Automatisierte HPLC-Trennung mit LC-mate: Ein integrierter wiederholender Autosampler und Fraktionssammler für die Mikroskalenreinigung

Zusammenfassung

Ein integrierter Autosampler und Fraction Collector (LC-mate) wurden entwickelt, um wiederholte HPLC-Trennungen zu automatisieren. Kompatibel mit HPLC-Detektoren, die analoge Signale ausgeben, verbessert LC-mate die Leistung manuell betriebener Systeme und beschleunigt Forschungsabläufe, die auf leistungsstarke Flüssigkeitschromatographie angewiesen sind.

Zusammenfassung

Die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) spielt eine entscheidende Rolle bei der Reinigung hochwertiger Verbindungen und erfüllt die steigenden Anforderungen der Chemie- und Biologiedisziplinen sowohl in akademischen als auch in industriellen Umgebungen. Wiederholte manuelle Injektion und Fraktionssammlung während der Mikroreinigung schränken jedoch die Effizienz und Reproduzierbarkeit erheblich ein. Um diesen Engpass zu überwinden, haben wir ein integriertes Autosampler- und Fraktionssammelsystem entwickelt, vorübergehend LC-mate genannt, das wiederholte Trennungen automatisiert, indem es direkt auf analoge Signale des HPLC-Detektors reagiert. Das Instrument ist um ein Hochdruck-Sechs-Port-Schaltventil für die Probeneinspritzung und ein Wahlventil zur Fraktionsaufnahme aufgebaut, wobei die Betriebsparameter über eine intuitive Touchscreen-Oberfläche gesteuert werden. LC-mate ist kompatibel mit kommerziellen HPLC-Detektoren, die analoge Ausgänge ermöglichen, und kann auch eine wiederholte Trennung des Gradient-Elutionsmodus durch synchrone Signalauslösung erreichen. Demonstrationsexperimente bestätigten stabilen Betrieb und reproduzierbare Trennungen zur Reinigung von Naturprodukten und zeigten eine deutliche Verkürzung der manuellen Handhabungszeit. Das System bietet eine praktische und zugängliche Lösung zur Verbesserung der Automatisierung in herkömmlichen HPLC-Arbeitsabläufen und überbrückt die Lücke zwischen manuellen und vollautomatischen Reinigungssystemen.

Einleitung

Die Chromatographie, die Anfang des 20. Jahrhunderts von M.S. Tswett entwickelt wurde, entwickelte sich in den 1960er Jahren mit Fortschritten in der Instrumentierung^zur modernen Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC).

Heute spielt HPLC eine entscheidende Rolle bei der Reinigung hochwertiger Verbindungen und erfüllt damit die wachsenden Anforderungen der Biomedizin, Chemie und Biologie sowohl in akademischen als auch industriellen Bereichen. In der akademischen Forschung hängt die mikroskalige Reinigung natürlicher Produkte und die Auflösung chiraler Moleküle kritisch von semi-präparativen HPLC-Techniken ^4,5,6,7,8 ab. In den meisten praktischen Fällen injizieren Forscher jeweils einen Teil der Probenlösung in eine HPLC-Säule, anstatt in die gesamte Säule, um unvorhersehbaren Probenverlust zu vermeiden oder aufgrund der Säulengrößenbeschränkung, was wiederholte Probeninjektion und Fraktionsentnahme unvermeidlich macht. Trotz seiner außergewöhnlichen Trennfähigkeit bleibt der Einsatz von HPLC zur Probenreinigung durch inhärente Einschränkungen in der aktuellen Instrumentierung und Arbeitsabläufen eingeschränkt. Ein wesentlicher Engpass liegt in der starken Abhängigkeit von manuellem Eingriff, insbesondere bei der Probeninjektion und Fraktionsentnahme. Diese Prozesse sind nicht nur zeitaufwendig und arbeitsintensiv, sondern auch anfällig für menschliche Fehler, was den Durchsatz, die Reproduzierbarkeit und die allgemeine Betriebseffizienz^{beeinträchtigt.}

Kommerzielle Autosampler und Fraction Collectors von großen HPLC-Herstellern wie Agilent, Shimadzu und Waters bieten zuverlässige und präzise Automatisierung, sind jedoch typischerweise auf proprietäre Hardware- und Softwareökosysteme beschränkt. So sind beispielsweise der Autosampler des Agilent 1260 Infinity II und der G1364F-Fraktionskollektor nahtlos in die HPLC-Systeme von Agilent integriert, was eine ausgezeichnete Reproduzierbarkeit, aber eine begrenzte plattformübergreifende Kompatibilität bietet. Ähnlich bieten Shimadzus SIL-20A/40C-Autosampler und FRC-40/FRC-10A-Fraktionssammler einen hohen Durchsatz und exzellente mechanische Präzision, sind jedoch auf Shimadzus LC-20- und Nexera-Steuerungsarchitekturen angewiesen. Der Waters Alliance HPLC-Autosampler und die Fraction Collector III-Module liefern ebenfalls robuste Leistungs- und flexible Sammelformate (bis zu 300 mL/min), bleiben jedoch auf die proprietären UHPLC- und LC-MS-Umgebungen von Waters zugeschnitten. Darüber hinaus können traditionelle Autosampler, die auf Injektionsnadeln setzen, die Probenentnahme reduzieren, und röhrenbasierte Fraktionskollektoren können für die Handhabung großer Eluentvolumen unpraktisch sein. Bei den meisten anderen HPLC-Instrumenten hängt die halbpräparative Trennung weiterhin von mühsamer, sich wiederholender manueller Bedienung ab.

Diese Herausforderungen verdeutlichen die Notwendigkeit eines innovativen Ansatzes zur Automatisierung der Probenreinigung in HPLC-Arbeitsabläufen. Um diesem Bedarf gerecht zu werden, haben wir LC-mate entwickelt, ein kompaktes und vielseitiges Instrument, das Autosampler und Fraktionssammlungsmodule in einer einzigen Plattform integriert. Der fluidische Kern von LC-mate besteht aus zwei Hauptkomponenten: einem Hochdruck-Schaltventil mit sechs Anschlüssen (SKVA-3130-S), gefertigt aus Edelstahl SUS 316 mit einem Durchflussweg von 0,4 mm und Betriebsdruck von bis zu 45 MPa, Kapazität für präzise Probeneinspritzkontrolle, sowie einem 10-Kanal-Mehrpositionenwahlventil mit minimalem Totvolumen (27,5 μL Port-zu-Port, 5 μL Rotorrille) mit einem Durchflusskanaldurchmesser von 1,2 mm zur effizienten Fraktionssammlung. Diese Konfiguration minimiert das Totverbrauch und verringert das Risiko einer Kreuzkontamination. Für detaillierte Instrumentenspezifikationen siehe Tabelle 1. LC-mate kann analoge Ausgänge von HPLC-Detektoren empfangen und das HPLC-Instrument über ein synchrones Signal auslösen, was eine unabhängige Steuerung sowohl der Probeneinspeisung als auch der Fraktionsentnahme ermöglicht.

Tabelle 1: LC-mate-bezogene Instrumentenparameter. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Das Instrument ist mit benutzerfreundlicher Steuerungssoftware und einer intuitiven Touchscreen-Oberfläche ausgestattet, die die Echtzeitvisualisierung analoger chromatographischer Signale ermöglicht. LC-mate unterstützt sowohl isokratische als auch Gradiententrennungsmodi und ermöglicht es Benutzern, wichtige Parameter zu konfigurieren – darunter Injektionsvolumen, Anzahl der Wiederholungszeiten, Intervallzeit jeder Injektion und Sammelmodus [Schwellenwert-, Zeit-basiert oder Sammel-Alles (Sammel-Fraktionen sowohl oberhalb als auch unterhalb des Schwellenwert)] – und den vollautomatischen Betrieb mit einem einzigen Befehl zu starten. Dadurch entfällt die Notwendigkeit wiederholter manueller Eingriffe und verbessert die Effizienz der HPLC-Reinigung erheblich.

Abbildung 1 zeigt das Gesamterscheinungsbild, das Betriebsprinzip und die Konfiguration des LC-mate, der in ein HPLC-System integriert ist.

Abbildung 1: Entwurf und Aufbau des LC-mate-Systems. (A) Schaltplan-Layout. (B) Instrumentendiagramm. (C) Praktisches Setup-Foto. (D) Verbindung der Signalübertragungsleitung zwischen dem UV-Detektor und dem LC-Mat. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Protokoll

1. Überprüfung der Verbindung

1. Überprüfen Sie die Lösungsmittelleitungsverbindungen zwischen HPLC, LC-MATE und chromatografischer Säule, um korrekte Durchflusswege sicherzustellen (Abbildung 1A).
2. Überprüfen Sie die Verbindung der Signalübertragungsleitung zwischen UV-Detektor und LC-Mat, wie in Abbildung 1D gezeigt.
   1. Verbinden Sie das schwarze Kabel mit dem roten Anschluss und das weiße Kabel mit dem schwarzen Terminal, um die Polarität des analogen Signalausgangs anzupassen.
   2. Beobachten Sie das LC-Mate-Display. Wenn die analoge Signalwellenform erscheint, ist die Verbindung korrekt.
      HINWEIS: Wenn keine Wellenform sichtbar ist, kehren Sie die Verbindungen um: Verbinden Sie das schwarze Kabel mit dem schwarzen Anschluss und das weiße Kabel an das rote Terminal.
3. Überprüfe die Verbindung des Triggers zwischen UV-Detektor und LC-Mate.
   1. Stecken Sie das einzelne Ende des Datenkabels in den Ausgangsanschluss des UV-Detektors.
   2. Verbinden Sie die schwarzen und weißen Drähte vom anderen Ende mit den blauen bzw. schwarzen Auslöseklemmen am LC-Mate.
   3. Ziehe den Anschluss und den Auslöser fest an, um eine feste Verbindung zu gewährleisten.

2. Der Start des integrierten Trennsystems

1. Stellen Sie sicher, dass die HPLC ordnungsgemäß gestartet wird.
2. Stellen Sie sicher, dass der LC-mate ordnungsgemäß gestartet wird.
   1. Beim Start des LC-mate-Systems klicken Sie auf das LC-mate-Symbol auf der Schnittstelle, um das System-Selbsttestprogramm automatisch auszuführen und wichtige Hardwaremodule zu initialisieren.
   2. Warte auf den kurzen Di-Prompt-Ton (etwa 0,5 s) und das Verschwinden der "Selbsttest"-Meldung auf dem Bildschirm, nachdem der Selbsttest abgeschlossen ist, da sie anzeigen, dass die Initialisierung abgeschlossen ist.

3. Zustandsoptimierung

1. Konfigurieren Sie die HPLC-Trennbedingung und beginnen Sie mit der Elution, um die Säulengleichgewicht zu realisieren.
2. Klicken Sie auf das Test-Symbol auf der linken Seite des LC-mate-Bildschirms, und die folgende Benutzeroberfläche wird auf dem Bildschirm angezeigt (Abbildung 2A). Parameter für Eingangsinjektionslautstärke, Elutionszeit und Wiederholungszeiten und drücken Sie das Start-Symbol ; der Betrieb von Autosampler, Fraction Collector und HPLC wird eingeleitet. In diesem Fall fließt das Eluent nur durch Port 10 des Selektorventils heraus und kann manuell aufgenommen oder weggeworfen werden.
3. Identifizieren Sie die zulässigen Trennbedingungen, einschließlich Auflösung, Betriebszeit, Retentionszeit, Einspritzvolumen und UV-Wellenlänge usw., um die anschließende Trennung und Fraktionserfassung unter geeigneten Modi zu erleichtern.

4. Automatisches Laufen

HINWEIS: Basierend auf dem Chromatogramm der zulässigen Trennbedingungen konnte man eine geeignete Fraktions-Sammelmethode aus den Optionen Threshold, Timing Collection und Collect All auf der linken Seite der Schnittstelle auswählen.

1. Fraktionserhebung basierend auf Schwellenwert
   1. Wählen Sie das Schwellenwertmodul auf der linken Seite der Schnittstelle aus, und das System zeigt die Parametereinstellungsschnittstelle wie in Abbildung 2B dargestellt.
   2. Geben Sie das Injektionsvolumen, die Wiederholungszeiten, die Schwelle und die Elutionszeit ein und drücken Sie Start; HPLC und LC-mate laufen automatisch. Fraktionen mit chromatografischen Spitzen, die die Schwelle überschreiten, werden in verschiedenen Sammelflaschen gesammelt.
   3. Überwachen Sie die vertikal angeordneten Statusanzeigen auf dem Display: Beobachten Sie die Injektion im Gange , um zu bestätigen, dass die Probeeinführung eingeleitet wurde. Überprüfen Sie die laufende Trennung , um sicherzustellen, dass die chromatografische Trennung stattfindet. Beachten Sie "Spritzenentleerung", um zu erkennen, wann die Spritze die Restflüssigkeit ausspült. Achten Sie auf blaue Markierung des entsprechenden Textes, um zu bestätigen, welcher Betriebszustand aktuell aktiv ist.
      HINWEIS: Während des Trennprozesses zeigt das Drücken des "Chromatogramm"-Symbols das Chromatogramm und die Schwellenlinie auf einer neuen Schnittstelle an, und das Chromatogramm ist identisch mit dem auf dem Bildschirm des Computers, der den HPLC steuert.
2. Fraktionserhebung basierend auf dem Zeitraum
   1. Wählen Sie das Modul Timing Collection auf der linken Seite der Schnittstelle aus, um das Parametereinstellungsmenü zu öffnen (Abbildung 2C).
   2. Geben Sie die erforderlichen Parameter ein: Injektionsvolumen, Wiederholungszeiten, Elutionszeit und eine Reihe von benötigten Sammelzeiten.
   3. Drücken Sie die Starttaste , um die automatisierte Sequenz zu starten, dann laufen das HPLC-System und LC-mate wiederholt gemäß den gesetzten Parametern.
3. Fraktionssammlung mit dem "Collect All"-Modus
   1. Wählen Sie das Collect-All-Funktionsmodul auf der linken Seite der Schnittstelle aus, das System zeigt die Parametereinstellungsschnittstelle wie in Abbildung 2D dargestellt.
   2. Setzen Sie einen Sammelschwellenwert, und chromatographische Spitzen, die über oder unter diesem Schwellenwert liegen, werden getrennt erfasst, was garantiert, dass keine Verbindung in einem Gemisch verloren geht.
      HINWEIS: Acetonitril ist ein brennbares und giftiges Lösungsmittel. Alle Verfahren mit Acetonitril oder anderen organischen Lösungsmitteln müssen in einem gut belüfteten Laborraum durchgeführt werden. Das Personal muss jederzeit geeignete persönliche Schutzausrüstung (PSA) tragen, einschließlich chemischer Wasserschutzbrille und lösungsmittelresistente Handschuhe. Abfallacetonitril und andere organische Lösungsmittel müssen in ausgewiesenen, ordnungsgemäß gekennzeichneten Behältern für gefährliche chemische Abfälle gesammelt werden. Diese Abfallströme wurden gemäß dem Umwelt-, Gesundheits- und Sicherheitsprotokoll unserer Institution von einem lizenzierten Entsorgungsdienst behandelt.

5. Rohrreinigung

HINWEIS: Die Reinigung der Pipeline stellt sicher, dass beim nächsten Einsatz des Autosamplers keine Probe in der Pipeline verbleibt.

1. Bereiten Sie eine kleine Flasche sauberes Lösungsmittel vor und führen Sie die Einspritzpipeline des Autosamplers in das Lösungsmittel.
2. Wählen Sie das Reinigungsmodul über die linke Oberfläche aus, um das Parametereinstellungsmenü zu öffnen (Abbildung 2E).
3. Reinigung der Injektorpipeline
   1. Stellen Sie das Injektionsvolumen zwischen 0 und 1000 ein und stellen Sie die Wiederholungszeiten fest (ohne Begrenzung).
   2. Klicken Sie auf die Reinigung unter "Reinigung abgeschlossen", um die Reinigung der Injektorpipeline zu beginnen.
   3. Überwachen Sie die Anzahl der "Zyklus"-Zyklen, um die Anzahl der abgeschlossenen Waschzyklen zu verfolgen.
4. Reinigung der Sammlungspipeline
   1. Setze die Reinigungszeit (ohne Grenzen).
   2. Klicken Sie auf die Reinigung unterhalb der "Aktuellen Pipeline", um mit der Reinigung der Sammlungspipeline zu beginnen.
   3. Überwachen Sie die Anzeige der aktuellen Pipeline , um zu bestätigen, welche Pipeline gereinigt wird, da das System sequentiell von Pipeline 0 bis Pipeline 10 verarbeitet.

Abbildung 2: LC-mate-Touchscreen-Schnittstelle für den Funktionsbetrieb. (A) Optimierungsbildschirm. (B) Schwellenwertmodus. (C) Timing-Modus. (D) Sammelmodus. (E) Pipeline-Reinigung. (F) Einstellungen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

6. Datenspeicheranweisungen

1. Aktivieren Sie das automatische Speichern. Das System speichert das Chromatogramm automatisch nach Abschluss jedes Elutionszyklus.
2. Führe manuelles Speichern durch. Klicke nach Abschluss der Elution auf die Schaltfläche Speichern . Geben Sie die erforderlichen Metadaten im Dialogfeld ein, um die Datei zu speichern.
3. Wähle den Lagerort aus. Wähle aus, ob du Dateien auf dem lokalen Speicher des Geräts, einer SD-Karte oder einem externen USB-Stick speicherst.
   HINWEIS: Verwenden Sie einen externen USB-Stick für die gesamte Datenspeicherung, um Kapazitätsbeschränkungen zu vermeiden und einen einfachen Datenzugriff zu gewährleisten.

Ergebnisse

Reinigung von 2"-O-galloyl-Hyperosid
2"-O-Galloyl-Hyperosid (2-GH) ist ein wesentlicher wasserlöslicher Bestandteil von Euphorbia helioscopia L., einer traditionellen chinesischen Medizin mit langer Tradition zur Lösung von Schleim und Feuchtigkeit¹¹. Seine chemische Struktur ist in Abbildung 3 dargestellt. 2-GH wurde kürzlich in einem Tiermodell

Diskussion

Diese Ergebnisse zeigen, dass das LC-mate-System autonom kontinuierliche Probeninjektion und Fraktionsentnahme gemäß den festgelegten Parametern durchführen kann, wodurch manuelle Eingriffe erheblich minimiert und die Trennungseffizienz verbessert wird. Das System verfügt über eine benutzerfreundliche Oberfläche, die lediglich eine anfängliche Hardware-Einrichtung und anschließend eine intuitive Touchscreen-Bedienung erfordert.

Um den experimentellen Erfolg zu...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Hochleistungs-Flüssigkeitschromatograph – EasySep-1050	Shanghai Tongwei Analysis Technology Co., Ltd. Webseite des Instruments EasySep®-1050 https://www.instrument.com.cn/netshow/sh100522/C140238.htm	1009992	Ein modulares präparatives HPLC-System, das im Protokoll verwendet wird. Sie umfasst eine Lösungsmittel-Förderpumpe, einen UV/VIS-Detektor und ein manuelles Einspritzventil. Dieses System bildet die Kerntrenneinheit, die der LC-mate automatisiert.
(Flüssigkeitschromatographische Säule) Sharpsil-U C18 150 mm (L) & Times; 30 mm (Identifikation) S-10 & Mikro; m, 100A	Shanghai Xuanmei Industrial Development Co., Ltd.	U180110-300150	Umgekehrt – Phase C18 chromatographische Säule mit einer Partikelgröße von 10 μ m und eine Porengröße von 100 & Aring. Es ist für die Trennung kleiner Moleküle (wie Arzneimittel, organische Verbindungen) konzipiert und besitzt eine gute Reproduzierbarkeit und Stabilität. Die Säulenabmessungen (150 mm Länge, 30 mm Innendurchmesser) machen sie geeignet für präparative oder halbpräparative Chromatographie.
LC-Mate	Shanghai Betterren Medical Technology Co., Ltd. Für jede Anfrage auf  das Instrument LC-mate, bitte kontaktieren Sie den korrespondierenden Autor per E-Mail: wmzhao@simm.ac.cn	GD202200337	Hilfsgeräte für Flüssigkeitschromatographiesysteme, wahrscheinlich für Probeninjektion, mobiles Phasenmanagement oder Datenerfassung verwendet. Es kann in HPLC-Systeme integriert werden, um die Automatisierung und Effizienz experimenteller Prozesse zu verbessern