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Forschungsartikel

Regulation des AKT/Wnt/β-Catenin-Pfads und Induktion der Cuproptose durch Curcumin im Glioblastom

651 Ansichten

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DOI:

10.3791/69663

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27. Januar 2026

 , 
1Department of Neurosurgery, The First Affiliated Hospital of Yangtze University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Curcumin (CUM) hemmt den Fortschreiten des Glioblastoms (GBM), indem es Cuproptose durch Suppression der AKT/Wnt/β-Catenin-Achse induziert. Dieses Protokoll untersucht den molekularen Mechanismus, durch den CUM das bösartige Fortschreiten bei GBM behindert, und beschreibt Methoden, um zu bewerten, wie CUM Cuproptose durch Modulation dieses Weges induziert.

Zusammenfassung

Curcumin (CUM) kann das bösartige Verhalten des Glioblastoms (GBM) regulieren. Diese Studie untersucht, ob CUM den GBM-Fortschreiten unterdrückt, indem Cuproptosis über den AKT/Wnt/β-Catenin-Signalweg induziert wird. Optimale Curcumin-Konzentrationen wurden mittels MTT-Tests bestimmt. A172- und U251-Zellen wurden mit CUM, AKT-Inhibitor MK-2206, Wnt-Inhibitor LGK974 und Elsm-Cu (Elesclomol + CuCl2) behandelt. Zellproliferation, Migration, Invasion und Apoptose wurden jeweils mittels Carboxyfluorescein-Succinimidyl-Aminoester-Färbung, Scratch-Assays, Transwell-Assays und Durchflusszytometrie untersucht. MitoSOX-Fluoreszenz, Seahorse-Stoffwechselanalyse, Immunfluoreszenz,Cu-2+- Detektion und Western-Blotting wurden verwendet, um mitochondrialen oxidativen Stress und Cuproptose zu bewerten. Die AKT/Wnt/β-Katenin-Achse wurde mit einem TCF/LEF1-Reporter-Kit und Western-Blotting analysiert. Ein GBM-Xenograft-Modell wurde etabliert, und CUM wurde fünf Wochen lang mittels Gavage verabreicht. Die Effekte von CUM auf das Tumorwachstum, die Cuproptosis und die Proteinexpression des AKT/Wnt/β-Catenin-Signalwegs wurden untersucht. Die Zellen wurden in vitro mit 10 μM und 20 μM CUM behandelt. Die CUM-Behandlung reduzierte Proliferation, Migration und Invasion und förderte oxidativen Stress sowie Cuproptosis. CUM unterdrückte außerdem die Wnt/β-Katenin-Signalisierungsaktivität. Die Hemmung des Signalwegs erhöhte die reaktiven Sauerstoffspezies (3,7-fach) und Cu2+ (3,1-fach) Werte und verringerte die Expression der Dihydrolipoamid-Acetyltransferase, wodurch bösartiges Verhalten eingeschränkt wurde. Bei nackten Mäusen reduzierte CUM signifikant das Tumorwachstum, förderte die Cuproptose und hemmte die Aktivierung der AKT/Wnt/β-Catenin-Achse. Unsere Ergebnisse zeigen, dass CUM die AKT/Wnt/β-Catenin-Signalübertragung unterdrückt, die Cuproptose fördert und die GBM-Entwicklung stört.

Einleitung

Gliom ist der am häufigsten vorkommende primäre intrakranielle bösartige Tumor im zentralen Nervensystem (ZNS). Grad-4-Gliom bezieht sich üblicherweise auf ein Glioblastom (GBM) mit schlechter Prognose2. GBM ist ein hochinvasiver Hirntumor, der fast 50 % der ZNS-Malignitäten ausmacht, mit einer mittleren Überlebensdauer von weniger als 1 Jahr3. Sie ist bekannt für ihre hohe Bösartigkeit und hohe Rückfallratevon 4,5. Derzeit basieren GBM-Behandlungsstrategien hauptsächlich auf Operationen, ergänzt durch Strahlentherapie, Chemotherapie und andere umfassende Behandlungsmethoden6. Obwohl neue therapeutische Strategien wie Immuntherapie, Biotherapie und Nanomedizin in präklinischenStudien bemerkenswerte Ergebnisse erzielt haben, bleibt die Gesamtüberlebensrate über 5 Jahre nur 4,3 %. Das am häufigsten verwendete Chemotherapie-Regime ist das bekannte Stupp-Regime; bei GBM-Patienten mit unmethyliertem MGMT ist die Gesamtüberlebensrate jedoch nicht signifikant verlängert:10. Daher ist die Erkundung neuer Behandlungsstrategien von entscheidender Bedeutung, um die Überlebensdauer der Patienten zu verlängern. Diese Forschung stellt die Hypothese auf, dass der krebshemmende Mechanismus von Curcumin (CUM) auf GBM die Cuproptose beinhaltet.

Ein abnormaler Kupferstoffwechsel oder kupferinduzierte Zellschäden können zu einer Reihevon Krankheiten führen. Unter konventionellen Redoxbedingungen kann reduziertes Cu+ zu Cu2+ oxidiert werden. Tsvetkov et al. fanden einen bisher unentdeckten Mechanismus des kupferinduzierten Zelltodes, genannt Cuproptose. Cu2+-Ionen binden an acylierte Verbindungen, und dann wird die Expression von Fe-S-Cluster-Proteinen herunterreguliert, was zumZelltod 12,13 führt. Umfangreiche Forschungen haben bestätigt, dass Cuproptose eng mit dem pathophysiologischen Prozess von Tumoren14,15 verbunden ist. Cuproptosis-bezogene lncRNAs und -gene stellen potenzielle Biomarker für die GBM-Prognose und -Behandlungdar 16. BCMD kann Cu2+ freisetzen, Cuproptose induzieren und immunogenen Zelltod auslösen, um GBM17 zu behandeln. Daher glauben wir, dass Cuproptosis als neuartiges Ziel für die GBM-Therapie eingesetzt werden kann. Die meisten bestehenden Verfahren basieren jedoch auf synthetischen Ladungsträgern wie Elesclomol-Cu oder der direkten Induktion hochkonzentrierter Kupferionen. Obwohl diese exogene drastische Intervention das Konzept der Cuproptose beweisen kann, sind ihre Aussichten auf klinische Transformation aufgrund fehlender physiologischer Korrelation und Zielgerichtetheit begrenzt. Daher ist die Suche nach natürlichen oder kleinmolekularen Verbindungen, die die Cuproptose von GBM endogen und präzise regulieren und ihren vorgelagerten Signalmechanismus aufklären können, zu einer wichtigen Brücke zwischen diesem neuartigen Mechanismus und der klinischen Behandlung geworden.

Die chinesische Medizin gilt weithin als wertvolle Ressource für die Anti-Tumor-Arzneimittelforschung. CUM ist eine polyphenolische Substanz, die aus Kurkuma der traditionellen chinesischen Medizin gewonnen wird. Die moderne Pharmakologie hat bestätigt, dass es antioxidative, entzündungshemmende und antitumorale Funktionen besitzt. CUM hat viele antitumorale Wirkungen. Sie kann die Aktivität von GBM-Zellen verringern, indem sie Apoptose, multimolekulare Signalwegstörungen und andere Mechanismen fördert18. In-vitro-Experimente haben gezeigt, dass niedrig dosiertes CUM in Kombination mit Bestrahlung synergetisch die AntiGBM-Proliferation steigernkann 19. Darüber hinaus kann CUM Kernwege regulieren, die mit GBM verbunden sind, einschließlich MAPK20. Im Vergleich zur traditionellen Temozolomid-Chemotherapie (TMZ) zeigt CUM einzigartige therapeutische Vorteile. Die Wirksamkeit von Temozolomid wird oft durch die leistungsstarken DNA-Reparaturmechanismen bei GBM begrenzt, was zu Arzneimittelresistenzen führt; der Mechanismus, durch den CUM Cuproptose durch gezielten Mitochondrienstoffwechsel 21,22 induziert, ist unabhängig von TMZ. CUM kann nicht nur die mit Cuproptosis verbundenen Stoffwechselprozesse regulieren, sondern gleichzeitig mehrere wichtige Signalwege, die mit dem Fortschreiten von GBM zusammenhängen, interferieren, wodurch potenzielle Wege eröffnet werden, die Einschränkungen einzelner Therapien zu überwinden und kombinierte Behandlungsstrategien zu entwickeln. Der in dieser Studie verwendete Konzentrationsbereich von CUM (10–20 μM) entspricht den in präklinischen Behandlungsstudienberichteten Konzentrationen 23. Obwohl die inhärente geringe orale Bioverfügbarkeit von CUM und seine effiziente Abgabe durch die Blut-Hirn-Schranke zentrale Herausforderungen in praktischen Anwendungen darstellen, haben aufkommende Nanoabgabesysteme und gezielte Modifikationsstrategien vielversprechende Lösungen geliefert, um diesenEngpass 24 zu überwinden.

Obwohl die proapoptotischen, antiproliferativen und migrationshemmenden Effekte von CUM in GBM in vielen Studienberichtet wurden (25,26), konzentrieren sich die meisten bisherigen Studien auf seine Auswirkungen auf traditionelle Apoptose- oder Autophagiewege. Diese Studie zielt darauf ab, zu klären, ob CUM das bösartige Fortschreiten von GBM durch die Regulierung der Cuproptose hemmt. Wir untersuchten, ob CUM teilweise durch die Unterdrückung der AKT/Wnt/β-Catenin-Achse Cuproptose induzieren und damit GBM unterdrücken kann. Auf dieser Grundlage bietet diese Studie experimentelle Grundlagen für CUM, um die GBM-Behandlung zu verbessern und neuartige Ziele in der GBM-Therapie zu entwickeln.

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Protokoll

Alle Tierverfahren wurden gemäß den festgelegten institutionellen Standards für die humane Pflege und Nutzung von Labortieren durchgeführt und vom institutionellen Tierethikkomitee offiziell genehmigt. Es wurden Maßnahmen ergriffen, um Unbehagen und Belastungen der Tiere wann immer möglich zu verringern.

Arbeiten mit chemischen Verbindungen, Farbstoffen und biologischen Proben folgten etablierten Biosicherheitspraktiken, um potenzielle Risiken zu mindern. Potenziell gefährliche Substanzen – darunter Paraformaldehyd, kupferbasierte Reagenzien und DHE – wurden mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung wie Handschuhen, Gesichtsmasken und Schutzbrillen behandelt. Alle Abfallmaterialien, wie verbrauchte Reagenzien und kontaminierte Einwegartikel, wurden in ausgewiesene Biohazard-Behälter abgetrennt und anschließend von autorisierten Diensten für gefährliche Abfälle gemäß institutionellen und Umweltsicherheitsvorschriften behandelt. Das gesamte experimentelle Design ist in Abbildung 1 dargestellt.

Abbildung 1
Abbildung 1: Der Arbeitsablauf dieser Studie. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Zellkultur und Gruppierung
Normale menschliche Gehirn-Astrozyten (NHA) und Glioblastomzelllinien A172, U251, LN229 und SHG-44 (siehe Materialtabelle) wurden in einem DMEM-Medium kultiviert, das 10 % fetales Rinderserum (FBS) enthält, und in einem Inkubator bei 3 °C mit 5 % CO₂ gehalten. Das Medium wurde jeden zweiten Tag gewechselt, und die Zellen wurden durchführt, wenn sie etwa 80 % Zusammenfluss erreichten. Die angemessene Dosis und die Expositionszeit für CUM wurden mittels MTT-Tests bestimmt. NHA-, A172-, U251-, LN229- und SHG-44-Zellen wurden mit unterschiedlichen Konzentrationen (0, 2,5, 5, 10, 20 und 4 μM) CUM für 24, 48 und 7 Stunden, jeweils23 Stunden, behandelt. Anschließend wurden 2 μL MTT-Lösung hinzugefügt. Nach h wurden 15 μL Dimethylsulfoxid zu jedem Brunnen gegeben und sanft gemischt. Die optische Dichte (OD) bei 45 nm wurde mit einem Mikroplattenleser gemessen. Unbehandelte Zellen (Kontrollgruppe) wurden in allen Experimenten als negative Kontrolle verwendet.

A172- und U251-Zellen wurden gesät und in Gruppen unterteilt: Kontrolle, CUM-Low-Dose (1 μM), CUM-High-Dose (2 μM), AKT-Inhibitor (MK-2206), ACT-Inhibitor + Wnt-Inhibitor (MK-2206 + LGK974) und Elsm-Cu (Elesclomol + CuCl₂), basierend auf Behandlungsbedingungen. Zellen in den CUM-Gruppen wurden 4 Stunden lang mit 10 oder 2 μM CUM behandelt. Zellen der MK-2206-Gruppe erhielten 1 μM MK-2206 für 2 Stunden. Zellen in der MK-2206 + LGK974-Gruppe wurden nach der MK-2206-Exposition mit μM LGK974 für h behandelt. Die Zellen der Elsm-Cu-Gruppe wurden mit 100 nM Elesclomol und μM CuCl₂ für 4 Stundenund 14 Jahre lang behandelt.

Durchflusszytometrie
Kultivierte A172- und U251-Zellen in jeder Gruppe wurden mit PBS inkubiert, das 1 μg/mL PI-Färbungslösung für 1 Minute enthielt. Anschließend wurden die Zellen mit 0,25 % Trypsin behandelt und durch Zentrifugation (20 × g, min, Raumtemperatur) gesammelt. PI-positive Zellen wurden mit einem Durchflusszytometer mit PE-Kanal (Anregung bei 488 nm) nachgewiesen, und die Zellsterblichkeitsrate wurdemit 27 berechnet.

Carboxyfluorescein-Succinimidyl-Aminoester-(CFSE)-Test
A172- und U251-Zellen wurden mit μmol/L CellTrace CFSE-Farbstoff bei 3 °C für 1 Minute im Dunkeln inkubiert. Das Medium wurde dann neutralisiert und die Zellen bei Raumtemperatur bei 20 × g für Minuten zentrifugiert. Nach der Entnahme wurden die Zellen kultiviert und entsprechend ihrer Gruppierung behandelt. Die Fluoreszenzintensität des CFSE wurde mittels Durchflusszytometrie (Anregung bei 488 nm)27 analysiert.

Zellklonbildungstest
Kultivierte A172- und U251-Zellen wurden verdaut, neu suspendiert und gezählt. Zwei Milliliter der vorbereiteten Zellsuspension wurden hinzugefügt. Nach sanftem Mischen wurden die Zellen etwa 14 Tage lang inkubiert. Die Zellen wurden dann 3 Minuten lang mit 4 % Paraformaldehyd fixiert, und das Fixierungsmittel wurde entsorgt. Nach der Färbung mit 0,1 % Kristallviolett. Es wurden Koloniebilder aufgenommen, und die Klonbildungsrate wurde berechnet:14.

Zellkratztest
A172- und U251-Zellen (1 × 106 Zellen/Brunnen) wurden kultiviert, bis sie eine 90%ige Konfluenz erreichten. Die Zellmonoschicht wurde einmal mit einer sterilen 2-μL-Spitze zerkratzt, um eine Wunde zu erzeugen, und anschließend mit verschiedenen CUM-Konzentrationen für h und 48 h behandelt. Die Bilder wurden mit einem Mikroskop aufgenommen. Die Heilungsrate der Kratzer wurde mit der ImageJ-Software bewertet. Bilder wurden in 8-Bit-Format umgewandelt, ein einheitlicher Schwellenwert wurde gesetzt, um den Kratzbereich vom Zellbereich zu unterscheiden, und die Kratzflächen bei 0 h und 48 h wurden mit der Funktion Partikelanalyse berechnet. Heilungsrate der Kratzer (%) = (0 h Abstand − 48 h Distanz) / 0 h Distanz × 100 % 23.

Transwell-Experiment
A172- und U251-Zellen wurden den vorgegebenen Behandlungen ausgesetzt, dann enzymatisch abgetrennt und bei 200 × g für 5 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert. Die Zellen wurden in serumfreiem Medium resuspendiert. Die Matrigel wurde im Verhältnis 1:8 in serumfreiem Medium verdünnt, gründlich vermischt, und 5 μL wurde in die obere Kammer eines Transwell-Einsatzes aufgetragen, gefolgt von einer 4-stündigen Inkubation. Insgesamt wurden 5 × 104-Zellen pro Bohrloch in die obere Kammer gelegt, während 60 μL Medium mit 20 % FBS in die untere Kammer platziert wurden. Nach 48 Stunden Inkubation wurden die Zellen mit Paraformaldehyd fixiert und mit Kristallviolett gefärbt. Fünf Gesichtsfelder wurden aus der Mitte und dem Rand jedes Brunnens ausgewählt. Die Zellen wurden beobachtet und unter dem Mikroskop abgebildet. Invasive Zellen wurden mit ImageJ berechnet. Die Bilder wurden in das 8-Bit-Format umgewandelt, Schwellenwerte wurden angelegt, um gefärbte Zellen vom Hintergrund zu unterscheiden, und die Funktion Teilchen analysieren zählte Zellen, die durch die Membran23 migriert waren.

Erkennung des Mitochondrialmembranpotenzials (MMP)
Kultivierte A172- und U251-Zellen in jeder Gruppe wurden mit mL JC-1-Arbeitslösung 30 Minuten lang im Dunkeln inkubiert. Die Zellen wurden vorsichtig mit vorgekühltem JC-1-Puffer gewaschen, beobachtet und mit einem Fluoreszenzmikroskop fotografiert. Mit 488-nm-Anregung wurden JC-1-Polymer- und Monomersignale mit 590 nm bzw. 530 nm Emissionsfiltern erfasst. Das Rot/Grün-Fluoreszenzverhältnis (JC-1-Aggregate zu Monomeren) wurde mit der ImageJ-Software analysiert, um MMP-Änderungen28 zu bewerten. Bilder von roten und grünen Kanälen wurden separat extrahiert und die durchschnittliche Fluoreszenzintensität in derselben Region quantifiziert.

Erkennung der Sauerstoffverbrauchsrate (OCR)
Kultivierte A172- und U251-Zellen wurden ausgesaat. Die Platte wurde zur Anpassung in einen vorgeheizten Analysator bei 3 °C gelegt. Nach der Anpassung wurde das Entschlossen-Medium hinzugefügt. Nach automatischer Kalibrierung wurde die Platte 15–2 Minuten bei 3 °C ohneCO2 ausgeglichen. Die Ausgangs-OCR wurde gemessen, und das Assay-Programm sollte mitochondriale OCR in definierten Abständen aufzeichnen. Die Daten wurden für die spätere Analyse exportiert28.

MitoSOX-Fluoreszenzsonde-Detektion reaktiver Sauerstoffspezies (ROS)
A172- und U251-Zellen wurden auf eine Dichte von 1 × 104 Zellen/mL angepasst, und 1 mL pro Bohrloch wurde in einer konfokalen Schale ausgesaat, woraufhin die Medikamentenintervention durchgeführt wurde. Der Zellsupernatant wurde entsorgt und 1 ml verdünnte MitoSOX-Sonde (1:1.000) hinzugefügt. Die Zellen wurden 1 Minute lang im Dunkeln bei 3 °C inkubiert. Das Fluoreszenzsignal wurde mit einem Fluoreszenzmikroskop (Anregung/Emission: 510/580 nm) erfasst, um mitochondriale ROS-Werte29 zu bewerten.

Immunfluoreszenz
Deckzettel wurden einmal mit DMEM-Kulturmedium gewaschen. Anschließend wurden sie in Sechs-Bohrloch-Platten für Zellaussaat und Medikamentenintervention eingesetzt. Nach 24 Stunden wurden die Zellen in 4 % Paraformaldehyd fixiert und anschließend 30 Minuten lang mit 5 % Rinderserumalbumin (BSA) blockiert. Die Blocklösung wurde entfernt, und verdünnte primäre Antikörper gegen Dihydrolipoamid-Acetyltransferase (DLAT) sowie β-Catenin wurden aufgetragen, gefolgt von einer nächtlichen Inkubation bei °C 30. Fluoreszierend markierte sekundäre Antikörper wurden dann eingeführt und bei 3 °C für 30 Minuten inkubiert. Die Zellkerne wurden mit DAPI gegenfärbt, und die Objektträger wurden mit einem Antifade-Reagenz montiert. Fluoreszenzbilder wurden mit einem Fluoreszenzmikroskop aufgenommen, und die Signalintensität wurde mit der ImageJ-Software quantifiziert. Die Bilder wurden in 8-Bit-Format umgewandelt, und es wurde ein einheitlicher Schwellenwert angewendet, um Zielsignale von Hintergrundrauschen zu unterscheiden. Das Rechteck-Werkzeug wurde verwendet, um die gewünschten Zellregionen auszuwählen, und die durchschnittliche Fluoreszenzintensität wurdemit 27 gemessen. Zur Visualisierung der Mitochondrien wurden die Zellen 30 Minuten lang mit 20 nM MitoTracker Red CMXRos behandelt und anschließend mit Paraformaldehyd30 fixiert.

TCF/LEF1 Luciferase-Reporter-Set
Die Wnt/β-Catenin-Aktivierung in den A172- und U251-Zellen wurde mit einem TCF/LEF1-Luciferase-Reporter-Kit untersucht. Der TCF/LEF-Reportervektor enthält eine TATA-Box und Antwortelemente des T-Zell-/lymphoiden Enhancer-Faktors (TCF/LEF), was eine indirekte Detektion der β-Catenin-Transkriptionsaktivität mittels grüner fluoreszierender Proteinexpression (GFP) ermöglicht. Kultivierte A172- und U251-Zellen wurden umgekehrt transfiziert mit einem 5-ng-TCF/LEF-Reportervektor. Sechzehn Stunden nach der Transfektion wurde die Fluoreszenzintensität mit einem Mikroplattenleser mit Anregungs- und Emissionseinstellungen von 488 bzw. 51 nm (31) aufgezeichnet.

Tumortragende Mäuse
Zehn männliche BALB/c-Nacktmäuse (7 Wochen alt, 2 ± 2 g) wurden unter spezifischen, pathogenfreien Bedingungen (2 °C, 65 % Luftfeuchtigkeit) mit uneingeschränktem Zugang zu Standardfutter und Wasser gehalten. Alle Verfahren wurden vom Ethikausschuss des ersten angeschlossenen Krankenhauses der Jangtse-Universität genehmigt (Nr. 2023092; Genehmigungsdatum: 18.10.2023).

Um ein GBM-Xenograft-Modell zu etablieren, wurden A172-Zellen (4 × 106 Zellen/mL) in serumfreiem Medium suspendiert, und 0,1 ml wurden subkutan in die rechte Flanke jeder Maus injiziert. Die Tiere wurden zufällig entweder einer Kontrollgruppe oder einer CUM-Behandlungsgruppe zugeteilt (n = 5 pro Gruppe). Die CUM-Gruppe erhielt täglich 60 mg/kg Curcumin über orale Gavage, während die Kontrollgruppe ein gleiches Volumen Kochsalzlösung erhielt. Die Tumordurchmesser wurden alle 7 Tage mit einem Vernier-Schieber erfasst, und das Tumorvolumen wurde mit der Formel 1/2 × Länge ×Breite 2 (mm3) berechnet. Nach 5 Wochen wurden die Mäuse durch eine zervikale Verrenkung eingeschläfert, und die Tumore wurden unter sterilen Bedingungen für die Gewichtsmessung32 entnommen.

TUNEL-Assay
Tumorgewebe wurden 24 Stunden lang in 4 % Paraformaldehyd fixiert, in Ethanol dehydriert, in Paraffin eingebettet und mit μm-Dicke geschnitten. Die Schnitte wurden entwachst und rehydriert, mit PBS abgespült, 50 Minuten lang mit Proteinase K behandelt und mit 3 % Wasserstoffperoxid inkubiert. Das TUNEL-Reaktionsgemisch wurde 1 Stunde lang aufgetragen und anschließend mit einem Antifade-Reagenz montiert. Fluoreszenzbilder wurden mikroskopisch aufgenommen, und TUNEL-positive Zellen pro Feld wurden mit der ImageJ-Software quantifiziert.

Immunhistochemie
Paraffin-eingebettete Tumorschnitte wurden bei 6 °C gebacken, in Xylol entwachst und durch eine graduierte Ethanolserie rehydriert. Die Antigenentnahme erfolgte mit einem erhitzten EDTA-Puffer, gefolgt von der Abschreckung der endogenen Peroxidase-Aktivität. Die Objektträger wurden über Nacht bei °C mit dem primären Anti-Ki-67-Antikörper inkubiert. Nach der 20-minütigen Inkubation mit einem sekundären Antikörper wurden die Schnitte 5 Minuten lang mit Diaminobensidin (DAB) gefärbt und mit Hämatoxylin gegenfärbt. Nach der Enttrocknung und dem Anbringen mit neutralem Harz wurden die Objektträger unter dem Mikroskop fotografiert. Eine positive Färbung wurde durch bräunlich-gelbes Präzipitat identifiziert, und Ki-67-positive Zellen wurden mit ImageJ27 quantifiziert.

Dihydroethidium (DHE) Fluoreszenzfärbung
Die ROS-Werte wurden mittels DHE-Fluoreszenzfärbung bewertet. Gefrorene Tumorgewebeschnitte wurden mit PBS ausgespült. Die Hintergrundfluoreszenz wurde abgeschreckt, und μM DHE wurde jedem Abschnitt für 3 Minuten hinzugefügt. Nach dem PBS-Waschen wurden die Abschnitte im Dunkeln versiegelt. Die Fluoreszenz wurde mit einem Mikroskop beobachtet (Anregung/Emission: 518/605 nm), und pro Gruppe wurden fünf zufällige Bilder aufgenommen. ImageJ wurde verwendet, um ROS-Werte zu quantifizieren.

Cu2+ Inhaltserkennung
Die Konzentration von Cu2+ in GBM-Cellen und Tumorgeweben wurde mit einem kolorimetrischen Nachweiskit bewertet. Die A172- und U251-Zellen wurden nach der Behandlung entnommen und bei 1.500 × g für 10 Minuten bei °C zentrifugiert. Zellpellets wurden in 0 wieder suspendiert. ml destilliertes Wasser, auf Eis soniziert und erneut zentrifugiert. Tumorgewebe wurden in destilliertem Wasser homogenisiert und ebenfalls 10 Minuten lang bei 4 °C zentrifugiert. Supernatanten (1 μL) wurden auf eine 96-Well-Platte transferiert, mit 23 μL chromogenem Reagenz vermischt, versiegelt und für 5 Minuten inkubiert. Die optische Dichte (OD) wurde bei 58 nm mit einem Mikroplattenleser gemessen, und Cu2+- Werte wurdenmit 14 berechnet.

Westlicher Fleck (WB)
Proteine wurden aus kultivierten Zellen und Tumorgeweben isoliert. Supernatanten wurden durch Zentrifugation bei 12.000 × g für 15 Minuten bei 4 °C gewonnen, und die Proteinkonzentrationen wurden mittels eines BCA-Tests quantifiziert. Nach der Denaturierung wurden die Proben durch SDS-PAGE getrennt, auf PVDF-Membranen übertragen und mit 5 % Magermilch für 1 Stunde blockiert. Die Membranen wurden in TBST gewaschen und über Nacht bei °C mit primären Antikörpern gegen FDX1, LIAS, DLAT, DLD, AKT, p-AKT, Wnt3a, GSK-3β, p-GSK-3β, β-Catenin, p-β-Catenin und β-Aktin inkubiert (siehe Materialtabelle)14,33. Nach weiteren TBST-Waschen wurden die Membranen 1 Stunde lang mit HRP-konjugierten sekundären Antikörpern inkubiert, mit ECL-Reagenz entwickelt und durch Chemilumineszenz visualisiert. Die ImageJ-Software wurde verwendet, um die Signalintensität mit dem Rechteck-Auswahlwerkzeug und der Gels-Analysefunktion zu quantifizieren. Die relative Proteinexpression wurde als Verhältnis des Zielband-Grauwerts zur internen Kontrolle (GAPDH) berechnet. Kernextrakte aus A172- und U251-Zellen wurden mit einem Extraktionskit für nukleare Proteine hergestellt. Die Expression von β-Katenin und Lamin B1 wurde bewertet, wobei Lamin B1 als nukleare Laststeuerung34 diente.

Statistische Analyse
Quantitative Ergebnisse spiegeln den Mittelwert von drei unabhängigen Replikaten wider. Alle Daten wurden hinsichtlich Normalverteilung und Varianzhomogenität bewertet. Einweg-ANOVA, gefolgt vom Post-hoc-Test von Tukey, wurde für Vergleiche zwischen mehreren Gruppen verwendet. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) dargestellt. Ein P-Wert von weniger als 0,05 galt als statistisch signifikant. Diese Verfahren wurden verwendet, um die Datenrobustheit sicherzustellen und die Zuverlässigkeit von Schlussfolgerungen zu unterstützen.

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Ergebnisse

Hemmung der Lebensfähigkeit der GBM-Zellen und induzierter Zelltod
Erstens gab es nach 2, 48 und 72 Stunden CUM-Intervention keine signifikante Veränderung der Lebensfähigkeit von NHA-Zellen (Abbildung 2A), was darauf hindeutet, dass die verwendeten CUM-Konzentrationen keine toxischen Auswirkungen auf normale Zellen hatten. Im Gegensatz dazu wurde die Lebensfähigkeit von GBM-Zelllinien (A172, U251, LN229 und SHG-44) bei CUM-Konzentrationen ≥ 1 μM (P < 0,05–0,001) signi...

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Diskussion

Die Rückfallrate von GBM ist mit seinen bösartigen biologischen Eigenschaften verbunden36. CUM übt Anti-GBM-Effekte aus, indem es oxidativen Stress, Apoptose, Autophagie, Metastasen, Invasionen und wichtige molekulare Zielereguliert. In dieser Studie zeigten zelluläre Experimente, dass CUM die Sterblichkeit von GBM-Zellen signifikant erhöhte und die Proliferation, Koloniebildung, Migration und Invasion hemmte – Ergebnisse, die mit früheren ...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,1 % Kristallviolett-FärbungslösungServicebioG1014Markierungszellen
4 % ParaformaldehydBeyotimeP0099Zellen oder Gewebe reparieren
AKT-Inhibitor (MK-2206)Selleck.cn, Shanghai, ChinaS1078Spezifischer AKT-Inhibitor
Antikörper (primäre und sekundäre Antikörper)ABclonal Technology, Wuhan, China / abcam, Cambridge, UK / Servicebio, Wuhan, China / Beyotime, Shanghai, China / Cell Signaling, Danvers, MA, USAA8814, ab32572, GB25303, ab15580, ab108257, ab246917, A8814, AF6708, AA326, 4060, ab219412, 280376, 9322, ab97051, ab229025Detektion der Proteinexpressionswerte
Zell-Apoptose-Detektions-KitServicebio, Wuhan, ChinaG1021Nachweis der Apoptose
Zellspur-CFSE-FarbstoffInvitrogen, Carlsbad, CA, USAC34570Zellproliferationsdetektion
ChemilumineszenzbildgebungssystemBio-Rad, Hercules, CA, USAChemi Doc XRS+Ultra-hohe Sensitivitätsdetektion von Proteinen
Cu2+ kolorimetrisches TestsetElabscience, Wuhan, ChinaE-BC-K300-MNachweis von Cu2+ Inhalt in Tumorgeweben und GBM-Zellen
CuCl2Sigma-Aldrich, Darmstadt, Deutschland751944Cuproptosis-Induzator
Curcumin (CUM)Shanghai Quellblatt, Shanghai, ChinaS19245Polyphenolische Verbindung
DHE-DetektionskitBeyotime, Shanghai, ChinaS0063Erkennung von ROS-Werten
Dimethylsulfoxidid (DMSO)ServicebioG4101-2Lösungsmittel für den MTT-Test
ECL-EntwicklerServicebioG2161Verwendung für Western Blot
ElesclomolSelleck.cnS1052Cuproptosis-Induzator
DurchflusszytometrieBD Biosciences, New Jersey, USABD FACSAria IIIVerwendet für Zelltod und CFSE-Tests
FluoreszenzmikroskopOLYMPUS, Tokio, JapanIX73Verwendet für Immunfluoreszenz-, ROS-, TUNEL-, DHE- und MMP-Assays
Glioblastomzelllinien A172 (RRID: CVCL_0131), U251 (RRID: CVCL_0021), LN229 (RRID: CVCL_0393) und SHG-44 (RRID: CVCL_6902)Punosai Biotechnology Co., Ltd., Wuhan, ChinaCL-0012, CL-0237, CL-0578, CL-0207Menschliche Glioblastomzelllinien
GraphPad Prism 9.0 SoftwareGraphPad Software, LLCVersion 9.0Statistische Analyse
ImageJ 1.53k SoftwareNationales Institut für Psychische GesundheitVersion 1.53kStatistische Berechnung
JC-1 ArbeitslösungSolarbio, Peking, ChinaM8650Detektion von MMP
Männliche BALB/c nackte MäuseSlack Kingda Laboratory Animal Co., Ltd., Hunan, ChinaMausexperiment
Mikroplatten-LeserBio-Tek, Vermont, USAELX-800Für die Messung des OD450-nm-Wertes
MikroskopOLYMPUSBX53Verwendet für Zellkratztests, Transwell-Experimente und immunhistochemische Assays
MitoSOX-SondeThermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USAM36008Verwendet zur ROS-Detektion
Mitotracker Red CMXRosThermo Fisher ScientificM7512Spezifische Markierung der Mitochondrien in lebenden Zellen
MTT-DetektionskitServicebioG4101-1Nachweis der Zelllebensfähigkeit
Normale menschliche Gehirn-Astrozyten-NHA-Zellen (RRID:CVCL_B0DK )Huatuo Biotechnology Co., Ltd., Shenzhen, ChinaHTX2408Zelllinie für Kontrollexperimente
Kernprotein-ExtraktionskitBeyotimeP0027Extraktion von Kernproteinen
Energiestoffwechsel-Analysator für SeepferdchenzellenAgilent,  Peking, ChinaSeahorse XFVerwendet zur OCR-Detektion
TCF/LEF1 Luciferase-Reporter-SetBiolab Technology Co., Ltd, Peking, ChinaNachweis der Aktivität des Wnt/β-Catenin-Signalwegs
TUNEL-DetektionskitBeyotimeC1088Nachweis von Apoptose im Tumorgewebe
Wnt-Inhibitor (LGK974)Selleck.cnS7143Spezifischer Wnt-Inhibitor

Referenzen

  1. Weller, M., et al. Glioma. Nat Rev Dis Primers. 10 (1), 33(2024).
  2. Liang, R., Xiang, Y., Hu, C., Tang, X. Expression and clinical significance of RBBP4 gene in lower-grade glioma: an integrative analysis. Biochem Biophys Rep. 35, 101533(2023).
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