Validierung des hyperbaren Drucksystems mit Xenon-Anästhesie für Drosophila melanogaster

Summary

Gase, die bei atmosphärischem Druck harmlos erscheinen, können unter hyperbaren Bedingungen Verhaltensweisen wie Narkose hervorrufen. Konventionelle hyperbare Druckkammern sind kostspielig und arbeitsintensiv. Diese Studie präsentiert eine einfache, kostengünstige Methode, um die Wirkung von Xenon auf Drosophila melanogaster bei moderaten Drücken unter 4 atm zu untersuchen.

Abstract

Unter hyperbaren Bedingungen können die erhöhten Konzentrationen der Umgebungsgase bei verschiedenen Tieren verschiedene Verhaltensreaktionen hervorrufen. Ein erheblicher Teil dieser Verhaltensweisen repräsentiert Veränderungen kognitiver Zustände, die noch wenig verstanden sind. Ein bemerkenswertes Beispiel ist die Vollnarkose. Die Verhaltenswirkung mehrerer Gase unter hyperbaren Bedingungen in der Allgemeinanästhesie, also Narkose, ist trotz des überwältigenden häufigen Gebrauchs der Medikamente in der Medizin eine langjährige wissenschaftliche Untersuchung. Xenon, eingestuft als Edelgas und Anästhetikum, gilt als eine der sichersten Optionen für Vollnarkose beim Menschen. Unter normobarischen Bedingungen betäubt es Fliegen jedoch nicht. Hier haben wir ein einfaches experimentelles System etabliert, das den Umgebungsdruck auf ~3 atm erhöht und die Untersuchung der Xenonanästhesie in einem der beliebtesten Modellorganismen, Drosophila melanogaster, ermöglicht. Dieses experimentelle Setup erleichtert zudem die Untersuchung anderer Gase und deren Wirkung unter hyperbaren Bedingungen.

Introduction

Die beiden extremen Enden von Verhaltenseffekten, die bei Tieren unter hyperbaren Bedingungen beobachtet wurden, sind Sauerstoffkrämpfe und Narkose durch Stickstoff ^1,2. Kurioserweise wurden kognitive Beeinträchtigungen wie Halluzinationen und Gedächtnisstörungen mit Stickstoff und Wasserstoff bei Druckwerten vor dem Bewusstlosigkeitsgrad ^3,4 berichtet. Eine durch Xenon, Krypton und Distickstoffmonoxid induzierte Anästhesie unter hyperbaren Bedingungen wurde bereits^{vor 5,6} berichtet.

Die Vollnarkose ist sowohl ein Grundpfeiler der Medizin als auch ein Phänomen von erheblichem wissenschaftlichem Interesse. Trotz seiner langen und weit verbreiteten Anwendung bleibt unser Verständnis darüber, wie genau bestimmte Chemikalien das vorübergehende Fehlen von Bewegung, Gedächtnis, Schmerz und Bewusstsein auslösen^. Xenon, als Edelgas, konnte als das eigenartigste Mitglied unter den Anästhetikumen ernannt werden. Es gilt als sichere Option für die Anästhesie, da es eine schnelle Einleitung und Genesung, minimale physiologische Störungen und nur milde Nebenwirkungen wie postoperative Übelkeit ^8,9 bietet.

Angesichts der medizinischen Bedeutung der Anästhesie und der ungewöhnlichen chemischen Eigenschaften von Xenon zielt diese Studie darauf ab, xenoninduzierte Anästhesie mit dem einfachen Tiermodell Drosophila melanogaster zu untersuchen. Verschiedene Forschungsstudien wurden durchgeführt, bei denen Fruchtfliegen die Vollnarkose untersucht haben, mit vielen vorgeschlagenen Setups und dem Einsatz verschiedener flüchtiger Anästhetika 10,11,12,13. Allerdings gibt es keine Berichte über eine Xenon-Anästhesie bei Drosophila. Unter normobaren Bedingungen induziert Xenon keine Anästhesie bei Drosophila melanogaster, allgemein bekannt als Fruchtfliegen. Um diese Einschränkung zu beheben, bietet diese Studie ein hyperbares System an, das eine kontrollierte Manipulation des Umgebungsdrucks zwischen 1 atm und etwa 4 atm ermöglicht. Es gab mehrere Studien mit überdruckbaren Kammern, um ähnliche Neugierden zu beantworten^14,15. Die meisten kommerziellen hyperbaren Kammern profitieren jedoch von robusten, auslaufsicheren Materialien, haben jedoch ein hohes Volumen (~3 L) und sind systematisch kompliziert in der Bedienung sowie teuer. Stattdessen ist die in diesem Artikel beschriebene Methode einfach und kostengünstig und ermöglicht die Erforschung der Auswirkungen verschiedener Gase und ihrer Kombinationen. Es bietet ein Setup, das für Kleintiermodelle wie D. melanogaster und C. elegans geeignet ist.

Protocol

1. Zubereitung von Drosophila melanogaster

1. Sammeln Sie für jedes Experiment mit_CO2 20 weibliche und 20 männliche Fliegen im Alter von 1–3 Tagen.
2. Lassen Sie die ausgewählten Fliegen mindestens 24 Stunden vor dem Experiment in einem Fläschchen mit Futter bei einer Temperatur von ~22 °C ausruhen.

2. Anästhesie-Verabreichung

1. Übertragen Sie die Gase aus ihren Gasflaschen in die undichten Gasbeutel für experimentelle Anwendungen. Für den direkten Transfer des Gases vom Behälter zu den Beuteln verwenden Sie Silikonschlauch.
2. Befestigen Sie 25 mm (3,4 mm Durchmesser) Silikonrohr an der Polypropylen-Spritze. Dann verbinden Sie die Polypropylen-Spritze mit den Gasbeuteln und dem Dreifach-Tap. Zur Klarstellung wird die Polypropylen-Spritze im weiteren Verlauf des Textes als Spritze #1 bezeichnet.

3. Zusammensetzung des hyperbaren Aufbaus (Abbildung 1)

1. Positioniere den LED-Leuchttisch im Querformat auf dem Tisch (lange Kante horizontal zur Tischoberfläche).
2. Stellen Sie die Einspritzpumpe neben eine der kurzen Seiten des LED-Leuchttischs und stellen Sie sicher, dass die Ausrichtung der Pumpe es ermöglicht, dass die experimentelle Spritze über die Hintergrundbeleuchtung hinausragt.
3. Positioniere die Kamera über dem Setup, um den Bereich abzudecken, in dem sich die experimentelle Spritze befindet.
4. Schneiden Sie ein 75 mm langes Siliziumrohr (3,4 mm Durchmesser). Verbinden Sie den Drei-Wege-Hahn mit dem Manometer über das Silikonrohr von der zentralen Düse.
5. Verwenden Sie Federklemmen an der Düse von der Seite des Manometers und den Dreifach-Tap, um sicherzustellen, dass das Rohr fest sitzt.
6. Mit dem durch einen Doppelpfeil im Steuergerät der Einspritzpumpe markierten Knopf stellen Sie die Drehzahl auf 80 mm/m und die Dauer auf 38 s für die automatische Kompression oder Dekompression des Kolbens ein.

4. Verfahren zur Xenon-Anästhesie

1. Begrenze das Umgebungslicht im Experimentierraum, schalte den LED-Leuchttisch ein und stelle die Helligkeit auf Stufe 3. Das hilft, den Kontrast im Video zu erhöhen.
2. Entfernen Sie den Kolben der Polycarbonatspritze. Führen Sie eine kleine Menge Baumwolle in die Brustwarze der Spritze, um das Entkommen von Fliegen zu verhindern. Zur Klarstellung wird die Polycarbonat-Spritze im restlichen Text als Spritze #2 bezeichnet.
3. Um 40 Fliegen von ihrem Fläschchen auf Spritze #2 zu übertragen, nehmen Sie zuerst den Deckel des Fläschchens heraus und setzen Sie den Spritzenbehälter senkrecht auf das Fläschchen. Der Laufflansch sollte mit der Oberseite des Fläschchens verschmelzen, damit die Fliegen in den Spritzenlauf gelangen können. Dreh die Konstruktion um 180° und tippe. Dadurch werden die Fliegen am Boden des Spritzenrohrs platziert. Setzen Sie den Pümpel wieder ein. Setzen Sie die Spritze mit den Fliegen in die Einspritzpumpe.
4. Richten Sie die Laufspuren der Spritze seitlich aus, um die Fliegen aus der Kameraperspektive besser sehen zu können.
5. Befestigen Sie die Spritze am Lauf und den Kolbenkopf mit den verstellbaren Schrauben an der Einspritzpumpe.
6. Entfernen Sie die Baumwolle von der Spitze der Spritze #2 und verbinden Sie sie mit dem 3-Wege-Tap.
7. Starte die Videoaufnahme. Schalten Sie das Manometer ein. Drehen Sie den Absperrhahn, um das Manometer mit Spritze #2 zu verbinden, und überprüfen Sie mit dem Manometer den 0 kPa-Druck in der Spritze.
8. Drehen Sie den 3-Wege-Tap vor dem Experiment in die seitliche Position, um den Luftaustausch mit der Spritze zu ermöglichen.
9. Verschieben Sie den Kolben von der 20- auf die 2-mL-Marke über die manuelle Steuerung der Einspritzpumpe, die darauf ausgelegt ist, die schnellste Option zu ermöglichen.
10. Aspirieren Sie 18 ml des Anästhetikumas aus dem Gasbeutel in Spritze #1. Schließen Sie Spritze #1 mit dem Drei-Wege-Tap vom seitlichen Lock-Lock-Port an. Um das korrekte Volumen zu beurteilen, würden 18 ml Betäubungsgas in einer Gesamtmenge von 20 ml Gemisch 90 % des Gasanteils liefern. Dies kann je nach gewünschtem Endgasanteil angepasst werden.
11. Verschieben Sie den Kolben manuell mit der Einspritzpumpe auf die 20-mL-Leitung.
12. Drehen Sie den Absperrhahn, um das Manometer mit Spritze #2 zu verbinden. Normalerweise zeigt das Manometer nach dem Einfüllen des Betäubungsmittels ~-3 kPa Druck an.
13. Bewegen Sie den Kolben automatisch, mit Geschwindigkeits- und Zeiteinstellungen auf 80 mm/s und 38 s. Die Pumpe soll die 5-mL-Stange des Laufs in 38 Sekunden erreichen. Wenn der Kolben stoppt, muss der maximale Druck ~200 kPa betragen.
14. Lass den Kolben 20 Sekunden auf 5 mL Position. Beachte den Spitzendruck.
15. Klopfen Sie mit der Spritze, um alle Fliegen zu lösen, die am Pümpel haften, sodass sie regungslos am Boden liegen.
16. Starte die automatische Dekompression am Ende von 20 Sekunden. Beende das Experiment, wenn der Kolben wieder bei der 20-mL-Stange ist. Beachten Sie den Enddruck für die Leckkontrolle.

5. Datenanalyse

HINWEIS: In diesem Experiment wurde die anästhetische Emergenz als Endpunkt verwendet. Die Flugbewegungen wurden vom Beginn der Plunger-Dekompression an quantifiziert. Es wurden zwei verschiedene Analysemethoden entwickelt: Pixelanalyse und Fliegenverfolgung. Jede Analysemethode hatte ihre Nachteile, die in der Diskussion kommuniziert werden.

1. Pixelanalyse
   1. Nutze ScreenFlow, um die Videos zu bearbeiten. Schneiden Sie jedes Video auf die gewünschte Region (ROI) zu, also die ersten 5 ml des Spritzenlaufs.
   2. Schneide das Video nach der Dekompression der Spritze auf die ersten 20 Sekunden. Exportiere die bearbeiteten Videos als GIFs. Dupliziere das GIF.
   3. Mit Fiji entferne du das erste Bild von einem Duplikat und entferne das letzte Bild vom anderen Duplikat. Um dies zu erreichen, wählen Sie Bild- > Videobearbeitung > Bilder löschen.
   4. Machen Sie jedes GIF in Fidschi so binär, dass Fliegen auf schwarzem Hintergrund weiß erscheinen. Um dies zu erreichen, wählen Sie Binär verarbeiten > Binär> Binär erstellen.
   5. Öffne beide GIFs in Fiji. Berechnen Sie den Pixelunterschied zwischen den GIFs. Um dies zu erreichen, wählen Sie Prozesse > Bildrechner. Diese Operation erzeugt ein GIF mit Pixeldifferenz.
   6. Speichere das GIF mit Pixelunterschieden. Analysieren Sie das Partikel in den verschiedenen GIFs. Dazu wählen Sie Analysieren > Teilchen in Fidschi analysieren. Passen Sie die Pixelgrößenschwellenwerte an, um das Signal-Rausch-Verhältnis zu erhöhen.
   7. Nach der Analyse der Partikel gibt Fiji eine CSV mit Pixelunterschieden pro Bild aus. Spar dir den CSV. CSV-Daten können verwendet werden, um die Bewegung pro Bild zu zeichnen. Verwenden Sie kumulative Bewegungen durch Frames, um statistische Unterschiede zwischen den Experimenten zuzuweisen.
2. Fliegenverfolgung
   HINWEIS: Für die Fliegenverfolgungsmethode wurde KI-Technologie eingesetzt, um den Schwerpunkt jeder Fliege in den Experimentvideos zu erkennen und zu verfolgen. Dafür wurden zwei Modelle kombiniert: YOLO (You Only Look Once) für die Erkennung und MASA (Matching Anything by Segmenting Anything) für das Tracking. Die Modelle wurden auf Google Colab mit einer Tesla T4-GPU ausgeführt.
   1. Installiere die Ultralytics YOLO-Bibliothek in Colab und lade dann das yolo11n.pt Modell. Verwenden Sie CVAT (Computer Vision Annotation Tool), um Fliegen in aus den Videos extrahierten Frames zu annotieren, und exportieren Sie dann den Datensatz im YOLO-Format für das Training. Detaillierte Installations- und Schulungsverfahren werden im Online-Repository beschrieben.
   2. Installieren Sie das MASA-Repository in Google Colab und integrieren Sie einen Kalman-Filter, um Objektverfolgung über aufeinanderfolgende Frames durchzuführen. Integrieren Sie das trainierte YOLO-Erkennungsmodell mit dem MASA-Tracking-Framework.
   3. Verwenden Sie FixTrack, um die von der kombinierten MASA+YOLO-Pipeline generierten Tracklets manuell zu überprüfen. Identifizieren und zusammenfügen Sie falsch fragmentierte Spuren oder korrigieren Sie Identitätsfehler, um kontinuierliche Flugbahnen für einzelne Fliegen zu erhalten. Detaillierte Installations- und Schulungsverfahren sind im FixTrack-Repository beschrieben.

Results

Die in diesem Artikel beschriebene Methode ermöglicht die Überwachung sowohl des Zeitpunkts als auch des Ausmaßes der Bewegungsaktivität bei Fliegen unter hyperbaren Bedingungen. Diese Konfiguration ermöglicht es Gasen wie Xenon und Distickstoffmonoxid, die unter normalen Bedingungen keine anästhetische Eigenschaften besitzen, bei Drosophila melanogaster eine Anästhesie zu erzeugen. Um dies zu demonstrieren, experimentierten wir mit verschiedenen Konzentrationen von Xenon und Lu...

Discussion

Diese einfache, kostengünstige Einrichtung macht hyperbare Verhaltenstests in Drosophila breit zugänglich und ermöglicht schnelle, reproduzierbare Experimente ohne spezialisierte Druckbehälter. Allerdings bringt es einige Einschränkungen mit sich. Einer seiner wichtigen Kompromisse ist der geringere maximale Druck im Vergleich zu bestehenden Setups. Der höchste Druck, den wir mit diesem Aufbau erzeugen können, beträgt ~4 atm, während Druckbehälter für Drosophila etwa da...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Luftdichte Gassäcke (0,5 l)	Techinstro	7440440
Kamera	Apfel	iPhone 15
Doppeldrahtfeder-Slangschellen	Quellenkarte	a24120200ux2109
Drosophila-Futtermischung	Fortgeschrittene Pflege	DM900
Drosophila melanogaster	Darwin Biological	LZ-210
Einspritzrohr	Aitoserlea	B09M8G5BQ8
LED-Leuchttisch	Lairi	M1-3878368
Manometer	Dwyeromega	477AV-8
Metall-Dreifach-Klemmmutter-Absperrhahn	Sigma Aldrich	Z182184
Polycarbonat-Spritze (20 ml)	DMC Medical	FD-1031NS
Polypropylen-Spritze (20 ml)	BD	301031
Silikonrohre
Xenon-Gas	Chengdu Taiyu Industriegase