Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.

Methodenartikel

Isolierung und Reinigung von extrazellulären Pflanzenvesikeln aus Arabidopsis-Blättern mit einer optimierten apoplastischen Waschabnahmemethode

1K Aufrufe

⸱

DOI:

10.3791/69715

⸱

24. März 2026

 ,  ,  , 
1Department of Plant Pathology and Microbiology, Texas A&M University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine optimierte Methode zur Isolierung extrazellulärer Vesikel (EVs) aus Arabidopsis-thaliana-Blättern , um nachgelagerte molekulare und funktionelle Analysen zu unterstützen.

Zusammenfassung

Extrazelluläre Vesikel (EVs) sind membrangebundene Nanopartikel, die von verschiedenen Organismen und Zelltypen ausgeschieden werden und zunehmend als wichtige Vermittler der interzellulären und reichübergreifenden Kommunikation anerkannt. Während die EV-Biologie in Säugetiersystemen gut etabliert ist, ist die Forschung an Pflanzen-EVs vergleichsweise neu und expandiert rasant, teilweise angetrieben durch Hinweise darauf, dass Pflanzen-EVs kleine RNAs, mRNAs, Proteine und andere Ladungen liefern können, die an der Immunität und Interaktionen zwischen Pflanzen und Mikroben beteiligt sind. Die Isolierung hochreiner Pflanzen-EVs bleibt jedoch technisch schwierig, da starre Zellwände, zahlreiche sekundäre Metabolite und das Risiko einer zytosolischen Kontamination während der apoplastischen Flüssigkeitssammlung bestehen. Dieses Protokoll beschreibt einen optimierten Arbeitsablauf zur Isolierung und Reinigung von Pflanzen-EVs aus Arabidopsis thaliana-Blattgewebe . Ein sanfter, spritzenbasierter Infiltrationsschritt wird eingesetzt, um Zellschäden und zytosolisches Lecken zu minimieren, während einzelne Blattblätter (ohne Blattstiele/Gefäßgewebe) helfen, die Kontamination durch vaskulär-assoziierte und intrazelluläre Inhalte zu reduzieren. EVs werden zunächst durch differentielle Zentrifugation angereichert und können entweder durch Saccharosedichte-Gradientenfraktionierung oder Größenausschlusschromatographie (SEC) weiter gereinigt werden. Dieses Protokoll liefert EVs mit erhaltener struktureller Integrität und reduzierter zellulärer Kontamination, indem Zellschäden und zytoplasmatische Leckagen während der apoplastischen Flüssigkeitssammlung minimiert werden, wie durch Nanopartikel-Tracking-Analyse und Transmissionselektronenmikroskopie bewertet. Diese EV-Proben eignen sich für nachgelagerte Anwendungen, einschließlich RNA-Profilierung, Proteomik und funktionelle Assays für Pflanzen-Mikroben-Interaktionsstudien. Insgesamt bietet diese Methode einen reproduzierbaren und anpassungsfähigen Ansatz zur Gewinnung hochwertiger Anlagen-EVs.

Einleitung

Extrazelluläre Vesikel (EVs) sind lipid-doppelschichtgebundene Membranpartikel, die von einer Vielzahl von Organismen ausgeschieden werden, von Bakterien bis zum Menschen 1,2. In Tiersystemen werden EVs häufig in Exosomen, Mikrovesikel und apoptotische Körper basierend auf ihren Biogenesewegen und Größe3 eingeteilt. Exosomen (~30–150 nm im Durchmesser) entstehen durch die Fusion von Mehrvesikularkörpern (MVBs) mit der Plasmamembran, was zur Freisetzung intraluminaler Vesikelführt. 4, während Mikrovesikel (~100–1000 nm Durchmesser) direkt aus der Plasmamembranabspringen. Neben Exosomen und Mikrovesikeln produzieren Säugetierzellen auch apoptotische Körper, die während des programmierten Zelltodesfreigesetzt werden. Diese Vesikel wurden an der Immunmodulation, dem Tumorfortschritt und der therapeutischen Verabreichung beteiligt und sind daher Gegenstand intensiver biomedizinischer Forschung 7,8. Bei Pflanzen ist die EV-Klassifikation weniger klar definiert als bei Tieren. Studien in Arabidopsis thaliana haben mehrere pflanzliche EV-Subtypen identifiziert, basierend auf Unterschieden in Proteinmarkern, Größe und mutmaßlichen Biogenesewegen. Dazu gehören tetraspanin-positive (TET)-positive EVs, die als exosom-ähnliche Vesikel gelten, die aus mehrfachen Körpernstammen, Syntaxin-Protein-Penetration 1(PEN1)-positive EVs11, exocyst-positive Organellen (EXPO)-abgeleitete EVs12,13 sowie weitere EV-Populationen wie autophagie-bezogene EVs14 und Pollensomen15.

Zunehmende Belege deuten darauf hin, dass Pflanzen Elektroautos als Teil ihrer Abwehrstrategie gegen Krankheitserreger ausscheiden. Pflanzen-EVs liefern verschiedene molekulare Ladungen, darunter kleine RNAs, mRNAs und andere regulatorische Moleküle, die die Virulenz von Pilz- und Oomyceten-Krankheitserregern unterdrücken 10,16,17,18,19. Diese Ergebnisse heben EVs als Vehikel der "RNA-Kriegsführung" hervor, die Pflanzen ermöglichen, die Genexpression von Krankheitserregern direkt zu unterdrücken – ein Mechanismus mit tiefgreifenden Auswirkungen auf denPflanzenschutz. Über die Immunität hinaus können Pflanzen-EVs auch zur Zellwandremodellierung, Stressreaktionen und Entwicklungssignalgebungbeitragen 21. Im Gegensatz zur Tier-EV-Forschung, bei der standardisierte Isolations- und Charakterisierungsprotokolleweit verbreitet sind, befindet sich das Feld von Anlagen-Elektrofahrzeugen noch in der Gründungsphase. Dies schränkt die Reproduzierbarkeit und Vergleichbarkeit zwischen den Studien ein und schafft einen dringenden Bedarf an robusten, standardisierten Methoden zur Isolierung und Untersuchung dieser Vesikel.

Die Isolierung von Anlagen-Elektrofahrzeugen stellt einzigartige technische Herausforderungen dar, die in Tiersystemen nicht auftreten. Geschädigte Pflanzengewebe enthalten reichlich sekundäre Metaboliten, Zellwandreste und organellare Fragmente, die mit EVs gemeinsam reinigen können, was die nachgelagerte Charakterisierung erschwert23. Darüber hinaus liefert das apoplastische Waschmittel (AWF), das üblicherweise als Ausgangsmaterial für die Isolierung und Reinigung von EVs in Pflanzen verwendet wird, oft eine heterogene Mischung aus Vesikeln und Schadstoffen24. Obwohl die differentielle Zentrifugation weiterhin ein weit verbreiteter grundlegender Ansatz ist, kann sie keine unterschiedlichen EV-Subpopulationen vollständig auflösen oder EVs von koisolierten makromolekularen Komplexentrennen. Jüngste Übersichtsarbeiten und methodische Studien haben wichtige Leitlinien und bewährte Überlegungen zur EV-Isolierung und -Charakterisierungvon Pflanzen geliefert 27,28,29,30,31. Dennoch bleibt die praktische Umsetzung und Integration dieser Ansätze herausfordernd, und zusätzliche Reinigungsschritte wie Dichtegradientenzentrifugation und Größenausschlusschromatographie sind häufig erforderlich, um die Reinheit und Reproduzierbarkeit von EV in verschiedenen Studien zu verbessern.

Hier präsentieren wir ein vereinfachtes Protokoll zur Isolierung von Elektrofahrzeugen aus Arabidopsis-apoplastischem Waschmittel mittels einer mehrstufigen Reinigungsstrategie. Im Gegensatz zu gängig verwendeten Anlagen-EV-Isolierungsmethoden, die auf die gesamte Anlageninfiltration mit Vakuumpumpenberuhen, vermeidet dieses Protokoll die Einbeziehung von Blattstiele und Gefäßgewebe, was die Kontamination durch Gefäßstrukturen erhöhen kann. Stattdessen werden isolierte Blattblätter und eine sanfte, spritzenbasierte Infiltrationsmethode eingesetzt, um die Apoplastabnahme zu verbessern und gleichzeitig Gewebestörungen zu minimieren. Sorgfältige Blatthandhabung, Ausrichtung und Zentrifugationsbedingungen reduzieren zusätzlich die Verunreinigung durch intrazelluläre Komponenten und bieten ein saubereres Ausgangsmaterial für die EV-Isolation. Nach der differentiellen Zentrifugation können EVs entweder durch Saccharosedichtegradientenfraktionierung oder Größenausschlusschromatographie weiter gereinigt werden, um eine höhere Vesikelreinheit und Auflösung zu erreichen. Die daraus resultierenden EV-Präparate eignen sich gut für nachgelagerte Anwendungen, einschließlich RNA-Sequenzierung, proteomisches Profilieren und funktionelle Assays wie Pathogen-Interaktionen und EV-Aufnahmestudien, wodurch die Reproduzierbarkeit und Interpretierbarkeit in der Pflanzen-EV-Forschung verbessert wird.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

HINWEIS: Führen Sie Zentrifugationsschritte in einer gekühlten Zentrifuge bei 4 °C durch, um die EV-Integrität zu erhalten. Sterile Röhren sollten verwendet werden. Alle Probenhandhabungsschritte sollten schnell und effizient durchgeführt werden, idealerweise von mehreren Personen parallel, um Gewebeschäden zu minimieren und Kontaminationen zu vermeiden, die die EV-Qualität beeinträchtigen könnten.

1. Blattvorbereitung und Infiltration

  1. Bereiten Sie einen 1-Liter-Vesikel-Isolationspuffer (VIB) vor, bestehend aus 20 mM MES-Hydrat, 2 mM CaCl2, 0,1 M NaCl, pH 6.
  2. Ernte die distalen Blattzonen der Blätter, indem du an der Basis der Klinge schneidest, um den Blattstiel zu entfernen.
    HINWEIS: Mindestens 100 vier Wochen alte Pflanzen pro Behandlung oder Genotyp werden empfohlen, um einen ausreichenden EV-Ertrag zu gewährleisten. Arabidopsis-Pflanzen wurden unter 8-Stunden-Licht- und 16-Stunden-Dunkelzyklen angebaut. Verwenden Sie keine Blätter, die sichtbare Anzeichen von Stress zeigen, wie zum Beispiel Bleiche und Schrumpfen der Blätter.
  3. Wasche die Blätter dreimal mit umgekehrtem Osmosewasser (RO). Legen Sie sie auf Papiertücher und tupfen Sie sie vorsichtig trocken.
  4. Geben Sie etwa 50 ml Blätter in eine 120 ml-Spritze. Klopfen Sie leicht auf die Spritze, um die Blätter zu beruhigen.
  5. Gib etwa 60 ml Vib in die Spritze, bis die Blätter vollständig eingetaucht sind. Lassen Sie die eingeschlossene Luft durch sanftes Drücken des Kolbens aus. Drücken Sie ein viermal gefaltetes Stück Parafilm auf die Spitze der Spritze, um ein Auslaufen zu verhindern.
    HINWEIS: Bei einer spritzenbasierten Vakuuminfiltration sollten Sie sicherstellen, dass Spritze und Kolben vor dem Vakuumanlegen sicher zusammengesetzt sind. Üben Sie die Kraft langsam aus und halten Sie einen festen Griff um die Spritze, um eine plötzliche Bewegung des Kolbens oder Kontrollverlust zu verhindern.
  6. Infiltrieren Sie die Blätter, indem Sie den Pümpel langsam nach außen ziehen, um ein Vakuum zu erzeugen. Halte den Pümpel 5 Sekunden lang in der ausgefahrenen Position und lasse dann langsam los. Wiederholen Sie diesen Infiltrationszyklus 2-3 Mal, bis die Blätter dunkler und durchsichtiger erscheinen, was auf eine erfolgreiche Infiltration hinweist.
  7. HINWEIS: Das Ziehen des Kolbens erfordert aufgrund des Vakuumwiderstands mäßige Kraft. Die Spritze sollte fest gehalten werden, während der Kolben langsam zurückgezogen wird, um eine kontrollierte Infiltration zu gewährleisten.
  8. Sobald die Blätter gefiltert wurden, zieh den Pümpel heraus. Gib den überschüssigen Puffer in die Spüle.
  9. Wiederholen Sie die Schritte 1.4-1.7, bis alle geernteten Blätter infiltriert sind (Abbildung 1A).

2. Sammlung von apoplastischem Waschmittel (AWF)

  1. Schneiden Sie einen ~30-cm-Streifen Klebeband ab und legen Sie ihn mit der Klebeseite nach oben. Sichern Sie ein Ende des Bandes, indem Sie es um eine leere, unnötige 1-mL-Spritze direkt unter dem breiteren Ende wickeln. Sorgfältig arrangieren Sie etwa 50–70 versickerte Blätter in überlappenden Schichten entlang der klebrigen Oberfläche, sodass die Basis jeder Klinge zur unteren Spritze zeigt und die Spitzen nach oben zur Sammlung zeigen (Abbildung 1B).
    HINWEIS: Das Schichten mehrerer Blätter auf einem Streifen Klebeband hilft, Schäden zu verhindern. Richten Sie alle Blätter so aus, dass die Klinge einem Ende zeigt und zum Boden des Sammelrohrs ausgerichtet ist, um eine effiziente Rückgewinnung von apoplastischen Flüssigkeiten während der Zentrifugation zu ermöglichen.
  2. Wickeln Sie die mit Klebeband gebundenen Blätter sicher um die Spritze und befestigen Sie dann den oberen Teil des Bündels mit zwei Streifen Klebeband. Führe die umwickelte Spritze in ein 50-mL-Rohr ein, wobei das abgeschnittene Ende der Blätter und die Spritzenbasis zum Boden des Rohrs ausgerichtet sind. Stellen Sie sicher, dass die Blätter fest mit Klebeband verbunden sind, da lockere Folien Blattschäden verursachen und zerbrochene Zellen freisetzen können, die die Apoplast-Waschflüssigkeit kontaminieren (Abbildung 1B).
  3. Zentrifugiere die umwickelte Spritze mit infiltrierten Blättern bei 900 × g für 10 Minuten bei 4 °C mit einer gekühlten Zentrifuge mit einem Rotor mit festem Winkel. Sammeln Sie das apoplastische Waschmittel in einem neuen 15-mL-Kegelrohr und bewahren Sie die Probe auf Eis auf. Wiederholen Sie die Schritte 2.1-2.3, bis alle Blätter zum Einsammeln von AWF verwendet wurden.
    HINWEIS: Die AWF muss klar sein, nicht grün oder sogar hellgrün. Ein grüner AWF zeigt das Vorhandensein von Chloroplasten/Chlorophyll an und kann auch auf eine Zellkontamination hinweisen. Um Blattschäden zu minimieren, verwenden Sie einen Rotor mit festem Winkel.

3. Arabidopsis EV-Isolierung von AWF mittels Differentialzentrifugation

  1. Zentrifugieren Sie das gesammelte apoplastische Waschmittel bei 2.000 g für 20 Minuten bei 4 °C mit einer gekühlten Zentrifuge mit einem Drehschaufelrotor mit Standardeinstellungen für Beschleunigung und Verzögerung. Nach der Zentrifugation verwendet man einen 0,45 μm Nylonzellfilter, um große zelluläre Ablagerungen vom Überstandsmittel zu entfernen. Wirf das Pellet weg. Übertragen Sie das gefilterte Supernatant in neue Zentrifugenröhren (Abbildung 2).
  2. Zentrifugieren Sie den gefilterten Überstandsstoff bei 10.000 × g für 30 Minuten bei 4 °C mit einer gekühlten Zentrifuge mit einem festen Winkelrotor und Standardeinstellungen für Beschleunigung und Verzögerung. Entsorgen Sie das Pellet und behalten Sie das Supernatant für die Ultrazentrifugation zurück. Dieser Schritt entfernt außerdem große zelluläre Ablagerungen und große Vesikel (Abbildung 2).
  3. Übertragen Sie das Überlagerungsmittel in 17 mL Ultrazentrifugenröhren und Ultrazentrifugen mit 100.000 × g für 1 Stunde bei 4 °C mit einer Ultrazentrifuge mit einem Schwenkschaufelrotor und Standardeinstellungen für Beschleunigung und Verzögerung. Nach der Zentrifugation wird das Supernatant entsorgt und das Pellet in etwa 16 ml VIB-Puffer zum Waschen wieder suspendiert. Wiederholen Sie die Ultrazentrifugationsrunde, um EVs zu sammeln (Abbildung 2).
    HINWEIS: Zentrifugation bei 100.000 x g erfolgt zur Sedimentation kleiner Vesikel wie Exosomen. Nachfolgende Waschschritte helfen, nicht-EV-Proteine zu eliminieren, indem das Pellet im Puffer wieder suspendiert wird. Ultrazentrifugenröhren müssen vor der Zentrifugation sorgfältig nach der Masse ausbalanciert werden, entsprechend den Herstellerspezifikationen. Überprüfen Sie Rohre und Rotoren vor der Nutzung auf Mängel und stellen Sie sicher, dass der Rotor vor Beginn des Laufs richtig gesichert ist.
  4. Entsorge das Supernatant und suspendiere das Pellet in VIB erneut. Verwenden Sie eine Pipettenspitze, um vorsichtig den Boden des Rohrs abzukratzen, um die vollständige Rückgewinnung des EV-Pellets zu erleichtern (Abbildung 2).
    HINWEIS: Das EV-Pellet ist oft durchsichtig und kann nach dem Wiederaufhängen nicht sichtbar sein. Das vorsichtige Abkratzen am Rohrboden erleichtert den Wiederaufhängungsprozess des Elektrofahrzeugs. Stellen Sie das Aufhängungsvolumen so an, dass die gewünschte EV-Konzentration erreicht wird, da kleinere Aufhängungsvolumina in der Regel zu konzentrierteren EV-Vorbereitungen führen. Typischerweise ergibt das Resuspendieren von EVs in 50 μL Proteinkonzentrationen von etwa 1–1,5 μg/μL und Partikelkonzentrationen von etwa 10–10 10 Partikeln/mL.
  5. Lagern Sie die neu suspendierten Elektrofahrzeuge bei 4 °C für sofortige Nutzung oder bei -80 °C für die Langzeitlagerung ohne Schnelleinfrieren in flüssigem Stickstoff.
    HINWEIS: Langzeitlagerung kann die Integrität von Elektrofahrzeugen verringern. Verwenden Sie wann immer möglich frisch zubereitete Elektrofahrzeuge.

4. Verwendung der Fraktionierung des Saccharosedichtegradienten bei der EV-Reinigung

HINWEIS: Ultrazentrifugation allein setzt mehrere Arten von Vesikeln zusammen. Um eine feinere Auflösung zu erreichen, kann Dichtegradientenfraktionierung eingesetzt werden, bei der Vesikel nach ihrer Auftriebsdichte und Flotationseigenschaften getrennt werden. Bei diesem Ansatz werden Saccharosegradienten verwendet, um definierte EV-Subpopulationen zu bereichern. Alternativ können Iodixanol-Gradienten verwendet werden.

  1. Top-Last-Saccharose-Gradiententrennung von Elektrofahrzeugen
    1. Bereiten Sie 10–90 % Saccharosegradienten-Aktien vor, bestehend aus folgenden Konzentrationen: 10 %, 16 %, 22 %, 28 %, 34 %, 40 %, 46 %. 52 %, 58 %, 64 %, 70 % und 90 % mit VIB. Verwenden Sie ein 60 °C Wasserbad, um die 70%- und 90%-Bestände besser aufzulösen.
    2. Bereiten Sie einen diskontinuierlichen Gradienten vor, indem Sie 1 ml jeder Saccharoselösung in ein 17 mL Ultrazentrifugenrohr schichten, beginnend mit der konzentriertesten Lösung am Boden und fortlaufend zur am wenigsten konzentrierten. Schließen Sie die 10%ige Saccharoseschicht beim Zusammenstellen des Gradienten aus.
      HINWEIS: Geben Sie jede Dichteschicht sorgfältig entlang der Innenwand des Rohrs auf, um die Vermischung zwischen den benachbarten Schichten zu minimieren. Eine automatische Pipette mit niedriger Dosiergeschwindigkeit wird empfohlen, um einen kontinuierlichen, kontrollierten Durchfluss zu gewährleisten und die Steigungsstabilität zu verbessern. Wenn eine herkömmliche manuelle Pipette verwendet wird, sollte das Abgeben langsam und stetig erfolgen, wobei die Pipettenspitze knapp über der Oberfläche der vorherigen Schicht positioniert ist und darauf geachtet wird, dass sich keine Luftblasenbildung bildet.
    3. Mischen Sie das umgehängte EV-Pellet (~100 μg EV-Protein) mit 1 ml 10%iger Saccharoselösung. Anschließend schichtet man diese Mischung als letzte Schicht der diskontinuierlichen Schicht. Das Gesamtvolumen beträgt ~12,1 ml.
    4. Zentrifugiere bei 100.000 g für 16 Stunden bei 4 °C.
      HINWEIS: Für längere Ultrazentrifugationsläufe sollten überprüft werden, dass Rohre, Kappen und Rotoren für längere Hochgeschwindigkeitsbetriebe ausgelegt sind und dass die vom Hersteller empfohlenen Ausgleichsverfahren eingehalten werden.
    5. Sammeln Sie sechs 2-mL-Fraktionen pro Probe durch Pipettieren von oben ab. Übertragen Sie jede Fraktion in ein neues 17-mL-Ultrazentrifugenrohr.
    6. Die gesammelten Fraktionen in einem ~16 mL VIB-Puffer wieder suspendieren und bei 100.000 g für 1 Stunde bei 4 °C zentrifugieren.
    7. Entsorge das Supernatant und suspendiere dann jedes Pellet in 50 μL VIB.
      HINWEIS: Das EV-Pellet ist nicht sichtbar. Schaben Sie vorsichtig mit der Pipettenspitze den Rohrboden ab, um sie wieder aufzuhängen. Passen Sie das Puffervolumen nach Bedarf an (z. B. 10 μL für höhere Konzentration).
  2. Bodenlastende Saccharose-Gradiententrennung von Elektrofahrzeugen
    1. Bereiten Sie 10–90 % Saccharosegradienten-Aktien vor, bestehend aus folgenden Konzentrationen: 10 %, 16 %, 22 %, 28 %, 34 %, 40 %, 46 %, 52 %, 58 %, 64 %, 70 % und 90 % mit VIB-Puffer. Verwenden Sie ein 60 °C Wasserbad, um die 70%- und 90%-Bestände besser aufzulösen.
    2. Mischen Sie das resuspendierte EV-Pellet (~100 μg EV-Protein) mit 1 ml 90%iger Saccharoselösung. Dann schichtet man diese Mischung als erste Schicht einer diskontinuierlichen Schicht.
    3. Bereiten Sie den verbleibenden diskontinuierlichen Saccharosegradienten vor, indem Sie nacheinander 1 ml jeder Saccharose-Lösung auf die EV-90%-Saccharosemischung schichten, beginnend bei 70% und dann schrittweise zu niedrigeren Konzentrationen (64 %, 58 %, 52 %, 46 %, 40 %, 34 %, 28 %, 22 %, 16 % und 10 %). Geben Sie jede Schicht vorsichtig entlang der Wand des Rohrs mit einer Pipette ab, um das Mischen zwischen benachbarten Schichten zu minimieren. Das Gesamtvolumen beträgt ~12,1 ml.
    4. Zentrifugiere bei 100.000 g für 72 Stunden bei 4 °C.
      HINWEIS: Für längere Ultrazentrifugationsläufe sollten überprüft werden, dass Rohre, Kappen und Rotoren für längere Hochgeschwindigkeitsbetriebe ausgelegt sind und dass die vom Hersteller empfohlenen Ausgleichsverfahren eingehalten werden.
    5. Sammeln Sie sechs 2-mL-Fraktionen pro Probe durch Pipettieren von oben ab. Übertragen Sie jede Fraktion in ein neues 17-mL-Ultrazentrifugenrohr.
    6. Die gesammelten Fraktionen werden in einem ~16 mL VIB-Puffer und Zentrifuge bei 100.000 g für 1 Stunde bei 4 °C wieder suspendiert.
    7. Entsorge den Supernatant und suspendiere dann jedes Pellet in 50 μL VIB-Puffer.
      HINWEIS: Das EV-Pellet ist nicht sichtbar. Schaben Sie vorsichtig mit der Pipettenspitze den Rohrboden ab, um sie wieder aufzuhängen. Passen Sie das Puffervolumen nach Bedarf an (z. B. 10 μL für höhere Konzentration).

5. Einsatz von Größenausschlusschromatographie (35-nm-Säule) zur Reinigung von EVs

  1. Puffervorbereitung und Säulenausgleich
    1. Bereite VIB und alle zusätzlichen Puffer frisch vor. Filtern Sie alle Puffer durch eine 0,22-μm-Membran und entfetten Sie sie vor der Verwendung unter Vakuum, um die Bildung von Luftblasen und eine Porenverstopfung zu verhindern.
      HINWEIS: Unvollständige Entgasung oder der Einsatz ungefilterter Puffer kann Luftblasen oder Partikel ins Harzbett einbringen, was zu gestörtem Durchfluss und verminderter Effizienz der EV-Trennung führt. Wenn in der Spalte Blasen beobachtet werden, sollte der Lauf gestoppt und die Spalte wieder ausgegliglibriert werden.
    2. Lassen Sie die Säule und Puffer vor dem Entfernen der Säulenkappen auf Raumtemperatur (18–24 °C) ausgleichen.
      HINWEIS: Die Säule und die Puffer sollten vor dem Entfernen der Kappe vollständig auf Raumtemperatur ausgeglichen sein. Das Anbringen eines Puffers bei Raumtemperatur auf eine kalte Säule kann zu Blasenbildung im Harz führen, was zu verzerrten Elutionsprofilen und verminderter Reproduzierbarkeit führt.
    3. Stellen Sie die Säule aufrecht hin und entfernen Sie vorsichtig die obere Kappe der Säule.
    4. Entfernen Sie die untere Kappe und lassen Sie den Puffer vollständig aus der Säule abfließen.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass der Speicherpuffer vor der Gleichstellung vollständig aus der Säule abgelaufen ist.
    5. Gleichgewicht der Säule durch Spülen mit drei Säulenvolumen (25,5 mL) entgastem 0,22 μm VIB-Puffer.
  2. EV-Beladung und Probenentnahme
    1. Verwenden Sie 100 μg Gesamt-EV-Protein für jede SEC-Reinigung. Vor dem Laden auf die SEC-Säule stellen Sie EV-Proben mit VIB auf ein Endvolumen von 500 μL ein.
    2. Bringen Sie die 500 μL EV-Federung direkt auf den Ladefel am oberen Rand der Säule an.
    3. Lassen Sie die Probe vollständig ins Harzbett eindringen, bevor Sie einen VIB-Puffer hinzufügen. Halten Sie während der gesamten Trennung einen kontinuierlichen Säulenfluss aufrecht, um eine genaue größenbasierte Elution zu gewährleisten.
      HINWEIS: Der Säulenfluss sollte während der gesamten Trennung kontinuierlich bleiben. Das Austrocknen der Säule oder das längere Pausieren des Durchflusses stört die größenbasierte Trennung und kann zu Bruchüberlappungen und einer verminderten EV-Anreicherung führen.
    4. Nachdem die EV-Probe (500 μL) vollständig in das Harzbett eingedrungen ist, fügen Sie 2 mL VIB hinzu und lassen sie vollständig elutieren. Dieses Eluat entspricht dem Kolonnen-Totvolumen und sollte verworfen werden. EV-Fraktionen wurden anschließend durch sequentielles Hinzufügen von 400 μL VIB und das Sammeln des Eluats gesammelt, wobei dieser Prozess wiederholt wurde, um Fraktionen 1–6 in 1,5-mL Mikrozentrifugenröhren zu erhalten.
      HINWEIS: Das Totvolumen sollte keine EVs enthalten. Basierend auf der Validierung mit der 35-nm-Spalte werden EVs typischerweise in den Brüchen 1–3 wiederhergestellt. Falls erforderlich, kann das Dead Volume mittels Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA) oder Immunoblotting für EV-Marker bewertet werden, um das Fehlen von EVs zu bestätigen.
  3. Säulenreinigung und Lagerung
    1. Unmittelbar nach der Fraktionssammlung spülen Sie die Säule mit einem Säulenvolumen (8,5 mL) von 0,5 M NaOH, um das Harz zu desinfizieren. Dann spülen Sie die Säule mit 17 ml VIB, um den neutralen pH-Wert wiederherzustellen. Die Säule ist dann bereit zum Laden der nächsten Probe.
      HINWEIS: Das Spülen der Säule allein mit Puffer reicht nicht aus, um Restproteine oder Vesikel zu entfernen. Der NaOH-Reinigungsschritt ist unerlässlich, um eine Übertragung zwischen Proben zu verhindern, insbesondere bei nachgelagerten Nukleinsäure- oder RNA-Analysen.
    2. Für die Langzeitlagerung spülen Sie die Säule nach der Reinigung mit zwei Säulenvolumina deionisiertem Wasser, gefolgt von zwei Säulenvolumen 20 % Ethanol für die Lagerung. Decke die Säule wieder ab und stelle sie aufrecht auf.
      HINWEIS: Das Abspülen der Säule mit deionisiertem Wasser vor der Ethanollagerung verhindert die Salzkristallisation im Harzbett, was die Säulenleistung bewahrt.

6. EV-Validierung, Quantifizierung und Größe/Morphologie-Bewertung

  1. Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA)
    1. Messen Sie die EV-Größenverteilung und Partikelkonzentration anhand von NTA.
    2. Verdünnen Sie die EV-Proben auf 1:100 Zoll steril, 0,2 μm-gefilterte VIB, um eine Partikelkonzentration im optimalen Detektionsbereich (etwa 10⁷–10⁹ Partikel/mL) zu erreichen.
    3. Mischen Sie die verdünnten Proben vorsichtig, um Blasenbildung zu vermeiden, und laden Sie sie in das Instrument, das mit einem 532-nm-Laser und einer hochempfindlichen sCMOS-Kamera ausgestattet ist.
    4. Führen Sie Datenerfassung und -analyse mit der NS Xplorer-Software mit einem Detektionsschwellenwert von 10 nm (bis zu 1.000 nm) durch, wobei ein auf dynamischem Beobachtungsvolumen basierender Konzentrationsalgorithmus angewendet wird.
  2. Western-Blot-Analyse von EV-Markern
    1. Für die Western-Blot-Analyse werden die nach der Saccharose-Gradiententrennung gewonnenen EV-Fraktionen in 50 μL VIB gewaschen und wieder suspendiert. Mischen Sie einen Aliquot von 10 μL aus jeder Fraktion mit einem SDS-Ladepuffer, denaturiert und aufgelöst auf einem 12%igen Tris-Glycin-Gel vor der Immunoblottierung mit EV-Marker-TET8-Antikörpern.
    2. Für SEC-abgeleitete EV-Fraktionen konzentriert man zunächst 400 μL jeder Fraktion auf 50 μL mit einem 100 kDa Molekulargewichts-Cutoff-Zentrifugalfilter. Anschließend verwenden Sie 10 μL der konzentrierten Probe für die oben beschriebene Western-Blot-Analyse.
  3. Transmissionselektronenmikroskopie (TEM)
    1. Deponieren Sie 5 μL EVs, die in VIB suspendiert sind, auf glüh-entladene Kohlenstoffformvar-300-Gitter. Anschließend wird die überschüssige Probe mit Filterpapier abgewickelt.
    2. Anschließend wird das Gitter negativ mit 3 μL Elektronenmikroskopie-Färbung gefärbt, mit Filterpapier abgewickelt und vor der Bildgebung mit 300 kV TEM an der Luft trocknet.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

Um zu bewerten, ob das optimierte AWF-Sammelprotokoll Gewebeschäden und zytoplasmatische Kontaminationen reduziert, wurde das mit unserer Methode (Methode 1) gewonnene AWF direkt mit einer alternativen Methode (Methode 2) auf Basis der Infiltration der Vakuumpumpe11 in der ganzen Anlage verglichen. Zellschäden nach der Infiltration wurden mittels Trypan-Blau-Färbung bewertet, die eine deutlich reduzierte Färbung in Blättern zeigte, die mit Methode 1 verarbeitet wu...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

Pflanzen-EVs haben sich als entscheidende Akteure für die Pflanzenimmunität etabliert, insbesondere bei der Vermittlung der Kommunikation zwischen verschiedenen Reichen mit Pilzpathogenen32. Zunehmende Belege zeigen, dass Pflanzen EVs in den Apoplast absondern, wo sie kleine RNAs (sRNAs), mRNAs und Proteine abliefern, die die Virulenz eindringender Krankheitserreger wie Botrytis cinerea, Rhizoctonia solani und den Oomyceten-Pathogen Phytophth...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

Die Autoren geben keinen Interessenkonflikt offen.

Danksagungen

Der B.D. wird durch das Pathways to the Doctoral Fellowship der Texas A&M University unterstützt. B.H. wird durch Startkapital der Texas A&M University und des US-Landwirtschaftsministeriums HATCH 7009138 Projektnummer unterstützt: TEX08074.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,45 &Mikro; M-NylonfilterVWR76479-032
1 ml unnötige SpritzeBD Biosciences309659
100 kDa Ultra-ZentrifugalfilterAmiconUFC 910008
100 ml überflüssige SpritzeBD Biosciences551721050
15 ml konische RöhrenVWR89039-664
50 ml konische RöhrenVWR89039-656
Arabidopsis thaliana (Col-0)Laborgepflegte LeitungenNicht anwendbar
Kohlenstoffformvar 300-GitterTED PELLA01753-F
Klares BandScotch Magic TapeS-9783
ParafilmFisher Scientific13-374-12
PBS-PufferHergestellt im HausNicht anwendbar
qEV Originalsäule Gen2 35 nmIZON-WissenschaftICO-35
Gekühlte ZentrifugeEppendorf5810R
Kühler Zentrifugenrotor mit festem WinkelEppendorfF-34-6-38
Gekühlter Zentrifugen-DrehbehälterrotorEppendorfA-4-62
SucroseVWR470302-810
UltrazentrifugeBeckman CoulterXPN-100
UltrazentrifugenröhrenBeckman Coulter337986
UranyLess-FleckElektronenmikroskopiewissenschaften250218-01

Referenzen

  1. Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends. J Cell Biol. 200 (4), 373-383 (2013).
  2. Zhou, X., et al. Small extracellular vesicles: The origins, current status, future prospects, and applications. Stem Cell Res Ther. 16 (1), 184(2025).
  3. Colombo, M., Raposo, G., Théry, C. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annu Rev Cell Dev Biol. 30, 255-289 (2014).
  4. Akers, J. C., Gonda, D., Kim, R., Carter, B. S., Chen, C. C. Biogenesis of extracellular vesicles (EV): Exosomes, microvesicles, retrovirus-like vesicles, and apoptotic bodies. J Neurooncol. 113 (1), 1-11 (2013).
  5. Ratajczak, M. Z., Ratajczak, J. Extracellular microvesicles/exosomes: Discovery, disbelief, acceptance, and the future. Leukemia. 34 (12), 3126-3135 (2020).
  6. Hristov, M., Erl, W., Linder, S., Weber, P. C. Apoptotic bodies from endothelial cells enhance the number and initiate the differentiation of human endothelial progenitor cells in vitro. Blood. 104 (9), 2761-2766 (2004).
  7. Marar, C., Starich, B., Wirtz, D. Extracellular vesicles in immunomodulation and tumor progression. Nat Immunol. 22 (5), 560-570 (2021).
  8. Ruan, S., et al. Extracellular vesicles as an advanced delivery biomaterial for precision cancer immunotherapy. Adv Healthc Mater. 11 (5), e2100650(2022).
  9. Cai, Q., et al. Message in a bubble: Shuttling small RNAs and proteins between cells and interacting organisms using extracellular vesicles. Annu Rev Plant Biol. 72, 497-524 (2021).
  10. Cai, Q., et al. Plants send small RNAs in extracellular vesicles to fungal pathogen to silence virulence genes. Science. 360 (6393), 1126-1129 (2018).
  11. Rutter, B. D., Innes, R. W. Extracellular vesicles isolated from the leaf apoplast carry stress-response proteins. Plant Physiol. 173 (1), 728-741 (2017).
  12. Ding, Y., et al. Exo70e2 is essential for exocyst subunit recruitment and expo formation in both plants and animals. Mol Biol Cell. 25 (3), 412-426 (2014).
  13. Wang, J., et al. Expo, an exocyst-positive organelle distinct from multivesicular endosomes and autophagosomes, mediates cytosol to cell wall exocytosis in Arabidopsis and tobacco cells. Plant Cell. 22 (12), 4009-4030 (2010).
  14. Jeon, H. S., et al. Pathogen-induced autophagy regulates monolignol transport and lignin formation in plant immunity. Autophagy. 19 (2), 597-615 (2023).
  15. Prado, N., et al. Nanovesicles are secreted during pollen germination and pollen tube growth: A possible role in fertilization. Mol Plant. 7 (3), 573-577 (2014).
  16. Samuel, M., Bleackley, M., Anderson, M., Mathivanan, S. Extracellular vesicles including exosomes in cross kingdom regulation: A viewpoint from plant-fungal interactions. Front Plant Sci. 6, 766(2015).
  17. Pinedo, M., De La Canal, L., De Marcos Lousa, C. A call for rigor and standardization in plant extracellular vesicle research. J Extracell Vesicles. 10 (6), e12048(2021).
  18. Huang, Y., et al. Rice extracellular vesicles send defense proteins into fungus rhizoctonia solani to reduce disease. Dev Cell. 60 (8), 1168-1181.e6 (2025).
  19. Wang, S., et al. Plant mrnas move into a fungal pathogen via extracellular vesicles to reduce infection. Cell Host Microbe. 32 (1), 93-105.e6 (2024).
  20. He, B., et al. Publisher correction: Rna-binding proteins contribute to small rna loading in plant extracellular vesicles. Nat Plants. 7 (4), 539(2021).
  21. Rutter, B. D., Innes, R. W. Extracellular vesicles as key mediators of plant-microbe interactions. Curr Opin Plant Biol. 44, 16-22 (2018).
  22. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (misev2018): A position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. J Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
  23. Regente, M., et al. Plant extracellular vesicles are incorporated by a fungal pathogen and inhibit its growth. J Exp Bot. 68 (20), 5485-5495 (2017).
  24. Mu, J., et al. Interspecies communication between plant and mouse gut host cells through edible plant derived exosome-like nanoparticles. Mol Nutr Food Res. 58 (7), 1561-1573 (2014).
  25. Baldrich, P., et al. Plant extracellular vesicles contain diverse small RNA species and are enriched in 10- to 17-nucleotide "tiny" RNAs. Plant Cell. 31 (2), 315-324 (2019).
  26. Regente, M., et al. Vesicular fractions of sunflower apoplastic fluids are associated with potential exosome marker proteins. FEBS Lett. 583 (20), 3363-3366 (2009).
  27. Rutter, B. D., Innes, R. W. Growing pains: Addressing the pitfalls of plant extracellular vesicle research. New Phytol. 228 (5), 1505-1510 (2020).
  28. Thieron, H., et al. Practical advice for extracellular vesicle isolation in plant-microbe interactions: Concerns, considerations, and conclusions. J Extracell Vesicles. 13 (12), e70022(2024).
  29. Borniego, M. L., et al. Diverse plant Rnas coat Arabidopsis leaves and are distinct from apoplastic RNAs. Proc Natl Acad Sci U S A. 122 (1), e2409090121(2025).
  30. Chen, A., He, B., Jin, H. Isolation of extracellular vesicles from Arabidopsis. Curr Protoc. 2 (1), e352(2022).
  31. Koch, B. L., Rutter, B. D., Innes, R. W. Arabidopsis produces distinct subpopulations of extracellular vesicles that respond differentially to biotic stress. bioRxiv. , (2024).
  32. Hamby, R., Cai, Q., Jin, H. RNA communication between organisms inspires innovative eco-friendly strategies for disease control. Nat Rev Mol Cell Biol. 26 (2), 81-82 (2025).
  33. Hou, Y., et al. A phytophthora effector suppresses trans-kingdom RNAi to promote disease susceptibility. Cell Host Microbe. 25 (1), 153-165.e5 (2019).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Tags

Vesikelisolierungdifferenzielle ZentrifugationSaccharosegradientGr enausschlusschromatographieNanopartikel TrackingTransmissionselektronenmikroskopiePflanze Mikrobe Interaktion
Isolierung und Reinigung von extrazellulären Pflanzenvesikeln aus Arabidopsis-Blättern mit einer optimierten apoplastischen Waschabnahmemethode
Kontaktieren Sie uns
Der Bibliothek empfehlen

Datenschutz

Nutzungsbedingungen

Richtlinien

Urheberrecht © 2026 MyJoVE Corporation. Alle Rechte vorbehalten.