Mikrobielle DNA-Analyse im Feld mit einem biologischen Extraktions-Feldkit und einer Feld-qPCR-Einheit

Summary

Zuverlässige und präzise Formen der vor Ort einsetzbaren DNA-Analysen sind für viele Branchen entscheidend. Dieses Papier bietet zwei Methoden für die Umweltmikrobienanalyse im Feld: 1) die Isolierung mikrobieller DNA aus Umweltproben mittels eines biologischen Extraktions-Feldkits und 2) die Analyse der DNA über die Feld-qPCR-Einheit.

Abstract

Da quantitative PCR (qPCR) branchenübergreifend immer weiter eingesetzt wird, wird die Fähigkeit, DNA in entfernten Umgebungen ohne logistische Hürden zu extrahieren und zu analysieren, immer wichtiger. Ein klares Beispiel ist der Bedarf an einfachen Werkzeugen zur Quantifizierung von kontaminanten Bakterien an abgelegenen Orten, die von Zugentgleisungen oder Erdölfreisetzungen betroffen sind, um eine zeitnahe Bewertung von Risiken und Umweltauswirkungen zu ermöglichen. Um dies zuverlässig zu erreichen, müssen die Prozesse tragbar und leicht, für Nicht-Wissenschaftler benutzerfreundlich, verunreinigungsresistent und in der Lage sein, schnelle Ergebnisse zu liefern, während dennoch eine strenge Qualitätskontrolle gewährleistet ist. Obwohl es seit Jahren Optionen für Nukleinsäureextraktion und qPCR-Analyse außerhalb des Labors gibt, haben erst in jüngerer Zeit technologische Fortschritte die Entwicklung von vor Ort einsetzbaren Systemen ermöglicht, die zuverlässige und präzise Leistung bieten. In dieser Studie demonstrieren wir die Verwendung eines Feld-DNA-Extraktionskits in Kombination mit tragbaren qPCR-Instrumenten unter realistischen Umweltbedingungen. Feldversuche bei Umgebungstemperaturen von etwa 30 °C zeigten DNA-Erträge und Amplifikationseffizienzen, die mit denen in kontrollierten Laborumgebungen vergleichbar sind. Wichtig ist, dass die im Feld gewonnenen Ergebnisse eine gleichwertige Sensitivität und Reproduzierbarkeit zeigten, was bestätigt, dass portable Arbeitsabläufe hochwertige Daten liefern können, ohne konventionelle Laborinfrastruktur zu benötigen. Diese Ergebnisse unterstreichen das Potenzial dezentraler molekularer Analysen, die die Reichweite von qPCR auf abgelegene und ressourcenbegrenzte Umgebungen ausweiten, während gleichzeitig die für Entscheidungsfindung erforderliche Genauigkeit und Zuverlässigkeit erhalten bleibt.

Introduction

Bei molekularbiologischen Analysen wie qPCR gibt es mehrere Einschränkungen beim Probenmanagement. Ein klares Beispiel ist die Nachfrage nach einfachen, zuverlässigen Werkzeugen zur Quantifizierung von schadstoffabbauenden Bakterien an abgelegenen Standorten, die von Entgleisungen oder Erdölfreisetzungen betroffen sind, was eine zeitnahe Bewertung von Umweltrisiken und Auswirkungen 1,2,3,4,5 unterstützt. Die Haupteinschränkung besteht darin, dass mikrobielle Gemeinschaften, egal wie kalt man die Probe hält, sich im^{Laufe der Zeit} verschieben können (und werden). Um sicherzustellen, dass die Daten genau die ursprüngliche Umgebung widerspiegeln, aus der die Proben entnommen wurden, wird empfohlen, die DNA innerhalb von 24 Stunden^{und 8} Stunden aus diesen Proben zu extrahieren. Für einen Ingenieur, der mikrobielle Proben auf einer Offshore-Ölplattform sammelt, oder einen Wissenschaftler tief im Inneren eines Regenwaldes ist dieser Zeitplan nicht machbar. Es ist schlichtweg unmöglich, eine Wasser- oder Bodenprobe von einem dieser abgelegenen Orte noch am selben Tag zu einer Reederei zu bringen und dann über Nacht in ein Labor zu bringen (während die Kühlung aufrechterhalten wird), wo die DNA vor der Analyse extrahiert werden kann.

Sobald die DNA extrahiert ist, bleibt die Uhr stehen, und die gesamte genetische Information der Probe wird mit geeigneten Aufbewahrungstechniken unbegrenzt erhalten⁹. Das macht die extrahierte DNA im Vergleich zur überwiegenden Mehrheit der chemischen, metallurgischen und biologischen Proben – von denen die meisten eine begrenzte Haltbarkeit haben, unglaublich einzigartig. Archivierte DNA kann Jahre oder Jahrzehnte später abgerufen und auf neuen Plattformen für neue Ziele analysiert werden. Aus diesem Grund ist es entscheidend, dass die extrahierte DNA tatsächlich die ursprüngliche mikrobielle Gemeinschaft repräsentiert und nicht die veränderte durch den verzögerten Transit.

Darüber hinaus schränkt die Notwendigkeit eines Labors, die Proben zu extrahieren und zu analysieren, sowohl die Flexibilität als auch die Konsistenz in den Probenahmen erheblich ein. Allein die logistischen Kosten können bei^{bestimmten Projekten} prohibitiv sein. Die Möglichkeit, Proben zu analysieren und genetische Ziele von Interesse innerhalb von Stunden oder sogar Minuten nach der Probenahme genau zu quantifizieren, öffnet viele Türen für Umweltprojekte weltweit.

Protocol

HINWEIS: Das folgende Protokoll wurde mit einem Bio-Extract Kit (biologisches Extraktionsfeldkit) und dem FieldQuant qPCR (feldbasiertes qPCR) durchgeführt.

1. Biomasseprobenentnahme aus Grundwasser und ein DNA-Isolationsprotokoll mit einem gekapselten Filter und einem biologischen Extrahier-Feldkit

1. Trage Handschuhe und Schutzbrille für alle Schritte in Schritt 1.
2. Bereiten Sie die peristaltische Pumpe und Schläuche vor und spülen Sie den Brunnen mit einer Standardvolumenreinigung gemäß den Grundwasserprobenempfehlungen^{der Umweltschutzbehörde (}EPA) 11.
3. Entfernen Sie den gekapselten Filter, den Adapter, die Klemme und die Kappen aus dem mitgelieferten Zentrifugenrohr (Abbildung 1).
4. Führen Sie das Rohr (1/4-5/16 Zoll Innendurchmesser [I.D.]) durch die mitgelieferte Klemme und ziehen Sie die Klemme fest, um den Schlauch am Verriegelungsschluradapter zu befestigen (Abbildung 2).
5. Schließen Sie den Einlass des Filters an den Luer-Lock-Adapter an, der im vorherigen Schritt installiert wurde.
6. Platzieren Sie den Filter in einen Aufnahmebehälter, damit die Menge des gefilterten Wassers genau gemessen werden kann.
7. Filtern Sie bis zu 1 Liter Wasser mit niedrigen Durchflussraten (<0,5 L/min). Die Menge des gefilterten Wassers variiert je nach Trübheit des Wassers.
   1. Wenn der Filter verstopft, bevor 1 L gefiltert ist, stoppen Sie und fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort.
      HINWEIS: Die DNA-Analyse ist empfindlich und kann je nach Biomasse des Systems bereits mit 10 ml durchgeführt werden.
8. Nehmen Sie das Volumen, das durch den Filter fließt, manuell in Millilitern (mL) auf. Entsorge das gefilterte Wasser.
9. Decke den Filter an beiden Enden ab. Stellen Sie sicher, dass das dünnere Ende mit der roten Kappe geschlossen ist und das dickere Ende mit dem weißen Luer-Lock-Stopfen.
10. Setze den Filter zurück in das bereitgestellte Plastikrohr.
11. Befestigen Sie das Etikett am Zentrifugenrohr und notieren Sie die Menge des Wassers, die durch den Filter gegangen ist, den Ort, das Probenahmedatum und die angeforderten Analysen. Lagern Sie bei 1-4 °C, bis Sie extrahiert sind.
    HINWEIS: Filter müssen innerhalb von 24 Stunden nach der Probenahme extrahiert werden.
12. Mit den mitgelieferten Alkohol-Vorbereitungstüchern reinigen Sie eine flache Oberfläche, die zur Vorbereitung der Extraktion verwendet werden kann (z. B. ein Holzbrett, eine Heckklappe des Lastwagens usw.).
13. Um die DNA zu extrahieren, legen Sie alle Komponenten des biologischen Extraktionsfeld-Kit auf die flache, saubere Oberfläche (Abbildung 3).
    1. Entdecke beide Enden des Filters und lege die Kappen für spätere Verwendung beiseite. Finde und öffne eine der 3 mL Spritzen, die im Set enthalten sind. Sauge Luft in die 3-mL-Spritze und verbinde sie mit dem Filter über die Verriegelungsluerverbindung.
    2. Drücken Sie die Luft aus der Spritze, um das restliche Wasser aus dem Filter zu drücken. Trenne die Spritze und ziehe mehr Luft ein, bevor du das wiederholst.
    3. Wiederhole das mehrmals und achte darauf, dass so viel Wasser wie möglich aus dem Filter herausgedrückt wird. Decke den roten Steckdosendeckel wieder auf.
14. Wenden Sie die geschlossene Spritze Solution A mehrmals um, um sicherzustellen, dass sie gut gemischt ist. Entfernen Sie die Schraubenverriegelungskappe.
15. Schließen Sie die Lösung A-Spritze über die Luer-Lock-Spitze an den gekapselten 0,2 μm-Filtereinlass an und fügen Sie langsam die gesamte Lösung A durch Drücken des Kolbens hinzu. Zu schnelles Drücken kann Gegendruck verursachen, also senke den Pümpel langsam ab. Wenn ein Verstopfen des Filters die Zugabe von Lösung A verhindert, entfernen Sie die rote Auslasskappe des Filters und versuchen Sie es erneut. Kondensiere den Filter erneut.
16. Schütteln Sie den geschlossenen Filter 5 Minuten lang kräftig von Hand.
    HINWEIS: Um Ermüdung vorzubeugen, können mehrere Proben bis zu diesem Schritt vorbereitet werden, und alle können gleichzeitig von Hand geschüttelt werden. Falls verfügbar, kann ein wiederaufladbarer Wirbelmischer verwendet werden, um diesen Schritt statt Handschütteln durchzuführen.
17. Wenden Sie die geschlossene Spritze der Lösung B mehrmals um, um sicherzustellen, dass sie gut vermischt ist. Nehmen Sie die Luer-Locker-Kappe von der Spritze ab.
18. Entfernen Sie die verkapselte Filtereinlasskappe. Verbinden Sie die Spritze mit Lösung B über die Luer-Locking-Spitze an den eingeschlossenen Filtereinlass und fügen Sie langsam die gesamte Lösung B durch Drücken des Kolbens hinzu. Zu schnelles Drücken kann Gegendruck verursachen, also senke den Pümpel langsam ab. Schließen Sie die Filtereinlasskappe wieder auf.
19. Schütteln Sie den geschlossenen Filter 5 Minuten lang kräftig von Hand.
    HINWEIS: Um Ermüdung zu vermeiden, können mehrere Proben bis zu diesem Schritt vorbereitet und alle gleichzeitig handgeschüttelt werden. Falls verfügbar, kann ein wiederaufladbarer Wirbelmischer verwendet werden, um diesen Schritt statt Handschütteln durchzuführen.
20. Entferne die Einlasskappe.
21. Wenn der Filter umgedreht ist, drücke 1 ml Luft mit einer 3-ml-Spritze, die an die gekapselte Filtereinheit angeschlossen ist, in den Filter und ziehe dann am Kolben zurück, um so viel Lysat (Flüssigkeit) wie möglich zu entfernen.
    HINWEIS: Wenn das Lysat besonders viskos ist, kann es notwendig sein, den Kolben mehrmals zu drücken und zu ziehen, um die Lösung aus dem Filter zu entfernen.
22. Gib das Lysat in eine 5-mL-Perlentube. Decke die Tube ab und verdichte sie oben mit Parafilm.
23. Schüttle die Tube 5 Minuten lang kräftig mit der Hand. Stellen Sie das Rohr aufrecht auf, während Sie mit den Stufen fortfahren.
    HINWEIS: Um Ermüdung vorzubeugen, können mehrere Proben bis zu diesem Schritt vorbereitet werden, und alle können gleichzeitig von Hand geschüttelt werden. Falls verfügbar, kann ein wiederaufladbarer Wirbelmischer verwendet werden, um diesen Schritt statt Handschütteln durchzuführen.
24. Um eine Verunreinigung des Foliendeckels zu vermeiden, setzen Sie die Probenpräparationspatrone auf eine ebene Oberfläche.
25. Nehmen Sie die 1-ml-Spritze aus der Verpackung und schrauben Sie die Locker-Lock-Säule am Ende der Spritze fest. Verwenden Sie die spitze Spitze der Säule, um zwei Löcher in den ersten Abschnitt der Probenvorbereitungskatusche zu stechen.
    VORSICHT: Einige Abschnitte der Kartusche enthalten chaotrope Salze und/oder Ethanol. Trage Handschuhe und Schutzbrille.
26. Mit einer Kunststoff-Volumetric-Pipette wird 1 ml Lysat (nur flüssig, Perlen möglichst vermeiden) vom Perlenrohr in das neu gestanzte Loch des ersten Proben-Vorbereitungskartuschenabschnitts übertragen. Für beste Ergebnisse fügen Sie das Lysat langsam in einem leichten Winkel hinzu, wenn Sie in das Loch in der Folie pipetten.
27. Setzen Sie die Spritzensäule wieder in den roten Bereich der Patrone ein. Ziehe die Flüssigkeit vollständig in die Spritze und drücke sie dann heraus. Führe diese Pumpbewegung 10 Mal aus.
28. Drücke die gesamte Flüssigkeit aus der Spritze und zurück in den roten Bereich der Kartusche, bevor du zum nächsten Schritt übergehst. Keine Flüssigkeit sollte von einem Abschnitt in einen anderen übertragen werden – dies gilt für jeden verbleibenden Schritt des DNA-Isolierungsprotokolls der Probe.
29. Positioniere die spitze Spitze der Spritzensäule über dem rot-orangen Abschnitt und durchsteche zwei Löcher durch die Folienbarriere. Benutze den Kolben, um die volle Spritze zu pumpen, die Flüssigkeit ganz nach oben in der Spritze zu pumpen und wieder auszupumpen. Wiederhole diesen Schritt einmal für insgesamt zwei Pumpen, wobei die gesamte Flüssigkeit herausgepumpt wird. Übertragen Sie keine Flüssigkeit auf den nächsten Schritt.
30. Positioniere die spitze Spitze der Spritzensäule über dem orangefarbenen Abschnitt und durchstiche zwei Löcher durch die Folienbarriere. Benutze den Kolben, um das gesamte Flüssigkeitsvolumen der Spritze in die Spritze zu ziehen und pumpe dann wieder ganz heraus. Übertragen Sie keine Flüssigkeit auf den nächsten Schritt.
31. Positioniere die spitze Spitze der Spritzensäule über dem gelben Abschnitt und stach zweimal durch die Folienbarriere. Benutze den Kolben, um das gesamte Flüssigkeitsvolumen der Spritze in die Spritze zu ziehen und pumpe dann wieder ganz heraus. Übertragen Sie keine Flüssigkeit auf den nächsten Schritt.
32. Positionieren Sie die spitze Spitze der Spritzensäule über dem blauen Lufttrocknungsbereich und durchstoßen Sie die Folienbarriere nur einmal. Benutze den Pümpel, um das gesamte Luftvolumen der Spritze in die Spritze zu ziehen und schnell wieder auszupumpen. Wiederholen Sie diese Pumpaktion schnell mindestens 20 Mal, bis die Säule trocken erscheint.
33. Positionieren Sie die spitze Spitze der Spritzensäule über dem letzten grünen Abschnitt und stoßen Sie zweimal durch die Folienbarriere. Benutze den Kolben, um das gesamte Flüssigkeitsvolumen der Spritze in die Spritze zu ziehen und pumpe dann wieder ganz heraus. Wiederholen Sie diesen Schritt für insgesamt 5 Pumps.
34. Mit der 1-ml-Spritze und der Probenvorbereitungssäule wird die gesamte Lösung aus dem grünen Abschnitt in eine gut beschriftete 1-mL-Mikroröhre übertragen – das ist die vor Ort extrahierte DNA-Probe. Lagere bei 1–10 °C (z. B. in einer Kühlbox mit Eis/Kühlpackungen oder im Kühlschrank usw.) bis zu einer Woche oder bis zur Verwendung.
    HINWEIS: Zur Langzeitlagerung können DNA-Proben unbegrenzt bei -20 °C gelagert werden.

2. Feldbasiertes qPCR-Analyseprotokoll unter Verwendung einer Feld-qPCR-Einheit

HINWEIS: Das feldbasierte qPCR-Instrument und das Telefon, das das Instrument steuert, basieren auf wiederaufladbaren Batterien. Stellen Sie sicher, dass beide vollständig geladen sind, bevor Sie zum Einsatz fahren.

1. Lege bis zu drei aus dem Feld entnommene DNA-Proben in die reinen Probenschlitze des Tabletts. Stellen Sie sicher, dass pro Abschnitt eine Stichprobe vorhanden ist: eine Probe in den Slots 1, 2 oder 3, eine in den Slots 4, 5 oder 6 und eine in den Slots 7, 8 oder 9.
2. Legen Sie die Prüfstreifen für jede Probe in die entsprechenden A-, B- oder C-Streifenschlitze auf dem Tablett. Richte den ersten Schacht auf dem Strip mit dem ersten Schlitz im Tablett aus.
3. Entsperren Sie das Telefon und öffnen Sie die Anwendung, die nach dem markenrechtlich geschützten qPCR-Instrument benannt ist. Das Telefon und die Feld-qPCR-Einheit verbinden sich über integrierte Kurzstrecken-WLAN. Wenn die App geöffnet wird, tippe auf den Start Run-Button .
   HINWEIS: Die Anwendung ist auf dem mitgelieferten Handy vorinstalliert und kann nirgendwo heruntergeladen werden.
4. Auf dem nächsten Bildschirm tippen Sie auf die Schaltfläche "IDs generieren ".
5. Auf diesem nächsten Bildschirm werden die Stichprobeninformationen für jede Probe eingegeben; tippen Sie unter Sample-ID und tippen Sie den Sample-Namen ein.
   1. Tappen Sie die Probeneinheiten ab und wählen Sie die passende Volumeneinheit für den Probentyp, der bei der Extraktion verwendet wurde (Gramm [g], Milliliter [mL] oder Abstricher).
   2. Dann wird die Probenmenge angetippt und das Probenvolumen eingegeben, das bei der oben genannten Feldextraktion verwendet wurde (z. B. gefiltertes Milliliter-Wasser). Wiederholen Sie diesen Vorgang für die verbleibenden beiden Proben.
   3. Wenn die Sample-Informationen für alle Samples abgeschlossen sind, tippen Sie auf den Continue-Button .
      HINWEIS: Wenn weniger als 3 Proben verwendet werden, lassen Sie die Stichproben-ID als Standard, wählen Sie eine beliebige Einheit aus und geben Sie eine 1 in die Probenmenge-Zeile ein, damit alle ungenutzten Proben fortfahren können.
6. Auf dem nächsten Bildschirm tippen Sie auf den Ordner. Wechsle zum nächsten Bildschirm und tippe auf Speichern im aktuellen Ordner.
7. Auf dem nächsten Bildschirm geben Sie einen Laufnamen ein und tippen Sie auf Bestätigen.
8. Schalten Sie das Instrument ein, indem Sie den Einschaltknopf oben links gedrückt halten, bis alle Lichter an der Vorderseite des Instruments leuchten (~5 Sekunden). Tippe dann in der App auf Bestätigen , um fortzufahren.
9. Auf dem nächsten Bildschirm tippen Sie über integriertes Kurzstrecken-WLAN verbinden. Drücken Sie die integrierte Kurzstrecken-Funktaste (ein bekanntes Markenzeichen) oben auf dem Instrument, bis das blaue Licht zu blinken beginnt. Tippe auf Bestätigen und warte, bis App und Instrument synchron sind. Sobald sie synchronisiert sind, tippe in der App auf den Instrumentnamen, um ihn auszuwählen, und dann auf den Verbinden-Button , um mit dem Laden der Prüfstreifen fortzufahren.
   HINWEIS: Wenn das Instrument und die App beim ersten Mal nicht synchronisieren, stelle sicher, dass das integrierte Kurzstrecken-Funklicht am Instrument noch blinkt, und scan erneut.
10. Bevor Sie die Kappen der Prüfstreifen entfernen, überprüfen Sie, ob die gevriesten Pellets nicht oben in einem der Bohrlöcher des Prüfstreifens sind. Wenn ja, schnippe vorsichtig den Boden des Brunnens, damit das Pellet tiefer in den Brunnen fällt.
11. Entferne die Kappen von den Go-Streifenröhrchen für die erste Probe. Geben Sie 18 μL steriles Wasser in die erste Bohrung des Prüfstreifens und pipieren Sie vorsichtig auf und ab, um das Pellet aufzulösen. Wiederhole das für die verbleibenden zwei Brunnen.
12. Fügen Sie jedem Bohrloch 2 μL der Probe hinzu und versiegeln Sie die Röhren, indem Sie eine Reihe von Gummi-Prüfstreifenkappen in die Röhren einsetzen, wobei die Kerben zwischen den Kappen zur Rückseite des Tabletts zeigen. Wiederholen Sie bei Bedarf die Schritte 2.10-2.12 für die verbleibenden Proben. Sobald alle Prüfstreifen gefüllt und mit Streifenkappen versiegelt sind, tippen Sie in der App auf Bestätigung .
13. Entfernen Sie jeden Prüfstreifen einzeln und prüfen Sie auf Blasen am Boden der Bohrungen. Wenn sich am Boden eines der Brunnen Blasen befinden, wiege den Streifen vorsichtig hin und her, bis die Blasen sich nach oben bewegen. Sobald alle Brunnen überprüft sind, tippe in der App auf Bestätigen und lade die Streifen im Instrument.
14. Öffnen Sie den Deckel des Instruments und legen Sie die Prüfstreifen in derselben Reihenfolge und Orientierung in das Feld-qPCR-Instrument ein, sodass die Scharniere des Schachts und die Kerben zwischen den Kappen zur Rückseite des Instruments zeigen. Nachdem alle Streifen hinzugefügt wurden, drücke den Deckel vorsichtig herunter, bis er verriegelt, und tippe auf Bestätigen.
15. Tippe in der App auf den Start-Run-Knopf .
    HINWEIS: Der Lauf beginnt und dauert ~45 Minuten unter vorgegebenen Laufbedingungen. Diese Bedingungen sind nicht bearbeitbar.
16. Wenn der Durchlauf beendet ist, tippe auf E-Mail-Ergebnisse. Sobald das Telefon über WLAN angeschlossen ist, werden die Ergebnisse zur Analyse und Berichterstattung gesendet; Bis dahin werden die Ergebnisse auf dem Instrument gespeichert.
    1. Sobald er mit dem WLAN verbunden ist, muss der Nutzer erneut auf die Senden-Schaltfläche klicken, um die Ergebnisse zu senden.
17. Reinigen Sie das Bleif zwischen den Durchläufen, um eine Kontamination zwischen den Proben zu vermeiden.
    HINWEIS: Die Ausgabe ist eine Excel-Datei mit Zyklus-Schwellenwerten (Ct) für jeden Brunnen. Diese Ergebnisse werden an das Labor gesendet, das die Amplifikationsqualität prüft und die CT-Werte mithilfe validierter Standardkurven in Häufigkeiten umwandelt, die spezifisch für jedes qPCR-Ziel sind und auf Volumen und Matrix der ursprünglichen Probe basieren. Diese Ergebnisse werden dem Nutzer sowohl als elektronische Lieferung als auch als PDF übermittelt.

Results

DNA-Extraktion aus repräsentativen Umweltproben wurde sowohl mit dem biologischen Feld-Kit als auch mit einer hoch validierten laborbasierten Methode, die zuvor beschrieben^{wurde, durchgeführt}. Wie in Abbildung 4 gezeigt, wurde die erfolgreiche Abschluss der DNA-Isolierung mit dem Feldkit bestätigt, als qPCR-Ergebnisse mit einer hochvalidierten laborbasierten Extraktionsmethode verglichen wurden. Diese Konsistenz bestätigt, dass die Methode die DNA-Integrität von Umweltproben im Feld bewahrt hat.

Die Komponenten des Feld-qPCR-Kits sind in Abbildung 5 dargestellt. Die Analyse einer Standardkulturverdünnung von Dehalococcoides (DHC) mit der Feld-qPCR-Einheit wurde sowohl bei Innen- (21 °C) als auch Außentemperatur (30 °C) durchgeführt, um die Robustheit des Instruments unter realen Feldbedingungen zu veranschaulichen. Die in Abbildung 6 gezeigten Ergebnisse heben die geringe Abweichung bei 10 verschiedenen Wiederholungen jeder Variante hervor. Zum vollständigen Kontext: DHC ist ein Organismus, der chlorierte Lösungsmittel abbauen kann, und wird in der Umweltsanierungsindustrie häufig mittels qPCR quantifiziert⁴.

Um die Präzision der Instrumente zu validieren, wurde DHC in drei verschiedenen Konzentrationen mit zehn Feld-qPCR-Instrumenten analysiert, die in Duplikaten durchgeführt wurden (Abbildung 7). Selbst bei niedrigen Häufigkeiten blieb die relative Standardabweichung über alle Läufe hinweg niedrig (unter 5 %). Beachten Sie, dass im Vergleich zur Standardabweichung die relative Standardabweichung für logarithmische Daten wichtig ist, da sie die Ergebnisse durch folgende Gleichung normalisiert:

Dabei ist RSD relative Standardabweichung, σ die Standardabweichung des Datensatzes und μ der Mittelwert des Datensatzes.

Zusammen liefern beide Methoden in diesem Artikel reproduzierbare Ergebnisse über Replikationsfeldextraktionen und qPCR-Assays. Die Übereinstimmung zwischen Feld- und Laborextraktionen sowie qPCR-Analyse zeigt, dass zuverlässige, hochwertige Daten ohne Abhängigkeit von Laborinfrastruktur gewonnen werden können, was mikrobielle Analysen in abgelegenen oder ressourcenbegrenzten Umgebungen ermöglicht.

Abbildung 1: Komponenten des gekapselten Filterkits. Der gekapselte Filter wird verwendet, um die Biomasse aus der Wasserprobe herauszufiltern. Durch die Verbindung mit einer peristaltischen Pumpe über einen Schlauch wird Wasser durch den Filter geleitet. Nachdem das gesamte Wasservolumen notiert wurde, wird das Wasser entsorgt und die auf dem Filter gesammelte Biomasse bereit zur DNA-Extraktion. Komponenten: a. sterile Röhre, die den Filter und die Komponenten vor und nach der Nutzung hält, b. Einlasskappe, c. Schlauchklemme, d. Luer-Locking-Schlauchadapter, e. gekapselter Filter, f. Gummiauslasskappe. Bild mit Genehmigung von Microbial Insights, ^Inc.12 verwendet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 2: Filter- und Rohrverbindung. Das Rohr wird über den Adapter für den Schluer-Locking-Schlauchanschluss geschoben und mit der Rohrklemme fixiert. Das andere Ende des Rohrs ist mit einer peristaltischen Pumpe verbunden (diese Verbindung und der Betrieb der Pumpe liegen außerhalb des Anwendungsbereichs dieses Protokolls). Bild mit Genehmigung von Microbial Insights, ^Inc.12 verwendet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 3: Komponenten des DNA-Isolations-Feldkits. Alle Komponenten sind vor der Anwendung steril. Zu den Komponenten gehören: (1) verkapseltes Filterkit (siehe Abbildung 1 für weitere Details), (2) 3 mL Spritze, (3) 1 mL Spritze, vorgeladen mit Lösung A, verdeckt, (4) 1 mL Spritze, vorgeladen mit Lösung B, verdeckt, (5) 3 mL Spritze, (6) Silikonperlrohr, (7) 1 mL Spritze mit Isolationssäule, (8) 1 mL Einweg-Transferpipett, (9) DNA-Isolationsproben-Vorbereitungskartusche, (10) 1,5 mL Mikrozentrifugenröhre. Nicht abgebildet: Parafilm-Quadrate zum Abdichten beim Schütteln und Alkohol-Vorbereitungstücher zur Reinigung der Oberfläche für die Extraktion. Bild mit Genehmigung von Microbial Insights, ^Inc.12 verwendet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 4: Feldextraktionsvergleich mit realen Proben. Vergleichende qPCR-Ergebnisse von DNA, die aus zwei repräsentativen Proben mit einer Labormethode (rote Balken) isoliert wurde, im Vergleich zum biologischen Extraktions-Feldkit (blaue Balken). Diese wurden nicht im Replikat analysiert, wie es bei einer Standard-qPCR-Analyse zu erwarten wäre. Genziele (x-Achse) zeigen eine Häufigkeit (y-Achse) innerhalb einer Größenordnung für beide Methoden. Informationen zu jedem spezifischen Genziel sind nicht enthalten, da sie außerhalb des Umfangs dieses Artikels liegen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 5: Feldbasiertes qPCR-Instrument und Komponenten. Die Komponenten umfassen: A. Das feldbasierte qPCR-Instrument, B. Probenvorbereitungstray, C. Prüfstreifen mit lyophilisierten Reagenzien, D. Telefon vorgeladen mit der Anwendung zum Ausführen des Instruments. Bild mit Genehmigung von Microbial Insights, ^Inc.12 verwendet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 6: Demonstration der Feld-qPCR-Robustheit. Dehalococcoides (DHC) Standard wurde in zehn Replikaten unter Außen- (30 °C, rote Balken) und Innentemperaturen (21 °C, blaue Balken) analysiert, was die Zuverlässigkeit des Instruments für den Einsatz unterstreicht. Die Replikationslaufzahl wird entlang der x-Achse aufgeführt und die berechnete DHC-Häufigkeit entlang der y-Achse. Der Innen-Mittelwert (20 °C) wurde mit 4,92 × 10² Zelle/mL berechnet, SD = 1,14 × 10² Zellen/mL (n = 10), und der Außen-Mittelwert (30 °C) wurde mit 5,89 × 10² Zellen/mL berechnet, SD = 1,80 × 10² Zelle/mL (n = 10). Messungen bei 20 °C und 30 °C unterschieden sich nicht signifikant (Welchs t-Test, p = 0,17). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 7: Demonstration der Feld-qPCR-Präzision. Präzisionsleistung zwischen 10 verschiedenen Instrumenten, dupliziert bei drei verschiedenen Standardkonzentrationen. Der wahre Wert und die Replikationszahl (n = 2 für 10 Instrumente bei jeder Standardkonzentration) sind entlang der x-Achse aufgeführt, mit farbigen Balken, die spezifisch für die Feldeinheit sind. Die y-Achse zeigt die berechnete Häufigkeit für jeden Durchlauf. Die prozentuale relative Standardabweichung für jede Standardkonzentration ist in den gestrichelten Linien über den Balken dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Discussion

Ein entscheidendes Merkmal dieses Protokolls ist, dass es die extraktion von mikrobieller DNA und die qPCR-Analyse unter Feldbedingungen ermöglicht, ohne dass Laborinfrastruktur oder Strom erforderlich^sind. Die Methode wurde optimiert, um Portabilität und Zuverlässigkeit auszubalancieren und liefert reproduzierbare Ergebnisse, die auch im Freien bei einem Bereich von^{Umgebungstemperaturen 12} mit laborbasierten Arbeitsabläufen konsistent sind. Der empfohlene Anwendungsbereich liegt bei 4 °C bis 95 °C, und ein direkter Vergleich bei Standardtemperaturen im Freien (30 °C, 86 °F) zeigt eine zuverlässige Konsistenz (Abbildung 6). Diese Konsistenz ist unerlässlich, um sicherzustellen, dass Feldergebnisse zusammen mit Labordatensätzen interpretierbar sind.

Mehrere Schritte sind entscheidend für den Erfolg des Protokolls. Während des Extraktionsprozesses sind die vollständige Entfernung der Flüssigkeit aus den Filtern und das gründliche Mischen der Reagenzien wichtig, um eine effiziente Lyse und DNA-Rückgewinnung zu gewährleisten. Ebenso ist eine sorgfältige Übertragung von Lysat in die Proben-Prep-Kartusche bei Minimierung des Perlentransports entscheidend, um Verstopfungen oder Säulenversagen zu vermeiden. Zu den Fehlerbehebungsstrategien gehören das Verlangsamen des Kolbendrucks zur Reduzierung des Gegendrucks und das wiederholte Pumpen der Spritze, falls viskose Lysate die Flüssigkeitsbewegung behindern. Bei qPCR ist das Vermeiden von Blasen in Prüfbrunnen und die vollständige Pellet-Resuspension entscheidend für eine genaue Amplifikation.

Trotz ihrer Vorteile hat die Methode Einschränkungen. Die DNA-Erträge können niedriger sein als bei Zentrifugations-Kits, und stark trübe oder organisch reiche Proben können die Säulenleistung herausfordern. Obwohl die Isolationskits für jeden – auch für Nutzer ohne vorherige Laborerfahrung – einfach und leicht zu benutzen sind, besteht beim Vergleich einer unerfahrenen Person im Feld ein zusätzliches Fehlerrisiko. Außerdem liefert die Feld-qPCR-Einheit zwar schnelle Ergebnisse, ist jedoch im Vergleich zu Standard-Thermocyclern auf eine begrenzte Anzahl gleichzeitiger Reaktionen beschränkt (derzeit auf 9 Genziele pro Durchlauf). Diese Einschränkungen werden jedoch durch die Geschwindigkeit der Analyse und die Möglichkeit, mikrobielle Gemeinschaftsprofile im Feld zu erfassen, ausgeglichen. Es gibt keine inhärente Einschränkung, welche qPCR-Ziele analysiert werden dürfen, außer dem Katalog des Labors, das die Einheit anbietet.

Die Bedeutung dieser Methode liegt in ihrer Fähigkeit, molekulare Analysen zu mobilisieren und so eine Echtzeitüberwachung mikrobieller Populationen in Umgebungen wie Ölfeldern, landwirtschaftlichen Standorten oder abgelegenen Ökosystemen zu ermöglichen. Durch die Erhaltung der DNA-Integrität am Zeitpunkt der Probenahme und die Erzielung von Ergebnissen vor Ort reduziert dieser Ansatz logistische Hürden, verbessert die Datenqualität und ermöglicht schnelle Entscheidungsfindung. Zukünftige Anwendungen könnten die Überwachung von Krankheitserregern in der öffentlichen Gesundheit, die Überwachung des Bioremediationsfortschritts oder die Bewertung mikrobieller Risiken in Wassersystemen umfassen. Mit geringfügigen Änderungen kann die Plattform kontinuierlich für zusätzliche molekulare Ziele und neue qPCR-Tests angepasst werden.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
5/16" Siliziumrohr	Amazon (www.amazon.com)	796753613221	Alternative Modelle könnten akzeptabel sein
Kühlboxen	Staples (www.staples.com)	24299978	Alternative Modelle könnten akzeptabel sein
DNA-Isolations-Feldkit	Microbial Insights, Inc.	https://microbe.com/bio-extract/	Proprietär
Feld-qPCR-Einheit mit Zubehör	Microbial Insights, Inc.	https://microbe.com/fieldquant/	Proprietär
Handschuhe	Amazon (www.amazon.com)	Kommt auf die Größe an	Alternative Modelle könnten akzeptabel sein
Grundwasserfilter	Microbial Insights, Inc.	https://microbe.com/wp-content/uploads/2025/08/MI-Sampling-US-01.02-bio-flo_dna_mi.pdf
Eis	Lokaler Kiosk	NA
Kamoer DIP1500 peristaltische Pumpe 24 V 1500 mL/min Höhepunkt	Amazon (www.amazon.com)	701705886813	Alternative Modelle könnten akzeptabel sein
Nadelzange	Amazon (www.amazon.com)	762983170575	Alternative Modelle könnten akzeptabel sein
Papiertücher	Staples (www.staples.com)	2126874	Alternative Modelle könnten akzeptabel sein
Sicherheitsbrille	Amazon (www.amazon.com)	B0BNHKWR6W	Alternative Modelle könnten akzeptabel sein
Sharpie Fine Tip Marker	Amazon (www.amazon.com)	71641300033	Alternative Modelle könnten akzeptabel sein