Research Article

Visualisierung altersabhängiger Elektrotaxis menschlicher fettabgeleiteter Stammzellen unter Gleichstromfeldern

DOI:

10.3791/69666

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December 19th, 2025

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1Department of Plastic Surgery, The First Affiliated Hospital of China Medical University, 2Department of Dermatology, Institute for Regenerative Cures, University of California, Davis, 3Department of Ophthalmology and Vision Science, Institute for Regenerative Cures, University of California, Davis

In This Article

Summary

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In einer kleinen Kohorte weiblicher Spender verringerte das Altern die elektrotaktische Migration von hADSCs. DCEF veränderte die Genexpression (747 nach oben, 624 nach unten), anreicherte die Natriumtransport-/Kanal-GO-Terme und PI3K-Akt KEGG-Signalwege, was auf eine Beteiligung an altersbedingter Elektrotaxis hindeutet, ohne eine Kausalität nachzuweisen.

Abstract

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Menschliche, fettabgeleitete Stammzellen (hADSCs) sind entscheidend für Geweberegeneration und Wundheilung, und ihre gerichtete Migration ist eine Voraussetzung für diese therapeutischen Wirkungen. Elektrische Felder (EFs) sind als Schlüsselsignale zur Zellmigration während der Wundreparatur gut anerkannt, doch das elektrotaktische Verhalten von hADSCs – insbesondere wie Spendereigenschaften (z. B. Alter) dieses Verhalten und seine zugrundeliegenden molekularen Mechanismen regulieren – sind weiterhin wenig verstanden. Diese Wissenslücke begrenzt die optimierte Anwendung von hADSCs in der regenerativen Medizin. In dieser Studie validierten wir zunächst die Existenz von Elektrotaxis in hADSCs und bestätigten deren Spannungsabhängigkeit: Bei Gleichstromfeldern (DCEFs) von 100–200 mV/mm wanderten hADSCs richtungsweise zur Anode zu, wobei stärkere EF-Intensitäten sowohl die Migrationsrichtung als auch die Geschwindigkeit verbesserten (im Gegensatz zur 0 mV/mm-Kontrolle). Anschließend verglichen wir hADSCs von jungen weiblichen Spenderinnen (27,00 ± 4,58 Jahre) und älteren weiblichen Spenderinnen (62,33 ± 4,04 Jahre) mittels RNA-Sequenzierung (RNA-seq) nach 200 mV/mm DCEF-Stimulation. Die transkriptomische Analyse identifizierte 747 hochregulierte und 624 herunterregulierte Gene in älteren hADSCs, wobei differenziell exprimierte Gene (DEGs) in biologischen Prozessen/Wegen angereichert sind, die für Elektrotaxis kritisch sind – einschließlich Natriumionen-Transmembrantransport, spannungsgesteuerter Natriumkanalaktivität (GO-Terme) und des PI3K-Akt-Signalwegs (KEGG-Signalweg). Funktional zeigten ältere hADSCs unter DCEF-Stimulation eine signifikant reduzierte anodale Migration (verringerte akkumulierte Distanz, euklidische Distanz und Direktheit) im Vergleich zu jungen hADSCS. Diese Studie liefert den ersten Beleg für altersabhängige Elektrotaxien bei hADSCs und zeigt, dass das Spenderalter mit einer beeinträchtigten elektrotaktischen Kapazität korreliert. Es zeigt außerdem, dass dysregulierte Natriumkanalaktivität und PI3K-Akt-Signalübertragung diesem altersbedingten Rückgang zugrunde liegen könnten. Diese Ergebnisse weisen auf die potenziellen regulatorischen Mechanismen der hADSC-Elektrotaxis hin und bieten neue Erkenntnisse zur Anpassung von hADSC-basierten Therapien (z. B. Auswahl optimaler Spender oder Zielsetzung von Natrium-/PI3K-Akt-Wegen) zur Verbesserung der Geweberegeneration und Wundheilungsergebnisse.

Introduction

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Fett-abgeleitete Stammzellen (ADSC) besitzen eine starke Selbsterneuerungskapazität und ein erhebliches regeneratives Potenzial. Unter geeigneten Induktionsbedingungen können sie sich in Osteoblasten, Chondrozyten und Adipozyten differenzieren, unter anderem1. Durch parakrine Signalübertragung kann ADSC auch die Bildung von Blutgefäßen und Lymphgefäßenunterstützen, die Narbenbildunghemmen 4 und immunregulatorische Effekte zeigen5. Daher gilt ADSC als ideale Samenzelle für zellbasierte Therapien in der regenerativen Medizin.

Die Funktion von ADSC wird von verschiedenen Spendereigenschaften beeinflusst, die ihre potenzielle Wirksamkeit bei Zelltherapien beeinflussen können, darunter Spenderalter, Body-Mass-Index, Geschlecht und andere6. ADSC von älteren Spendern zeigt ausgeprägtere Alterungsmerkmale mit reduziertem adipogenem Differenzierungspotenzial, osteogenem Differenzierungspotenzial und Migrationskapazität 7,8,9. Außerdem ist die Fähigkeit, die Proliferation von Keratinozyten zu fördern und die Selbstreparaturmechanismen des Körpers zu stimulieren, um10 reduziert.

Zellgesteuerte Migration ist ein zentraler physiologischer Mechanismus bei der Wundheilung und Geweberegeneration, wobei elektrische Felder (EFs) eine wichtige Rolle bei der Zellmigration und der Förderung der Wundreparatur spielen. Wenn beispielsweise die epithheliale Barriere beschädigt ist, entstehen sofort endogene elektrische Felder, die bestehen bleiben, bis die Wunde heilt und die Funktion der epithelialen Barrierewiederhergestellt wird. Als eines der Signale, die die gerichtete Zellmigration steuern, wurde gezeigt, dass elektrische Signale eine höhere Priorität haben als andere koexistierende Signale, wie Kontakthemmung, mechanische Kräfte und chemotaktische Faktoren15,16. Mehrere Methoden wurden entwickelt, um Wundheilung und Geweberegeneration zu fördern, etwa durch Medikamente und externe elektrische Stimulationsgeräte, die die endogenen elektrischen Felder im menschlichenKörper verstärken oder nachahmen. Die Fähigkeit der Zellen, sich nach einem elektrischen Feldgradienten zu bewegen, wird als Elektrotakse bezeichnet. In-vitro-Studien haben gezeigt, dass viele verschiedene Zelltypen zu einer gerichteten Migration in elektrischen Feldern fähig sind. Einige Zellen wandern zur Anode, wie z. B. säugetierische Schädel-Neuralkammzellen, menschliche Astrozyten und menschliche Brustkrebszellen 19,20,21. Andere Zellen wandern zur Kathode, wie menschliche Nierentubulärepithelzellen, humane dermale Fibroblasten und menschliche Neutrophile 22,23,24. ADSC kann in Gleichstromfeldern (DC) zur Anode migriert werden, und unter längeren Kulturbedingungen wurde gezeigt, dass exogener gepulster elektrischer Strom die gerichtete Migration von ADSC zur Anode effektiv fördert, während die Zellviabilität25 erhalten bleibt. Bis heute sind Studien zu den Elektrotaxis-Eigenschaften menschlicher fett-abgeleiteter Stammzellen noch rar, und die zugrunde liegenden Mechanismen, die ihr elektrotaktisches Verhalten regulieren, sind noch nicht vollständig verstanden.

Wir sind die Ersten, die systematisch altersabhängige elektrotaktische Unterschiede in hADSCs von jungen und älteren weiblichen Spendern unter gradienten Gleichstromfeldern (DCEF) untersuchen und die zugrunde liegenden Mechanismen (bezogen auf Natriumkanalaktivität und PI3K-Akt-Signalisierung) mithilfe einer transkriptomischen Analyse weiter aufdecken. In dieser Studie untersuchten wir die Auswirkungen von DCEF auf hADSCs. Mit RNA-Sequenzierung und differenzieller Genanreicherungsanalyse verglichen wir Genexpressionsprofile zwischen zwei hADSC-Gruppen – abgeleitet von jungen und älteren weiblichen Spendern – nach DCEF-Stimulation –, um altersbedingte transkriptionelle Unterschiede zu identifizieren. Wir vermuteten, dass das Spenderaltern die elektrotaktische Reaktionsfähigkeit von hADSCs beeinträchtigt und dass dieser altersbedingte Rückgang mit veränderter Natriumkanalaktivität und PI3K-Akt-Signalgebung zusammenhängt.

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Protocol

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Vor der Gewebeentnahme wurde von allen Teilnehmern eine informierte Zustimmung eingeholt. Diese Studie wurde vom Ethikausschuss des ersten angeschlossenen Krankenhauses der China Medical University genehmigt (Genehmigungsnummer: [2018]2018-110-2). Vor der Gewebeentnahme wurde von allen Teilnehmern eine schriftliche informierte Zustimmung eingeholt

hADSC-Isolation und Kultur
Gewebesammlung: Humane abdominale Fettgewebeproben wurden während routinemäßiger elektiver Fettabsaugungen in der Abteilung für plastische Chirurgie des ersten angeschlossenen Krankenhauses der China Medical University entnommen. Alle Spender waren gesunde weibliche Freiwillige, die sich einer kosmetischen Bauchliposuktion unterzogen, und es wurden keine weiteren chirurgischen Eingriffe zu Forschungszwecken durchgeführt. Gewebeproben wurden vom operierenden Chirurgen unter sterilen Bedingungen unmittelbar nach der Aspiration entnommen und innerhalb von 30 Minuten in sterilen Behältern auf Eis ins Labor gebracht.

Stichprobengröße: Insgesamt wurden 6 Spender in diese Studie einbezogen, bestehend aus 3 jüngeren Spendern (Alter: 27,00 ± 4,58 Jahre) und 3 älteren Spendern (Alter: 62,33 ± 4,04 Jahre).

Gewebeverarbeitung: Fettgewebefragmente werden in ein 50 ml konisches Rohr übertragen, bei 1.800 x g 3 Minuten bei 4 °C zentrifugiert und die obere Ölphase vorsichtig aspiriert (um überschüssige Lipide zu entfernen). Gib 0,2 % Kollagenase Typ IV (Endvolumen: 5–10 ml pro 1 g Fettgewebe) in das Gewebepellet und stelle das Rohr dann für 45 Minuten in ein 37 °C Wasserbad oder einen Inkubator. Bewegen Sie die Sonde alle 10–15 Minuten während der Verdauung vorsichtig, um einen gleichmäßigen Kontakt zwischen Kollagenase und Gewebe sicherzustellen. Nach der Verdauung wird die Reaktion durch Zugabe von Blutzuckerarmem DMEM beendet, ergänzt mit 10 % FBS und 1 % Penicillin/Streptomycin (Volumenverhältnis zwischen Neutralisationsmedium und Kollagenlösung = 1:1).

VORSICHT: Tragen Sie beim Umgang mit Kollagenase Einweghandschuhe, einen Laborkittel und eine Schutzbrille, um Haut- und Augenkontakt zu vermeiden, bereiten Sie das Reagenz in einem biologischen Sicherheitsschrank (BSC) vor, um eine Aerosolkontamination zu verhindern, und wischen Sie im Falle eines Verschüttens sofort mit 75 % Ethanol ab und entsorgen Sie kontaminierte Materialien als biologische Abfälle.

Zellisolation: Zentrifugieren Sie das neutralisierte Verdauungsgemisch bei 1.200 x g für 10 Minuten bei 4 °C, um die Zellen zu pelletieren. Entsorgen Sie das Supernatant, suspendieren Sie das Pellet dann in einem Erythrozyten-Lysepuffer (155 mM NH₄Cl, 10 mM KHCO₃, 0,1 mM EDTA; pH 7,4; Volumen: 2-3 mL pro Pellet) und inkubieren Sie bei Raumtemperatur (22-25 °C) für 5 Minuten, um die restlichen roten Blutkörperchen zu lysieren. Filtern Sie die Zellsuspension sequentiell durch 200-μm-Siebe, um unverdaute Gewebereste zu entfernen und eine Einzelzellsuspension zu erhalten.

Zellzählung: Vor der Aussaatung wurden die Zellzahlen mit einem Hämozytometer quantifiziert. Kurz gesagt wurden hADSCs mit 0,25 % Trypsin-EDTA abgelöst, in Wachstumsmedium neu suspendiert und 1:1 mit 0,4 % Trypan-Blau-Lösung gemischt. Lebensfähige Zellen (nicht gefärbt) wurden manuell mit einem Neubauer-Hämozytometer unter Lichtmikroskop gezählt, und die Gesamtzahl der lebensfähigen Zellen wurde berechnet wie folgt: Zellanzahl/mL = (durchschnittlich gezählte Zellen x Verdünnungsfaktor x 104).

Zellkultur: Säen Sie die gefilterten Zellen mit einer Dichte von 5 x 103 Zellen /cm/2 im Wachstumsmedium (niedrig glukosearmes DMEM + 10 % FBS + 1 % Penicillin/Streptomycin) und inkubieren Sie bei 37 °C mit 5 %CO2. Ersetzen Sie das Medium alle 2-3 Tage, um nicht haftende Zellen zu entfernen und optimale Kulturbedingungen zu erhalten. Alle hADSCs, die für nachfolgende Experimente verwendet wurden – einschließlich Zellcharakterisierung (Oberflächenmarkererkennung, Trilineage-Differenzierungstests), DCEF-Stimulation, Migrations- und Morphologieanalyse, Senezenz-/Proliferationstests und RNA-Sequenzierung – befanden sich bei Passage 3 bis Passage 5.

hADSC-Charakterisierung
Expression von Zelloberflächenmarkern: Zellen auf 70 % Konfluenz kultivieren, dann die adhärenten Zellen mit 0,25 % Trypsin-EDTA dissoziieren (3 Minuten bei 37 °C inkubieren). Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 300 x g für 5 Minuten bei 4 °C, entsorgen Sie den Überstandsstoff und suspendieren Sie das Zellpellet erneut in 1x PBS (Volumen: 1-2 mL). Aliquot 1 x 105 Zellen pro Probe (resuspendiert in 100 μL 1x PBS) und fluoreszierend konjugierte Antikörper bei den angegebenen Verdünnungen hinzufügen: anti-CD44 (1:50), anti-CD90 (1:100), anti-CD29 (1:50), anti-CD73 (1:50) und anti-CD105 (1:20)1,4,7. Inkubieren Sie die Antikörper-Zell-Mischung bei 4 °C für 30 Minuten im Dunkeln, um ein Fluorophor-Abschrecken zu vermeiden. Nach der Inkubation zentrifugieren Sie bei 1.000 x g für 5 Minuten bei 4 °C und aspirieren Sie den Supernatant vollständig. Das Pellet in 1–2 ml 1x PBS wieder suspendieren, erneut bei 1.000 x g für 3 Minuten bei 4 °C zentrifugieren, das Supernatant entsorgen und diesen Waschvorgang zweimal wiederholen, um ungebundene Antikörper zu entfernen. Schließlich wird das Zellpellet in 200 μL frischem 1x PBS wieder suspendiert, Fluoreszenzdaten mit einem Durchflusszytometer erfasst und eine quantitative Analyse mit der FlowJo-Software (v10) durchgeführt. Der Gating Workflow folgte den Standardverfahren der MSC-Phänotypisierung: FSC-SSC-Gate zum Ausschließen von Müll und zur Auswahl der Hauptzellpopulation basierend auf Größe und Granularität, gefolgt von Doublet-Ausschluss mit FSC-A vs. FSC-H und SSC-A vs. SSC-H Plots, um Einzelzell-Ereignisse sicherzustellen. Anschließend wurde Live-Cell-Gating durchgeführt, um Trypan-Blue-positive oder PI-positive tote Zellen auszuschließen. Fluoreszenzgating wurde für einzeln gefärbte Kontrollgruppen durchgeführt, und ungefärbte Kontrollgruppen wurden verwendet, um Schwellenwerte für CD29, CD44, CD73, CD90, CD105 (positive Marker) und CD34, CD45 (negative Marker) festzulegen. Repräsentative Gating-Plots wurden exportiert und analysiert, um die Identität der hADSCs zu bestätigen.

Differenzierungspotenzial
Adipogene Differenzierung: Ernte HADSCs der P3-Generation bei 85 % Konfluenz mit 0,25 % Trypsin-EDTA, pflanze sie dann in 24-Well-Platten mit einer Dichte von 1 x 10⁵ Zellen pro Bohrloch (mit vollständigem DMEM-Medium) und inkubiere bei 37 °C mit 5 % CO2 , bis die Zellen wieder 85 % Konfluenz erreichen. Für die Induktion verwenden Sie das Adipogenese-Differenzierungskit, rekonstituieren Sie Komponente A (Adipogener Induktor) und Komponente B (Adipogener Erhalter) gemäß dem Handbuch und verwenden Sie Komponenten A für die ersten 3 Tage, bevor Sie für 1 Tag auf Komponente B wechseln. Wiederhole diesen Zyklus für 3 Wochen. Zur Färbung aspirieren Sie das Induktionsmedium, waschen Sie die Zellen vorsichtig mit 3 ml 1x PBS (vermeiden Sie Störung der Zellschichten), fixieren Sie die Zellen mit 4 % Paraformaldehyd (PFA) bei Raumtemperatur für 20 Minuten und inkubieren Sie dann mit 0,3 % Oil Red O-Lösung (hergestellt in 60 % Isopropanol) bei Raumtemperatur für 15 Minuten. Wasche die Zellen dreimal mit 1x PBS, um überschüssige Färbung zu entfernen, und bilde dann die Lipidtröpfchen mit einem Invertiertlichtmikroskop ab (20x).

Osteogene Differenzierung: Samen hADSCs in 12-Well-Platten mit einer Dichte von 1 x 10⁵ Zellen pro Bohrloch, und wenn die Zellen eine 85%ige Konfluenz erreichen, verwenden Sie das Osteogenese-Differenzierungskit zur Induktion – rekonstituieren Sie das Kit Komponente A (osteogener Indduktor) und Komponente B (osteogenes Präparat) in niedrigglukosehaltigem DMEM (Endkonzentrationen: 10% FBS, 1% Penicillin/Streptomycin, 0,1 μM Dexamethason, 10 mM β-Glycerophosphat, 0,05 mM Ascorbinsäure-2-phosphat) und das Medium alle 3 Tage für 3 Wochen auffrischen. Zur Färbung fixieren Sie die Zellen mit 4 % PFA bei Raumtemperatur für 15 Minuten, waschen Sie sie 3x mit 1x PBS und inkubieren Sie dann mit 2 % Alizarin Red S-Lösung (pH 4,2, zubereitet in deionisiertem Wasser) bei Zimmertemperatur für 30 Minuten. Waschen Sie die Zellen dreimal mit 1x PBS, um ungebundene Färbungen zu entfernen, bilden Sie dann kalkabgelagerte Knötchen unter einem Phasenkontrastmikroskop ab (20x) und quantifizieren Sie die Mineralisierung durch Messung der Fläche der Alizarin-roten S-positiven Knötchen mit der ImageJ-Software.

Chondrogene Differenzierung: Zentrifugiere 250.000 hADSC bei 500 x g für 5 Minuten bei 4 °C in einem 15 mL konischen Rohr, um ein Zellpellet zu bilden, gib 500 μL vollständiges DMEM-Medium in das Rohr und inkubiere über Nacht bei 37 °C mit 5 % CO2zur Stabilisierung des Pellets. Am nächsten Tag verwenden Sie das Condrogenese-Differenzierungskit zur Induktion – rekonstituieren Sie das Kit Komponente A (Chondrogener Induktor) in einemCO-2-unabhängigen Medium (Endkonzentrationen: 1 % Penicillin/Streptomycin, 10 ng/mL TGF-β3, 50 μg/mL Ascorbinsäure-2-phosphat, 100 μg/mL Natriumpyruvat) und erneuern Sie das Medium alle 3 Tage sanft (ohne das Pellet zu stören). Nach 3 Wochen Induktion wird das Zellpellet mit 4 % PFA bei Raumtemperatur für 30 Minuten fixiert, das Fixierungsmittel aspiriert, mit 0,1 % (w/v) Toluidin-Blue-O-Lösung (hergestellt in 0,1 m Natriumacetatpuffer, pH 4,0) bei Raumtemperatur für 15 Minuten inkubiert, die Farbe aspiriert, die Pellet dreimal mit deionisiertem Wasser abgespült, um überschüssige Farbe zu entfernen. anschließend wird unter einem Hellfeldmikroskop (20x) abgebildet und die sulfatierte Proteoglykanakkumulation durch Messung der mittleren optischen Dichte (OD) der Toluidinblau-O-Färbung mit der Software ImageJ quantifiziert.

VORSICHT: Beim Umgang mit 4 % PFA (einem giftigen und korrosiven Reagenz) arbeiten Sie ausschließlich mit einer Abzugshaube und dabei Einweghandschuhe, Laborkittel und Schutzbrillen, um das Einatmen von Dampf oder Kontakt mit Haut und Augen zu vermeiden – bei Kontakt sofort 15 Minuten mit fließendem Wasser spülen und medizinische Hilfe aufsuchen. Für die Entsorgung gefährlicher Abfälle sammeln Sie gebrauchte PFA- und PFA-kontaminierte Materialien (z. B. Pipettenspitzen, Platten) in einem speziellen chemischen Abfallbehälter, der als PFA-Abfall gekennzeichnet ist, und entsorgen Sie sie nach institutionellen Protokollen für gefährliche Abfälle, wobei Sie darauf achten, dass sie sich nicht mit biologischen Abfällen vermischen.

Elektrotaxis-Kammer-Zusammenbau: Bohren Sie zwei Löcher (0,75 cm Durchmesser) an gegenüberliegenden Enden der Mittellinie auf einen 10 cm langen Petrischalendeckel, der 1 cm vom Rand der Schale entfernt positioniert ist (um Agar-Salz-Brücken aufzunehmen). Tragen Sie eine dünne Schicht Vakuumfett (≤ 2 cm Länge, ≤ 1 cm Breite) auf den Boden der Petrischale entlang der Mittellinie, 4 cm von jeder Kante entfernt auf (Abbildung 1A). Mit sterilen, feinspitzigen Zangenstiften legen Sie auf jede Fettstelle einen sterilen 1 cm x 2 cm großen Glasdeckel und drücken Sie sanft, um eine dichte Abdichtung sicherzustellen (Bruch des Deckrutsches zu vermeiden; Abbildung 1B-C). Tragen Sie eine weitere dünne Schicht Vakuumfett auf jeden befestigten Deckschicht auf und legen Sie dann einen zweiten sterilen 1 cm x 2 cm großen Glasdeckel direkt auf das Fett, um einen doppelten Überdeckungsschachtel zu bilden. Drücken Sie sanft, um eine dichte Abdichtung zwischen den beiden Deckfolien sicherzustellen (Mittelundichtigkeit verhindern; Abbildung 1D). Entlang der diagonalen Linie, die die obere linke Ecke eines Deckdeckels mit dem nächstgelegenen Schalenrand verbindet, und die untere rechte Ecke des gegenüberliegenden Stapels mit dem nächstgelegenen Rand, tragen Sie Vakuumfett auf, um eine durchgehende Barrierenwand zu bilden. Die Wand sollte fest am Boden der Schüssel befestigt sein (ohne Lücken) und etwa 2 cm hoch und 0,5 cm breit sein (Abbildung 1E). Sterilisieren Sie die zusammengesetzte Kammer unter UV-Licht für 20 Minuten (um mikrobielle Kontamination zu eliminieren) und lagern Sie dann bei Raumtemperatur unter sterilen Bedingungen bis zur Nutzung (Abbildung 1F).

DCEF-Stimulation: Sterile Glasobjektträger (zur Zellaussäung) in eine 10 cm lange Petrischale zu legen und über Nacht bei 37 °C mit 5 % CO2 zu inkubieren, um die Objektträger vorzubereiten (Zelladhäsion zu fördern). Bereite Steinbergs Lösung vor, indem man 10 mL 10x Lagerlösung in 90 mL ddH2O verdünnt (steril; Endkonzentrationen: 58 mM NaCl, 0,67 mM KCl, 0,44 mM Ca(NO3)24H2O, 0,83 mM MgSO47H2O, 10 mM HEPES; pH 7,4). Fügen Sie 0,3 g Agar zu 20 ml der vorbereiteten Steinberg-Lösung hinzu, mikrowellen 20 Sekunden, bis der Agar vollständig gelöst ist und die Lösung klar ist, füllen Sie dann sofort individuelle Glassalzbrücken mit der heißen Agar-Steinberg-Mischung und lassen sie bei Raumtemperatur fest werden. Nach der Erstarrung sterilisieren Sie die Salzbrücken unter UV-Licht für 15 Minuten und sterilisieren Sie zwei Becher (jeweils mit 30 ml Steinberg-Lösung) unter UV-Licht für 15 Minuten. Seed P3-generierte hADSCs auf den vorkonditionierten sterilen Objektträgern mit einer Dichte von 2 x 10⁴ Zellen/cm² inkubieren bei 37 °C mit 5 % CO2für 24 Stunden, um eine Zelladhäsion zu ermöglichen, Dann werden die zellbesetzten Objektträger auf die Start- und Landebahn der zusammengebauten Elektrotaxiskammer übertragen und mit sterilen Seitenschlitten gesichert (um eine Bewegung zu verhindern). Versiegeln Sie die Startbahn, indem Sie einen 3 cm x 2 cm großen Glasdeckel über das Vakuumfett legen, sanft drücken, um eine dichte Abdichtung zu gewährleisten, und zusätzliches Vakuumfett an den Rändern des oberen Abdeckers auftragen, um eine Barriere zu bilden (Verdunstung des Mediums zu verhindern). Füllen Sie die Reservoirs der Kammermit einem CO2-unabhängigen Medium (ergänzt durch 10 % FBS und 1 % Penicillin/Streptomycin; Volumen: 5–8 ml pro Reservoir), führen Sie die sterilisierten Agar-Salz-Brücken durch die Löcher im Petrischalendeckel ein (wobei ein Ende im Mediumreservoir der Kammer eingetaucht ist und das andere Ende in die lösungsgefüllten Steinberg-Becher eingetaucht ist) und verbinden Sie die Becher mit einer Stromversorgung über Ag/AgCl-Elektroden (um einen stabilen Gleichstrom zu liefern). Legen Sie ein Gleichstromfeld (DCEF) von 2 V/cm für 4 Stunden an, überwachen Sie die Spannung alle 15 Minuten mit einem digitalen Multimeter (gegebenenfalls anpassen, um eine konstante Feldstärke zu erhalten) und nehmen alle 5 Minuten Zeitrafferaufnahmen der Zellmigration bei 4 Zufallsfeldern mit der Software auf (5x Objektiv, Hellfeldmodus).

HINWEIS: Bei der Verwendung elektrischer Geräte sollten Sie darauf achten, dass das Netzteil und die Elektroden trocken sind und auf einer nicht leitenden Oberfläche platziert sind, um einen Stromschlag zu vermeiden. Tragen Sie isolierte Handschuhe beim Anschließen oder Trennen von Elektroden, schalten Sie den Strom ab, bevor Sie das Setup anpassen, und bei mittlerer Undichtigkeit an elektrischen Komponenten schalten Sie den Strom sofort ab und wischen Sie ihn mit saugfähigem Papier ab, das in 75 % Ethanol getränkt ist. In dieser Studie wurde durch die Minimierung der Dicke der Elektrophoresekammer und das Halten von etwa 1 mm sowie der Durchführung von Mehrpunktspannungsmessungen an beiden Enden der Kammer die Feldstärke innerhalb von 10 % kontrolliert. Unter diesen Bedingungen wird angenommen, dass die elektrische Feldverteilung innerhalb des Kulturbereichs im Wesentlichen gleichmäßig26 ist.

Migrations- und Morphologieanalyse
Live-Imaging: Für hADSCs unter DCEF-Stimulation importieren Sie die Zeitrafferbildsequenzen (5-Minuten-Intervalle) in die ImageJ-Software, verfolgen Sie manuell 100 Zellen über 4 unabhängige Felder vom Anfang (t=0) bis zum Ende der Stimulation (t=4 H) mit dem Manual Tracking-Plugin und berechnen Sie die mittlere Migrationsgeschwindigkeit (μm/min) und die Richtungsfähigkeit (D/T-Verhältnis, wobei D = gerade Strecke vom Anfang bis zum Ende ist), T = Gesamtweglänge) mit dem Chemotaxis Tool-Plugin (ImageJ).

Tracking: Berechnen Sie folgende Migrationsparameter, um elektrotaktisches Verhalten zu quantifizieren: Gerichtethigkeit (Σcosθi/n, wobei θi der Winkel zwischen dem Verschiebungsvektor der Zelle und der Richtung des elektrischen Feldes (EF) ist und n die Gesamtzahl der gefolgten Zellen ist, die von -1 bis 1 reichen, wobei Werte näher an 1 eine stärkere anodengerichtete Migration anzeigen), Akkumulierte Distanz (Gesamtweglänge, die jede Zelle während der Stimulationsperiode zurücklegt), in μm), Spurengeschwindigkeit (akkumulierte Entfernung geteilt durch Stimulationszeit in μm/h) und euklidische Entfernung (geradestrecke Start-zu-End-Verschiebung jeder Zelle in μm, die die Nettomigration widerspiegelt).

Morphometrie: Nach der DCEF-Stimulation werden Zellen mit 4 % PFA bei Raumtemperatur für 20 Minuten fixiert, 3-mal mit 1x PBS gewaschen, das Zytoskelett mit Phalloidin-TRITC (1:500 Verdünnung in 1x PBS; Volumen: 200 μL pro Bohrloch bei 24-Well-Platten) bei Raumtemperatur für 30 Minuten (zur Markierung von F-Actin) fixiert und die Kerne mit DAPI (1 μg/mL in 1x PBS; Volumen) gekontert. 100 μL pro Brunnen) für 5 Minuten. Die Zellen wurden mit einem Fluoreszenzmikroskop mit 20-facher Vergrößerung fotografiert (mit repräsentativen hochauflösenden Bildern mit 40-facher Vergrößerung). Phalloidin-TRITC wurde mit einer Anregungswellenlänge von 540–555 nm und einer Emissionswellenlänge von 565–580 nm visualisiert, während DAPI mit einer Anregungswellenlänge von 358–405 nm und einer Emissionswellenlänge von 420–480 nm abgebildet wurde. Dann werden in ImageJ folgende morphologische Parameter gemessen: Lange Achse (maximaler Feret-Durchmesser, der längste Abstand zwischen zwei Punkten am Zellrand), vertikale Länge (Breite der Zelle senkrecht zur langen Achse) und Vertikalität (sinα, wobei α der Winkel zwischen der langen Achse der Zelle und der Richtung der EF ist, wobei höhere Werte auf eine stärkere Ausrichtung mit der EF hinweisen).

Alters- und Proliferations-Assays
SA-β-Gal Flecken: Verwenden Sie ein Seneszenz-Detektionsset, um seneszente Zellen (blau gefärbte Zellen) unter einem Hellfeldmikroskop (20x Objektiv) zu identifizieren. Säe HADSCs der P3-Generation in 6-Well-Platten mit einer Dichte von 2 x 105 Zellen pro Well, kultiviere bis zur 80%-Konfluenz, aspiriere das Medium, wasche die Zellen vorsichtig 3x mit 1x PBS, gib pro Bohrloch 1 ml Fixativlösung (im Kit enthalten) und inkubiere bei Raumtemperatur 15 Minuten, wasche die Zellen 3x mit 1x PBS, um nach der Fixierung den Restfixativ zu entfernen. Fügen Sie 0,5 ml SA-β-gal Färbearbeitungslösung hinzu (hergestellt durch Mischung von 50 μL SA-β-gal Substrat mit 450 μL Färbepuffer gemäß dem Kit-Handbuch) pro Bohrloch, versiegeln Sie die Platte mit transparenter Folie (um Verdunstung zu verhindern), inkubieren Sie über Nacht (16–18 H) bei 37 °C (vermeiden Sie eine CO2-Exposition, da dies den pH-Wert verändert und die Enzymaktivität hemmt), Am nächsten Tag werden Hellfeldbilder von ≥10 Zufallsfeldern pro Bohrloch (10x Objektiv) erfasst, die Anzahl der blau gefärbten (SA-β-gal+) Zellen und Gesamtzellen gezählt und der Prozentsatz der seneszenten Zellen berechnet als (Anzahl der SA-β-gal+ Zellen / Gesamtzahl der Zellen) x 100.

Ki67-Immunfärbung
Nach der SA-β-gal-Färbung aspirieren Sie die Färbelösung, waschen Sie die Zellen zweimal mit 1x PBS, permeabilisieren Sie die Zellmembranen mit 0,1 % Triton X-100 (hergestellt in 1x PBS; 1 ml pro Bohrloch) bei Raumtemperatur für 10 Minuten und blockieren Sie die unspezifische Antikörperbindung mit 5 % BSA (in 1x PBS; 1 ml pro Bohrloch) bei Raumtemperatur für 1 Stunde. Die Zellen wurden anschließend über Nacht mit dem Anti-Ki67-Primärantikörper (1:200 Verdünnung in 1 % BSA/PBS; 500 μL pro Bohrloch) bei 4 °C inkubiert. Am nächsten Tag wurden die Zellen dreimal mit 1x PBS (jeweils 5 Minuten) gewaschen, den ungebundenen primären Antikörper entfernt und mit Alexa Fluor 488 488-konjugiertem Sekundärantikörper (1:500 Verdünnung in 1 % BSA/PBS; 500 μL pro Bohrloch) bei Raumtemperatur für 1 Stunde im Dunkeln inkubiert. Die Zellen wurden erneut dreimal mit 1x PBS gewaschen und 5 Minuten lang mit DAPI (1 μg/mL in 1x PBS; 200 μL pro Bohrloch) gekonterfärbt. Fluoreszenzbilder wurden mit einem Fluoreszenzmikroskop mit 20-facher Vergrößerung aufgenommen (mit repräsentativen hochauflösenden Bildern mit 40x). Alexa Fluor 488-markierte Ki67+- Zellen wurden mit einer Anregungswellenlänge von 485–495 nm und einer Emissionswellenlänge von 515–545 nm visualisiert, während DAPI-gefärbte Kerne mit einer Anregungswellenlänge von 358–405 nm und einer Emissionswellenlänge von 420–480 nm abgebildet wurden. Der Prozentsatz der proliferativen Zellen wurde berechnet wie folgt: (Anzahl der Ki67+- Zellen / Anzahl der DAPI+- Kerne) x 100.

HINWEIS: Beim Umgang mit primären und sekundären Antikörpern arbeiten Sie in einem BSC, um Kontaminationen zu verhindern, Aliquot-Antikörper in Einmalvolumen zu verwandeln, um wiederholte Gefrier-Tau-Zyklen zu vermeiden, und sammeln antikörperkontaminierte Materialien (z. B. Pipettenspitzen, Platten) in einem speziell autoklavierbaren biologischen Abfallbeutel zur Sterilisation durch Autoklavierung vor der Entsorgung.

Altersabhängige Elektrotaxisanalyse von hADSCs: Verwenden Sie eine DC-Puls-Stromversorgung, um DCEF mit drei Intensitäten zu erzeugen: 0 mV/mm (Kontrolle), 100 mV/mm und 200 mV/mm, setzen Sie eine Live-Cell-Workstation ein, um die Zellmigration in Echtzeit zu beobachten und aufzuzeichnen, und vergleichen Sie für jede EF-Intensität quantitativ die anodale Migrationskapazität von hADSCs von jungen und älteren weiblichen Spendern durch Messung der akkumulierten Distanz, Euklidische Distanz, Streckengeschwindigkeit und Gerichtetheit, mit drei unabhängigen biologischen Replikaten pro Gruppe, um die Zuverlässigkeit des Ergebnisses sicherzustellen. Elektrotaktische Migrationsparameter wurden mithilfe der Manual Tracking and Chemotaxis Tool-Plugins in ImageJ (NIH) quantifiziert. Einzelne Zellen wurden während des gesamten 4-Stunden-Stimulationszeitraums manuell verfolgt, und die folgenden Parameter wurden nach Standardmethoden berechnet: Akkumulierte Distanz: die gesamte Weglänge, die jede Zelle während des Aufzeichnungszeitraums zurückgelegt hat. Euklidische Distanz: die gerade Linie zwischen der Start- und Endposition der Zelle. Streckengeschwindigkeit: akkumulierte Entfernung geteilt durch die gesamte Verfolgungszeit (μm/h). Gerichtetheit: berechnet als mittlerer Kosinus des Winkels (θ) zwischen jedem Verschiebungsvektor und dem elektrischen Feldvektor (Werte reichen von -1 bis 1; Werte näher an 1 zeigen eine starke anodale Migration an).

RNA-Sequenzierung
RNA-Extraktion und Präparation: Sterilisieren Sie einen mit Eis gefüllten Behälter unter UV-Licht für 15 Minuten (um die RNA-Stabilität zu gewährleisten) und führen Sie alle folgenden Schritte auf Eis durch. hADSC-gesäte Glasobjektträger (1 cm x 2 cm) aus der Elektrotaxiskammer in eine sterile Petrischale überführen, die Zellen dreimal mit 3 mL eiskalten 1x PBS waschen (PBS vorsichtig hinzufügen, leicht bewegen und vollständig aspirieren, um das Restmedium zu entfernen), dann 1 ml Trizol-Reagenz zu jedem Objektträger geben und 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren, um die Zellen vollständig zu lysieren (stellen Sie sicher, dass das Lysat die gesamte Zellschicht bedeckt). Das Lysat in ein RNase-freies 1,5-mL-Zentrifugenrohr übertragen, 0,2 ml Chloroform hinzufügen, 15 Sekunden lang energisch vortieren, um die Phasentrennung zu induzieren, das Rohr 15 Minuten auf Eis bekubieren und dann 15 Minuten bei 12.000 x g bei 4 °C zentrifugieren. Dies teilt das Lysat in drei Schichten auf: die obere wässrige Phase mit RNA, die mittlere Proteinschicht und die untere organische Phase. Übertragen Sie vorsichtig die obere wässrige Phase (≈ 0,5 mL) in ein neues, RNase-freies Rohr (vermeiden Sie Berührung der mittleren Schicht), fügen Sie 0,5 ml Isopropanol hinzu, lassen Sie vorsichtig RNA ausfällen, inkubieren Sie 10 Minuten auf Eis und zentrifugieren Sie dann bei 12.000 x g für 10 Minuten bei 4 °C; RNA bildet am Boden des Röhrchens ein weißes Pellet. Entsorge den Überstandsstoff, wiederhole die Isopropanol-Ausfällung einmal, um die RNA-Reinheit zu verbessern, aspiriere den Überstandsstoff vollständig, trockne das RNA-Pellet 5–10 Minuten bei Raumtemperatur in einem BSC an der Luft (nicht übertrocknen, da dies die Löslichkeit verringert), suspendiere das RNA-Pellet in 30 μL DEPC-behandeltem Wasser, inkubiere bei 55 °C für 10 Minuten zur Unterstützung der Auflösung, RNA-Reinheit durch Messung des A260/A280-Verhältnisses (Ziel: 1,8–2,0) mit einem Spektrophotometer quantifizieren, RNA-Integrität mit einem RNA-Nanochip bewerten; Ziel: RNA-Integritätsnummer [RIN] > 8,0 und Lagerung qualifizierter RNA-Proben bei -80 °C bis zur Sequenzierung.

VORSICHT: Trizol und Chloroform sind giftig, flüchtig und krebserregend, daher sollten Sie sie ausschließlich in einer Dampfhaube mit Nitrilhandschuhen, Laborkittel und Schutzbrille behandeln – vermeiden Sie das Einatmen von Dämpfen, wischen Sie mit einem Küchenpapier ab und spülen Sie 10 Minuten lang mit Seife und Wasser, falls es auf die Haut verschüttet wird, und mischen Sie es nicht mit Bleichmittel oder anderen Oxidationsmitteln (da dies giftige Gase erzeugen kann). Für die Entsorgung von gefährlichen Abfällen im Zusammenhang mit RNA-Extraktion sammeln Sie Mischungen, Isopropanol-Supernatanten und kontaminierte Schläuche in einem versiegelten, chemisch resistenten Behälter mit der Bezeichnung RNA Waste (nicht mit wässrigem oder biologischem Abfall mischen) und entsorgen Sie die institutionellen Protokolle für gefährliche Abfälle, wobei Sie darauf achten, keine Abflüsse hineinzugießen.

Datenvorverarbeitung und Qualitätskontrolle: Sequenzierungsbibliotheken mit dem VAHTS mRNA-seq Library Prep Kit nach dem Protokoll des Herstellers vorbereiten – mRNA mit Oligo(dT)-Magnetperlen anreichern, mRNA in 200–300 bp-Fragmente mittels divalenten Kationen fragmentieren, Erststrang-cDNA mit zufälligen Hexamern gefolgt von zweiter Strang-cDNA synthetisieren, Endreparaturen durchführen, A-Schwänze hinzufügen, Sequenzierungsadapter ligieren, Bibliotheken durch PCR amplifizieren und mit Perlen reinigen. Sequenzieren Sie die Bibliotheken auf einer Sequenzierungsplattform (150 bp gepaarte Endlesungen), die etwa 50 Millionen Rohlesungen pro Probe erzeugen, und verwenden Sie dann eine Software, um minderwertige Lesearten zu trimmen (Lesearten mit >50 % Basen mit Phred-Qualitätsscore <20) und Adaptersequenzen zu entfernen, wobei etwa 48 Millionen saubere Lesearten pro Probe erhalten werden (Q30 > 90 %) für die nachgelagerte Analyse nach dem Trimmen.

Bioinformatik-Analyse: Richten Sie die sauberen Reads mit der humanen Referenzgenom (GRCh38/hg38) mit der Hisat2 v2.2.1-Software aus und speichern Sie die Ausrichtungsergebnisse als BAM-Dateien, verwenden Sie die Software htseq-count v0.13.5, um die Anzahl der auf jedes Gen abgebildeten Reads zu zählen (basierend auf Ensembl-Genannotationen), normalisieren Sie Genzähldaten mit der Funktion estimateSizeFactors aus dem DESeq (2012) R-Paket, um Batch-Effekte und Unterschiede in der Sequenzierungstiefe zu eliminieren, und eine differentielle Expressionsanalyse mit der nbinomTest-Funktion (DESeq-Paket) durchzuführen, wobei differenziell exprimierte Gene (DEGs) unter Verwendung von Schwellenwerten der Faltenänderung (FC) > 2 und einem angepassten p-Wert (PADJ) < 0,05 ausgewählt werden. Durchführung von Genontologie-(GO)-Anreicherungsanalysen (biologischer Prozess, molekulare Funktion, zelluläre Komponente) und Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)-Pfadanreicherungsanalyse auf DEGs mit dem ClusterProfiler v4.0 R-Paket, wobei der Fokus auf Anreicherungen im Zusammenhang mit Zellmigration (z. B. Zelladhäsion, Zellmigration), Ionentransport (z. B. Natriumionen-Transmembrantransport) und Signalwegen (z. B. PI3K-Akt-Signalweg) steht. Führen Sie unüberwachtes hierarchisches Clustering bei DEGs mit dem pheatmap v1.0.12 R-Paket durch und visualisieren Sie Genexpressionsmuster über Proben hinweg mit einer Heatmap (zeilenskalierte Z-Scores).

Statistische Analyse: Alle experimentellen Daten werden als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (Mittelwert ± SEM) dargestellt, mit mindestens 3 unabhängigen biologischen Replikaten pro Gruppe (n ≥ 3). Verwenden Sie den Student's t-Test, um Unterschiede zwischen zwei Gruppen (z. B. junge vs. ältere Spender) und die Einweg-Varianzanalyse (ANOVA) gefolgt vom Tukey-Post-hoc-Test zu vergleichen, um Unterschiede zwischen drei oder mehr Gruppen (z. B. unterschiedliche EF-Intensitäten) zu vergleichen, indem statistische Analysen mit SPSS 23.0-Software durchgeführt und die statistische Signifikanz wie folgt definiert wird: *p < 0,05, **p < 0,01, p < 0,001.

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Results

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Die Anwendung elektrischer Felder leitet die Richtungswanderung von hADSCs und erhöht ihre Migrationskapazität
Die extrahierten hADSCs wiesen typische mesenchymale Stammzelloberflächenmarker auf (z. B. CD29, CD44, CD90, CD73, CD105) und besaßen ein Potenzial zur Trilineage-Differenzierung (adipogen, osteogen, chondrogen; Abbildung 2A), erfüllt die Standardkriterien für die hADSC-Identifikation. Wir legten Gleichstromfelder (DCEFs) bei Intensitäten von 0 mV/mm, 100 mV/mm u...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Früh im Prozess der Reparatur und Regeneration von Gewebeverletzungen treten elektrische Felder als eines der frühesten physikalischen Signale in der Mikroumgebung auf. Ihre richtungsweisenden Eigenschaften korrelieren räumlich und zeitlich mit der Rekrutierung von Zellen an der Verletzungsstelle27. Endogene elektrische Felder entstehen aus dem transepithelialen Potential, das durch polarisierten Ionentransport in Epithelgeweben erzeugt wird. Wenn die epitiheliale...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte, die offengelegt werden müssen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir danken der Abteilung für plastische Chirurgie am First Affiliated Hospital der China Medical University (Shenyang, China) und dem Institute for Regenerative Cures der University of California, Davis (CA, USA) aufrichtig für ihre Bereitstellung kritischer experimenteller Infrastruktur und gemeinsame Forschungsressourcen, die diese Studie ermöglichten. Wir danken auch Shanghai OE Biotech Co., Ltd. für ihre technische Unterstützung in der RNA-Sequenzierung und bioinformatischen Analyse.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
4° C/-20 Grad; C/-80 & Grad; C-KühlschrankHaier, ChinaHYC-390/DW-25L262/DW-86L728J
AgarHUSHI, China10000561
Agilent 2100 BioanalyzerAgilent Technologies, Vereinigte StaatenG2939BA
Alizarin Red S Sigma-Aldrich, Vereinigte StaatenA5533
Biosicherheitskabinett Thermo Fisher Scientific, Vereinigte Staaten1300 A2 1,5 m
CaNO3· 4H2OHUSHI, China10013960
ZentrifugeThermo Fisher Scientific, Vereinigte StaatenX4R Pro 
CO2 InkubatorThermo Fisher Scientific, Vereinigte StaatenForma Steri-Zyklus 3307 
Kollagenase Typ IVBiosharp, China BS076
KonfokalmikroskopZEISS, DeutschlandLSM 900
Gleichstrom-Impuls-Netzteil Daedo Powertronics, KoreaDDP-500
DexamethasonSigma-Aldrich, Vereinigte StaatenD4902
Digitales MultimeterFluke, Vereinigte StaatenFLUKE-175
DMSOSigma-Aldrich, Vereinigte StaatenD2650
Elektronisches Konto Sartorius, Deutschland BSA224S-CW
FBS Gibco, Vereinigte Staaten10270-106
DurchflusszytometerThermo Fisher Scientific, Vereinigte StaatenA24858
IBMX (1-Methyl-3-Isobutylxanthin)Sigma-Aldrich, Vereinigte StaatenI7018
Indomethacin   Sigma-Aldrich, Vereinigte StaatenI7378
InsulinSigma-Aldrich, Vereinigte StaatenI5500   
Invertiertes MikroskopZEISS, DeutschlandAxio Observer 7 / ACR
ITS-GSigma-Aldrich, Vereinigte StaatenI3146
KClHUSHI, China10019318
KH2PO4HUSHI, China10019320
Linolsäure Sigma-Aldrich, Vereinigte StaatenL1376
Live-MobilfunkstationLive Cell Instrument, KoreaChamlide TC 
Niedriges Glukose-DMEMGibco, Vereinigte Staaten11885084
MgSO4· 7H2O HUSHI, China10019322
Na2HPO4· 12H2OHUSHI, China10019324
NaClHUSHI, China10019318
NanoDrop 2000 SpektrophotometerThermo Fisher Scientific, Vereinigte StaatenND-2000
Oil Red OSigma-Aldrich, Vereinigte StaatenO0625
Penicillin/StreptomycinGibco, Vereinigte Staaten15140122
PipettenEppendorf, Deutschland 4920000061
SYBR Premix EX TaqTakara, China RR420A
Toluidine Blue O         Sigma-Aldrich, Vereinigte StaatenT3260
TrisHUSHI, China10019326
TRIzolBeyotime, ChinaR0016
Trypsin-EDTAGibco, Vereinigte Staaten25200056
Vertikales MikroskopZEISS, Deutschland415200-0000-000 
VakuumfettDOW CORNING, Vereinigte Staaten1597418
Vitamin C     Sigma-Aldrich, Vereinigte StaatenA4544
WasseraufbereitungssystemThermo Fisher Scientific, Vereinigte Staaten  GenPure xCAD Plus UF-TOC
β-Glycerophosphat Sigma-Aldrich, Vereinigte StaatenG9422

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