftige Aggregate oder schwebende Cluster wachsen.

1. Zellkultur

1. Erhaltung der Zelllinien DMS79 (ASCL1-Subtyp), H146 (ASCL1-Subtyp), H82 (NEUROD1 Subtyp) und H446 (NEUROD1 Subtyp) in 13 ml RPMI-1640-Medien, ergänzt durch 10 % fetales Rinderserum (FBS) und 1 % Penicillin/Streptomycin (siehe Materialtabelle) in 75-mL-Kolben. Kultivieren Sie die Zellen in einem Inkubator bei 37 °C mit 5 %_CO2.
   HINWEIS: Alle in dieser Studie verwendeten Zellen wurden vom ATCC gekauft und mit kurzem Tandem-Repeat-Profiling authentifiziert.

2. Zellpermeabilisierung

HINWEIS: Eine ordnungsgemäße Zellpermeabilisierung ist unerlässlich, damit Antikörper, pAG-MNase und verdaute Protein-DNA-Fragmente frei in und aus den Zellen diffundieren können. Vor Beginn des CUT&RUN-Protokolls an einer neuen Zelllinie sollten Optimierungen durchgeführt werden, um die ideale Digitoninkonzentration für eine effektive Permeabilisierung zu bestimmen. Die niedrigste Konzentration, um mehr als 95 % Permeabilisierung zu erreichen (95 % der Zellen sind "tot"), sollte für das CUT&RUN-Protokoll verwendet werden.

1. Legen Sie den 5%igen Digitonin-Fond, den Proteasehemmer und das Spermidin auf Eis und lassen Sie sie vollständig auftauen.
2. Bereite den Waschpuffer gemäß Tabelle 1 vor und lasse den Puffer auf Eis.
3. Bereiten Sie eine 0,05%ige Digitonin-Arbeitslösung vor, indem Sie 10 μL des 5%-Materials mit 990 μL Wash Buffer mischen. Gründlich durch Vortex mischen und auf Eis lassen.
4. Erzeugen Sie eine Verdünnungsserie von Digitonin (0,05 %, 0,01 %, 0,001 % und 0,0001 %), indem Sie die vorherige Lösung sequentiell auf ein Endvolumen von 1 ml jeder Röhre verdünnen. Wirbel jede Verdünnung vor, bevor sie zur nächsten übergeht. Gleichzeitig bereiten Sie eine 0,05%ige Dimethylsulfoxid-(DMSO)-Kontrolle im Waschpuffer vor (insgesamt 100 μL; siehe Tabelle 2).
   HINWEIS: Digitonin und DMSO sind gefährliche Chemikalien. Gehen Sie vorsichtig mit und entsorgen Sie alle Abfälle in einem korrekt gekennzeichneten Behälter für gefährliche Abfälle mit sicheren Deckeln.
5. Lassen Sie alle Digitonin-Verdünnungslösungen und die DMSO-Steuerung auf Eis, bis sie verwendet werden.
6. Bestimmen Sie die Anzahl der benötigten Zellen, indem Sie die Anzahl der Permeabilisierungsbedingungen mit der Anzahl der pro Test benötigten Zellen multiplizieren. Fügen Sie zusätzlich 20 % hinzu, um Pipettiervariationen auszugleichen (z. B. für fünf Bedingungen mit jeweils 5×10⁵ Zellen, etwa 1,2 x 5 x 5 x 10⁵ Zellen vorbereiten).
7. Sammeln Sie die erforderliche Anzahl kultivierter Zellen durch Zentrifugation bei 600 × g für 3 Minuten bei Raumtemperatur (RT). Das Pellet in 600 μL 1× PBS (100 μL pro Zustand plus 20 % extra) wieder suspendieren.
8. Aliquot 100 μL der PBS-resuspendierten Zellen in fünf 1,5-mL-Mikrozentrifugenröhren – ein Rohr für jede Digitoninkonzentration und eines für die DMSO-Kontrolle.
9. Zentrifugiere die Röhren bei 600 × g für 3 Minuten bei RT.
10. Entfernen Sie vorsichtig den Überstandsstoff und suspendieren Sie jedes Pellet in 50 μL des entsprechenden Digitonin- oder DMSO-Kontrollpuffers.
11. Inkubiere die Proben bei RT für 10 Minuten.
12. Man mischt 10 μL der behandelten Zellen mit 10 μL Trypanblau und legt 10 μL der Mischung auf einen Zellzähl-Objektträger.
13. Verwenden Sie einen Zellzähler, um lebensfähige Zellen (ungefärbt) und nicht lebensfähige, permeabilisierte positive Zellen (blau gefärbt) zu quantifizieren.
14. Identifizieren Sie die niedrigste Digitoninkonzentration, die den höchsten Anteil an Trypan-Blue-positiven Zellen erzeugt. Verwenden Sie diese Konzentration für das nachgeschaltete CUT&RUN-Experiment. Bestätigen Sie, dass die DMSO-Kontrolle die Lebensfähigkeit aufrechterhält, die typisch für eine normale gesunde Zellkultur ist.

3. CUT&RUN-Seq

HINWEIS: Die Reagenzien in diesem Protokoll sind auf 5 Reaktionen skaliert, wobei zusätzlich hinzugefügt wird, um den Pipettverlust auszugleichen. Eine Liste der Materialien und Ausrüstung finden Sie in Tabelle der Werkstoffe. Für jedes CUT&RUN-Experiment werden mindestens zwei unabhängige biologische Replikate empfohlen.

1. Tag 1
   1. CUT&RUN-Puffervorbereitung
      1. Bereiten Sie den Wash-Puffer vor, indem Sie Pre-Wash-Puffer, 25-fachen Protease-Inhibitor und 1 M Spermidin kombinieren, wie in Tabelle 3 beschrieben.
      2. Bereiten Sie den Zellpermeabilisierungspuffer vor, indem Sie gemäß Tabelle 3 5 % Digitonin zum Waschpuffer hinzufügen.
      3. Bereiten Sie den Antikörperpuffer vor, indem Sie 0,4 μL EDTA zu 100 μL Zellpermeabilisierungspuffer mit der entsprechenden Digitoninkonzentration hinzufügen, wie in Tabelle 3 beschrieben. Stellen Sie den vorbereiteten Puffer auf Eis.
      4. Lagern Sie den verbleibenden Zellpermeabilisierungspuffer bei 4 °C für die Verwendung am zweiten Tag.
   2. Aktivierung von Concanavalin A (ConA) Perlen
      1. ConA-Perlenaufhängung vorsichtig wieder aufhängen, um eine gleichmäßige Verteilung zu gewährleisten.
      2. Transferiere 55 μL der Perlensuspension (11 μL pro Probe) in ein 1,5 mL Mikrozentrifugenrohr.
      3. Setze das Rohr auf ein 1,5-mL Magnetrack, bis die Perlen vollständig getrennt sind, und pipette dann, um das Überleitungsmittel zu entfernen.
      4. Waschen Sie die Perlen sofort zweimal mit 500 μL eiskaltem Perlenaktivierungspuffer (100 μL pro Probe). Die Perlen durch sanftes Pipettern für jede Wäsche wieder aufhängen und verwenden Sie das magnetische Gitter, um zwischen den Waschgängen das Überdeckmittel zu entsorgen.
      5. Nach der letzten Waschung wird das Supernatant entfernt und die aktivierten Perlen vorsichtig in 55 μL (11 μL pro Probe) eines eiskalten Perlenaktivierungspuffers wieder suspendiert.
      6. Aliquot 10 μL der Perlen werden in jedes Rohr eines 8-Streifen-Röhrensatzes aufgehängt und die Röhren auf Eis gehalten.
   3. Zellen entnehmen und Zellen an aktivierte Perlen binden
      HINWEIS: Die Zellviabilität ist wichtig für das Verhältnis von Signal zu Hintergrund. Die Lebensfähigkeit von SCLC NE-Zelllinien kann jedoch variabel sein (70 %–90 %), da der von Natur aus hohe Zellumsatzrate und die Präferenz, als mittelgroße bis große Aggregate in Suspension zu wachsen, zu wachsen.
      1. Entnehmen Sie die Zellen aus dem 37 °C Inkubator und untersuchen Sie sie unter dem Mikroskop, um die Qualität sicherzustellen.
      2. Die Zellsuspension in ein 50-mL konisches Rohr übertragen und bei 1.000–1.200 × g für 5 Minuten bei RT zentrifugieren.
      3. Saugen Sie das Medium aus dem konischen Rohr ab und spülen Sie das Zellpellet mit 20 ml 1× PBS.
      4. Zentrifugieren Sie erneut, aspirieren Sie das PBS und verdauten Sie das Pellet mit Accutase 3–5 Minuten bei 37 °C, abhängig von der Größe des Pellets.
      5. Beenden Sie die Verdauung, indem Sie 5 ml PBS + 10 % FBS hinzufügen. Erhalten Sie die Einzelzell-Suspension, indem Sie sanft mit einer serologischen Pipette auf und ab pipetten.
      6. Zentrifugiere die Zellen bei 1.000–1.200 g × g für 5 Minuten, entsorge das Supernatant und suspendiere das Zellpellet in 5 mL PBS neu.
      7. Zähle die Startzellen, prüfe die Lebensfähigkeit und Integrität der Zelle.
      8. Berechnen Sie die Gesamtzahl der benötigten Zellen, indem Sie die Anzahl der Reaktionen mit der Anzahl der Zellen pro Reaktion multiplizieren (5×10,⁵). Fügen Sie 20 % Überschuss hinzu, um Pipettierungsfehler auszugleichen (z. B. 1,2 × 6 × 5 × 10⁵ für 6 Reaktionen). Übertragen Sie die berechneten Zellsuspensionen auf 1,5-mL-Röhren. Zentrifuge bei 600 x g, 3 Minuten bei RT.
         HINWEIS: Bereiten Sie mindestens eine zusätzliche Reaktion als Backup vor.
      9. Die Zellen werden im RT Wash Buffer mit einer Dichte von 5×10⁵ Zellen pro Reaktion (insgesamt sechs Reaktionen) wieder suspendiert, wobei 100 μL pro Reaktion verwendet werden, wobei eine sanfte, aber gründliche Pipetterung gewährleistet ist, um eine gleichmäßige Suspension zu gewährleisten. Zentrifugiere bei 600 x g für 3 Minuten bei RT. Pipette verwenden, um das Überwassermittel zu entfernen.
      10. Wiederhole den Waschschritt (Schritt 9) noch einmal.
      11. Aliquot 100 μL gewaschene Zellen in jedes Rohr im 8-Streifen-Set mit 10 μL aktivierter CoA-Perlen. Sanft mit einer Pipette zum Mischen und schnell in einer Mini-Zentrifuge drehen, um den Schlamm aufzufangen (Perlen sollten nicht absetzen).
      12. Inkubieren Sie den Perlenzell-Slurry für 10 Minuten bei RT, damit sich die Zellen an die Perlen binden können.
      13. Setze Röhren auf ein 0,2-ml-Röhren-Magnetgestell, lass den Schlauch klar werden und pipette, um das Überstandsmittel zu entfernen. Bewahren Sie 10 μL Supernatant auf, um zu bestätigen, dass Zellen an Perlen gebunden sind. Verwerfe das verbleibende Supernatant und gehe schnell zum nächsten Schritt über.
      14. Entferne die Schläuche aus dem Magneten. Fügen Sie jeder Reaktion sofort 50 μL eiskalten Antikörperpuffer hinzu und pipieren Sie die Perlen vorsichtig.
      15. Mischen Sie 10 μL sowohl des Supernatanten als auch 10 μL der Zell-/Perlensuspension (im Antikörperpuffer wieder suspendiert) mit 10 μL Trypanblau und laden Sie das Gemisch auf den Zellzähler-Schlitten.
      16. Analysieren Sie mit einem Zellzähler. Bestätigen Sie, dass der Supernatant fast keine Perlen oder Zellen enthält und die Mischung aus Permeabilis, die von Perlen umgeben sind.
          HINWEIS: Es ist wichtig, die Bindungskompatibilität der CoA-Kugeln der Zellen zu überprüfen.
   4. Permeabilisierung und Antikörperbindung
      HINWEIS: Der Erfolg von CUT&RUN hängt entscheidend von der Affinität des Antikörpers zu seinem Ziel und seiner Spezifität unter bestimmten experimentellen Bedingungen ab. Wir empfehlen Folgendes: 1. Verwenden Sie kommerzielle Antikörper, die für CUT&RUN validiert sind, sofern verfügbar. 2. Für Ziele ohne CUT&RUN-validierte Antikörper sollten solche betrachtet werden, die für Immunfluoreszenz (IF) validiert sind, da IF-Antikörper Epitope im nativen zellulären Kontext erkennen, ähnlich wie die in-situ-Bindung von Antikörpern an das Ziel in permeabilisierten Zellen von CUT&RUN. 3. Testen Sie 3-5 Antikörper parallel, um die effektivste für Ihre spezielle Anwendung zu identifizieren.
      1. Drehen Sie das K-MetStat-Panel schnell und pipetten, um es wieder aufzuhängen. Fügen Sie 2 μL K-MetStat Panel zu Reaktionen hinzu, die für H3K4me3-positive und IgG-Negativkontrollantikörper bestimmt sind. Pipette zum Mischen und Schnell-Spin-Röhrchen (optional).
      2. Fügen Sie jeweils 0,5 μg H3K4me3, H3K4me1 und IgG-Antikörper sowie 0,6 μg E2F7 polyklonalen Antikörper aus verschiedenen Quellen zu jeder Reaktion hinzu (Tabelle 4). Beschrifte die 8-Streifen-Röhren.
      3. Pipette vorsichtig, um jedes Reaktionsrohr richtig zu mischen. Über Nacht bei 4 °C auf einem Nutator mit erhöhten Röhrenkappen inkubieren. Drehen oder wenden Sie die Röhren nicht ^um.
2. Tag 2
   1. Bindung von pAG-MNase an den Antikörper
      HINWEIS: Perlen, die sich über Nacht absetzen, sind normal und beeinträchtigen die Ergebnisse nicht. Wenn die Perlen nach der Übernachtung klumpig oder klebrig werden, lassen Sie die Perlen durch sanftes Pipettern wieder aufhängen. Um Konsistenz und Durchsatz zu verbessern, wird Mehrkanal-Pipetterung empfohlen. Bei der Verwendung von 8-Streifen-Röhrchen entfernen und ersetzen Sie die Pufferstoffe jeweils einzeln, um ein Austrocknen der ConA-Perlen zu verhindern.
      1. Stell den Magnetstand auf Eis.
      2. Entfernen Sie die 8-Streifen-Röhrchen aus der 4 °C-Inkubation und drehen Sie sie schnell, um Flüssigkeit zu sammeln.
      3. Stellen Sie Schläuche auf den Magnethalter, bis der Schlamm frei ist. Pipette vorsichtig und entferne das Überlagermittel.
      4. Lass die Schläuche auf dem Magnetständel stehen. Waschen Sie die Schläuche zweimal mit 200 μL kaltzelliger Permeabilisierungspuffer. Pipette verwenden, um Überwassermittel zu entfernen.
      5. Entfernen Sie die Röhrchen vom Magnetstand und fügen Sie jeder Reaktion sofort 50 μL Cold Cell Permeabilization Buffer hinzu. Sanftes Pipetten, um Zellen/Perlen wieder aufzuhängen.
      6. Fügen Sie jeder Reaktion 2,5 μL pAG-MNase hinzu und mischen Sie sie gut durch sanftes Pipetteren.
      7. Inkubiere die Reaktionen für 10 Minuten bei RT.
      8. Schnell die Röhren drehen, sie zurück auf den Magnethalter stellen, bis die Schlamm verschwunden ist. Pipette verwenden, um Überwassermittel zu entfernen.
      9. Tuben auf dem Magnetstand aufbewahren, die Röhren zweimal mit 200 μL Cold Cell Permeabilization Buffer waschen. Pipette verwenden, um Überwassermittel zu entfernen.
      10. Entfernen Sie die Röhren vom Magnetstand und setzen Sie sie vorsichtig in 50 μL Cold Cell Permeabilization Buffer wieder auf. Legen Sie die Schläuche auf Eis.
   2. Gezielte Chromatinverdauung und -freisetzung
      HINWEIS: Führen Sie eine^Ca-2+-abhängige Verdauung bei 0 °C durch, um die unbeabsichtigte MNase-Spaltung der zugänglichen DNA¹² zu minimieren. Beziehen Sie Spike-in-DNA wie Escherichia coli (E. coli) ein, sodass sie etwa 0,5–5 % (idealerweise ~1 %) der gesamten^{Sequenzierungswerte 13} ausmacht. Spike-in-DNA wird verwendet, um die Sequenzierungstiefe zu normalisieren und ist besonders wichtig beim Vergleich von Proben über eine Reihe hinweg, beispielsweise bei der Bewertung der globalen Histonmodifikationsänderungen nach Hemmung oder genetischer Löschung von histonmodifizierenden Enzymen.
      1. Gib 1 μL 100 mM Calciumchlorid zu jeder Reaktion im 8-Röhrchen-Streifen (ab Schritt 3.2.1.10) während des Eises hinzu. Pipette vorsichtig, um die Perlen vollständig wieder aufzuhängen und eine effiziente Verdauung zu gewährleisten.
      2. Inkubieren Sie die Röhren auf einem Nutator bei 4 °C für 2 Stunden, wobei die verschlossenen Enden erhöht sind.
      3. In einer neuen 1,5-mL-Röhre bereiten Sie den Stop Buffer Mix vor. Für jede Reaktion werden 33 μL Stop Buffer mit 1 μL E. coli Spike-in DNA (0,5 ng) kombiniert. Sanft vortexen, um zu mischen.
      4. Fügen Sie jeder Reaktion am Ende der 2-stündigen Inkubation 33 μL Stopppuffer hinzu. Mischen Sie durch sanftes Pipetteren.
      5. Inkubieren Sie die Reaktionen in einem Thermocycler bei 37 °C für 10 Minuten.
      6. Schnell Röhrchen drehen, um den Inhalt am Boden aufzusammeln, und dann auf ein Magnetgestell legen, bis die Lösung klar ist.
      7. Übertragen Sie vorsichtig etwa 84 μL Supernatant, das die von CUT&RUN freigesetzte DNA enthält, in frische 1,5-mL-Röhrchen.
   3. DNA-Reinigung mit dem DNA Purification Kit (siehe Materialtabelle)
      HINWEIS: Vor der ersten Anwendung geben Sie 6,9 ml Isopropanol zum DNA-Bindungspuffer und 20 ml ≥ 95 % Ethanol zum DNA-Waschpuffer.
      1. Fügen Sie jedem gesammelten Supernatant 420 μL DNA-Bindungspuffer hinzu. Vortex kurz, um gründlich zu mischen.
      2. Setzen Sie eine DNA-Reinigungssäule in die Sammelröhren.
      3. Laden Sie jede Probe auf die entsprechende Spalte.
      4. Zentrifugiere bei 16.000 × g für 30 Sekunden bei RT. Entsorge den Durchfluss und bring die Säule zurück ins Sammelrohr.
      5. Fügen Sie jeder Säule 200 μL DNA-Waschpuffer hinzu und zentrifugieren Sie bei 16.000 x g für 30 Sekunden bei RT. Entfernen Sie den Durchfluss und ersetzen Sie die Säule im Sammelrohr.
      6. Wiederhole den Waschschritt einmal.
      7. Zentrifugiere erneut bei 16.000 x g für 30 Sekunden bei RT, um den Restwäschpuffer vollständig zu entfernen.
      8. Transfert die Säulen auf beschriftete 1,5-ml-Röhren.
      9. Übertragen Sie 12 μL Elutionspuffer direkt auf die Membran in der Mitte der Säule.
      10. Inkubiere 5 Minuten bei RT und zentrifugiere dann bei 16.000 × g für 1 Minute bei RT, um die DNA zu elutieren.
          HINWEIS: Dies ist ein sicherer Anhaltspunkt. Speichern Sie elutierte DNA bei -20 °C für die spätere Verarbeitung.
   4. CUT&RUN-DNA-Quantifizierung und Analyse der Fragmentgrößenverteilung
      HINWEIS: Quantifizieren Sie DNA mit einem Fluorometer und dem dsDNA High Sensitivity Assay Kit, das genauere Messungen von doppelsträngiger DNA liefert als absorbanzbasierte Methoden.
      1. Verwenden Sie 1 μL jeder Probe, um die CUT&RUN-DNA-Konzentration mit dem dsDNA High Sensitivity Assay Kit (siehe Materialtabelle) zu bestimmen.
      2. Verwenden Sie zusätzlich 1 μL DNA, um das Vorhandensein und die Größenverteilung gespaltener Fragmente zu beurteilen. Führen Sie eine Fragmentanalyse mit dem High Sensitivity DNA Kit durch (siehe Materialtabelle) gemäß den Richtlinien des Herstellers (optional).
         HINWEIS: Hochhäufige bindende Proteine, wie Histon-posttranslationale Modifikationen (PTMs), können in diesem Schritt leicht nachgewiesen werden. Allerdings können Transkriptionsfaktoren mit geringer Häufigkeit schwieriger nachzuweisen sein.
   5. Bibliotheksaufbau, Fragmentanalyse und Sequenzierung
      HINWEIS: ≤5 ng Gesamt-CUT&RUN-DNA, bestimmt durch die Quantifizierung des dsDNA High Sensitivity Assay Kit, wurde für den Bau von CUT&RUN-Next-Generation-Sequenzierungsbibliotheken (NGS) verwendet. Um Adapterdimere zu minimieren, reduziert der Adapter von Illumina auf 1 μL für die Adapterligatur. Die Anzahl der PCR-Zyklen während des Bibliotheksaufbaus kann je nach Eingabemenge, Bibliotheksausbeute und Duplizierungsrate angepasst werden. Verschiedene DNA-Reinigungsstrategien Magnetperlen (siehe Materialtabelle) können je nach Zielhiston-PTMs oder Transkriptionsfaktoren verwendet werden.
      1. Der Bibliotheksaufbau erfolgte unter Verwendung des CUT&RUN-Bibliotheksvorbereitungskits (siehe Materialtabelle) gemäß den Anweisungen des Herstellers des Bausatzes, mit kleinen Änderungen. Kurz gesagt, 5 ng CUT&RUN-DNA wurden als empfohlener Input für die Bibliotheksvorbereitung verwendet. Für DNA unter 5 ng solltest du so viel wie möglich für die Bibliotheksvorbereitung verwenden. Für jede Probe wurden duale i5- und i7-Indexprimer verwendet, um eine erfolgreiche multiplexierte Sequenzierung sicherzustellen.
         HINWEIS: Dies ist ein sicherer Anhaltspunkt. Die DNA kann bei -20°C zur weiteren Verarbeitung gespeichert werden.
      2. Messen Sie die Konzentration der CUT&RUN-Bibliothek mit einem Fluorometer und dem dsDNA High Sensitivity Assay Kit. Die Größenverteilung der CUT&RUN NGS-Bibliotheken wurde mithilfe des High Sensitivity DNA Kit (siehe Materialtabelle) bestimmt, basierend auf dem High Sensitivity DNA Kit Guide oder einem vergleichbaren Kapillarelektrophorese-Instrument TapeStation (siehe Materialtabelle).
         HINWEIS: Verdünnen Sie die CUT&RUN-Bibliothek, um die Konzentration in den Nachweisbereich des dsDNA High Sensitivity Assay Kit und des High Sensitivity DNA Kit zu bringen.
      3. Pool-Bibliotheken (40-46) basieren auf gleichen molekularen und einzigartigen Indexen. Nach der DNA-Reinigung wurde die Auswahl der Magnetperlengröße für die gepoolten Bibliotheken auf einem Illumina NovaSeq 6000-System mit einer halben S-Prime (SP) Lesetiefe von geschätzten 10 Millionen Lesezeiten pro Bibliothek durchgeführt.
   6. CUT&RUN-Datenanalyse
      1. Analysieren Sie CUT&RUN-Daten mit einer benutzerdefinierten Pipeline (Abbildung 5A). Bewerten Sie die Lesequalität mit FastQC. Entfernen Sie Adaptersequenzen vom Anfang der Lesungen mit Cutadapt. Aligned-Paired-End-Reads liest auf das menschliche Genom (hg38) und das E.-coli-Referenzgenom mit Bowtie2. Verwende Samtools, um unzugeordnete Lesungen zu entfernen. Entferne doppelte Lesearten mit Picard und generiere bedGraph-Dateien mit Bedtools. Erstellen Sie BigWig-Dateien (BW) mit DeepTools. Visualisieren Sie die Daten mit IGV und DeepTools. Normalisiere die Gesamtlesezählung auf die Spitzen-Lesezahlen von E. coli . Führen Sie Peak Calling mit SEACR (Sparse Enrichment Analysis for CUT&^{RUN) durch}.

Ergebnisse

Typische oder "klassische" SCLC-NE-Zelllinien zeichnen sich durch große Kerne, spärliches Zytoplasma und Wachstum als nicht-haftende Aggregate oder kompakte Sphäroide in Suspension aus. ASCL1-hohe Zelllinien wie NCI-H146 und DMS79 sowie NEUROD1-hohe Zelllinien wie NCI-H82 und H446 weisen diesen klassischen SCLC-Phänotyp auf: kleine bis mittelgroße Zellen mit spärlichem Zytoplasma, feingranulärem Chromatin und einer Tendenz, überwiegend als nicht-adhärente Aggregate oder kompakte Sphäroid...

Diskussion

Epigenetische Dysregulation und LDTFs sind Haupttreiber der SCLC-Tumorbiologie⁶. Die Bestimmung der genomischen Verteilung spezifischer Histonmodifikationen und DNA-bindenden Proteine im SCLC kann potenzielle Mechanismen erworbener therapeutischer Resistenz und phänotypischer Plastizität aufzeigen. CUT&RUN-seq ist eine leistungsstarke Methode zur Kartierung von Histon- und Nicht-Histon-Protein-DNA-Interaktionen mit hoher^{Auflösung 14} aus Zel...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Reagenz
RPMI-1640 media	Gibco ThermoFisher Wissenschaftlich	11875093	Zellkulturmedium
Fetales Rinderserum (FBS)	Neuromik	FBS002-HI	Bestandteil des Zellkulturmediums
1 % Penicillin-Sstreptomycin	Gibco ThermoFisher Wissenschaftlich	15140122	Antibiotika zur Verhinderung bakterieller Kontamination von Zellkulturen
Trypan Blaue Lösung, 0,4 %	Gibco ThermoFisher Wissenschaftlich	15250061	Trypan Blue Staining wurde verwendet, um die Permeabilität mit einem automatisierten Zellzähler zu bewerten.
Roche cOmplete, EDTA-freier Proease Inhibitor Cocktail	Roche	11873580001	Proteasehemmer. Zusammensetzungen des Waschpuffers
5 % Digitonin	EpiCypher	21-1004	Pufferkomponenten  und das Pufferrezept finden Sie im Pufferblatt
Perlen-Aktivierungspuffer	EpiCypher	21-1001	Pufferkomponenten  und das Pufferrezept finden Sie im Pufferblatt
Concanavalin A (ConA)-Perlen	EpiCypher	21-1401	ConA-konjugierte paramagnetische Mikrosphären sind mit Lektin beschichtete magnetische Perlen, die die Lipidmembranbindung ermöglichen
CUT & RUN Kit	CUTANA ChIC EpiCypher	14-1048	Reagenzien für CUT& RUN-DNA-Generierung
DNA-Reinigungskit	CUTANA  EpiCypher	14-0050	Extrahiere DNA aus den freigesetzten, gezielten DNA-Fragmenten im Supernantant der Reaktion
CUT & RUN-Bibliotheksvorbereitungsset	CUTANA EpiCypher	14-001	Generiere den CUT& RUN-Next-Generation-Sequenzierungen (NGS)-Bibliotheken
DNA-Reinigung Magnetperlen	Agencourt AMPure XP Beckman Coulter	A63880	PCR-Produt-Reinigung und Größenauswahl (z. B. Entfernung von Adapter-Dimer und Grundierung)
E. coli Spike-in DNA	EpiCypher	18-1401	Verwendet als exogener Spike-in zur Kalibrierung von Sequenzlesungen über eine Reihe von Samples— zum Beispiel behandelte versus unbehandelte Erkrankungen
pAG-MNase	EpiCypher	15-1016	Nach der Bindung an den primären Antikörper spaltet das Enzym das Ziel-DNA-Fragment auf beiden Seiten des gebundenen Proteins, wenn es durch Kalzium aktiviert wird
PBS PH7.4 1x	Gibco (Thermo Fisher Scientific)	10010-049	Waschzellen
Vorwaschpuffer	EpiCypher	21-1002	Pufferkomponenten  und das Pufferrezept finden Sie im Pufferblatt
dsDNA hohe Sensitivität  Assay-Kit	QubitTM Thermo Fisher Scientific	Q32854	CUT & RUN-DNA-Quantifizierung
Stop-Puffer	EpiCypher	21-1003	Pufferkomponenten  und das Pufferrezept finden Sie im Pufferblatt
Hochsensitives DNA-Kit	Agilent Technoligies	5067-4626	CUT & RUN DNA- und NGS-Bibliotheksanalysen zur Quatifikation und Fragmentgrößenverteilung
Material
8-Streifen 0,2 mL PCR-Röhren	EpiCypher	10-0009k	Rohre für CUT& RUN-Reaktionen, kompatibel mit dem 0,2-ml-Röhren-Magnetseparationsrack
LUNA-8-Kanal-Schieber	Logos BioSystems INC	L72001	Folien zur Zellzählung,  Zellviabilität und Integritätsprüfung
Mehrkanal-Reagenzreservoir	Fisher Scientific	14-387-072	Waschpufferbehälter
DynaMagTM-2 (Magnetseparationsrack), 1,5-mL-Röhren	Thermo Fisher Scientific	12321D	ConA-Perlen wurden durch ein magnetisches Trenngestell aus ihrem Speicherpuffer isoliert und anschließend durch eine Resuspension im Aktivierungspuffer in einem 1,5-mL Mikrozentrifugenröhrchen aktiviert.
Magnetisches Trenngitter, 0,2-mL-Röhren	EpiCypher	10-0008	Stand zu trennen  perlenbindende Zellen, Antikörper, pAG/MNase aus Reaktions- und Waschpuffern
Eppendor Research plus 8-Kanal-Pipette, 0,5–10 μL	Eppendorf	3125000010	Aspirations-8-Streifenröhren-Samples  Um den Arbeitsablauf zu beschleunigen, vergleichbarer Mehrkanal-Pipettor
Eppendorf Refrence 2 8-Kanal-Pipette, 30-300 μL	Eppendorf	4926000050	Aspirations- und Waschschritte zur Beschleunigung des Arbeitsablaufs, vergleichbarer Mehrkanal-Pipettor
Ausrüstung
Scientific Industries Vortex-Genie 2 Mixer, variable Geschwindigkeit, 120V	Fisher Scientific	50-728-002	Min-Zentrifuge und Spin
LUNA FX7 Automatischer Zellzähler	Logos BioSystems INC	L70001	Zellzähler
Nutierender Mixer	VWR	82007-202	Perleninkubationsschritte (nächtliche Antikörperinkubation, pAG-MNase-Verdauungsreaktion).
Eppendorf 6331 Nexus Gradient MasterCycler Thermal Cycler	Eppendorf	6331	CUT & RUN-Bibliotheksbau der nächsten Generation
Qubit 4 Fluorometer	Thermo Fisher Scientific	Q33226	DNA-Quantifizierung.
Agilent 2100 Bioanalyzer	Agilent Technologien	G2939A	Fragmentgröße, Konzentrationsanalyse für CUT & TEST DNA und SCHNITT& RUN-Bibliotheken,  vergleichbares Kapillarelektrophorese-Instrument (z. B. Agilent TapeStation)
Agilent TapeStation	Agilent Technologien	G2992AA	Fragmentgröße, Konzentrationsanalyse für CUT & TEST DNA und SCHNITT& RUN-Bibliotheken
Illumina NovaSeq 6000 System	Illumina, San Diego, CA, USA		Sequenzierung des gepoolten CUT& RUN-bibliotheken