Bewertung der multimodalen Funktionalität chimerischer Antigenrezeptor-T-Zellen bei Einzelzellauflösung mittels Optofluidik-Analyse

Summary

Die adoptive T-Zell-Therapie mit CAR-T-Zellen zeigt vielversprechende Ergebnisse bei der Behandlung von Blutkrebs, obwohl die dauerhaften Reaktionen inkonsistent sind. Polyfunktionale T-Zellen korrelieren mit der Remissionsbeständigkeit, aber Standardtests verdecken wichtige Subpopulationen. Wir präsentieren einen Single-Cell-Workflow unter Verwendung einer Optofluidik-Plattform, um hochfunktionale CAR-T-Zellen für weitere Studien zu identifizieren und zu isolieren.

Abstract

Die adoptive T-Zell-Therapie ist ein neuartiges Behandlungsparadigma, bei dem autologe T-Zellen genetisch modifiziert werden, um einen tumorzielgerichteten chimerischen Antigenrezeptor (CAR) vor der ex-vivo-Expansion und Re-Infusion in den Patienten auszudrücken. Trotz bemerkenswerter Nachweise der Antitumorwirksamkeit bei Patienten mit fortgeschrittenen hämatologischen Malignitäten zeigen sich in einem erheblichen Teil der Fälle keine langanhaltenden Reaktionen. Obwohl mehrere idiosynkratische Faktoren zur Variabilität der klinischen Ergebnisse beitragen können, gibt es immer mehr Hinweise darauf, dass der Anteil polyfunktionaler T-Zellen im präinfusionsbedingten CAR-T-Zellprodukt stark mit der Dauerhaftigkeit der Krebsremission korreliert. Leider basieren Standardbewertungen von CAR-T-Zellprodukten derzeit auf Massenpopulationsmessungen oder terminalen Tests, was die Fähigkeit einschränkt, Subpopulationen mit erhöhten funktionellen Eigenschaften zu isolieren und zu untersuchen. Hier demonstrieren wir einen Workflow, der eine Optofluidik-Plattform nutzt, um sowohl das Zytokinsekretionsprofil als auch die Aktivierung mittels CD137-Expression einzelner CAR-T-Zellen zu bewerten, was optional mit der Bewertung zytotoxischer Aktivität kombiniert werden kann. Zellen mit dem höchsten Maß an multimodaler Funktionalität können für weitere Analysen isoliert werden, um die Entwicklung der nächsten Generation von CAR-T-Zelltherapien zu unterstützen.

Introduction

Chimerische Antigenrezeptoren (CAR)-exprimierende T-Zellen haben bei Patienten mit fortgeschrittenen hämatologischen Malignitäten eine bemerkenswerte Antitumorpotenz^{gezeigt 1,2}. Erhebliche Teile der behandelten Patienten fallen jedoch schließlich zurück, was die Notwendigkeit unterstreicht, CAR-T-Zellprodukte mit höherer funktioneller Persistenz^{zu entwickeln} 3,4,5,6. Obwohl viele idiosynkratische Faktoren zur Variabilität der klinischen Ergebnisse beitragen können, gibt es immer mehr Hinweise darauf, dass der Anteil polyfunktionaler T-Zellen im präinfusionsbedingten CAR-T-Zellprodukt stark mit der Haltbarkeit der Krebsremission korreliert. Daher könnten Strategien zur Anreicherung oder Entwicklung von CAR-T-Zellen mit höherer Polyfunktionalität therapeutische Produkte mit erhöhtem Potenzial zur Vermittlung langanhaltender klinischer Reaktionen ^6,7,8 hervorbringen. Leider basieren die aktuellen Methoden zur Charakterisierung von CAR-T-Zellfunktionen weitgehend auf Massenpopulationsmessungen oder terminalen Assays. Diese schränken die Fähigkeit ein, bestimmte Subpopulationen mit erhöhten multifunktionalen Eigenschaften zu isolieren und zu untersuchen. Beispielsweise wird die Zytokinsekretion typischerweise entweder durch Massensupernatanten oder durch intrazelluläre Färbung beurteilt. Letztere erfordert eine Zellfixation im Austausch für Informationen auf Einzelzellebene⁹. Ähnlich wird das zytotoxische Potenzial am häufigsten für Massenpopulationen von CAR-T-Zellen bewertet, indem der Verlust der Zielzell-Viabilität nach der T-Zell-/Zielzell-Kokultur¹⁰ quantifiziert wird. Die Fähigkeit, die Sekretion, Aktivierung und zytolytische Aktivität lebensfähiger CAR-T-Zellen bei Einzelzellauflösung zu bewerten, könnte die Entwicklung von therapeutischen Produkten mit nachhaltigerer antitumorwirksamer Wirkung fördern.

Hier stellen wir eine Methode vor, um einzelne CAR-T-Zellen gleichzeitig für multimodale Funktionalität über eine optofluidische Einzelzellplattform zu profilieren (Abbildung 1). Das System nutzt optoelektrische Positionierung (OEP), um Zytokin-Fangkugeln und einzelne Zellen in räumlich getrennte Stifte zu bewegen, was funktionelle Bewertungen einzelner CAR-T-Zellen ermöglicht (Abbildung 2A). In diesem Protokoll demonstrieren wir einen Arbeitsablauf zur Erzeugung von CAR-T-Zellen mittels nicht-viraler Gentransfer und bewerten die Sekretion und Aktivierung von Zytokinen über CD137 einzelner CAR-T-Zellen während der Kokultur mit antigenexpressiven und antigennegativen Zielzellen (Abbildung 3 und Abbildung 4)¹¹. Das Potenzial, Zytokin- und Aktivierungsprofile zwischen modifizierten Zellprodukten zu differenzieren, zeigt sich durch den Vergleich von Standard-CAR-T-Zellen mit c-Jun-überexprimierenden Cellen⁶. Die zytotoxische Aktivität gegen einzelne Zielzellen kann ebenfalls anhand von Caspase- oder Fluoreszenz-basierten Anzeigen auf der optofluidischen Plattform bewertet werden (Abbildung 2B). Allerdings ist eine Zeitrafferanalyse erforderlich, um die Wechselwirkungskinetik zu bestimmen, die für jedes CAR-Konstrukt und Experiment erheblich variieren kann. Ähnlich erfordern wiederholte Tötungstests, die chronische Stimulation nachahmen, einen alternativen Arbeitsablauf. Daher beschreiben wir in diesem Artikel das grundlegende Verfahren zur Durchführung der Zytotoxizitätsbewertung, gehen jedoch nicht auf die detaillierten Anwendungen ein.

Basierend auf der gewählten Bewertung und den Zielmerkmalen können lebende CAR-T-Zellen mit dem höchsten Maß an multimodaler Funktionalität aus dem Instrument entladen und in einzelnen Brunnen in 96-Bohrloch-Platten zur weiteren Untersuchung übertragen werden (Abbildung 2C).

Protocol

HINWEIS: Der Puffer und die Medienvorbereitung sind in Tabelle 1 angegeben.

1. CD8-T-Zell-Isolierung aus den Kegeln des Leukozytenreduktionssystems

HINWEIS: Führen Sie alle Schritte mit steriler, aseptischer Technik in einem Gewebekultur-Biosicherheitsschrank durch. Alle Medien für Verdünnungen, Waschen und Resuspensionen sollten während des gesamten Eingriffs bei 4 °C gehalten werden.

1. Fügen Sie 15 ml Zelltrennmedium (Dichte 1,077 g/mL) zu jedem der beiden 50-mL konischen Röhren (Trennrohr) hinzu.
2. Halten Sie einen Leukozyten-Reduktionssystem (LRS) Kegel (konische Seite nach unten) über einem unbedeckten 50-mL konischen Rohr. Mit sterilisierter Schere schneiden Sie den Kunststoffschlauch unterhalb des LRS-Kegels durch. Legen Sie den LRS-Kegel auf das offene 50-mL konische Rohr und schneiden Sie das Kunststoffrohr darüber durch. Sammeln Sie etwa 8–10 ml Blut im 50 ml konischen Rohr.
3. Füllen Sie das 50-mL konische Rohr auf 50 mL mit PBS + EDTA (wie in der Liste der Medien und Puffer zubereitet) und pipetteieren Sie das verdünnte Blut. Teilen Sie das verdünnte Blut gleichmäßig auf die beiden Trennröhren auf.
4. Zentrifugieren Sie die Trennrohre mit verdünntem Blut bei 750 x g für 15 Minuten bei Raumtemperatur (RT), mit 9 als Beschleunigung und 2 als Verzögerung.
5. Mit einer 10-ml-serologischen Pipette sammeln und übertragen Sie die Buffy-Schicht aus jedem Trennrohr sorgfältig in ein frisches 50-ml-konisches Rohr.
6. Füllen Sie jedes 50-mL-konische Rohr mit PBS + EDTA auf 40 mL und setzen Sie es wieder auf, um Einzelzellensuspensionen zu erhalten. Zentrifugieren Sie die Einzelzell-Suspensionen bei 300 x g für 10 Minuten bei 4 °C. Aspiriere das Supernatant.
7. Die Zellpellets werden in 40 ml PBS + EDTA neu suspendiert und kombiniert. Zentrifugieren Sie die Einzell-Suspension bei 300 x g für 10 Minuten bei 4 °C. Aspiriere das Supernatant.
8. Setzen Sie das Zellpellet in PBS + EDTA neu auf und bestimmen Sie die lebensfähige Zelldichte der peripheren Blut-Mononuklearzelle (PBMC)-Suspension mittels Trypan Blue-Färbung.
   HINWEIS: Trypan Blue ist ein lebendzellig undurchlässiger Farbstoff, der DNA färbt. Daher bleiben sowohl lebende PBMCs als auch nicht-nukleäre Zellen (d. h. rote Blutkörperchen) unverfärbt. Es ist wichtig, kleine Zellen (z. B. rote Blutkörperchen) auszuschließen, um die lebensfähige PBMC-Dichte zu bestimmen.
9. Übertragen Sie die gewünschte Anzahl von PBMCs auf eine frische 50-mL konische Röhre zur magnetischen Anreicherung der CD8^+- T-Zellen. Schätze die Anzahl der gewünschten CD8^+- T-Zellen als Anfangsmenge an PBMCs, die für die magnetische Anreicherung benötigt werden, um das Zehnfache. Bewahren Sie die Reagenzien während des Eingriffs kalt auf.
10. Zentrifugiere die PBMC-Zellsuspension mit 300 x g für 10 Minuten bei 4 °C. Aspiriere das Supernatant. Lassen Sie das Zellpellet in 40 μL MACS-Puffer (wie in der Liste der Medien und Puffer angegeben) pro 1 x 10 ×⁷ Zellen wieder suspendieren.
11. Fügen Sie 10 μL CD8⁺ T-Zell-Biotin-Ab-Cocktail pro 1 x 10^{7 Zellen hinzu} . Durch Pipettern mischen und 5 Minuten bei 4 °C inkubieren.
12. Fügen Sie 30 μL MACS-Puffer pro 1 x 10^{7 Zellen hinzu} . Fügen Sie 20 μL CD8⁺ T-Zell-Mikroperlen pro 1 x 10^{7 Zellen hinzu} . Durch Pipette mischen und 10 Minuten bei 4 °C inkubieren.
13. Setze vorgekühlte LS-Säulen auf einen Magneten. Setzen Sie ein 15 ml konisches Rohr darunter, um den Durchfluss zu sammeln. Gleiche jede LS-Spalte mit 3 mL MACS-Puffer aus.
14. Mit demselben 15-mL konischen Rohr wie das Sammelrohr wird die Zellsuspension auf die ausgeglichene LS-Säule aufgetragen. Waschen Sie die Säule dreimal mit 1 ml MACS-Puffer. Lassen Sie jede 1-ml-Spülung vollständig durch die LS-Säule laufen, bevor Sie die nächste Wash auftragen.
15. Die gesammelten Zellen werden sorgfältig wieder suspendiert und die fruchtbare Zelldichte der angereicherten CD8⁺ T-Zellsuspension mittels Trypan Blue-Färbung bestimmt.

2. Perlenbasierte Aktivierung von CD8⁺ T-Zellen

1. Berechnen Sie die Anzahl der menschlichen CD3/CD28-Perlen, die für ein 1:1-Verhältnis von T-Zellen zu Perlen benötigt werden. Der Aktivierungskolben enthält 1 x 10^{6 Perlen} pro 25 μL.
2. Lassen Sie die Aktivierungsperlen mindestens 30 Sekunden vortexen, bevor Sie das berechnete Volumen der Perlensuspension auf ein 15-mL konisches Rohr übertragen. Fügen Sie eine gleiche Menge Medium hinzu, um die Perlen und den Vortex mindestens 5 Sekunden lang zu waschen.
3. Setzen Sie das 15-mL konische Rohr für 1 Minute in den jeweiligen Magneten, um die Perlen an den Seiten des Rohrs zu sammeln. Aspiriere und entsorge das Supernatantant.
4. Berechnen Sie das Volumen des Mediums, das für eine endgültige T-Zell-Konzentration von 1 x 10 6 T-Zellen/ml benötigt wird. Entferne das 15-mL konische Rohr vom Magneten und suspendiere es im berechneten Volumen des Kulturmediums wieder. Fügen Sie rekombinantes humanes IL-2 zu einer Endkonzentration von 50 U/ml hinzu.
5. Übertragen Sie das vollständig ergänzte Medium in das Rohr mit den T-Zellen und suspendieren Sie es erneut. Säen Sie die Zellsuspension in ein geeignetes Zellkulturformat ein (z. B. 1 ml in 48-Brunnen-Platten, 2 ml in 24-Bohrloch-Platten) und inkubieren Sie es 40 Stunden.

3. CAR-T-Zellerzeugung durch nicht-virale Genübertragung mittels Nukleofektion

HINWEIS: Die Vorwärmung von Medien (37 °C), Reagenzien (RT) und der Zentrifuge (RT) ist entscheidend, um eine hohe Genübertragungseffizienz zu gewährleisten.

1. Bereiten Sie eine 48-Well-Platte mit 1 ml Zellkulturmedium für jede Nukleofektionsbedingung vor und beschriften Sie. Inkubieren Sie die Platte mindestens 30 Minuten, um ein warmes und_{CO2-angepasstes} Medium mit physiologischem pH-Wert zu schaffen.
2. Schalten Sie den Nukleofektor ein und wählen Sie die Positionen aus, die im 16-Wellen-Streifen nukleofektiert werden sollen. Wählen Sie das passende Programm aus (z. B. FI-115, um hohe Effizienz zu bevorzugen, oder EO-115 für höhere Viabilität).
3. Nehmen Sie die Zellkulturplatte mit T-Cellen aus dem Inkubator und verwenden Sie ein Mikroskop, um das visuelle Erscheinungsbild der Zellen zu überprüfen, um einen ersten Eindruck davon zu erhalten, ob die Aktivierung erfolgreich war. Erfolgreich aktivierte T-Zellen sollten gleichmäßige Clusterbildung und eine vergrößerte Zellform aufweisen. Eine mittlere Farbe, die sich von frischem Medium in einen leicht orangefarbenen Ton unterscheidet, zeigt an, dass die Aktivierung zu einem aktiveren Stoffwechselzustand geführt hat und gilt als gutes Zeichen. An diesem Punkt kann eine durchflusszytometrische Analyse der frühen Aktivierungsmarker CD25 und CD69 die Aktivierung validieren.
4. Aktivierte T-Zellen wieder suspendieren, entnehmen und zählen. Berechnen Sie die Anzahl der benötigten T-Zellen, indem Sie 1,2 bis 2 x 10 6 T-Zellen pro Bedingung betrachten. Übertragen Sie das berechnete Volumen in ein frisches 15-mL konisches Rohr und zentrifugieren Sie bei 200 x g für 10 Minuten bei RT.
5. Absaugen und Entsorgen Sie Supernatant sowie Waschen Sie die T-Zellen mit 10 ml warmem PBS. Zentrifugieren Sie bei 200 x g für 10 Minuten bei RT. Nutzen Sie die Zentrifugationszeit, um die CAR-kodierenden Plasmide, typischerweise mit einer Konzentration von 1 μg/μL DNA aufzutauen. Fügen Sie transposase-kodierendes (SB100x) Plasmid (1,0 μg) oder Minikreis (0,5 μg) zusammen mit CAR-kodierendem Plasmid (1,0 μg) oder Minikreis (0,6 μg) in einem einzelnen DNAse-freien 1,5-mL-Mikrozentrifugationsröhrchen gemäß Nukleofektionsbedingung zusammen.
6. Bereite eine ausreichende Menge P3-Nukleofektorlösung mit zusätzlichem Supplement (gemäß Bedingung: 16,4 μL Nukleofektorlösung + 3,6 μL Ergänzung) vor.
7. Nimm das 15-mL konische Rohr mit den T-Zellen aus der Zentrifuge, aspiriere Supernatant und zentrifugiere für 1 Minute bei 200 x g, um Restflüssigkeit am Boden zu sammeln. Nehmen Sie eine 200-μL-Pipette, um so viel Puffer wie möglich vorsichtig zu entfernen, ohne das Zellpellet zu berühren.
8. Wird sofort mit der Resuspension des T-Zell-Pellets in 20 μL P3-Puffer (wie in der Materialliste angegeben) gemäß Zustand fortgesetzt. Übertragen Sie 20 μL Zellsuspension im P3-Puffer in das 1,5-mL Mikrozentrifugationsrohr mit den jeweiligen Konstrukten, mischen Sie vorsichtig ohne Luftzufuhr und übertragen Sie die Zellsuspension auf den 16-Brunnen-Nukleofektionsstreifen. Klopfen Sie vorsichtig an, um Luft vom Boden des Brunnens zu entfernen.
9. Setzen Sie den 16-Well-Streifen in das 4D-Nukleofektorsystem ein und beginnen Sie mit dem Nukleofektionsverfahren. Nach erfolgreicher Nukleofektion sollte für jeden gewählten Brunnen ein grünes Kreuz auf dem Bildschirm sichtbar sein.
10. Fügen Sie sofort 100 μL vorgewärmtes Medium von der vorbereiteten 48-Well-Platte hinzu, bevor Sie den 16-Well-Streifen für 10 Minuten im Inkubator inkubieren.
11. Vorsichtig 2 bis 3 Mal wieder suspendieren, die Zellsuspension in die vorbereitete 48-Well-Platte übertragen und zurück in den Inkubator geben.
12. Nach 4-5 Stunden entnehmen Sie sorgfältig 500 μL aus jedem Bohrloch und fügen vorsichtig 500 μL frisches und vorgewärmtes Kulturmedium hinzu, ergänzt mit 50 U/mL rekombinantem humanem IL-2.
13. Führen Sie jeden zweiten Tag regelmäßige Medienwechsel durch, um die Zellen zu erweitern, wobei eine Zelldichte zwischen 0,5 und 2 x 10 6 T Zellen/ml gehalten wird.
14. Am Tag 6 entferne die CD3/CD28-Aktivierungsperlen. Entnehmen Sie T-Zellen, indem Sie vorsichtig 10x aufhängen und die Zellsuspension in ein 15-mL konisches Rohr übertragen. Setzen Sie das 15-mL konische Rohr für 1 Minute in den jeweiligen Magneten.
15. Die Zellsuspension wird abgesaugt, auf eine frische Kulturplatte übertragen und die Zellen mit frischem Zellkulturmedium mit IL-2 ergänzt bis zu einer Endkonzentration von 50 U/ml gegeben. Perlen sollten in den Seitenwänden des 15-mL-konischen Rohrs im Magneten sichtbar bleiben.
16. Analysieren Sie die Genübertragungseffizienz am 7. Tag mittels flowzytometrischer Analyse der jeweiligen CAR- oder Surrogatmarker-Expression, bevor Sie am 8. Tag mit der magnetischen Sortierung transgenpositiver CAR-T-Zellen beginnen (Gating Strategy in ergänzender Abbildung 1).

4. Magnetische Anreicherung von transgen-positiven T-Zellen.

HINWEIS: Führen Sie alle Schritte mit steriler, aseptischer Technik in einem Gewebekultur-Biosicherheitsschrank durch. Alle Medien für Verdünnungen, Waschen und Resuspensionen sollten während des gesamten Eingriffs bei 4 °C gehalten werden.

1. Entnehmen Sie T-Zellen, indem Sie sanft resuspendieren und auf 15-ml-konische Röhren übertragen werden. Zähle T-Zellen, nimm die Anzahl der magnetisch angereicherten Zellen und zentrifugiere 10 Minuten bei 300 x g.
2. Absaugen und Entsorgen Sie Supernatant sowie Waschen Sie es durch Wiederaufhängen in 10 ml MACS-Puffer. Zentrifugiere 10 Minuten bei 300 x g. Aspirieren und Supernatanten entsorgen.
3. Berechnen Sie die Menge des biotinylierten Antikörpers, die gegen den Surrogatmarker (z. B. TEGFR) gerichtet ist. Typischerweise sollte der Antikörper auf 1 μL pro 1 x 10^{6 Zellen} getitert werden.
4. T-Zellen mit einer Dichte von 1 x 10^{7 Zellen pro} ml neu suspendieren und die berechnete Menge des biotinylierten Antikörpers addieren. 20 Minuten bei 4 °C inkubieren.
5. Waschen Sie mit 10 ml MACS-Puffer und zentrifugieren Sie 10 Minuten bei 300 x g. Aspirieren und Supernatanten entsorgen.
6. T-Zellen bei 1 x 10^{7 Zellen pro} 80 μL MACS-Puffer neu suspendieren. Fügen Sie Antibiotin-Mikroperlen mit einem Volumen von 20 μL pro 1 x 10^{7 Zellen hinzu} . Gut mischen und 15 Minuten bei 4 °C inkubieren.
7. Waschen Sie mit 10 ml MACS-Puffer und zentrifugieren Sie 10 Minuten bei 300 x g. Aspirieren und Supernatanten entsorgen. Cellen in 500 μL MACS-Puffer wieder suspendieren.
8. Setze vorgekühlte LS-Säulen auf einen Magneten. Setzen Sie ein 15 ml konisches Rohr darunter, um den Durchfluss zu sammeln.
9. Gleiche jede LS-Spalte mit 3 mL MACS-Puffer aus. Mit demselben 15-mL konischen Rohr wie das Sammelrohr wird die Zellsuspension auf die ausgeglichene LS-Säule aufgetragen.
10. Waschen Sie die Säule dreimal mit 1 ml MACS-Puffer. Lassen Sie jede 1-ml-Spülung vollständig durch die LS-Säule laufen, bevor Sie die nächste Wash auftragen.
11. Um transgenpositive Zellen zu sammeln, nehmen Sie die LS-Säule vom Magneten und legen sie in ein frisches 15-ml-konisches Rohr. Gib 5 ml MACS-Puffer hinzu und drücke die Flüssigkeit vorsichtig aus der Säule.
12. Zähle die isolierten Zellen und zentrifugiere sie 10 Minuten lang bei 300 x g. Die transgen-positiven Zellen in einem geeigneten Medium mit IL-2 ergänzt und inkubieren Sie, bis funktionelle und/oder phänotypische Untersuchungen durchgeführt werden. Führen Sie vor Beginn der Arbeitsabläufe eine Reinheitsprüfung durch, indem Sie für den CAR- oder Ersatztransduktionsmarker färben (ergänzende Abbildung 2).

5. Systemvorbereitung

1. Schalten Sie das Instrument ein und öffnen Sie die Software Cell Analysis Suite (CAS). Stellen Sie sicher, dass der Abfallbehälter leer ist. Überprüfen Sie, ob sich Wasser in der Luftbefeuchtersäule befindet.
2. Navigiere zum Workflow-Panel. Öffne den Full Clean-Workflow (vorinstalliert während der Systeminstallation).
   HINWEIS: Es wird empfohlen, den Full Clean-Workflow innerhalb von 72 Stunden nach Beginn eines Experiments auf dem Instrument durchzuführen.
3. Führen Sie alle Prüfungen durch und klicken Sie auf Start. Auf Nachfrage tauschen Sie die konischen Röhrchen und Reagenzienflaschen in jedem der Reagenzbucht-Schächte gegen frische Behälter mit BLI-Reinigungslösung aus. Klicken Sie auf das Ausführen-Symbol , um fortzufahren.
4. Tauschen Sie bei Aufforderung die konischen Schläuche und Reagenzienflaschen in jedem der Reagenzbucht-Slots durch frische Behälter durch steriles Wasser aus. Klicken Sie auf das Ausführen-Symbol , um fortzufahren.
5. Öffnen Sie den Pre-Flight Check-Workflow (vorinstalliert während der Systeminstallation). Führen Sie alle Prüfungen durch und klicken Sie auf Start.
6. Bereiten Sie ein 50 ml konisches Rohr mit 2 ml Benetzungslösung vor. Bereiten Sie ein separates 50 mL konisches Rohr mit 39,6 mL 1x DPBS und 400 μL Benetzungsadditiv vor.
7. Wenn du aufgefordert wirst, ersetze den Flush-Chip durch einen Optofluidik-Chip. Klicken Sie auf das Ausführen-Symbol , um fortzufahren. Reinigen Sie sorgfältig die Oberfläche des Optofluidikchips und der Nest-Ferrulen mit 70 % Ethanol, bevor Sie die Nester schließen.
8. Tauschen Sie bei Aufforderung die konischen Röhrchen und Reagenzienflaschen in jedem der Reagenzienschacht-Schlitze gegen frische Behälter mit den passenden Lösungen aus.

6. Erstellung von Assay-Workflows

1. Navigiere zum Workflow-Panel. Wählen Sie Neuen Workflow erstellen (+), wählen Sie Opto T-Zellprofilierung und dann MCA und Zytotoxizitätstest im Dropdown-Menü.
2. Doppelklicken Sie auf Multiplex Cytokine Bead Load, um die Bead-Load-Liste zu erweitern. Wenn weniger als 3 Zytokinziele getestet werden, klicken Sie auf das X , um die Zytokinperle(n) aus der Ladungsliste zu löschen.
3. Aktualisieren Sie jedes Feld mit dem passenden Perlentyp, dem Zytokinziel und dem Importort.
   HINWEIS: Die CAS-Software lädt automatisch jede Zytokin-Aufnahmekugel in der Reihenfolge der abnehmenden Cy5-Helligkeit, unabhängig davon, wie die Einträge für das Laden der Kugeln angeordnet sind.
4. Doppelklick auf Priorisierte APC-Last mit Kontrolle , um die Zielzellen-Lastliste zu erweitern. Wenn mehr als eine Kontroll-Ziel-Zelle und eine Proben-Zielzell-Linie getestet werden, fügen Sie zusätzliche Zell-Ladeschritte hinzu.
5. Aktualisieren Sie jedes Feld mit dem gewünschten Zielzell-Zeilennamen, dem gewünschten Sichtfeld (FOVs) in den Buchstaben und den APC-Auswahlkriterien (indem Sie die Ziel-Pen-Auswahl-(TPS)-Vorlage angeben).
6. Wählen Sie T-Zellen-Lastkonfiguration und wählen Sie mehrere Zellleitungen. Doppelklicke auf Priorisierte T-Zellen-Last, um die T-Zellen-Lastliste zu erweitern.
7. Aktualisieren Sie jedes Feld mit dem gewünschten T-Zell-Liniennamen, den gewünschten FOVs zum Speichern und den T-Zell-Auswahlkriterien (indem Sie die TPS-Vorlagendatei angeben).
8. Doppelklicken Sie auf den Zytotoxizitätstest, um die Einstellungen des Zytotoxizitätstests zu erweitern. Aktualisieren Sie die workflow-spezifischen Bildeinstellungsfelder mit der gewünschten Assay-Dauer (h).
9. Doppelklick-Phänotyp- und Zytokin-Assays zur Erweiterung des Färbungsprotokolls für den Zytokinsekretionstest.
10. Aktualisieren Sie die On Chip Staining-Felder mit dem passenden Importort für die Primär- und Sekundärfarbe.
11. Doppelklicke auf T-Zellen-Entladen , um die Entladeliste zu erweitern. Aktualisieren Sie das Feld # der Exporte pro Chip (einschließlich Blanks) auf die gewünschte Anzahl der Exporte. Speichere und öffne den neu erstellten Workflow.

7. Zytokin-Capture-Perlenlast

1. Sonicate und/oder wirbel jedes Perlenfläschchen, um die Fangperlen vollständig wieder aufzuhängen. Bestimmen Sie die Perlenkonzentration über einen Zellzähler.
2. Stellen Sie die Perlendichte auf 4,5 x 10^{6 Perlen} /mL (Typ A Perlen) oder 4 x 10^{6 Perlen} /mL (Typ B Perlen) in 30 μL Perlenverdünnungspuffer ein.
3. Lagern Sie die Perlensuspensionen bei 4 °C, bis Sie aufgefordert werden, in die Probenladebucht zu laden. Führen Sie alle Prüfungen durch und klicken Sie auf Start.
4. Auf Aufforderung mischen Sie die Zytokin-Perlenfederung mit einer 20-μL-Pipette und laden Sie die Perlenfederung an die entsprechende Importstelle. Klicken Sie auf das Ausführen-Symbol , um fortzufahren.
5. Wenn aufgefordert wird, inspizieren Sie mehrere Sichtfelder visuell, um sicherzustellen, dass die Fangkugeln mit einer gleichmäßigen Verteilung über die fluidischen Kanäle bei angemessener Dichte geladen wurden. Wenn die Ladeverteilung und/oder Dichte suboptimal war, wähle Flush und Import, um erneut das Laden der Wulst zu versuchen. Wenn die Lastverteilung und Dichte ausreichend waren, wählen Sie Fahren, um mit dem Penning von Perlen zu beginnen.
6. Wiederholen Sie Schritt 7.3 für jede Zytokin-Fangkugel.

8. Zielzellenlast

1. Bestimmen Sie die Dichte der lebenden Zellen jeder Zielzelllinie mittels Trypan Blue-Färbung.
   HINWEIS: Dieser Workflow geht davon aus, dass die Zielzellen aus aktiven Kulturen stammen. Wenn stattdessen kryokonservierte Zellen verwendet werden sollen, stellen Sie sicher, dass die Zellen mindestens einen Durchgang nach dem Auftauen kultiviert wurden und zu mindestens 90 % lebensfähig sind.
2. Entnehmen Sie 1 x 10^{6 Zielzellen} in ein 1,7-mL Mikrofugerohr. Zentrifugiere mit 300 x g für 5 Minuten bei RT. Sauge das Supernatant ab.
3. Jedes Zielzell-Pellet wird in 100 μL Annexin-V-Färbelösung erneut suspendiert. Inkubiere 30 Minuten bei RT, geschützt vor Licht.
4. Füge 400 μL 1x Annexin V Bindungspuffer hinzu und suspendiere sie durch Pipettieren wieder. Zentrifugiere mit 300 x g für 5 Minuten bei RT. Sauge das Supernatant ab.
5. Jede Zielzell-Pellet in 250 μL Lademedium + CaCl₂ wieder suspendieren. Lagern Sie die Zielzellen-Suspensionen bei 4 °C, bis Sie aufgefordert werden, in die Ladebucht der Proben zu laden.
6. Wenn aufgefordert wird, werden die Zielzellen mit einer 200-μL-Pipette wieder suspendiert und die Zielzellensuspension an den entsprechenden Importort geladen. Klicken Sie auf das Ausführen-Symbol , um fortzufahren.
7. Wenn Sie aufgefordert werden, inspizieren Sie mehrere Sichtfelder visuell, um sicherzustellen, dass die Zielzellen mit einer gleichmäßigen Verteilung über die fluidischen Kanäle mit angemessener Dichte belastet wurden. Wenn die Lastverteilung und/oder Dichte suboptimal waren, wählen Sie Flush und Import, um erneut eine Zielzellenladung zu versuchen. Wenn die Lastverteilung und -dichte ausreichend waren, wählen Sie Fahren, um mit dem TPS-Gating zu beginnen.
8. Wenn du aufgefordert wirst, gehe zu Manuelle Operationen, klicke dann auf TPS und lade die gewünschte TPS-Vorlage.
9. Geben Sie die optischen Filter und FOVs an, die abgebildet werden sollen, um TPS-Gatter zu definieren, und klicken Sie dann auf Nur aufnehmen , um die Bildaufnahme zu starten.
10. Öffnen Sie den Gating Configuration Editor, klicken Sie auf das Kontrollkästchen für Annexin und wählen Sie den entsprechenden Kanal für Annexin V Staining für den X-Parameter aus. Im Dropdown-Menü wählen Sie Log (Delta Median Brightness) aus. Wählen Sie OEP für den Y-Parameter. Im Dropdown-Menü wählen Sie Nächster Nachbar.
11. Ziehe die Ecken des resultierenden Gatters, um Annexin V^Hi und Nearest Neighbor^low Cells auszuschließen, und speichere dann die TPS-Vorlage, ohne den Dateinamen zu ändern.
12. Gehen Sie zurück zu Workflows und klicken Sie auf Weitermachen , um mit dem Schreiben fortzufahren. Wiederholen Sie die Schritte 8.7-8.11 für jede Zielzelllinie.

9. T-Zelllast

1. Bestimmung der lebenden Zelldichte jeder T-Zelllinie mittels Trypan Blue-Färbung.
   HINWEIS: Dieser Workflow geht davon aus, dass die T-Zellen aus aktiven Kulturen stammen. Wenn stattdessen kryokonservierte Zellen verwendet werden sollen, stellen Sie sicher, dass die Zellen über Nacht nach dem Auftauen kultiviert wurden und mindestens zu 90 % lebensfähig sind.
2. Entnehmen Sie 1 x 10 6-T-Zellen in ein 1,7-ml-Mikrofugerohr. Zentrifugiere mit 300 x g für 5 Minuten bei RT. Sauge das Supernatant ab.
3. Jedes Zielzell-Pellet wird in 100 μL Annexin-V-Färbelösung erneut suspendiert. Inkubiere 30 Minuten bei RT, geschützt vor Licht.
4. Füge 400 μL 1x Annexin V Bindungspuffer hinzu und suspendiere sie durch Pipettieren wieder. Zentrifugiere mit 300 x g für 5 Minuten bei RT. Sauge das Supernatant ab.
5. Jedes T-Zell-Pellet in 250 μL Lademedium + CaCl₂ wieder suspendieren. Lagern Sie die T-Zell-Suspensionen bei 4 °C, bis Sie aufgefordert werden, in die Probenladebucht zu laden.
6. Auf Aufforderung wird die Zielzelle mit einer 200-μL-Pipette wieder aufgehängt und die T-Zellen-Suspension an die entsprechende Importposition geladen. Klicken Sie auf das Ausführen-Symbol , um fortzufahren.
7. Auf Anfrage inspizieren Sie mehrere Sichtfelder visuell, um sicherzustellen, dass die T-Zellen mit einer gleichmäßigen Verteilung über die fluidischen Kanäle bei entsprechender Dichte belastet wurden. Wenn die Lastverteilung und/oder Dichte suboptimal waren, wähle Flush und Import, um erneut die T-Zellen-Last zu versuchen. Wenn die Lastverteilung und -dichte ausreichend waren, wählen Sie Fahren, um mit dem TPS-Gating zu beginnen.
8. Wenn du aufgefordert wirst, gehe zu Manuelle Operationen, klicke dann auf TPS und lade die gewünschte TPS-Vorlage.
9. Geben Sie die optischen Filter und FOVs an, die abgebildet werden sollen, um TPS-Gatter zu definieren, und klicken Sie dann auf Nur aufnehmen , um die Bildaufnahme zu starten.
10. Öffnen Sie den Gating Configuration Editor, klicken Sie auf das Kontrollkästchen für Annexin und wählen Sie den entsprechenden Kanal für Annexin V Staining für den X-Parameter aus. Im Dropdown-Menü wählen Sie Log (Delta Median Brightness) aus. Wählen Sie OEP für den Y-Parameter. Im Dropdown-Menü wählen Sie Nächster Nachbar.
11. Ziehe die Ecken des resultierenden Gatters, um Annexin V^Hi und Nearest Neighbor^low Cells auszuschließen, und speichere dann die TPS-Vorlage, ohne den Dateinamen zu ändern.
12. Gehen Sie zurück zu Workflows und klicken Sie auf Weitermachen , um mit dem Schreiben fortzufahren. Wiederholen Sie die Schritte 9,7–9,11 für jede T-Zelllinie.

10. Zytotoxizitätstest

1. Bereiten Sie Perfusionsmedien in einem 50 mL konischen Rohr vor, indem Sie 100 μL voraufgetautes NucView 530 Caspase-3-Reagenz zu 20 mL T-Zell-Medien (Lagerkonzentration 1 mM, Endkonzentration 5 μM) hinzufügen.
2. Wenn aufgefordert, tauschen Sie das entsprechende konische Rohr in den Reagenzschlitzen durch das vorbereitete konische Rohr mit Perfusionsmedium aus. Klicken Sie auf das Ausführen-Symbol , um fortzufahren.
   HINWEIS: 20 mL Perfusionsmedium reichen aus, um einen einzelnen Optofluidikchip für 24 Stunden zu perfundieren. Bereiten Sie zusätzliches Perfusionsmedium vor, wenn der Zytotoxizitätstest länger als 24 Stunden dauern soll.
3. Falls gewünscht, beenden Sie alle verbleibenden Zytotoxizitäts-Assay-Bildgebungsschritte zu jedem Zeitpunkt nach 14 Stunden, indem Sie auf Remain of TPS Imaging überspringen klicken und mit dem Workflow fortfahren.

11. Phänotyp- und Zytokin-Test

1. Bereiten Sie die primäre Färbungslösung in einem 1,7-mL Mikrofuge-Röhrchen vor, indem Sie 76 μL Multiplex-Human CD8/NK Panel Detection Antibodies und 4 μL Anti-CD137_BV421 mischen.
2. Mischen Sie durch Pipetten und lagern Sie bei 4 °C, bis Sie zum Laden aufgefordert werden. Auf Nachfrage mischen Sie die primäre Färbelösung mit einer 20-μL-Pipette und laden Sie sie an die entsprechende Importstelle. Klicken Sie auf das Ausführen-Symbol , um fortzufahren.
3. Bereite die sekundäre Färbungslösung in einem separaten 1,7-mL-Mikrofugerohr vor, indem 72 μL 1x DPBS mit 8 μL des Multiplex-Kit SA-PE gemischt werden.
   HINWEIS: Die Sekundärfärbungslösung sollte im Voraus vorbereitet werden, sodass sie sofort nach Abschluss der Primärfärbung geladen werden kann.
4. Mischen Sie durch Pipetten und lagern Sie bei 4 °C, bis Sie zum Laden aufgefordert werden. Auf Aufforderung mischen Sie die sekundäre Färbelösung mit einer 20-μL-Pipette und laden Sie sie an die entsprechende Importstelle. Klicken Sie auf das Ausführen-Symbol , um fortzufahren.

12. Assay-Analyse

1. Navigiere zum Desktop und öffne die Assay Analyzer-Software . Wählen Sie Assay Analyzer, wählen Sie Workflows und dann den zu analysierenden Workflow-Typ.
2. Verwenden Sie beliebige Kriterien, um die Interessenspunkte für das Entladen zu definieren. Erstellen Sie die Entlastungsliste gemäß den gewünschten Kriterien, kehren Sie dann zur CAS-Software zurück und wählen Sie den ausgewählten Workflow fortsetzen.
3. Überprüfen Sie, ob das Kästchen für die Create Export-Liste mit dem Assay Analyzer aktiviert ist: [Optofluidics Chip ID] angekreuzt.

13. Entladen

1. Bereiten Sie eine 96-Well-Platte mit rundem Boden mit 50 μL T-Zell-Medium pro Bohrloch vor. Klicken Sie auf Fortsetzen , um mit dem Entladen der Zelle fortzufahren.
2. Wenn du aufgefordert wirst, öffne die Chip-Ladebucht, öffne den Nest-Deckel und entferne den Optofluidik-Chip. Platzieren Sie den Chip in eine sterile Petrischale, wobei die obere Kante des Optofluidikchips >1° angehoben ist, um zu verhindern, dass die Zellen aus den Stiften herausrollen. Lagern Sie während des folgenden Spülungsschritts in einem sterilen Gewebekultur-Inkubator.
3. Setzen Sie einen sterilen Flush-Chip in das leere Nest, schließen Sie den Nestdeckel und schließen Sie dann die Chip-Schacht. Klicke auf Fertig und dann auf Fortsetzen.
4. Wenn du aufgefordert wirst, öffne die Chip-Ladebucht, öffne den Nest-Deckel und entferne den Flush-Chip. Setze den Optofluidik-Chip in das leere Nest, schließe den Nestdeckel und schließe dann den Chipschacht. Klicken Sie auf das Lauf-Symbol, um fortzufahren.
5. Wenn Sie aufgefordert werden, wählen Sie Öffnen , um das Menü "Laden/Entladen der Brunnenplatte" anzuzeigen. Klicken Sie auf Unload, um die vorherige Platte zu entfernen. Aktualisieren Sie die Bohrlochplatten-ID und den Bohrlochplattentyp, wählen Sie Laden und dann Fertig.
6. Klicken Sie auf Fortsetzen , um mit dem Entladen der Zelle fortzufahren. Sobald alle gewünschten Stifte entladen sind, navigieren Sie zu Manuelle Operationen und öffnen Sie den Chipschacht, um die Platte mit den interessierenden Zellen herauszuholen.

Results

Mit dem beschriebenen Protokoll haben wir einzelne Mock-Nukleofect-, CAR- und c-Jun-überexprimierende CAR-T-Zellen mit entweder antigen-negativen oder antigen-positiven Figur 3 K562-Tumorzellen herausgefordert oder sie unstimuliert (nur T-Zellen) gelassen. Zielzellen wurden auf ihre homogene Expression des Antigens als Voraussetzung für reproduzierbare Ergebnisse bewertet (ergänzende Abbildung 3). Durch ihre Isolierung in einzelnen Nanopen konnten wir die Zytokin-Expressionsprofile dieser Zellen je nach getesteter Bedingung als Einzel-, Doppel- oder Dreifachproduzenten charakterisieren (Abbildung 3). Diese Ergebnisse wurden mit ELISA als etablierter Methode zur Zytokindetektion verifiziert (ergänzende Abbildung 4).

Wie erwartet blieb die Mehrheit der simulierten T-Zellen negativ für alle drei gemessenen Zytokine (TNF-α, IFN-γ und IL-2). Unter den Standard-CAR-T-Zellen wurden doppelte, dreifache und einzel-positive IFN-γ-Zytokinproduzenten sowie kleine Teile von TNF-α- und IL-2-sekretierenden Zellen bei Antigen-Herausforderung nachgewiesen, während die Exposition gegenüber antigennegativen Tumorzellen keine multizelluläre Zytokinsekretion induzierte. Interessanterweise erhöhte die Überexpression von c-Jun den Anteil der Doppel- und Dreifach-Zytokin-Produzenten sowie der einzeln zytokinsekretierenden Zellen bei der Begegnung mit dem Ziel, wodurch der Gesamtanteil der zytokinnegativen Zellen im Vergleich zu Standard-CAR-T-Zellen reduziert wurde. Diese Ergebnisse stimmen mit früheren Berichten überein, die die phänotypische Modulation von CAR-T-Zellen durch erzwungene Expression dieses Transkriptionsfaktors⁶ beschrieben. Bemerkenswert ist, dass wir in der T-Zell-Only-Gruppe einen größeren Anteil an IFN-γ-positiven Zellen beobachteten als in der antigen-negativen Tumorzellgruppe, was möglicherweise auf die geringere Anzahl analysierter Zellen in diesem Zustand zurückzuführen ist.

Um die T-Zellaktivierung weiter zu untersuchen, untersuchten wir die Expression von CD137 in einzelnen mock-nukleofekten, CAR- und c-Jun-überexprimierenden CAR-T-Zellen, die wie oben beschrieben behandelt wurden (Abbildung 4 und ergänzende Tabelle 1). Die Herausforderung von CAR-T-Zellen mit antigenexprimierenden K562-Zielzellen führte zu einer erhöhten CD137-Expression im Vergleich zu Mock-Nukleofect-Zellen. Darüber hinaus beobachteten wir einen Trend zu einem etwas höheren Anteil CD137-positiver Zellen unter c-Jun-überexprimierenden CAR-T-Zellen im Vergleich zum Standardprodukt CAR.

Abschließend ermöglichte das beschriebene Protokoll die Bewertung der Zytokinsekretion und Aktivierung von CAR-T-Zellen auf Einzelzellebene, wodurch die Identifizierung einzelner und mehrzelliger Zytokinproduzenten und die repapitulierten phänotypischen Trends auf Bulk-Ebene⁶ möglich waren.

Abbildung 1: Schaltplan-Workflow für multimodale Profilierung über eine optofluidische Plattform. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 2: Repräsentative Bilder verschiedener Funktionen der Optofluidik-Plattform. (A) Importiere die Sequenz der einzelnen Partikel in einzelne Stifte über OEP. Die Stifte im linken Teil der Bilder wurden in der vorherigen Reihenfolge geladen. (B) Tötungsereignisse in drei einzelnen Federn über die Zeit, wobei GFP-exprimierende, antigenexprimierende Tumorzellen gezeigt werden. (C) Export einer einzelnen Zelle aus einem Stift über OEP. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 3: Repräsentative Analyse von Cytokinsekretionsprofilen auf Einzelzellebene. Einzelne mock-nukleofectierte T-Zellen oder CAR-T-Zellen wurden in Anwesenheit oder Abwesenheit von antigen-negativen oder antigen-positiven K562-Tumorzellen in Nanopenen kultiviert, die Zytokin-Capture-Perlen für TNF-α, IL-2 und IFN-γ enthielten. Piediagramme zeigen die Anteile der analysierten einzeln geschriebenen CAR-T-Zellen mit dem angezeigten Cytokinsekretionsprofil nach 24 Stunden Kokultur (Endpunktanalyse). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 4: Repräsentative Analyse der CD137-Expression auf Einzelzellebene. Einzelne mock-nukleofectierte T-Zellen oder CAR-T-Zellen wurden auf dem Optofluidik-Chip auf CD137-Oberflächenexpression gefärbt, 24 Stunden nach der Kultur in Anwesenheit oder Abwesenheit von antigennegativen oder antigenpositiven K562-Tumorzellen. Violin-Diagramme zeigen die Fluoreszenzintensität der CD137-Expression auf mock-nukleofectierten T-Zellen und CAR-T-Zellen nach 24 Stunden Kultur. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

T-Zell-Mediumkomponenten (steril gefiltert mit 0,22μM Vakuumfiltereinheiten)	Lautstärke (Endkonzentration)
RPMI-1640 (1x GlutaMAX, 25mM HEPES)	500 mL
Penicillin/Streptomycin (10.000 U/mL)	5 mL (90 U/mL)
β-Mercaptoethanol (50 mM)	0,5 mL (45μM)
Menschliches Serum (hitze-inaktiviert)	50 mL (9 %)
GlutaMAX-Supplement (100x)	5 ml (0,9x)
Komponenten des Tumorzellmediums	Lautstärke (Endkonzentration)
RPMI-1640 (1x GlutaMAX, 25mM HEPES)	500 mL
Penicillin/Streptomycin (10.000 U/mL)	5 mL (90 U/mL)
Fetales Kalbserum (hitzeinaktiviert)	50 mL (9 %)
MACS-Pufferkomponenten	Lautstärke (Endkonzentration)
DPBS (Mg2+-frei, Ca2+-frei)	500 mL
Fetales Kalbserum (hitzeinaktiviert)	2,5 mL (0,5 %)
EDTA (0,5 M)	2 mL (2 mM)
PBS/EDTA-Pufferkomponenten	Lautstärke (Endkonzentration)
DPBS	500 mL
EDTA (0,5 M)	2 mL (2 mM)
Komponenten des Lademediums	Lautstärke (Endkonzentration)
T-Zell-Medium	18 mL
Ladereagenz	2 mL
Lademedien+CaCl2-Komponenten	Lautstärke (Endkonzentration)
Lademedien	499 μL
CaCl2	1,25 μL
Perfusionsmedien+Caspase-Substrat	Lautstärke (Endkonzentration)
T-Zell-Medium	20 mL
NucView 530 Caspase-3 Substrat (1 mM in DMSO)	100 μL
Komponenten des Perlenverdünnungspuffers	Lautstärke (Endkonzentration)
DPBS	800 μL
BSA (2 % w/v)	100 μL (0,2 % W/V)
Tween-20 (10 % mit Alkoholik)	10 μL (0,1 % w/v)

Tabelle 1: Medien- und Puffervorbereitung.

Ergänzende Abbildung 1. Beispielhafte Gating-Strategie zur Bewertung der Genübertragungseffizienz vor der magnetischen Anreicherung. Beispielhafte Kontur- und Histogrammdiagramme zeigen die Gating-Strategie zur Identifizierung von CAR-exprimierenden (tEGFR-positiven) CAR-T-Zellen nach dem Gentransfer. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 2. Reinheitskontrolle nach der Sortierung. Beispielhafte Konturdiagramme zeigen den Anteil der CAR-exprimierenden (tEGFR-positiven) CAR-T-Zellen nach der Durchführung der magnetischen Sortierung. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 3. Antigenexpression an Zieltumorzellen. Repräsentative Histogrammdiagramme zeigen WT-K562-Tumorzellen oder sind so konstruiert, dass sie ROR1 exprimieren, gefärbt mit Isotyp- oder ROR1-Zielantikörpern mittels Durchflusszytometrie. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 4. Zytokin-Detektion mit Standard-ELISA. IL-2 und IFN-γ Konzentrationen im Supernatant nach 24 Stunden Kokultivierung mit K562^{ROR1-Tumorzellen} bei E:T von 4:1, gemessen mittels ELISA für CAR vs. CAR+cJ T-Zellen. Statistische Signifikanz, bestimmt durch einen ungepaarten t-Test mit *P≤ 0,05, **P≤ 0,01, ***P≤ 0,001, ****P≤ 0,0001. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Tabelle 1: Analysierte Zellen. Die Tabelle zeigt die Anzahl der einzelnen analysierten Zellen pro Zustand. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Discussion

Der nachgewiesene Arbeitsablauf ermöglicht die Bewertung des Zytokinsekretions- und Aktivierungsprofils einzelner CAR-T-Zellen während der Kokultur mit antigenpositiven und antigennegativen Zielzellen, die optional mit der Bewertung der zytolytischen Aktivität kombiniert werden können. Während die Fähigkeit, multimodale funktionale Daten mit Einzelzellauflösung zu erfassen, eine Möglichkeit bietet, die Leistung von CAR-T-Zellen mit beispielloser Präzision zu analysieren, hängt die Quantifizierbarkeit der Messungen stark von der Genauigkeit der OEP-Technologie ab, die in jedem Behälter die gleiche Anzahl von Zytokin-Fangkugeln, Zielzellen und CAR-T-Zellen lädt. Daher ist es entscheidend sicherzustellen, dass die Belastungsdichte und die TPS-Kriterien jedes Reagens oder jeder Zellprobe optimiert sind, um eine Einzelkugel- und/oder Einzelzellladung in jedem Stift zu ermöglichen. Während die Anpassung der Konzentration der Perle oder Zellsuspension in den fluidischen Kanälen eine ausreichende Pen-Belegung ermöglicht, dienen die Flush- und Import-Optionen der Plattform als zusätzliche Strategie, um den Ladeprozess erneut zu versuchen.

Ein vorteilhaftes Merkmal des Optofluidik-Chipdesigns ist die Aufteilung des Stiftlayouts in 22 verschiedene Sichtfelder. Durch das Laden von T-Zellen, die mit verschiedenen CAR-Konstrukten konstruiert wurden, in unterschiedliche FOVs innerhalb des Optofluidik-Chips konnten wir auch bewerten, ob ein alternatives Konstrukt, das die c-Jun-Überexpression durchsetzt, die Erzeugung von CAR-T-Zellen mit multimodaler Funktionalität im Vergleich zu einem Standard-CAR-Konstrukt verbessern könnte (Abbildung 3 und Abbildung 4). Auf diese Weise bietet eine optofluidische Plattform Möglichkeiten, Kandidaten-CAR-Konstrukte schnell zu identifizieren, die das Potenzial haben, die Haltbarkeit der CAR-T-Zell-induzierten Krebsremission zu erhöhen. Bemerkenswert ist, dass die Analyse der Interaktion zwischen Ziel- und Effektorzellen auf Einzelzellebene eine entscheidende Kontrolle wichtiger Parameter erfordert, z. B. die Heterogenität der Zielantigenexpression auf Tumorzellen und die Reinheit der CAR-T-Zellpopulation (ergänzende Abbildung 2 und ergänzende Abbildung 3).

Obwohl wir uns auf die Bewertung der Sekretion von IL-2, TNF-α und IFN-γ konzentriert haben, ermöglicht das breite Spektrum löslicher Analyte, die mit kommerziell erhältlichen Multiplex-Zytokin-Capture-Panels nachgewiesen werden können, eine erhebliche Individualisierung des Arbeitsablaufs. Jüngste Entwicklungen zeigen, dass sich das Fachgebiet auch in Richtung hochdimensionaler Durchflusszytometrie entwickelt und neue Möglichkeiten für Synergien mit funktioneller Profilierung verschiedener Immunzelltypen^{eröffnet 12,13}. Beispielsweise könnten zukünftige Anwendungen Screening-Kampagnen zur Identifizierung polyfunktionaler CAR-exprimierender regulatorischer T-Zellen (Tregs) umfassen. Diese sezernieren mehrere entzündungshemmende Zytokine wie TGF-β und IL-10-14. Daher könnte die Anpassungsfähigkeit eines optofluidischen Systems den Weg für entscheidende Erkenntnisse ebnen, da zelluläre Immuntherapien neue Grenzen in der Behandlung nicht-bösartiger Erkrankungen erreichen.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
4D-Nukleofektor	Lonza
Anti-Biotin-Mikroperlen	Miltenyi Biotec	130-090-485
CD3/CD28 Dynabeads	Thermo Fisher	11131D
CD8+ T-Zell-Isolationsset	Miltenyi Biotec	130-096-495
CELLSTAR 15-ml-konische Röhren (PP)	Greiner Bio-One	188271-N
CELLSTAR 50-ml-konische Röhren (PP)	Greiner Bio-One	227261
Corning 75cm² U-förmiger schräger Hals-Zellkulturkolben mit Stopfendichtungskappe	Corning	430720U
Costar 24-Wells Clear TC-behandelte Mehrfachbrunnenplatten, einzeln umwickelt, steril	Corning	3526
Costar 48-Wells Clear TC-behandelte Mehrfachbrunnenplatten, einzeln umwickelt, steril	Corning	3548
DPBS, kein Kalzium, kein Magnesium	Thermo Fisher	14190169
DynaMag-15 Magnet	Thermo Fisher	12301D
EGFR (Erbitux, Cetuximab)	Eli Lilly	NDC 66733-948-23	für die Hauskonjugation (Biotin)
EGFR-Antikörper (C225 (Cetuximab)) [Alexa Fluor 647]	Novus Biologicals	NBP2-75903AF647
Fetales Rinderserum, Wert	Thermo Fisher	A5256801
GlutaMAX-Supplement (100x)	Thermo Fisher	35050038
Menschliches IL-2 IS, Premiumqualität	Miltenyi Biotec	130-097-748
Menschliches Serum	Deutsches Rotes Kreuz (DRK) / Deutsches Rotes Kreuz (GRC)	N/A
MACS-Zelltrennspalte, LS	Miltenyi Biotec	130-042-401
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-042-303
P3 Primärzelle 4D-Nukleofektor X Kit	Lonza	V4XP-3032
Pancoll Mensch, Dichte: 1,077 g/ml	PanBiotech	P04-60500
PE Annexin V Apoptose-Detektionsset I	BD Biosciences	559763
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml)	Thermo Fisher	15140122
Pierce-Zelloberflächen-Biotinylierungs- und Isolations-Kit	Thermo Fisher	A44390
QuadroMACS Startkit (LS)	Miltenyi Biotec	130-091-051
RPMI 1640 Medium, Glutamax Supplement, HEPES	Thermo Fisher	72400054
Serologische Pipetten 2, 5, 10, 25 und 50 ml	Greiner Bio-One	710180, 606180, 607180, 760180, 768180
Trypan Blue Stain (0,4 %)	Thermo Fisher	15250-061
UltraPure 0,5  M EDTA, pH 8,0	Thermo Fisher	15575020
Β-Mercaptoethanol (50 mM)	Thermo Fisher	31350010
Leuchtfeuer-Reagenzien
96-Bohrloch-Platte mit rundem Boden	Corning	3799
Beacon Plastic Flush Chip		500-00030
BLI-Reinigungslösung, Natriumhypoklout, 0,825 %	Bruker	520-08000
Rinderserum-Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A4161
Brilliant Violet 421 anti-menschlicher CD137 (4-1BB) Antikörper	Biolegende	309820
Calciumchlorid (CaCl2)	Sigma-Aldrich	C5670
LEGENDplex Human IFN-γ Fangkugeln B3, 13X	Biolegende	740545
LEGENDplex Human IL-2 Fangkugel A5, 13X	Biolegende	740934
LEGENDplex Antikörper gegen Erkennung menschlicher Th-Panels V02	Biolegende	741041
LEGENDplex Human TNF-α Capture Perle B7, 13X	Biolegende	740711
LEGENDplex SA-PE	Biolegende	740452
NucView 530 Caspase-3 Substrat, 1 mM in DMSO	Hö lzel	B-10406
OptoSelect Chip 3500	Bruker	500-12001
Natriumazid	Sigma-Aldrich	S2002
ZZEHN 20	Sigma-Aldrich	P1379
Veganer Exportpuffer	Bruker	520-00040
VWR Media Bottles, Square, PETG, 125 ml	VWR	216-2265
VWR Media Bottles, Square, PETG, 500ml	VWR	216-2267
Benetzungsadditiv	Bruker	520-08016
Benetzungslösung	Bruker	520-00009