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Methodenartikel

Therapeutische Wirkung von Acorus calamus L. Extrakt auf strahlenbedingte Hautverletzungen in einem Rattenmodell

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DOI:

10.3791/69705

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9. Januar 2026

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1Department of Nuclear Medicine, General Hospital of Northern Theater Command, 2College of Medicine and Biological Information Engineering, Northeastern University, 3Shenzhen Institute for Advanced Study, University of Electronic Science and Technology of China

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Strahlenbedingte Hautverletzungen sind eine häufige und schwerwiegende Komplikation der Strahlentherapie bei Krebspatienten. Es gibt keine wirksame klinische Behandlung. Dieses Protokoll bewertet die therapeutische Wirkung des Acorus calamus L.-Extrakts auf strahlenbedingte Hautverletzungen mit dem Ziel, neue Wirkstoffkandidaten und therapeutische Strategien für die klinische Prävention und Behandlung bereitzustellen.

Zusammenfassung

Strahlenbedingte Hautverletzungen sind eine häufige und lähmende Komplikation in der Krebstherapie, die oft zu verzögerter Wundheilung und verstärkter Beschwerden beim Patienten führt. Es gibt einige therapeutische Medikamente zur Prävention oder Behandlung. Die traditionelle chinesische Medizin, insbesondere Acorus calamus L., hat Potenzial bei der Behandlung verschiedener Hauterkrankungen gezeigt, doch ihre Wirksamkeit bei strahlenbedingten Hautschäden ist noch wenig erforscht.

Diese Studie verwendete ein Sprague-Dawley-Rattenmodell, das 45-Gy-Strahlung ausgesetzt war, um Hautschäden zu induzieren. Die Ratten wurden 45 Tage lang mit 10 %, 20 % und 40 % Acorus calamus L. Extrakt behandelt. Wundheilung, Entzündung, Apoptose und Angiogenese wurden anhand von Wundheilungsraten, histopathologischer Analyse, Zytokinmessungen, TUNEL-Färbung und Immunhistochemie bewertet. Die Behandlung mit Acorus calamus L. beschleunigte die Wundheilung, wobei die Gruppe mit mittlerer Dosis die höchste Heilungsrate zeigte (88,97 % nach 45 Tagen). Die histopathologische Analyse zeigte eine verminderte Entzündung, eine verbesserte Kollagenorganisation und die Bildung neuer Blutgefäße. Die Serumspiegel der entzündlichen Zytokine (IL-1β, IL-6, TNF-α) waren signifikant reduziert, und die Apoptose war mit Modulation wichtiger apoptotischer Proteine (P53, Bax, Bcl-2) verringert. Die Expression von VEGF und bFGF wurde hochreguliert, was die Angiogenese und Gewebereparatur förderte. Acorus calamus L. fördert die Heilung strahlenbedingter Hautverletzungen, indem er Entzündungen reduziert, Apoptose hemmt und Angiogenese fördert. Diese Ergebnisse deuten auf sein Potenzial als therapeutisches Mittel zur Behandlung strahlenbedingter Hautschäden hin und bieten eine vielversprechende Alternative zur Behandlung strahlenbedingter Hautverletzungen in der klinischen Onkologie. Weitere Studien sind erforderlich, um seine molekularen Mechanismen zu klären.

Einleitung

Strahlenbedingte Hautverletzungen sind eine häufige und schwierige Komplikation sowohl bei Nuklearunfällen als auch bei Tumorstrahlentherapie1. Bei der Strahlentherapie entwickeln etwa 95 % der Patienten eine gewisse Hautschädigung, darunter Erythem, Entschädigung, wiederkehrende nekrotische Geschwüre, anhaltende Schmerzen und ein erhöhtes Risiko für eine bösartige Progression2. Diese Läsionen sind oft therapieresistent, verringern die Lebensqualität der Patienten erheblich und erfordern manchmal eine Unterbrechung der Strahlentherapie, was eine große klinische Herausforderung in der Strahlenonkologiedarstellt. Die zugrunde liegenden Mechanismen der durch Strahlung verursachten Hautschäden sind komplex und beinhalten hauptsächlich die Produktion freier Radikale im Hautgewebe, die zelluläre Prozesse stören und den Heilungsprozess verschärfen 4,5. Dies führt zu einer verlängerten Expression von apoptose-bezogenen Genen, dysregulierten Entzündungsreaktionen und veränderten Signalwegen, die alle zur anhaltenden Natur der strahleninduzierten Wunden beitragen6.

Derzeit gibt es keine allgemein anerkannte Goldstandardtherapie für strahlenbedingte Hautverletzungen. Die klinische Behandlung legt Wert auf entzündungshemmende oder antioxidative Ansätze7, insbesondere topische Kortikosteroide, die Hautreaktionen durch entzündungshemmende, immunsuppressive und vasokonstriktive Effekte reduzieren, aber bei längerer Anwendung Hautverdünnung verursachen können8. Amifostin, ein von der FDA zugelassenes Radioschutzmittel, ist in der klinischen Anwendung aufgrund erheblicher Nebenwirkungenbegrenzt 9. Wachstumsfaktoren beschleunigen die Wundheilung, indem sie Zellproliferation, Angiogenese und Granulationsgewebebildung fördern, doch ihre Wirkungen sind eng fokussiert, bieten eine begrenzte Kontrolle über tiefe Gewebeverletzungen und Entzündungen und bergen ein Risiko für übermäßige Hyperplasie7. Folglich hat die Traditionelle Chinesische Medizin (TCM) durch ihre ganzheitliche Philosophie, mehrere aktive Bestandteile mit vielfältigen therapeutischen Wirkungen und ein günstiges Sicherheitsprofil Aufmerksamkeit erregt. Frühere Studien haben gezeigt, dass Naturprodukte wie Lakritzextrakt, Aloe-Polysaccharide und Curcumin strahleninduzierte Entzündungen und Gewebeschäden lindern, indem sie freie Radikale abschaffen, proinflammatoriske Mediatoren (TNF-α, IL-6) hemmen und die Fibroblastenproliferation 10,11,12 fördern. Die meisten dieser Untersuchungen untersuchen jedoch einzelne aktive Verbindungen oder einzelne Ziele, was unzureichende Einblicke in die Mechanismen der multikomponentigen synergistischen Wirkung liefert. Acorus calamus L., eine Pflanze, die für ihre entzündungshemmende, antioxidativen, antibakteriellen und wundheilenden Eigenschaften bekannt ist, hat bei verschiedenen Hauterkrankungen Potenzial gezeigt.

Acorus calamus L., ein mehrjähriges Kraut aus der Familie der Araneae, enthält mehrere bioaktive Verbindungen, darunter Terpene, Phenylpropanoide, Flavonoide, Steroide und Alkaloide. Seine Mehrkomponentenzusammensetzung ermöglicht die gleichzeitige Wirkung auf mehrere Ziele und erzeugt synergetische pharmakologische Effekte13. Studien zeigen, dass es entzündliche Signalwege wie NF-κB und MAPK hemmt und dosisabhängig die mRNA-Expression proinflammatorischer Faktoren wie TNF-α und IL-6 herunterreguliert, während es die Aktivitäten von antioxidativen Enzymen wie SOD und GSH-PX erhöht und dadurch entzündungshemmende, antioxidative und antibakterielle Effekte ausübt14,15. Trotz seiner dokumentierten Vorteile bei der Behandlung von Hauterkrankungen, die durch Infektionen und Allergien verursacht werden, ist die Rolle von Acorus calamus L. bei strahlenbedingten Hautverletzungen weiterhin wenig erforscht. Jüngste Studien haben ihre schützenden Wirkungen gegen strahlenbedingte Schäden nachgewiesen, indem sie die Wundheilung fördern und Entzündungen reduzieren13. Die spezifischen therapeutischen Mechanismen von Acorus calamus L. bei strahlenbedingten Hautverletzungen sind jedoch noch nicht vollständig geklärt.

Das übergeordnete Ziel dieser Studie ist es, die therapeutischen Wirkungen des Acorus calamus L.-Extrakts in Tiermodellen von strahlenbedingten Hautschäden zu bewerten. Wir bewerten Wundheilung, entzündliche Reaktionen und zelluläres Verhalten, um die Wirkmechanismen des Extrakts aus verschiedenen Perspektiven zu erläutern. Die Ergebnisse zielen darauf ab, eine theoretische Grundlage für den Einsatz von Acorus calamus L. in der klinischen Behandlung von Hautläsionen zu schaffen, die durch Krebsstrahlentherapie entstehen. Darüber hinaus wird die Studie die funktionellen Eigenschaften des Extrakts, geeignete Interventionsszenarien und Kernwirksamkeitsdaten präsentieren, um den Lesern zu helfen, einzuschätzen, ob dieser auf natürliche Produkte basierende Ansatz ihre Forschungs- oder klinischen Bedürfnisse ergänzt. Letztlich sucht diese Arbeit nach wirksamen therapeutischen Optionen, um die Lebensqualität von Patienten, die eine Tumorstrahlentherapie erhalten, zu verbessern.

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Protokoll

Die in dieser Studie beschriebenen Tierversuche wurden vom Animal Medical Research Ethics Committee des Northern Theater Command General Hospital genehmigt (Ethics Approval Number: 2018-03). Für die Studie wurden männliche SD-Ratten (6–8 Wochen, Gewicht 190–220 g) verwendet. Die Details der verwendeten Reagenzien und Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Unterbringung der Versuchstiere

  1. Wählen Sie männliche SD-Ratten mit 108 LSF, die zwischen 6 und 8 Wochen alt sind und zwischen 190 und 220 g wiegen.
  2. Halten Sie die Raumtemperatur des Tieres bei 22 ± 2 °C, die relative Luftfeuchtigkeit bei 50 ± 5 % und einen 12-Stunden-Hell-Dunkel-Zyklus. Ermöglichen Sie den Ratten uneingeschränkten Zugang zu Nahrung und Wasser. Nach einer einwöchigen Akklimatisationsphase werden die Folgeversuche durchgeführt.

2. Gruppierung von Tieren

  1. Zufällig werden die Ratten in fünf verschiedene Gruppen eingeteilt: Normale Gruppe (Normal, n = 18), Modellgruppe (Modell, n = 18), positive Arzneimittelgruppen (Positiv, n = 18, Betametason-Creme)16, Niedrigdosis-Experimentalgruppe (Experimental-L, n = 18), Mitteldosis-Experimentalgruppe (Experimental-M, n = 18) und Hochdosis-Experimentalgruppe (Experimental-H, n = 18). Mit Ausnahme der normalen Gruppe waren alle Gruppen der Strahlung ausgesetzt.

3. Etablierung eines Tiermodells für radioaktive Hautverletzungen

  1. Verabreichen Sie die Anästhesie präzise und mit minimalem Unbehagen durch intraperitoneale (i.p.) Injektion einer 1%igen Natrium-Pentobarbitallösung (40 mg/kg). Überprüfen Sie die Tiefe der Anästhesie, indem Sie das Fehlen des Hornhautreflexes und das Ausbleiben einer Reaktion auf das Kneifen der Zehen beobachten. Tragen Sie Salbe auf die Augen der Ratten auf, um Trockenheit zu vermeiden.
  2. Entfernen Sie die Rückenhaare der Ratten mit einem Elektrorasierer. Desinfizieren Sie dann den hinteren Bereich mit Jod und 75 % Alkohol.
  3. Legen Sie jede Ratte in eine Bauchlage. Sichern Sie den 32P-β Bestrahler (Oberflächendosis: 0,9 Gy/min) über dem beidseitigen Wirbelsäulenbereich (2 cm × 2 cm Fläche), der 1 cm lateral zur Mittellinie zentriert ist, sodass die Quelle die Epidermis ohne Spalt berührt. Sichern Sie den Applikator mit sterilem medizinischem Klebeband, um eine Verschiebung während der Bestrahlung zu verhindern. Bestrahlen Sie den Zielbereich der Haut 50 Minuten lang, um eine insgesamt aufgenommene Dosis von 45 Gy17 zu erreichen.
  4. Sobald die Ratte nach der Bestrahlung wieder zu Bewusstsein kommt, bringen Sie sie zurück in ihren individuellen Käfig, sorgen Sie für den Zugang zu Wasser und Nahrung ad libitum, halten Sie die Temperatur bei 22 ± 2 °C, die relative Luftfeuchtigkeit bei 50 ± 5 % und einen 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus.
    HINWEIS: Der experimentelle Prozess muss strikt den festgelegten Prinzipien des biologischen und radioaktiven Arbeitsschutzes entsprechen. Zusätzlich müssen alle operativen Verfahren den Richtlinien für die ordnungsgemäße und konforme Entsorgung von medizinischen und radioaktiven Abfällen folgen, um die Sicherheit und Gesundheit aller beteiligten Personen zu gewährleisten.

4. Herstellung von Acorus calamus L.-Extrakt und Arzneimittelgabe

  1. Wiegen Sie die Rhizome von Acorus calamus L., sorgen Sie für gründliche Reinigung, lassen Sie sie an der Luft trocknen und mahlen Sie zu einem groben Pulver (40 Mesh). Fügen Sie 10–20 Bände 50 % Ethanol hinzu und homogenisieren Sie bei Raumtemperatur für 24 Stunden
  2. Nachdem der Extrakt 30 Minuten absinken lassen sollte, wird das Übersetzungsmittel dekantiert und eine vorläufige Filtration durch 4–8 Mullschichten durchgeführt, um grobe Verunreinigungen zu beseitigen. Anschließend filtern Sie mit Filterpapier und verdampfen Sie das Filtrat unter reduziertem Druck in einem Rotationsverdampfer bei 50–60 °C, um das Lösungsmittel zurückzugewinnen, was zu einem lösungsmittelfreien festen Rückstand (AE, Feuchtigkeitsgehalt < 5 %) führt.
  3. AE-Salbenzubereitung18
    HINWEIS: Formulieren Sie 10% (Experimental-L, w/w), 20% (Experimental-M, w/w) und 40% (Experimental-H, w/w) Acorus calamus L.-Extraktsalben gemäß der Ausgabe der Chinese Pharmacopoeia 2020 (Allgemeines Kapitel 0109)19.
    1. Genaues Gewicht von AE (z. B. 20 g für 20 % Salbe) und entsprechendem pharmazeutischen Petrolatum (z. B. 80 g für 20 % Salbe).
    2. 10 % des gesamten Petrolatums zu AE hinzufügen, 5 Minuten lang kräftig triturieren, um eine homogene Paste zu bilden (geometrische Verdünnungsmethode, bei der AE gleichmäßig in der lipophilen Basis verteilt wird).
    3. Schmelzen Sie das restliche Petrolatum bei 60 °C, lassen Sie es auf 55 °C abkühlen und geben Sie es langsam zur AE-Petrolatum-Paste.
    4. Rühren Sie magnetisch bei 250 U/min 30 Minuten bei 55 °C um und rühren Sie dann kontinuierlich beim Abkühlen auf Raumtemperatur, um eine glatte, partikelfreie Salbe zu erhalten.
    5. Blank-Control-Bereitung: Petrolatum bei 60 °C schmelzen, 30 Minuten bei 250 U/min umrühren und auf Raumtemperatur abkühlen (identisch mit der AE-Salbbasis).
    6. Lagern Sie alle Salben und das leere Petrolatum bei 4 °C in versiegelten sterilen Behältern.
  4. Alle Gruppen wurden zweimal täglich um 09:00 und 17:00 Uhr für 45 aufeinanderfolgende Tage nach der Bestrahlung topisch verabreicht (die normale Gruppe, nicht bestrahlt, erhielt denselben Verabreichungsplan synchron). Die aufgetragene Dosis betrug 0,2 g/cm², gleichmäßig verteilt auf eine 2 cm × 2 cm große Fläche der dorsalen Haut. Die normale Gruppe erhielt Fahrzeug (Petrolatum), und die Modellgruppe erhielt Fahrzeug (Petrolatum). Die positive Kontrollgruppe erhielt Betamethason-Creme. Die experimentellen Gruppen L, M und H erhielten Cremes mit AE von 10 %, 20 % bzw. 40 % (w/w). Nach jeder Anwendung wurde der behandelte Bereich 10 Sekunden lang sanft massiert, um die Aufnahme zu verbessern, und die Ratten wurden 5 Minuten lang zurückgehalten, um das Lecken zu verhindern.

5. Entnahme von Rattenhautgewebe und Blut

  1. Betäuben Sie die Ratten mit einer 1%igen Natrium-Pentobarbitallösung (40 mg/kg, I.P.). Desinfizieren Sie chirurgische Instrumente und entfernen Sie die Haut entlang der Wundstelle.
  2. Fixieren Sie einen Teil des Gewebes in 4 % Paraformaldehyd (10 ml), einen weiteren Teil in Glutaraldehyd/Osmiumtetroxid (5 ml, 2,5 %) und bewahren Sie den Rest in flüssigem Stickstoff für weitere Analysen auf (siehe Materialtabelle).
  3. Sammeln Sie Blutproben von der Bauchaorta der Ratte. Zentrifugieren mit 3.000 × g bei 4 °C für 15 Minuten; das Supernatant in EP-Röhren aspirieren; aliquot und bei -80 °C lagern.

6. Heilungsbewertung

  1. Beobachten Sie die Wunde am 7., 15., 30. und 45. Tag nach der Bestrahlung und machen Sie Bilder der Wundoberfläche mit einer hochauflösenden Kamera. Importiere die Bilder in ImageJ und zeichne den Wundbereich entlang des Wundrandes. Berechnen Sie die Fläche im Bild. Stellen Sie sicher, dass jede Operation konsistent ist, um Messfehler zu vermeiden. Berechnen Sie die Wundheilzeit und die Heilungsrate.
    HINWEIS: Wundheilungsrate (%) = (Anfangsbestrahlter Bereich – Unverheilter Wundbereich) / Anfangsbestrahlter Bereich. Wundheilkriterien: Vollständige Heilung ist definiert als entweder verkrusteter Bereich < 5 % der Wundfläche oder verheilter Bereich > 95 % der Wundfläche. Anfänglich bestrahltes Areal: das Wundareal, das zu dem Zeitpunkt gemessen wurde, als bestrahlte Tiere eine stabile Wunde (eine Basislinie) zeigten.

7. Elektronenmikroskopische Untersuchung

  1. Schnelle Gewebeprobenentnahme und Fixierung
    1. Verwenden Sie eine scharfe Klinge, um einen Hautgewebeblock von 1 mm³ zu entfernen, der die Epidermis-Dermis-Schicht umfasst.
    2. Tauchen Sie die Probe sofort in vorgekühlten 2,5 % Glutaraldehydphosphatpuffer (0,1 M, pH 7,4) bei 4 °C für 24 Stunden zur Fixierung.
  2. Pufferreinigung
    1. Führen Sie drei Waschgänge mit 0,1 m Phosphatpuffer (pH 7,4) durch, wobei jede Wasche 15 Minuten Zeit hat.
  3. Nach der Fixierung
    1. Die Probe wird in eine 1%ige Osmiumtetroxidlösung bei 4 °C umgewandelt, um die Fixierung von 1,5 Stunden zu halten.
  4. Gradientendehydrierung
    1. Es wird schrittweise Acetonkonzentrationen von 50 %, 70 %, 80 %, 90 % und 100 % durchlaufen und jedem Schritt 15 Minuten zugeteilt.
    2. Wiederhole die Behandlung dreimal mit 100 % Aceton, wobei jede Immersion 10 Minuten dauert.
  5. Epoxidharz-Einbettung
    1. Die Probe 2 Stunden lang in einer 2:1-Mischung aus Aceton und Epoxidharz einweichen und anschließend über Nacht in reines Epoxidharz eintauchen.
    2. Polymerisiere die Probe bei 60 °C für 48 Stunden, um einen festen Block zu bilden.
  6. Schnitt und Verfärbung
    1. Erzeugen Sie 70 nm ultradünne Schnitte mit einem Ultramikrotom.
    2. Färben Sie 15 Minuten mit Uranacetat, dann 5 Minuten mit Bleicitrat bei 60 °C.

8. Hämatoxylin-Eosin (HE) Färbung

  1. Paraffin-Einbettung durchführen
    1. Entfernen Sie Hautproben, dehydrieren Sie mit einem Alkoholgradienten (z. B. 70 %, 80 % und 95 % Ethanol, jeweils für 15 Minuten, gefolgt von zwei Wechseln von 100 % Ethanol, jeweils für 15 Minuten), und übertragen Sie anschließend auf Xylol, bis das Gewebe einen durchscheinenden Zustand erreicht.
    2. Tauchen Sie in Paraffin, um Einbettung sicherzustellen, und ermöglichen Sie dann die Verfestigung.
  2. Entwachsen und rehydratieren Sie
    1. Paraffin-Abschnitte jeweils 10 Minuten in Xylol I/II eintauchen.
    2. Xylol mit 100 % Ethanol abspülen, dann 3 Minuten in 95 % Ethanol eintauchen, 3 Minuten 80 % Ethanol, 3 Minuten 70 % Ethanol und schließlich mit destilliertem Wasser spülen.
  3. Durchführung von Hämatoxylin-Kernfärbung
    1. In Harris' Hämatoxylinlösung 7 Minuten bei Zimmertemperatur einweichen.
    2. Spülen Sie 10 Minuten unter fließendem Wasser, bis die blaue Färbung sichtbar ist.
  4. Differenzierung und Gegenfärbung implementieren
    1. Differenziere die Verwendung von 1 % Salzsäure in Ethanol für 3 Sekunden (beobachte die Kernklarheit unter dem Mikroskop).
    2. Gegenfärbe mit einer 0,5%igen Ammoniaklösung für 30 Sekunden.
  5. Führen Sie eine Eosin-Gegenfärbung durch
    1. Färben Sie mit einer 0,5%igen Eosinlösung (mit 1 % Gletscheressigsäure) für 90 Sekunden.
    2. Schnell 5 Sekunden lang mit destilliertem Wasser abspülen, um überschüssige Flecken zu entfernen.
  6. Führen Sie Dehydrierung und Reinigung durch
    1. Folgt durch 70 %, 80 %, 95 %, 100 % Ethanol I/II (jeweils 1 Minute).
    2. Mit Xylol I/II für jeweils 2 Minuten reinigen.
  7. Versiegelung und Beobachtung anwenden
    1. Trage Neutralharz tropfweise auf und decke dann mit einem Deckmantel ab.
    2. Trocknen Sie sie 30 Minuten in einem 60 °C Ofen vor der mikroskopischen Untersuchung.

9. Massons trichrome Färbung

  1. Führen Sie routinemäßiges Entwachsen ähnlich wie die Verfärbung vor der HE-Erkrankung durch.
  2. Nuklearfärbung
    1. 10 Minuten in Hämatoxylinlösung einweichen.
    2. Spüle 5 Minuten unter fließendem Wasser, bis der blaue Farbton wiederhergestellt ist.
  3. Kollagenfaserfärbung
    1. Tauchen Sie 5 Minuten in eine Mischung aus Alizarin Red und Acid Fuchsin ein.
  4. Differenzierung der Phosphomolybdiksäure
    1. Für 1 Minute in eine 1%-haltige Phosphomolybdic-Säurelösung übergeben.
  5. Gegenfärbung von Myofasern
    1. Direkt in eine 2,5%ige Anilinblau-Lösung für 5 Minuten übertragen.
    2. Schnell mit einer 0,5%igen Eisessigsäure-Lösung für 5 Sekunden abspülen.
  6. Austrocknung und Montage
    1. Führen Sie eine Gradienten-Ethanoldehydrierung aus: 95 % Ethanol I, 100 % Ethanol II (je 30 S).
    2. Mit Xylen freimachen.
    3. Mit neutralem Harz montieren, bei 60 °C trocknen und anschließend unter dem Mikroskop untersuchen.

10. ELISA-Erkennung der IL-1β-, IL-6- und TNF-α-Konzentrationen

HINWEIS: IL-1β, IL-6 und TNF-α sind wichtige proinflammatoriske Zytokine, die häufig zur Beurteilung sowohl des Vorhandensals als auch der Intensität von Entzündungen verwendet werden. Die Überwachung ihrer Werte ist entscheidend, um Einblicke in entzündliche Prozesse zu gewinnen und die Wirksamkeit entzündungshemmender Behandlungen zu bestimmen.

  1. Serumproben bereiten
    1. Folgen Sie dem in Schritt 5.3 beschriebenen Protokoll, um Serumproben zu entnehmen.
  2. Verdünnungsstandards und Muster
    1. Erstellen Sie eine Gradientenverdünnung von Standards unter Verwendung des Sample-Verdünners; Serumproben im Verhältnis 1:4 verdünnen.
  3. Proben hinzufügen und inkubieren
    1. Führen Sie 100 μL des Standards/Samples in jedes Bohrloch ein; die Brunnen mit einer Membran abdecken; Inkubieren bei 37 °C für 90 Minuten; Dann entsorgen Sie die Flüssigkeit und tupfen die Brunnen trocken.
  4. Antikörper-Enzym-Reaktion nachweisen
    1. Geben Sie 100 μL enzymmarkiertes Reagenz, das spezifisch für IL-1β, IL-6 und TNF-α ist, in jedes Bohrloch; 60 Minuten bei 37 °C bebrütet; Entfernen Sie die Flüssigkeit und tupfen sie trocken; Waschen Sie die Platte viermal mit 200 μL Waschpuffer.
    2. Fügen Sie jedem Bohrloch 100 μL Streptavidin-HRP-Arbeitslösung (1:100 Verdünnung) hinzu; 30 Minuten im Dunkeln bei 37 °C bebrütet; Waschen Sie die Platte viermal mit 200 μL Waschpuffer.
  5. Farbe entwickeln und beenden
    1. Geben Sie jedem Bohrloch 100 μL TMB-Substratlösung zu; 10 Minuten bei Zimmertemperatur im Dunkeln inkubieren; fügen Sie anschließend jedem Bohrloch 50 μL Stoplösung hinzu.
  6. Lesedaten
    1. Messen Sie die Absorption bei 450 nm (mit einer Kalibrierungswellenlänge von 630 nm) mit einem enzymgekoppelten Immunsorbent-Prüfleser innerhalb von 30 Minuten; Berechnen Sie die Konzentration (pg/mL) unter Verwendung der Standardkurve.

11. TUNEL-Assay

  1. Schnittvorbehandlung
    1. Paraffinabschnitte entwachsen und dehydrieren, bis sie destilliertes Wasser erreichen.
    2. Führen Sie eine Arbeitslösung der Proteinase K mit einer Konzentration von 20 μg/mL ein und inkubieren Sie bei 37 °C für 20 Minuten.
    3. Waschen Sie die Abschnitte dreimal mit PBS, wobei jede Wäsche 2 Minuten dauert.
  2. Beschriftungsreaktion
    1. Trage die TUNEL-Reaktionsmischung auf, die das TdT-Enzym und fluorescein-markierte dUTP enthält.
    2. Inkubieren Sie in einer befeuchteten Kammer bei 37 °C im Dunkeln für 60 Minuten.
  3. Signalumstellung
    1. Waschen Sie dreimal mit PBS und lassen Sie für jede Wasche 5 Minuten Zeit.
    2. Führen Sie einen HRP-markierten Antifluorescein-Antikörper mit einer Verdünnung von 1:500 ein.
    3. Inkubiere bei 37 °C für 30 Minuten.
  4. DAB-chromogene Entwicklung
    1. Nach dem PBS-Waschen wird die DAB-chromogene Lösung aufgetragen und die Entwicklung unter dem Mikroskop 1 bis 3 Minuten überwacht.
    2. Stoppen Sie die Reaktion mit destilliertem Wasser.
  5. Gegenfärbung und Montage
    1. Gegenfärbungskerne mit Hämatoxylin für 1 Minute.
    2. Dehydrieren Sie mit gradiertem Ethanol, mit Xylol klarmachen und mit neutralem Harz montieren.
  6. Ergebnisinterpretation
    1. Identifizieren Sie apoptotische Kerne als bräunlich-gelb, während normale Kerne blau erscheinen.
    2. Wählen Sie pro Folie zufällig fünf Hochleistungsfelder (400×) aus, um die Apoptose-Rate zu berechnen.

12. Immunhistochemische Färbung

  1. Entwachsen und Antigenentnahme
    1. Paraffinabschnitte 10 Minuten in Xylol I einweichen und dann weitere 10 Minuten in Xylol II übertragen. Anschließend wird mit einer Gradienten-Ethanolserie getrocknet, beginnend mit 5 Minuten in 100 % Ethanol I, gefolgt von 5 Minuten mit 100 % Ethanol II, je 3 Minuten mit 95 %, 80 % und 70 % Ethanol, und schließlich 2 Minuten mit destilliertem Wasser gespült.
    2. Durchführung von Hochdruck-Wärmereparatur mit einem 0,01 m Natriumcitratpuffer bei pH 6,0 bei einer Temperatur von 121 °C für 3 Minuten.
  2. Blockiere endogene Interferenz
    1. Geben Sie eine 3%ige H2O2-Lösung bei Raumtemperatur für 10 Minuten ein, um endogene Enzyme zu inaktivieren.
    2. Eine 5%ige BSA-Blockierungslösung auf das Gewebe auftragen und 45 Minuten in einer befeuchteten Kammer bei 37 °C inkubieren; Atmet überschüssige blockierende Lösung ohne Ausspülung ab.
  3. Antikörperinkubation
    1. Geben Sie eine 5%ige BSA-Blockierungslösung ab und inkubieren Sie bei 37 °C für 30 Minuten.
    2. Fügen Sie die primäre Antikörper-Arbeitslösung in der optimierten Konzentration hinzu (z. B. P53, Bax, Bcl-2, VEGF und bFGF) und inkubieren Sie über Nacht in einer befeuchteten Kammer bei 4 °C; Waschen Sie dreimal mit PBS-T-Puffer, der 0,1 % Tween-20 enthält, jeweils 5 Minuten lang.
    3. Einführung eines HRP-markierten sekundären Antikörpers, verdünnt 1:200; 60 Minuten lang in einer befeuchteten Kammer bei 37 °C brütet; Waschen Sie dreimal mit PBS-T Puffer für jeweils 5 Minuten. Anschließend wird die ABC-konjugierte Lösung hinzugefügt und bei 37 °C 30 Minuten inkubiert, gefolgt von drei Waschgängen mit PBS-Puffer jeweils 5 Minuten.
  4. DAB-Farbentwicklung
    1. Fügen Sie DAB-Entwicklungslösung mit 0,02 % H₂O₂ hinzu und überwachen Sie die Entwicklung unter Mikroskop bei Raumtemperatur 1–4 Minuten.
    2. Beenden Sie die Reaktion sofort mit destilliertem Wasser.
  5. Gegenfärbung und Montage
    1. Tauchen Sie die Probe 1 Minute in Harris' Hämatoxylinlösung ein und spülen Sie sie 10 Minuten unter fließendem Wasser, um die blaue Erholung zu erreichen.
    2. Folgen Sie der Reihe nach in folgende Lösungen: 70 % Ethanol für 30 Sekunden, 80 % Ethanol für 30 Sekunden, 95 % Ethanol für 30 Sekunden, 100 % Ethanol I für 1 Minute und 100 % Ethanol II für 1 Minute.
    3. Zur vollständigen Klärung und Fixierung tauchen Sie 2 Minuten in Xylol I ein und dann 2 Minuten in Xylol II. Neutrales Harz-Montagemedium hängenweise hinzufügen, mit einem Deckdeckel abdecken und 30 Minuten in einem 60 °C Ofen trocknen.
  6. Ergebnisquantifizierung
    1. Eine braune Farbe zeigt eine positive Reaktion an; Positive Signale (bräunlich-gelb) sollten dem negativen Hintergrund gegenübergestellt werden.
    2. Nutzen Sie die Software Image-Pro Plus, um den Prozentsatz der positiven Zellen in mindestens 5 Sichtfeldern zu berechnen.

13. Nachweis der westlichen Blotting

  1. Gewebelysevorbereitung
    1. Flüssigstick-gefrorenes Hautgewebe in einen vorgekühlten Edelstahlmörser bei -80 °C einführen; Flüssigstickstoff in drei Schritten schrittweise hinzufügen, um die Verdampfung zu verringern; Mahlen Sie vertikal, bis alle Partikel nicht mehr sichtbar sind; das resultierende Pulver in ein EP-Rohr mit Lysepuffer übertragen.
    2. Proteaseinhibitor (1:100) und Phosphataseinhibitor (1:50); Wirbel 30 Sekunden auf Eis; Durchführung von Ultraschallstörungen; 2 Stunden lang bei 4 °C in einem schüttelnden Brutkasten inkubieren; Zentrifugieren bei 4 °C, 14.000 × g für 20 Minuten; Atmen Sie vorsichtig das Überwassermittel ab.
  2. Proteinquantifizierung und -verarbeitung
    1. Dosieren Sie 5 μL des Supernatanten in eine 96-Well-Platte; 200 μL BCA-Arbeitslösung hinzufügen; 30 Minuten im Dunkeln bei 37 °C bebrütet; die Absorption bei 562 nm mit einem Mikroplattenleser zu messen; Bestimmen Sie die Konzentration gemäß der Standardkurve.
    2. Kombinieren Sie 5× Reduced Protein Loading Buffer mit der Proteinlösung im Verhältnis 4:1; Denaturieren, indem man sie 15 Minuten in ein kochendes Wasserbad stellt; Lagere sie bei -20 °C für die spätere Nutzung.
  3. SDS-PAGE-Elektrophorese
    1. Bereite ein 12%iges Acrylamid-Lösungsgel vor; Gieß das Gel, bis es 1 cm unterhalb der Kammzähne ist; mit Isopropanol abdecken, um Luftexposition zu verhindern; Nach der Erstarrung wird Isopropanol entfernt; Gieß ein 4%-Konzentrationsgel; einen 15-Loch-Kamm einführen; erlauben Sie 30 Minuten die Erstarrung bei Raumtemperatur; fügen Sie 5 μL vorgefärbten Proteinmarkers dem Ladebrunnen 1 hinzu; fügen Sie 20 μL Blanklysat in Mulde 2 hinzu; Fügen Sie 10 μL Probe mit 40 μg Protein zu jedem Brunnen von 3 bis 14 hinzu.
    2. Elektrophorese bei 80 V einleiten; wechselt auf 120 V, wenn das Bromphenolblau in das Trenngel migriert; eine Temperatur von 10–15 °C mit Eiswasserzirkulation zu halten; Laufen Sie, bis das Bromphenol-Blau 0,5 cm vom unteren Ende des Gels entfernt ist.
  4. Nass-Blotting-Verfahren
    1. Bereiten Sie einen Transferpuffer mit 20 % Methanol vor; Vorabkühlen auf 4 °C. Aktivieren Sie die PVDF-Membran, indem Sie sie 1 Minute lang in Methanol eintauchen; Gleiche die NC-Membran im Puffer aus. Zusammenbauen Sie die Transferschelle in folgender Reihenfolge: "Kathodenplatte - Schwammpad - Filterpapier - Gel - Membran - Filterpapier - Schwammpad - Anodeplatte"; Entfernen Sie alle Blasen gründlich mit einer Walze; Parameter entsprechend dem Ziel-Molekulargewicht des Proteins einstellen: Für Proteine < 50 kDa eine konstante Spannungsübertragung bei 100 V für 60 Minuten; bei 50-100 kDa Proteinen wird für 90 Minuten eine konstante Stromübertragung bei 250 mA angewendet; für Proteine > 100 kDa wird eine konstante Stromübertragung bei 300 mA für 120 Minuten implementiert; Anschluss an ein 4 °C zirkulierendes Wasserbad.
  5. Immundetektionsverfahren
    1. Nach dem Transfer wird die PVDF-Membran 1 Minute lang in Methanol eingetaucht; Dreimal mit TBST für jeweils 5 Minuten waschen; bedecken Sie die Membranoberfläche mit 3 % H₂O₂/TBST; 15 Minuten bei Zimmertemperatur im Dunkeln bebrüten; die Flüssigkeit aspirieren; eine 5%ige BSA/TBST-Blockierungslösung hinzufügen; Block für 1 Stunde in einem 37 °C schüttelnden Brutkasten; Waschen Sie die Membran jeweils 5 Minuten mit TBST.
    2. Fügen Sie die primäre Antikörper-Arbeitslösung hinzu (wie P53, Bax, Bcl-2, VEGF und bFGF); Inkubation über Nacht bei 4 °C in einem schüttelnden Brutkasten; Waschen Sie die Membran viermal mit TBST jeweils 10 Minuten; hinzufügen von HRP-markierten sekundären Antikörpern; 90 Minuten auf einem schüttelnden Brutkasten bei Raumtemperatur gebrütet; Waschen Sie die Membran sechsmal mit TBST + 0,5 % SDS für jeweils 8 Minuten.
  6. Chemilumineszenzbildgebung
    1. Mische gleiche Mengen von ECL A- und B-Lösungen; die Membranoberfläche gleichmäßig beschichtet; lässt die Reaktion 60 Sekunden im Dunkeln stattfinden; aspirieren Sie überschüssige Flüssigkeit; Setzen Sie eine einzelne Expositionszeit zwischen 1 und 5 Sekunden für starke Signalproteine ein; kumulative Exposition in fünf Segmenten (10/30/60/120/300 S) für schwache Signalproteine durchführen; Erfassen Sie Bilder mit einem Chemilumineszenz-Imager.
  7. Datenanalyse-Workflow
    1. Quantifizierung von Proteinen mit Hilfe der ImageJ-Software; eine einheitliche Hintergrund-Subtraktionsschwelle festzulegen; berechnen Sie das Graustufenverhältnis des Zielproteins zum Referenzprotein (β-Aktin oder GAPDH)
    2. Importiere die Daten zur Analyse in GraphPad Prism.

14. Statistische Analyse

  1. Präsentieren Sie Daten mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts. Verwenden Sie unabhängige Stichproben-t-Tests für Vergleiche zwischen zwei Gruppen und nutzen Sie Einweg-ANOVA für Vergleiche zwischen mehreren Gruppen.
  2. Analysieren Sie die Daten mit SPSS 26.0 und GraphPad Prism 8.0.2.
  3. Betrachten Sie P < 0,05 als Hinweis auf statistisch signifikante Unterschiede.

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Ergebnisse

Therapeutische Wirkung von Acorus calamus L. auf strahleninduzierte Hautverletzungen
15 Tage nach der Bestrahlung zeigten alle Rattengruppen trockene Abschälungen, lokale Rötung, Schwellungen, Geschwüre und Krustenbildung. 30 Tage nach der Bestrahlung zeigte die Modellgruppe die schwersten Hautschäden, wobei Scabbing und Geschwüre an der bestrahlten Stelle ihren Höhepunkt erreichten. Nach 45 Tagen zeigte die Modellgruppe nur minimale Krustenbildung, und die Wunde zeigte eine gewisse Wehe. Im Gegensatz...

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Diskussion

Strahlenbedingte Hautverletzungen bleiben eine der häufigsten und herausforderndsten Komplikationen in der klinischen Krebsstrahlentherapie. Als größtes Organ und das erste Ziel der Strahlung ist die Haut anfällig für Schäden durch freie Radikale und reaktive Sauerstoffspezies, die durch Strahlung entstehen, welche die Zellfunktionen beeinträchtigen können, einschließlich Zellteilung, Migration und Differenzierung, was letztlich zu verzögerter Wundheilung und Gewebeschäden führen

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch den Wissenschafts- und Technologieplan der Provinz Liaoning (Technical Tackling Project) (2024JH2/102600273) und das unabhängige Forschungsprojekt des Northern Theatre General Hospital (ZZKY2024001, ZZKY2024002, ZZKY2024003) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
4%-Paraformaldehyd-FixlösungBeyotime Biotech Inc (Beyotime), ChinaP0099
Acorus calamus L. ExtraktIntern vorbereitetN/A   Das detaillierte Vorbereitungsprotokoll ist in Abschnitt 4 des Protokolls beschrieben.
Anti-Bax Antikörper   Wuhan servicebio technology Co., Ltd. (Wuhan, Hubei, China)GB11690
Anti-Bcl-2-AntikörperWuhan servicebio technology Co., Ltd. (Wuhan, Hubei, China)GB113375
Anti-bFGF-AntikörperProteintech Group, Inc. (Wuhan, Hubei, China)11234-1-AP
Anti-P53-Antikörper Wuhan servicebio technology Co., Ltd. (Wuhan, Hubei, China)GB111740
Anti-VEGF-Antikörper Wuhan servicebio technology Co., Ltd. (Wuhan, Hubei, China)GB111971
BCA Protein Assay Kit Wuhan servicebio technology Co., Ltd. (Wuhan, Hubei, China)G2026-200T
Betamethason-Creme  United Pharmaceutical Co., Ltd. (China)N/A Konzentration: 0,1 % w/w
Nationale Zulassungsnummer: H19994057
EthanolShanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd.E111991Wird als Extraktionslösungsmittel für den Acorus calamus L.-Extrakt verwendet.
Gel- und Blot-BildgebungssystemBio-Rad Laboratories, Inc. (Hercules, CA, USA)ChemiDoc MP
Hämatoxylin-Eosin-FärbesetPeking Solarbio Science & Technology Co., Ltd., (Peking, China)    G1120
HRP-konjugiertes Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (H+L)Wuhan servicebio technology Co., Ltd. (Wuhan, Hubei, China)GB23303
Invertiertes FluoreszenzmikroskopOlympus Corporation (Tokio, Japan)IX83   
Masson' s Trichrome Stain KitPeking Solarbio Science & Technology Co., Ltd., (Peking, China)    G1340
Mikroplattenleser (für Absorptions-, Fluoreszenz- und Lumineszenznachweis)Molekulare Geräte (San Jose, CA, USA)SpectraMax iD3
PetrolatumSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. (Shanghai, China)N/A   Pharmazeutisches weißes Petrolatum; Schmelzpunkt: 45-60 →°C; C;  Nationale Arzneimittelzulassungsnummer: H31022350
Ratte IL-1β ELISA Kit   Beyotime Biotech Inc (Beyotime), ChinaPI303
Rat IL-6 ELISA Kit   Beyotime Biotech Inc (Beyotime), ChinaPI328
Ratte TNF-Α ELISA Kit   Beyotime Biotech Inc (Beyotime), ChinaPT516
TUNEL-Zell-Apoptose-Detektionskit (DAB)Beyotime Biotech Inc (Beyotime), ChinaC1091

Referenzen

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