Effiziente, regenerationsbasierte Agrobakterien-vermittelte Transformation einer asexuellen amphibischen Brassicaceae-Art, Rorippa aquatica

Zusammenfassung

Wir präsentieren ein effizientes, optimiertes Protokoll für die Agrobacterium-vermittelte Transformation einer asexuellen amphibischen Brassicaceae-Art, Rorippa aquatica, ohne ressourcenintensive sterile Gewebekulturverfahren. Durch die Nutzung eines visuellen Transformationsmarkers und einer Triebregenerationspipeline wurden erfolgreich nahe klonale Transformanten erzeugt und somit zukünftige Studien zur Anpassung der Pflanzen an die Unterwasserumgebung vorangetrieben.

Zusammenfassung

Die stabile genetische Transformation von Pflanzen, vermittelt durch Agrobacterium tumefaciens , war ein mächtiges Werkzeug für die grundlegende Pflanzenbiologie sowie für Pflanzenbiotechnologien, die die Pflanzenverbesserung direkt beeinflussen. Einfache und effektive Transformationspipelines, wie die Floral-Dipping-Methode für Arabidopsis, haben groß angelegte Analysen der Genfunktion drastisch vorangebracht. Eine solche Pipeline kann jedoch nicht auf Pflanzenarten angewendet werden, die keine sexuelle Fortpflanzung durchlaufen. Rorippa aquatica ist eine aufkommende amphibische Modellart der Brassicaceae, die heterophylle, drastische Veränderungen der Blatt- und Pflanzenform in terrestrischen oder unter Wasser aufweist. R. aquatica vermehrt sich ausschließlich vegetativ. Die hier vorgestellte optimierte Pipeline ermöglicht eine effiziente und zuverlässige Agrobacterium-vermittelte R. aquatica-Transformation , die keine sterile Gewebekultur erfordert. Blattstecklinge werden kurzzeitig in Agrobacterium eingetaucht, das in einem Transformationspuffer suspendiert ist und einen binären Vektor enthält, der unter dem konstitutiven Promotor einen visuellen Marker, RUBIN, ausdrückt. Anschließend werden die Inokulanten auf einem wassergetränkten Filterpapier in einer Wachstumskammer gezüchtet. Anschließend werden sich regenerierende Pflanzen mit RUB-roter Pigmentierung getrennt und in Erde gepflanzt. Diese anfänglichen T1-Regeneranten (R1-T1) drücken rote Sektoren aus. Durch das Ausschneiden des roten Sektors und die Wiederholung der Regenerationsschritte entstehen in der nächsten R2-T1-Generation eine große Anzahl transgener Geschwister, von denen einige nahezu einheitlich rot sind; Indikativ für den RUBIN-Ausdruck . Diese einfache Transformationspipeline kann für R. aquatica und möglicherweise andere vegetativ vermehrende Pflanzenarten übernommen werden, um interessante Gene einzuführen, die ihre Funktionen bei der Anpassung an terrestrische vs. aquatische Umgebungen.

Einleitung

Stabile genetische Transformation, d. h. die Einführung und Expression von Genen von Interesse für eine bestimmte Pflanzenart, ist zentral für die grundlegende Pflanzenwissenschaft und Pflanzenbiotechnologie. Die von Agrobacterium tumefaciens vermittelte Transformation ist bei weitem das am weitesten verbreitete Mittel der Pflanzengentechnik für die zuverlässige Erzeugung stabiler Transformanten¹. Die Entwicklung eines binären Vektorsystems, bei dem der T-DNA-Klonvektor und das entwaffnete Vir-Helfer-Plasmid in zwei Einheiten getrennt werden, revolutionierte die Agrobacterium-vermittelte Transformation ^1,2. Für die Modellpflanze Arabidopsis thaliana ermöglichte ein einfaches, kostengünstiges Verfahren zur floralen Tauchtransformation eine Hochdurchsatzerzeugung klonaler (hemizygoter) Transformanten für funktionelle Genetik und Genomik ^3,4. Ein solcher Ansatz ist jedoch für Pflanzenarten, die überwiegend oder ausschließlich vegetativ vermehren, nicht machbar.

Amphibische Pflanzen zeigen eine einzigartige Fähigkeit, sowohl in terrestrischen als auch in aquatischen (Unterwasser-)Umgebungen zu gedeihen⁵. Rorippa aquatica ist eine amphibische Brassicaceae-Art, die Heterophyllie aufweist. In einer terrestrischen Umgebung entwickelt R. aquatica runde Blätter mit einer Epidermis, die aus Pflasterflächenzellen und Spaltöffnungen besteht. Im Gegensatz dazu zeigen ihre aquatischen Blätter Morphologien, die gut an die Unterwasserumgebung angepasst sind: stark zerschnittene, nadelartige Blätter mit Epidermis ohne kutikuläre Bahnflächenzellen oder Spaltöffnungen ^6,7. Phylogenetisch ist R. aquatica eng verwandt mit Arabidopsis thaliana; beide gehören zur gleichen Familie, Brassicaceae⁶. Zusammen mit der Verfügbarkeit von Ganzgenomsequenzdaten und der hohen Sequenzkonservierung kodierender Gene zwischen R. aquatica und A. thaliana dient R. aquatica als aufkommende amphibische Modellpflanze, um die molekularen Grundlagen der Anpassung an Land^{und Wasser zu} untersuchen. Tatsächlich deuten neuere physiologische und Genexpressionsstudien darauf hin, dass die Umverdrahtung der Licht- und Hormonsignalwege für die Heterophyllie von R. aquatica ^7,8 entscheidend ist.

Um die molekularen Funktionen von Kandidatengenen und -signalwegen zu testen, ist genetische Transformation absolut unerlässlich. R. aquatica vermehrt sich in der Natur vegetativ ^8,9. Daher kann die florale Dip-Transformation von Agrobacterium im Gegensatz zu A. thaliana nicht auf R. aquatica angewendet werden. Bemerkenswerterweise regeneriert R. aquatica ganz Pflanzenkinder mühelos aus abgetrennten Blättern, ohne exogene Phytohormonsupplementierung¹⁰. Kurzzeitig wird innerhalb weniger Tage nach der Ablösung des Blattsegments die Zellproliferation im Gefäßgewebe am proximalen Ende der Schnittfläche aktiv. Innerhalb einer Woche regenerieren sich sowohl Wurzeln als auch Triebe und bilden schließlich junge Planzenkinder (Rosettenpflanzen). Einzelne Pflanzen können getrennt und bis zur Reife¹⁰ gewachsen werden. Dieser spontane Regenerationsprozess ganzer Pflanzen kann problemlos für eine genetische Transformation von R. aquatica genutzt werden.

Die hier berichtete optimierte Pipeline ermöglicht eine effiziente und zuverlässige Agrobacterium-vermittelte Transformation von R. aquatica , indem sie dessen Fähigkeit zur spontanen Regeneration nach der Blattablösung nutzt. Für eine einfache Auswahl von Transformanten ohne kostspielige sterile Kulturprozesse wurde ein nicht-invasiver visueller Selektionsmarker RUBY verwendet, ein synthetischer Vektor mit drei Genen, der zur Biosynthese von Betalain¹¹ führt. Durch die Optimierung der Bakterienkulturbedingungen, Inokulationsschritte und Inkubationsprozesse von Blattstecklingen zur Regeneration wurden zuverlässig transgene R. aquatica-Pflanzen zur Reife produziert. Fast alle anfänglichen Transformanten der R1-T1-Generation zeigen rote Sektoren, was darauf hindeutet, dass es sich um heterogene, genetische Mosaike handelt. Durch das Ausschneiden der RUBY+ -Sektoren der roten Blätter und die Wiederholung der Regenerationsprozesse ist die Entstehung vollständig roter Rosettenpflanzen, also nahezu klonale, R. aquatica-Transformanten bei der anschließenden R2-T1-Generation möglich. Diese Transformationspipeline kann leicht angewendet werden, um fremde Gene von Interesse in R. aquatica einzuführen/exprimieren und so die molekulargenetischen Studien der Heterophylie und der Pflanzenanpassung an extreme Umgebungen zu beschleunigen.

Protokoll

Die Reagenzien und die verwendeten Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Herstellung von Pflanzenmaterialien

1. Schnitt und Schnitt, vollständig gelappte, reife gesunde Blätter in 1–2 cm große Stücke von zwei Monaten alten, ausgewachsenen Mutterpflanzen (Abbildung 1A).
2. Bekleide eine Pflanzenvermehrungsschale (20 x 30 cm Perma Nest Trays) mit zwei Lagen autoklavierten, gefalteten Papiertüchern. Tränken Sie Papiertücher mit sterilem Wasser, sodass eine dünne Wasserschicht oben liegt.
3. Legen Sie die Stecklinge mit der Seitenseite nach oben, mit Abstand um jeden Explant, um Überlappungen zu vermeiden (Abbildung 1A).
4. Besprühen Sie die Stecklinge leicht und decken Sie das Tablett fest mit Frischhaltefolie ab.
5. Stellen Sie Schalen in die Wachstumskammer bei 25 °C-28 °C mit 16 Stunden Licht- und 8 Stunden Dunkelperiode unter feuchten Bedingungen und einer Lichtintensität von 50 μmol/m²/s auf.
6. Inspiziere und pflege saubere, feuchte Vermehrungsschalen 2-3 Mal pro Woche.
   1. Fügen Sie steriles Wasser hinzu, um eine dünne Wasserschicht über gesättigten Papiertüchern zu erhalten.
   2. Ersetzen Sie Frischhaltefolie, die die Haftung verloren hat und/oder Anzeichen von Verunreinigung zeigt (z. B. sichtbare Trübung im Wasser).
7. Mit einer Mikroschere oder einem Skalpell werden regenerierte, gesunde Rosettpflanzen, die sowohl einen Trieb als auch eine Wurzel tragen, zwischen 14 und 21 Tagen nach der Etablierung sorgfältig entfernt (Abbildung 1B).
   HINWEIS: Eine sorgfältige Exzision ist erforderlich, um eine einzelne Rosettenpflanze mit intaktem Trieb und Wurzel zu erhalten. Rorippa-Rosettenpflanzen vermehren sich dicht entlang der Schnittstelle von Blattexplant und Mittelrippe, was die Identifikation einzelner Rosettenpflanzen erschwert. Der Trieb einer Rosettenpflanze wächst adaxial, während die Wurzeln unter der Blattoberfläche wachsen, was die Sichtbarkeit des gesamten Rosettenpflanzlings erschwert (Abbildung 1B).
8. Pflanzen Sie einzelne Rosettenpflanzen in Töpfe mit feuchtem Bodenmedium (Verhältnis 2:1:1 von Blumenerde: Vermilculit: Perlit) und werden mit einem langsam freisetzenden Dünger ergänzt (Abbildung 1B).
9. Wasser mit Leitungswasser wird mit 0,25 g/L eines granulierten NPK-Düngers ergänzt und mit einer Feuchtigkeitskuppel oder Frischhaltefolie abgedeckt, um feuchte Bedingungen zu gewährleisten.
10. Stellen Sie Schalen unter vorherigen Bedingungen (25 °C–28 °C mit 16 Stunden Licht- und 8 Stunden Dunkelperiode unter feuchten Bedingungen und einer Lichtintensität von 50 μmol/m²/s) in die Wachstumskammer
    HINWEIS: Es ist entscheidend, feuchte Bodenverhältnisse zu erhalten. Halten Sie eine dünne Wasserschicht unter den Topfpflanzen.

2. Agrobakterienkulturen zur Transformation

1. Streak A. tumefaciens stammt GV3101 mit dem Ti-Plasmid pMP90 (pTiC58DT-DNA), das den RUBY-Vektor auf einer 30 mL LB-Platte enthält, die Rifampicin (0,03 mg/mL), Gentamycin (0,025 mg/mL) und Spectinomycin (0,05 mg/mL) enthält, und bei 28°C für 48–72 Stunden wächst, bis einzelne Kolonien sichtbar sind.
2. Wählen Sie eine einzelne Kolonie aus und inokulieren Sie 5 ml MG/L-Brühe, ergänzt mit Biotin und vorherigen selektiven Antibiotika (Tabelle 1), und inkubieren Sie 16 Stunden lang in einem 28 °C Rotationsshaker bei 200 U/min.
3. Inokulum in einen konischen Kolben mit 250 MG/L Brühe übertragen und 16 Stunden lang in einem 28 °C Rotationsschüttler bei 200 U/min inkubieren.
4. Stellen Sie sicher, dass die Flüssigkeitskultur mit einem Spektrophotometer mindestens einen OD₆₀₀ von 1,2 aufweist. Pelleten Sie die Bakterien durch Zentrifugation bei 3396 x g für 10 Minuten bei Raumtemperatur (ca. 22 °C). Ergänzen Sie die Inokulumbrühe mit 200 μM Acetosyringon (AS).
   HINWEIS: Aliquots von filtersterilem AS werden in DMSO bei einer Arbeitskonzentration von 100 mM hergestellt und bei -20 °C gelagert. Inokulumbrühe sollte frisch gemacht werden. AS wird direkt vor dem Zentrifugationsschritt hinzugefügt, um den Abbau zu minimieren. Medienbeschreibungen und -komponenten sind in Tabelle 1 aufgeführt.
5. Um eine direkte Störung des bakteriellen Pellets zu vermeiden, entsorgen Sie den Supernatant und schweben Sie die Kugel in Inokulumbrühe wieder.
6. Drehen Sie den Kolben von Hand so, dass die Lösung einen OD₆₀₀ von etwa 0,8 hat.
7. Inokulum auf einem Shaker bei 90 U/min 2,5 Stunden bei Umgebungstemperatur (ca. 22 °C) inkubieren.
8. Protokollrelevante Bedingungen (Kultur und Inokulum OD₆₀₀, AS-Konzentration und Tensidmenge, Impfdauer und Anzahl der für die Transformationseffizienz erforderlichen Versuchseinheiten).
   HINWEIS: Optimale Bakterien- und Resuspensionskulturkonzentrationen sind entscheidend, um die Transformationseffizienz zu maximieren und gleichzeitig übermäßiges Bakterienwachstum zu minimieren. Vor der Zentrifugation sollte sichergestellt werden, dass die Bakterienkultur mindestens einen OD600 von 1,2 enthält; Resuspendieren auf ein Inokulum OD600 von 0,8. Ergänzungen der Induktionsbrühe werden optimiert, um die Transformation zu verbessern, ohne die Lebensfähigkeit des Regeneranten zu beeinträchtigen. Die empfohlenen Konzentrationen liegen bei 150–225 μM für AS und 0,005 % für Tensid.
   VORSICHT: Entsorgen Sie alle transgenen Bakterien und Pflanzen in ausgewiesenen biogefährlichen Abfallbehältern.

3. Transformation der Blattstecklinge von R. aquatica

1. Während die Inkubationskultur des Inokulum-Resuspensions durchläuft, wählen Sie mehrere zwei Monate alte Stockpflanzen aus, die gesunde Blätter mit vollständigen Rändern zeigen.
2. Bereiten Sie ein Pflanzenvermehrungsbrett (20 x 30 cm Perma-Nistschalen) mit 2 Lagen autoklavierten Papiertüchern vor. Falte Papiertücher. Tränken Sie Papiertücher mit sterilem Wasser, sodass eine dünne Wasserschicht oben liegt.
   HINWEIS: Richten Sie ein Negativkontroll-Tablett ein, in dem unimpfte Expflanzen identischen Umweltbedingungen unterliegen.
3. Stellen Sie sicher, dass der Labortisch mit 100–500 mL ddH₂O, sterilen Behältern ausgestattet ist, die für das erwartete Volumen des resuspendierten Inokulums geeignet sind, einer Mikropipette und Spitzen.
4. Vor dem Ende der Brutphase werden schnell zehn Blätter am Blattstiel von den ausgewählten Stockpflanzen entfernt. Lege Explantationen in eine Petrischüssel mit sterilem Wasser.
   HINWEIS: Es ist entscheidend, frisch entferntes Gewebe für die Blattinokulation zu verwenden, um Blattaustrocknung zu vermeiden.
5. Nach 2,5 Stunden pipettieren Sie 50 μL Tensid in eine 1-Liter-Resuspensionslösung (0,005 % Tensidkonzentration) und bewegen Sie den Kolben sanft zum Mischen (Abbildung 2A). Stellen Sie sicher, dass eine Vermehrungsschale zugänglich ist, um die Explants nach der Impfung einzusetzen (Abbildung 2B).
6. Legen Sie das Blatt abaxial nach oben und schneiden Sie senkrecht entlang der Mittelrippe mit einem Skalpell in 1 cm lange Stücke (Abbildung 2C).
7. Fügen Sie frisch geschnittene Blätter sofort in ein 50-mL-Rohr ein, das für den rotierenden Röhrenmischer geeignet ist, um als Impfungen zu dienen.
8. Inokulum in das Explant-Rohr in einem Volumen gießen, um das gesamte Material zu sättigen, und dann 10 Minuten lang in einem Drehmischer bei Raumtemperatur rühren (Abbildung 2D, E).
9. Entfernen Sie alle geimpften Blätter aus der Lösung mit einer Pinzette und legen Sie sie direkt in die vorbereitete Vermehrungsschale.
10. Trennen und verteilen Sie die einweichenden Expflanzen, sodass sie teil, aber nicht vollständig, in die dünne Wasserschicht auf den gesättigten Papiertüchern eingetaucht sind (Abbildung 2F).
    VORSICHT: Halten Sie aseptische Bedingungen aufrecht und vermeiden Sie jeglichen Kontakt mit Oberflächen oder Werkzeugen, die während der Agrobacterium-Verfahren vor der Desinfektion verwendet werden.
11. Versiegeln Sie jedes Medium mit Frischhaltefolie und bebrüten Sie es drei Tage lang im Dunkeln bei Umgebungstemperatur (22° C).
12. Nach Abschluss der Dunkelphase sollten die Tabletts mit transparenter Frischhaltefolie versiegelt und mit ddH₂O ergänzt werden, um den Feuchtigkeitsstand zu erhalten.
13. Inokulationsschalen unter vegetativen Vermehrungsbedingungen in eine Wachstumskammer verlegen.
    VORSICHT: Konsolidieren Sie Inokulumabfälle in einem Abfallbehälter, behandeln Sie ihn mit einer 10%igen Bleichlösung und entsorgen Sie ihn gemäß den Biosicherheitsrichtlinien.

4. Regeneration der Rosettenpflanzen und Etablierung der R1-T1-Generation

1. Inspiziere die Impfschalen 2-3 Mal pro Woche, um saubere und feuchte Bedingungen sicherzustellen.
   1. Fügen Sie ddH₂₀mit einer Quetschflasche hinzu. Falls vorhanden, sprühen Sie die Sprühflasche mit einer Sprühflasche, bevor Sie die Schalen wieder verschließen.
   2. Halten Sie eine hohe Luftfeuchtigkeit aufrecht, indem Sie Frischhaltefolie ersetzen, deren Haftung verloren gegangen ist oder Anzeichen von Kontamination zeigt (z. B. sichtbare Wassertrübung).
2. Untersuchen Sie regenerierte Rosettenpflanzen visuell auf Eigenschaften der Umpflanzung. Ideale Regeneranten zeigen einen intakten Trieb mit mehreren Blättern und Wurzeln von mindestens 2–3 mm Länge (Abbildung 2G).
   HINWEIS: Transgene Rosettenpflanzen regenerieren sich typischerweise langsamer und erreichen in der Regel die Umpflanztauglichkeit 21–28 Tage nach dem Einsetzen in die Wachstumskammer.
3. Entfernen und transplantieren Sie intakte transgene Rosettenpflanzen unter denselben Bedingungen wie WT-klonale Regeneranten.
4. (Optional) Erfassen Sie die Anzahl der regenerierten Transformanten und korrelieren Sie mit ihren Transformationsbedingungen, um die Effizienz zu bewerten.
   HINWEIS: Seien Sie bei der Auswahl besonders vorsichtig. Transgene Regeneranten sind oft klein und leicht übersehen. Untersuchen Sie sowohl die adaxialen als auch die abaxialen Blattflächen sorgfältig mit einer Pinzette, um den Ertrag zu maximieren und Schäden zu minimieren.
5. Rosettenpflanze abschneiden und dabei vermeiden, transgene Blätter zu berühren. Schneiden Sie überschüssiges Laub unmittelbar um das transgene Blatt herum. Pflanze pro Topf eine Pflanze um.
6. Dünge, gießen und besprühen Sie jede Pflanze schnell und legen Sie sie unter eine Kunststoffkuppel, um die Luftfeuchtigkeit zu erhalten (Abbildung 2G, H).
7. Etikettieren und aufnehmen Sie jeden transgenen Setzling.
8. Bringen Sie Expflanzen zurück, die Transformanten enthalten, die keine Triebe, Wurzeln oder zu klein erscheinen, um sie in die Vermehrungsschale zu umpflanzen, um sie weiter zu screenen. Pflanzen Sie zusätzliche Transformanten um, wenn das Wachstum ausreichend ist.
9. Nebel- und Wassertransplantationen täglich in der ersten Woche. Stellen Sie sicher, dass immer Wasser im Tablett ist.
10. Entfernen und entsorgen Sie alle Transplantationen, die gesenesziert sind oder keine RUBY-Pigmentexpression mehr zeigen.
    VORSICHT: Entsorgen Sie alle transgenen Materialien gemäß institutionellen Biosicherheitsvorschriften.

5. Nachfolgende Erneuerung und Etablierung der nahezu klonalen R2-T1-Generation

1. Sobald sich Rosettenpflanzen zu großen, gesunden Pflanzen entwickelt haben (2 Monate), entfernen Sie expandierte, RUBIN-exprimierende Blätter von einem einzelnen Setzling (Abbildung 2H).
   HINWEIS: Während rubin-exprimierende Blätter gleichmäßig rot erscheinen können, sind sie häufiger chimärisch. Beide Phänotypen sind für die Vermehrung geeignet. Fahren Sie in den folgenden Schritten mit den üblichen vegetativen Vermehrungsmethoden fort.
2. Teilen Sie die umgewandelten Blattstücke auf und legen Sie sie in eine Vermehrungsschale. Beschriften Sie jede Vermehrungsschale deutlich mit der entsprechenden Spender-ID des Setzlings.
   VORSICHT: Mischen Sie keine Blätter mehrerer Setzlinge in derselben Schelle. Jeder Setzling repräsentiert ein einzigartiges transgenes Ereignis und muss als separate Generation verfolgt werden.
3. Umpflanzte regenerierte R2-T1-Pflanzen (14–28 Tage nach der Vermehrung). Jeder Anlage wird eine neue Kennung zugewiesen, die ihren zweiten Status widerspiegelt. Führen Sie die Standardversorgung nach der Transplantation wie zuvor beschrieben fort (Abbildung 2I, J).

Ergebnisse

Die Parameter der A. tumefaciens-Transformation wurden optimiert, um erfolgreich RUBIN-exprimierende transgene Pflanzen R. aquatica zu produzieren, wobei die sterilitätsbedingten Beschränkungen umgangen und gleichzeitig die schnelle asexuelle Regenerationsrate genutzt wurden (Abbildung 1 und Abbildung 2). Nachdem Blattstück-Explanten geimpft und einer anschließenden 72-stündigen Dunkelbehandlung ausgesetzt wurden, begannen regenerierte Pflanzenpflanzen innerhalb von zwei Wochen unter den beschriebenen Bedingungen zu wachsen. Regenerierte Pflanzen mit chimerischen RUBIN-Sektoren, die groß genug zum Umpflanzen waren, wurden zwischen 3 und 5 Wochen nach der Impfung gefunden (Abbildung 3) und waren etwas kleiner als jene nicht exprimierenden Rosettenpflanzen. Auf den Kontroll-Wildtyp-Tabletts wurden keine RUBY-regenerierten Pflanzenblätter gefunden, was bestätigt, dass dieses Phänomen von der Physiologie von R. aquatica abweicht. Bakterienkulturbrühe, Resuspensionsinkulum-Brühe, Infiltrationsmethode und Impfdauer unterschieden sich nicht signifikant in ihrer Fähigkeit oder Geschwindigkeit zur Erzeugung von Transformanten (Tabelle 2 und Tabelle 3). Behandlungsfaktoren, die die Transformationseffizienz positiv beeinflussten, umfassten eine erhöhte AS-Konzentration und eine Behandlung mit Auxinexposition vor der Impfung der Blattexplantation. Eine erhöhte Tensidkonzentration wirkte sich negativ auf die Ausbeute aus und wurde als ungeeignet eingestuft.

R-Version 4.4.2 12,13,14,15 wurde verwendet, um die Poisson General Linear Mixed Model (Poisson GLMM)-Analyse von Rosettenpflanzenzähldaten durchzuführen. In Experiment D (Tabelle 2D), wo RUBY-exprimierte Regeneranten für eine 15-minütige Impfung mit 150 μM AS oder 225 μM AS untersucht wurden, verletzte das Modell jedoch die Annahmen aufgrund der Unterdispersion und wurde stattdessen ein negatives binomiales GLMM angewendet.

Die Auswirkungen verschiedener bakterieller Brühe- und Kulturbedingungen auf die Transformationseffizienz wurden sorgfältig untersucht. Unter den fünf experimentellen Replikaten führte die Verwendung von Millers LB-Brühe oder transformationsspezifischer MG/L-Brühe dazu, dass Transformanten RUBY unter nahezu identischen Parametern ausdrückten und sich in ihren Effekten nicht signifikant unterschieden (Tabelle 2A). Die Mittel für RUBY exprimierten regenerierte Rosettenpflanzen aus einzelnen Blattstücken, bestehend aus 15–60 Expflanzen pro Behandlung, variierten zwischen 1,61 ± 0,71 Regeneranten, die aus Experimenten mit LB- und nicht-MS-basierten Kultur-Resuspensionsbrühe hergestellt wurden (Control Induction Fellh, Tabelle 1) und 3,23 ± 1,13 Regeneranten aus Experimenten mit MG/L und der optimierten Induktionsbrühe. Trotz fehlender signifikanter Unterschiede aufgrund subjektiver Beobachtungen wurden die MG/L-Kultur und die optimierte Induktionsbrühe (Tabelle 1) für zukünftige Optimierungsexperimente ausgewählt.

Als Nächstes haben wir Faktoren getestet, die die Bakterienlast und die Fähigkeit, auf meristematisches Pflanzengewebe zuzugreifen, beeinflussen. Unter acht Replikaten (Tabelle 2B) zeigten geimpfte Explants mit einer erhöhten Tensidkonzentration von 0,01 % einen Monat später extremen Stress, was zu kleinen, weitgehend nicht lebensfähigen Regeneranten führte. Unter diesen Replikaten schien es keine regenerierten Transformanten zu geben, obwohl der gestresste regenerative Phänotyp der Explants kastanienbraune, braune und gelbe Pigmentierung hatte, sodass potenzielle Transformanten vorhanden sein könnten. Ungeachtet dessen bestätigte die Nichtverträglichkeit der Regeneranten, dass eine Tensidkonzentration von 0,005 % aufrechterhalten wurde.

Zwei mechanistische Techniken, die Bewegung oder Vakuuminfiltration, wurden in ihrer Wirkung verglichen, um die gewünschte DNA in die Wirtspflanze einzuführen. Die Kontrollinfiltrationsmethode, bei der Explants in 50 ml resuspendiertem Inokulum untergetaucht und in einem Röhrenmischer gedreht wurden, war erfolgreich bei der Erzeugung von RUBY-exprimierten Regeneranten in den aufgeführten Behandlungen. Die angewandte Vakuuminfiltration erzeugte ebenfalls RUBIN-exprimierte Regeneranten, unterschied sich jedoch nicht in ihrer Transformationseffizienz im Vergleich zur Kontrollmethode (p = 0,478, Tabelle 2D). Etwa 2–5 RUBIN-exprimierte Regeneranten pro Vermehrungstray wurden beobachtet, sei es durch Vakuuminfiltration oder physische Bewegung.

Die modifizierte Acetosyringon-(AS)-Konzentration des bakteriellen Inokulums unterschied sich deutlich in ihrer Wirkung auf die Transformationseffizienz. Die Erhöhung der AS-Konzentration von 150 μM auf 225 μM verbesserte die Produktion von RUBY signifikant, indem transgene Explants exprimiert werden (p = 0,000309, 0,000458; Tabelle 3C,D). Von den vier Experimenten bestand jede Behandlung aus einem Tablett mit 40 identisch behandelten impften Expflanzen. Die in höherer Konzentration impften im Durchschnitt fast 5 RUBY-exprimierte Regeneranten im Vergleich zu 1 Transformant pro Kontroll-AS-Tablett (Tabelle 3C). Darüber hinaus schien der AS-Effekt von den Impfzeiten getrennt zu sein.

Unter den drei Experimenten mit einer Impfdauer von 15 Minuten, bei denen Expflanzen mit 225 μM AS modifiziert wurden, wurde ein Mittelwert von 7,28 ± 4,13 RUBIN-exprimierten Regeneranten gefunden, was deutlich höher war als bei den 150-μM-Behandlungen, bei denen 2,03 ± 1,32 Regenerationsrate betrug (Tabelle 3D). Es gab keinen klaren Effekt auf das Zeitintervall bei 150 μM AS-Kontrollbehandlungen (p = 0,676), bei denen die durchschnittliche 10-minütige Impfrate 1,48 ± 0,954 betrug, verglichen mit 1,84 ± 1,230 Regeneranten bei 15-minütigen Impfungen (Tabelle 3B). Ähnlich regenerierten 10-minütige, 225 μM-behandelte Inokulanten etwa 5 RUBY-exprimierte Rosettenpflanzen pro Behandlung, was sich nicht klar von 15-minütigen Impfungen unterschied, bei denen 6–7 Regeneranten für das Behandlungstablett angezeigt wurden (Tabelle 3A).

Außerdem wurde das Pflanzenhormon Auxin, das die Pflanzenregeneration im Allgemeinen unterstützt, getestet. Die Exposition frisch entfernter Blattstücke einer Puls-Auxinbehandlung vor der Impfung hatte einen eindeutig positiven Effekt auf eine erhöhte RUBY-Regeneration im Vergleich zu den in ddH₂O (p = 0,00969, Tabelle 2C). In ddH₂0 mit 285 μM Indol-3-Essigsäure (IAA) platziert, zeigten Explants eine durchschnittliche Transformantenrate von 6,67 ± 1,490 pro Behandlung im Vergleich zur auxinfreien Behandlung, die im Durchschnitt eine Regenerationsrate von 2,00 ± 0,816 entsprach.

Die sofort regenerierte transgene Linie wurde als R1-T1-Generation bezeichnet (Abbildung 2), wobei einzelne Regeneranten als Linien fungieren. Alle anfänglichen R1-T1-Rosettenpflanzen zeigten RUBIN-Expression in Form chimerischer Blätter mit verschiedenen chimerischen Mustern. Am häufigsten zeigten 1–3 Pflanzenblätter deutliche Chimären, bei denen RUBIN-exprimiertes und unexprimiertes Gewebe an der Mittelrippe auseinandergingen. Die Mehrheit der einen Monat alten R1-T1-Sämlinge behielt die chimäre Expression (Abbildung 3A), aber es wurde eine kleine Anzahl vollständig RUBIN-exprimierender Setzlinge gefunden.

Asexuell vermehrte, RUBIN-pigmentierte chimäre Sektoren aus R1-T1-Blattstücken (Abbildung 3B) regenerierten sich innerhalb von 2–4 Wochen nach der Exzision entweder vollständig RUBIN- oder chimärische R1-T1-Rosettenpflanzen (Abbildung 3C). Nach einem Monat zeigten die meisten R2-T1-Sämlinge überwiegend RUBIN-Blätter, einige zeigten kleine, nicht exprimierte chimäre Regionen (Abbildung 3D,E).

Abbildung 1: Vegetatives Vermehrungsprotokoll und Zeitplan. Repräsentative Bilder zeigen die Produktionspipeline, die zur Regeneration asexueller Rosettenpflanzen verwendet wird. (A) Ausgewachsene, gesunde, ganzlappige Blätter von etablierten Mutterpflanzen zu entfernen und in 2–3 Stücke zu schneiden. (B) Setzen der Expflanzen in eine Vermehrungsschale und deren Pflege unter festgelegten Bedingungen. Nach drei Wochen wurden die Rosettenpflanzen aus den Explants entfernt und in das Bodenmedium umgepflanzt. Unten ist ein echtes Foto der regenerierten Rosetten, die noch (rosa Pfeile) am Mutterblattschnitt befestigt sind. Diese Pflanzenkinder befinden sich im optimalen Stadium für die Transplantation. Maßstabsleiste: 10 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 2: Transformation von R. aquatica-Blattabschnitten und Regeneration von Transformanten, die RUBY-Transkripte exprimieren. Grafischer Überblick über das Transformationsverfahren und die Herstellung transformierter Regeneranten. (A) Bakterielle Inokulum erhalten. (B) Vorbereitung einer Vermehrungsschale mit sterilem Filterpapier und Wasser. (C) Blätter in Explant-Stücke abschneiden. (D) Eintauchen von Explanten in Inokulum. (E) Rühren in einem Rotationsmischer für 20 r/1 Minute für 10 Minuten. (F) Verteilen gesättigter Expflanzen in der Schale, Abdecken mit einer Kunststoffkuppel und 72 Stunden unter dunklen Bedingungen inkubieren. (G,H) Nach 1 Monat, intakte transformierte Regeneranten aus Agrobacterium-Expflanzen entfernen und umpflanzen, um ausgewachsene Pflanzen zu etablieren. (I,J) Wiederholung des Ausbreitungsschritts (G,H), um eine nahezu klonale R2-T1-Generation zu erzeugen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 3: Asexuell vermehrte Generationen einer RUBY-transgenen Linie. (A) Ausgewachsener R1-T1-Sämling mit chimerischen Blättern mit RUBIN-Expression . Schuppenbar: 1 cm. (B) Zwei von zwanzig Expflanzen, frisch in eine Vermehrungsschale gelegt, aus dem in (A) gezeigten 3 Monate alten Setzling. Die Explants zeigen ein chimerisches Muster von RUBIN, das an der Mittelrippe getrennt ist. Schuppenbar: 1 cm. (C) Regenerierte R2-T1-Rosettenpflanzen mit unterschiedlichen Graden chimerischer RUBIN-Expression , einen Monat nach der Exzision, vor der Transplantation. Regenerierte RUBY-positive Wurzeln (Marron-Pfeil). Schuppenbar: 2 cm. (D) R2-T1-Sämling 1 Monat nach der Umpflanzung gezeigt, zeigt RUBY-Expression . Schuppenbar: 2 cm. (E) Ausgewachsener R2-T1-Sämling 3 Monate nach der Umpflanzung mit kleinen Sektoren (grüne Pfeile). Maßstabsleiste: 2 cm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4: Flussdiagramm der optimierten Pipeline. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Tabelle 1: Medienformulierungen Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 2: Auswirkungen von vier Optimierungsparametern auf die Transformationseffizienz von R. aquatica. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 3: Auswirkung der Konzentration von Inoculumacetosyringon auf die Transformationseffizienz vonR. aquatica. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Diskussion

In dieser Studie etablierten wir eine einfache, direkte regenerationsbasierte Agrobacterium-vermittelte stabile Transformation von R. aquatica, einer amphibischen Pflanze der Brassicaceae, die ausschließlich asexuell^10,16 vermehrt. Eine umfassende Transformationspipeline von vegetativ vermehrten amphibischen Pflanzen wurde noch nicht etabliert, noch wurde die praktische Transformationsfähigkeit von R. aquatica mit einem visuellen Marker genutzt. Bemerkenswert ist, dass diese Pipeline keinen mühsamen, sterilen Pflanzengewebekulturprozess oder spezialisierte Pflanzenwachstumsinkubatoren benötigt. Daher kann dieses Protokoll in vielfältigen experimentellen Umgebungen von wissenschaftlichen Forschungslaboren bis hin zum Unterricht weit verbreitet sein.

Unter den verschiedenen getesteten Impf- und Inkubationsbedingungen führten einige Faktoren zu einer signifikanten Verbesserung der Transformationseffizienz. Bemerkenswert ist, dass eine etwas höhere Acetosyringonkonzentration (AS) sowie die Konzentration von Indol-3-Essigsäure (IAA) die Transformationseffizienz positiv beeinflussten (Tabelle 1 und Tabelle 2). AS ist eine phenolische Verbindung, die Agrobacterium anzieht, und es wurde gezeigt, dass sie die Effizienz der Pflanzentransformation in Arabidopsis¹⁷ verbessert. Das Phytohormon Auxin ist zentral für die Umprogrammierung von Pflanzenzellen. Ein rascher Anstieg der auxinbezogenen Genexpression wurde während der wundinduzierten Regeneration¹⁰ beobachtet. Aus diesem Grund könnte man annehmen, dass exogent aufgetragenes Auxin (IAA) während der Explant-Impfung die Regenerationseffizienz erhöht. Allerdings wurden in drei Studien keine Unterschiede in der beobachteten Anzahl regenerierter Pflanzenpflanzen festgestellt (57 7,55 vs. 59,67 5,51 für Kontroll- vs. Behandlung). Daher könnte die Auxinbehandlung wahrscheinlich eher den Transformationsprozess unterstützen als die Regeneration selbst.

Ein nicht-ionisches Tensid, alkoxylatiertes Trisilan (bekannt als Silwet L-77), erhöht die Transformationseffizienz von Arabidopsis durch die Floral-Dip-Methode³ erheblich und wird daher in der Pflanzenbiologie weit verbreitet verwendet. Bei Explantationen, die mit Silwet L-77 versetzt wurden, wurde bei 0,005 % (die für Blüten-Dip empfohlene Konzentration) minimal beobachtet. Wenn diese Dosis verdoppelt wurde (0,01 %), waren die Blattstecklinge von R. aquatica stark beschädigt, sodass fast keine Transformanten mehr gefunden wurden (Tabelle 2B). Während des Blütentauchens von Arabidopsis reduziert der Einsatz von Tensiden die Oberflächenspannung der Inokulanten und verbessert den Zugang zu Blütenknospen. Im Gegensatz dazu entwickelt R. aquatica als amphibische Pflanzenart glatte Blätter ohne Trichome oder dicke Nagelhaut⁵. Ein erhöhtes Tensid verursachte Blattgewebeschäden, was darauf hindeutet, dass andere Faktoren als Tensid für die Effizienz der Umwandlung in nicht-behaarten Blattgeweben priorisiert werden sollten. Tensid ist für den pubertären Phänotyp relevanter, da es die Gewebedurchdringung erleichtert. Nach Integration aller getesteten Parameter wird eine Pipeline mit den optimalsten Bedingungen als Flussdiagramm bereitgestellt (Abbildung 4).

Die Nutzung eines visuellen Markers, RUBY, ist entscheidend für diese Transformationspipeline. RUBY ist ein synthetischer Reporter, der drei kodierende Gene (CYP76AD1, DODA und Glucosyltransferase) codiert, die ein leuchtend rotes Pigment, Betalain¹¹, synthetisieren. Als die RUBY-Expression bei R1-T1-Regeneranten beobachtet wurde, zeigte sie die Expression als rote Sektoren, was darauf hindeutet, dass sie höchstwahrscheinlich chimärisch sind (Abbildung 2 und Abbildung 3). Eine frühere Studie zeigte, dass die Regeneration von R. aquatica aus einem vaskulären Kambium eines abgeschnittenen Blattabschnitts¹⁰ entsteht. Auffällig ist, dass R1-T1-Regeneranten gelegentlich eine chimärische Grenze entlang der Mittelvene aufweisen, wobei die Hälfte der Blattklinge rot und die andere Hälfte grün ist (Abbildung 3A,B). Die Regeneration aus RUBY-Sektoren brachte gelegentlich vollständig rote Pflanzen mit roten Wurzeln hervor (Abbildung 3C, kastanienbrauner Pfeil), die dann zu gleichmäßig roten R2-T1-Pflanzen gewachsen wurden (Abbildung 3D). Es wurden keine negativen Auswirkungen einer RUBY-Überexpression auf das Wachstum und die Entwicklung von R. aquatica beobachtet (Abbildung 3). Zur Unterstützung wurden keine erkennbaren Unterschiede in Größe und Form der R1-T1-Rosettenblätter mit RUB-Sektoren beobachtet (z. B. Abbildung 3B). Es ist möglich, dass jedes starke, konstitutive, promotorgetriebene Transgen das normale Pflanzenwachstum und die physiologische Reaktion beeinträchtigen könnte.

In manchen Fällen entwickelten diese 'nahezu klonalen' RUBIN-Pflanzen grüne Sektoren (Abbildung 3E, grüne Pfeile), was auf Rückgang oder Transgen-Silencing hindeutet. Dies deutet darauf hin, dass ein sichtbarer Marker wie RUBY unverzichtbar ist, um eine ektopische Expression oder Stilllegung (z. B. RNAi) eines Gens von Interesse für zukünftige molekulare, mechanistische Studien zu gewährleisten. Man kann ein interessierendes Transgen in die RUBY-Kassette einführen und die Phänotypen in den roten RUBY-Sektoren beobachten. Abschließend lässt sich sagen, dass durch die Nutzung der durch Blattschnitt induzierten direkten Reprogrammierung und eines nicht-invasiven sichtbaren Markers eine einfache, effiziente Transformationspipeline für R. aquatica, eine vegetativ vermehrende Brassicaceae, optimiert wird. Obwohl es außerhalb des Anwendungsbereichs dieses Protokolls liegt, könnte das zukünftige Verständnis des genauen Ursprungs der Regeneration von transformierten R. aquatica Einblicke in die zelluläre Umprogrammierung bei Pflanzen liefern.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
1000 & Mikro; L LTS gefilterte Pipetspitzen mit niedriger Retention	Rainin	30389213
Acetosyringon	Sigma-Aldrich	D134406-1G
Bacto-Hefeextrakt, technisch	Fisher Scientific	DF0886-17-0
BD Bacto Agar	Fisher Scientific	214030
BD Difco LB Brühe, Miller	Midland Scientific	DIFCO 244610
BD Bacto Dehydriertes Trypton	Fisher Scientific	DF0123-17-3
Biotin-lyophilisiertes Pulver	Sigma-Aldrich	B4501-100MG
Klare Kuppeln für PermaNest-Tabletts	Erzeugerlösung	GD221
Durchsichtige Frischhaltefolie	Thomas Scientific	22-305654
Grober Vermiculit	Bectine
di-Kaliumwasserstoffphosphat wasserstofffrei	Sigma-Aldrich	105109
Einweg-Petrischalen 100 x 15 mm	VWR International	25384-342
D-Mannitol	Sigma-Aldrich	M9546-250G
Ethanol, 200 Proof	Fisher Scientific	04-355-720
Falcon 50 mL konische Zentrifugenrohre	Fisher Scientific	14-432-22
Gefaltete Papiertücher 9,3" x 10,5"	Kimberly-Clark	2920
GENESYS 30 Sichtbares Spektrophotometer	Thermowissenschaftlich	840-277000
Gentamicin-Lösung	Sigma-Aldrich	G1272-100ML
L-Glutaminsäure-Mononatriumsalhydrat	Sigma-Aldrich	G1626-100G
Magnesiumchlorid	Sigma-Aldrich	M8266-100G
Magnesiumsulfat, Heptahydrat	Sigma-Aldrich	M9546-250G
MaxQ 6000 Inkubator-Shaker	Thermowissenschaftlich	SHKE6000
MES-Hydrat	Sigma-Aldrich	M8250-100G
Murashige- und Skoog-Basalsalsalzmischung (MS), Pulver	Sigma-Aldrich	M5524-50L
MX-RL-pro: Rotisserie-Röhren-Rotator	Scilogex	824222019999
myo-Inositol	Sigma-Aldrich	I7508-100G
Percival-Wachstumskammer	Percival	AR36L3
Perlitpflanzungsbodenzusatz	PVP-Industrien	PVP105408
Perma-Nest-Pflanzenschalen 8''x12''	VWR International	470150-476
pH-Meter Seven Compact 5220	Mettler Toledo	30019028
Geschütztes Skalpell	Fisher Scientific	02-688-79
Rifampicin	Sigma-Aldrich	R3501-5G
Smart Release Dünger Pflanzennahrung	Osmocote	B0071CZTBA
Natriumchlorid	Fisher Scientific	S271-3
Spectinomycin-Dihydrochlorid-Pentahydrat	Sigma-Aldrich	S4014-5G
Sprühflaschen mit Pumpen-Verdampfer	Thomas Scientific	1141V43
Quadratische 3,5" Gauge-Potis	Growers Nursery Supply Inc.	03GA-0350S
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389-5KG
Sunshine #4 Professioneller Anbau-Mischboden	Sun GRO Gartenbau	1341CFL0028P S
Tensid – Silwet L-77	Fisher Scientific	NC1791615
Vakuum-Desiccator	Das Lab Depot	55207
Wasserlösliche Allzweckpflanzennahrung	Miracle-Gro	160101