Methodenartikel

Antiproliferativer Plaque-Test zur Screening bioaktiver Moleküle in vitro gegen Toxoplasma gondii Tachyzoites

DOI:

10.3791/69725

⸱

23. Januar 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratório de Quimioterapia de Protozoários Egler Chiari, Departamento de Parasitologia - ICB, Universidade Federal de Minas Gerais

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Diese Arbeit zielt darauf ab, eine einfache Methode des Plaque-Assays zu beschreiben, um beim Screening neuer bioaktiver Moleküle gegen das Tachyzoit-Stadium des protozoen Toxoplasma gondii zu helfen.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Toxoplasmose ist eine parasitäre Infektion, die häufig mit Augenläsionen und neonatalen Fehlbildungen in Verbindung steht. Seit den frühen 1950er Jahren basiert die Erstlinienbehandlung dieser Krankheit auf der Kombination von Sulfadiazin, Pyrimethamin und Folinsäure. Im Laufe dieser Jahre wurden nur wenige alternative Behandlungsprogramme eingeführt. Dies unterstreicht die Notwendigkeit, neue bioaktive Moleküle gegen Toxoplasma gondii zu entdecken. Da dieser Erreger ein obligater intrazellulärer Parasit ist, erfordert das traditionelle Medikamentenscreening im Labor typischerweise teure Materialien und Ausrüstung, wie Tests mit fluoreszierenden Proteinen oder β-Galactosidase-exprimierende Parasiten. Außerdem können Methoden wie die Quantifizierung der optischen Mikroskopie zeitaufwendig sein. Der Plaque-Test ist eine Methode, die die Intensität der intrazellulären Proliferation von Krankheitserregern bewertet, indem die Anzahl der Regionen und die Zerstörungsfläche in einer durch den lytischen Zyklus des Parasiten beschädigten Zellmonoschicht gemessen werden. Diese Arbeit beschreibt ein optimiertes Plaque-Assay-Protokoll, das darauf ausgelegt ist, aktive Moleküle auf intrazelluläre Tachyzoiten von T. gondii in vitro abzuschirmen. Dieses Protokoll nutzt kostengünstige Materialien und eine einfache Laboreinrichtung und liefert schnelle und reproduzierbare Ergebnisse, die die Identifizierung neuer aktiver Moleküle gegen diesen Parasiten durch verschiedene Forschungsgruppen erleichtern.

Einleitung

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Toxoplasmose ist eine zoonotische Erkrankung mit einer heterogenen weltweiten Verbreitung, die etwa ein Drittel der Weltbevölkerung betrifft. Die Symptome dieser Krankheit stehen im Zusammenhang mit dem Ausmaß der Wirtsimmunität und der Replikation des Parasiten 3,4. Die akute Phase der Erkrankung, gekennzeichnet durch die Replikation des Tachyzoit-Stadiums, ist bei immunkompetenten Personen im Allgemeinen asymptomatisch 5,6. Im Gegensatz dazu zeigen immungeschwächte Personen häufigere Symptome, darunter unspezifische Symptome wie allgemeines Unwohlsein, Fieber sowie Enzephalitis und Retinochoroiditis 6,7,8. Trotz ihrer klinischen Bedeutung ist die derzeit verfügbare Behandlung gegen das Toxoplasma gondii bradyzoit-Stadium (in der chronischen Phase) unwirksam und führt nicht zu einer parasitologischen Heilung. Unerwünschte Ereignisse aktueller Medikamente verringern ebenfallsdie Therapietreue 9,10,11. Daher ist es notwendig, neue, sicherere und wirksamere Behandlungen für die Toxoplasmose zu finden.

Die Entwicklung neuer Medikamente erfordert einen langen Zeitraum, Investitionen in Milliarden von Dollar und mehrere Forschungsphasen. Da die Kosten für die Arzneimittelentwicklung hoch sind, muss die Pharmaindustrieim Voraus den besten Wirkstoffkandidaten auswählen. Für das Drogenscreening können verschiedene Ansätze angewandt werden, darunter in silico-Methoden, der Einsatz von künstlicher Intelligenz, und der gebräuchlichste Ansatz, biologische Methoden 16,17,18,19. In-vitro-biologisches Screening beinhaltet die Verwendung von Molekülbibliotheken (Chemobibliotheken), um Moleküle zur Identifikation biologischer Aktivitätenbereitzustellen 20,21,22. Da diese Chemobibliotheken eine Vielzahl von Molekülen enthalten, ist es notwendig, Ressourcen und Zeit zu optimieren. Daher kann der Plaque-Test eine Methode sein, um neue bioaktive Moleküle schnell gegen verschiedene Krankheitserreger wie T. gondii zu testen.

Der Plaque-Test ist eine in-vitro-Methode , die den lytischen Zyklus intrazellulärer Krankheitserreger nutzt, um die Konzentration von Krankheitserregern in einer zelligen Monoschicht zu quantifizieren, was im Laufe der Zeit zur Bildung nekrotischer Plaques führt23. Die erste Studie mit der Plaque-Assay-Technik stammt aus der frühen zweiten Hälfte des 20. Jahrhunderts, als Renato Dulbeccos Team Monolayern von Hühnerfibroblasten verwendete, die mit dem Western Equine Encephalomyelitis Virus infiziert waren, um die Proportionalität zwischen der Anzahl der gebildeten nekrotischen Plaques und der Konzentration von Virus16 zu demonstrieren. Auch der Einsatz dieser Technik bei T. gondii wurde gut beschrieben, wie zuvor von Ufermann und Mitarbeitern23 erläutert.

Eine der ersten Studien, die den Plaque-Test verwendete, um eine Reaktion bei der Hemmung von T. gondii gegen unterschiedliche Molekülkonzentrationen zu beobachten, wurde 1976 von Roberts et al.durchgeführt. Obwohl der Plaque-Test weit verbreitet zur Virustitration 16,24 verwendet wird, wurde diese Methode nur von wenigen Forschungsgruppen verwendet, um die Anti-T. gondii-Aktivität von Molekülen 21,22,25,26,27 zu bewerten. Um einen Test zu finden, der das Testen von Verbindungsbibliotheken mit hoher Durchsatzrate sowie kostengünstigen Materialien und einer einfachen Laboreinrichtung ermöglichen kann, wurde der Plaque-Test als Alternative zum routinemäßigen Labor-Drogenscreening untersucht. Dies führte zur Einrichtung eines optimierten Protokolls, das die gleichzeitige Bewertung der Aktivität verschiedener Moleküle mittels einfacher Materialien und eines Bildaufnahmesystems ermöglicht, was schnelle und reproduzierbare Ergebnisse liefert. So beschreiben wir hier das detaillierte Protokoll, das in unserem Labor validiert wurde, um anderen Gruppen bei der Untersuchung neuer bioaktiver Moleküle gegen Tachyzoiten von T. gondii zu helfen.

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Protokoll

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Die Manipulation von Parasiten- und Zellkulturen sowie die Entsorgung und Bestimmung von Abfällen erfolgten gemäß der brasilianischen Gesetzgebung, wie es die Nationale Agentur für sanitäre Überwachung (ANVISA) RDC Nr. 222/2018 vorgeschrieben hat. Alle Verfahren wurden vom Internen Biosicherheitsausschuss (CIBio) der ICB-UFMG überwacht. Diese Studie bezieht sich nicht auf Tiere, Menschen oder gentechnisch veränderte Organismen. Fördermittel von CNPq, CAPES und FAPEMIG unterstützten diese Arbeit. ESMD (CNPq 308082/2023-0) und RWAV (CNPq 305574/2021-3) sind CNPq-Produktivitätsstipendiaten. Die Reagenzien und die verwendeten Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Vorbereitung eines ergänzten RPMI-1640-Mediums

HINWEIS: Das Medium RPMI-1640 wurde ursprünglich für die Kultivierung menschlicher Leukämiezellen sowohl in Suspension als auch in Monoschicht entwickelt. Spätere Studien haben jedoch ihre Eignung für verschiedene Säugetierzellkultivierungen gezeigt.

  1. Zur Flasche mit 250 ml RPMI-1640 geben Sie 2,5 mL 200 mM L-Glutamin (100x).
  2. Fügen Sie dem Medium 2,5 ml des Antibiotikum-Antimykotikums (100x) hinzu.
  3. Als Nächstes werden 5,0 mL oder 25 ml fetales Rinderserum (FBS) zusammen mit RPMI-1640 (2 % oder 10 % FBS) in die Flasche gegeben.
  4. Im Kühlschrank aufbewahren (2–8 °C).

2. Vorbereitung von PBS (1x)

HINWEIS: Um 1 Liter phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) bei pH 7,2 und 25 °C herzustellen, folgen Sie den folgenden Schritten.

  1. Messen Sie die folgenden Salzmengen separat ab: 1,4 g Na2HPO4, 0,24 g KH2PO4 und 8,5 g NaCl.
  2. Geben Sie die gewichteten Salze einzeln in einen 1-Liter-Becher mit 800 ml deionisiertem Wasser. Rühren Sie die Lösung um, bis alle Salze vollständig gelöst sind.
  3. Messen Sie den pH-Wert der Lösung mit einem pH-Messgerät. Es sollte 7,2 sein. Falls nötig, verwenden Sie 6 M Salzsäure oder 3 M Natriumhydroxid, um den pH-Wert auf 7,2 zu bringen.
  4. Mit einem Glasstab wird die oben genannte Lösung quantitativ in einen 1-Liter-Volumenkolben übertragen.
  5. Geben Sie deionisiertes Wasser in die Volumenkolben, bis das Gesamtvolumen 1 L erreicht, um sicherzustellen, dass der Meniskus am richtigen Punkt ist.
  6. Mische die Lösung im Volumenkolben und drehe sie sanft um.
  7. Teile die endgültige PBS-Lösung in kleinere Glasflaschen (100–250 mL).
  8. Autoklaven der Flaschen bei 121 °C, 1,1 kg/cm2 für 15 Minuten.
  9. PBS-Lösung im Kühlschrank aufbewahren (2–8 °C).
    HINWEIS 1: Verwenden Sie PBS bei 37 °C für alle Experimente.

3. Herstellung einer 4%igen Formaldehydlösung

  1. Mischen Sie 35,68 ml 1x PBS und 4,32 ml 37 % P.A. Formaldehyd.
  2. Lagern Sie die Lösung in einer Plastikflasche bei Raumtemperatur (25 °C).

4. Herstellung der Grundlösung der aktiven Moleküle

HINWEIS: Überprüfen Sie die Löslichkeit der Moleküle in DMSO, DMF, Ethanol oder Wasser und wählen Sie das am besten geeignete Lösungsmittel aus. Um potenzielle verdünnende Toxizitätseffekte auf Parasiten zu minimieren, sollte die Serienlösung mindestens 1000-mal konzentrierter sein als die höchste Konzentration der zu testenden Verbindung. Wenn beispielsweise die höchste zu testende Konzentration 1 μM beträgt, sollte die Serienlösung mindestens 1 mM betragen. Um eine 10-mM-Lagerlösung vorzubereiten, folgen Sie den folgenden Schritten:

  1. Wiegen Sie die zu prüfende Verbindung mit einer analytischen Waage mit einer Genauigkeit von 0,0001 g.
  2. Bestimmen Sie das Volumen des Verdünners, das benötigt wird, um eine 10 mM Lösung mit folgender Formel zu erhalten:
    V (mL) = (Y MM) x 100
    Wobei:
    Y: Masse der Verbindung in Milligramm (mg)
    MM: Molmasse der Verbindung
    V (mL): Volumen des Lösungsmittels
  3. Gib den Verdünner dem Behälter mit dem gewichteten Stoff zu.
  4. Homogenisieren Sie mit einem Wirbelmischer.
  5. Teilen Sie die Lösung in kleine Aliquoten und bewahren Sie sie bei -20 °C im Gefrierschrank auf.
  6. Vor der Anwendung lassen Sie die Aliquot-Lösung vollständig auftauen und homogenisieren Sie erneut mit einem Vortexmischer.
    HINWEIS: Zur Herstellung von Unterlagerlösungen mit anderen Konzentrationen verwenden Sie folgende Formel
    V (μL) = x mM × y μL/10 mM
    V (μL) ∶ Volumen der Standardlösung, die zur Herstellung der neuen Lösung benötigt wird
    x mM: gewünschte Konzentration der neuen Lösung.
    y (μL): gewünschtes Volumen der neuen Lösung.

5. Zellkultur

  1. Verwenden Sie NHDF-Zellen, indem Sie das Fläschchen vorsichtig im 37 °C Wasserbad wirbeln.
    HINWEIS: NHDF-Zellen können durch humane Vorhautfibroblasten (HFF) oder andere Zelllinien ersetzt werden, die eine stabile Monoschicht bilden. Der Plaque-Test funktioniert nur mit Zelllinien, die eine stabile Monoschicht bilden, also Zellen, deren Wachstum durch Kontakt stoppt. Zelllinien, die keine Proliferationshemmung aufweisen, wie Tumorlinien, können nicht verwendet werden, da die Zellen mit den Parasiten um Nährstoffe im Kulturmedium konkurrieren und den von den Parasiten gebildeten Plaquebereich auffüllen.
  2. Sofort werden aufgetaute Zellen in ein 15 mL konisches Rohr mit 10 mL aufgetautem RPMI-1640-Medium übertragen (siehe Schritt 1).
  3. Zentrifugiere die Zellen bei 200 x g für 5 Minuten bei Raumtemperatur. Wenn der Spinzyklus abgeschlossen ist, sollte am Boden des Röhrchens ein Zellpellet sichtbar sein.
  4. Entsorgen Sie das Supernatant vorsichtig, um das Zellpellet zu erhalten.
  5. Lassen Sie das Zellpellet mit einem 12-ml-Supplement, einem RPMI-1640-Medium, das 10 % FBS enthält, wieder suspendieren und drei 25-cm-2-Kulturkolben oder eine 75-cm-2-Kolben-Flasche aussäen. Nach 2–3 Tagen untersuchen Sie die Kulturkolben mit einem Inverted-Phasenkontrastmikroskop, um die Wiederherstellung der Zellproliferation zu bestimmen (Zellen sollten mindestens 40%-50% Konfluenz zeigen).
  6. Wenn die Zellen eine vollständige Monoschicht (100 % Zusammenfluss) erreichen, wird das Medium mit einer Pasteur-Pipette aus der Kolbe entfernt. Werfen Sie das Medium und die Pipette weg.
  7. Gib 1-2 ml PBS einmal in die Flasche, warte 1 Minute und entferne das PBS.
  8. Gib 1 ml 0,05 % Trypsin-Versene-Lösung in den Kolben und setze ihn in den Inkubator mit 5 %CO2, Luftfeuchtigkeit und einer Temperatur von 37 °C für 2 Minuten.
  9. Nach 2 Minuten beobachten Sie die Zellen mit dem umgekehrten Mikroskop, um zu bestätigen, dass sich die Zellen gelöst haben.
  10. Suspendieren Sie die abgetrennten Zellen mit 24 ml ergänztem RPMI-1640-Medium mit 10 % FBS unter Verwendung einer 10 mL serologischen Pipette und einem automatischen Pipettenspender.
    HINWEIS: Jede 25- oder 75 cm²-Kulturflasche mit einer konfluenten Monoschicht kann sich in 5 bzw. 15 weiteren 25 cm² Kulturflaschen replizieren.
  11. Nach der Zugabe des erforderlichen Mediumvolumens (24 ml) homogenisieren Sie die Zellsuspension mit der serologischen Pipette.
  12. Übertragen Sie 4 ml der Zellsuspension in einem Medium auf jeden 25 cm2 Kolben oder 12 ml auf 75 cm2 Kolben. Denken Sie daran, 4 ml Zellsuspension im ersten Kolben zu lassen.
  13. Stellen Sie die Flaschen in einen Inkubator mit 5 %CO2, Luftfeuchtigkeit und einer Temperatur von 37 °C.
  14. Warten Sie, bis eine vollständige Monoschicht von Zellen erreicht ist (100 % der Konfluenz).
    HINWEIS: Identifizieren Sie jede Flasche mit dem Datum und der Passagennummer.

6. Zubereitung der Kulturplatte

  1. Inspizieren Sie die Integrität der Zellmonoschicht (100 % Konfluenz) im Kulturkolben mit einem umgekehrten Mikroskop.
  2. Folgen Sie dem oben beschriebenen Trypsinisierungsverfahren (Schritte 5.7-5.9).
  3. Mit einer 5-mL serologischen Pipette werden die abgetrennten Zellen mit 4 mL RPMI-Medium wieder aufgehängt und in ein 15-mL konisches Rohr übertragen.
  4. Zentrifugiere mit 200 x g für 5 Minuten bei Raumtemperatur für 5 Minuten.
  5. Entsorge das Supernatant vorsichtig.
  6. Die Zellkugel mit 1 mL frischem RPMI-1640-Medium wieder suspendieren.
  7. Homogenisieren Sie mit einem Wirbelmischer.
  8. Übertragen Sie 10 μL in ein 1,5 mL Rohr mit 490 μL einer 4%igen Formaldehydlösung (1:50 Verdünnung) mit einer Mikropipette mit steriler Spitze.
    HINWEIS: Verdünnungsfaktor = (Gesamtvolumen (μL)) / (Probenvolumen (μL))
  9. Richte eine Neubauer-Kammer ein.
  10. Homogenisiere die fixative Lösung mit den Parasiten (vorbereitet in Artikel 6.8) mit einem Wirbelmischer.
  11. Fügen Sie 10 μL der Lösung mit den fixierten Parasiten in die Neubauer-Kammer ein.
  12. Zähle die vier Quadranten der Neubauer-Kammer, die jeweils aus 16 Quadraten bestehen.
  13. Bestimme die Anzahl der Zellen pro mL:
    Anzahl der Zellen (pro mL) = [(n° Zellen pro Quadrat)/4] x Fd x 104
    Wobei:
    Fd (Verdünnungsfaktor) = 50
  14. Säen Sie jede Welle einer 12- oder 6-Well-Kulturplatte mit 5 × 104 oder 10 x10 5 Zellen, die in 1 oder 2 ml RPMI-1640-Supplement-Medium mit 10 % FBS resuspendiert werden.
  15. Stellen Sie die Platten in einen Inkubator mit 5 %CO2, feuchter Atmosphäre und einer Temperatur von 37 °C.
  16. Warte, bis die Zellmonoschicht 100 % Konfluenz erreicht hat.

7. Tachyzoit-In-vitro-Kultivierung

HINWEIS: Für den Plaque-Test empfehlen wir den RH-Stamm von T. gondii.

  1. Entsorge das alte Medium aus einer 25 cm2-Flasche , die eine vollständige Monoschicht (100 % Konfluenz) von NHDF-Zellen enthält, mit einer Pasteur-Pipette. Gib als Nächstes 4 ml frisches RPMI-1640-Komplettmedium in die Flasche.
  2. Übertragen Sie 5 μL eines Supernatanten mit frisch ausgetretenen Tachyzoiten aus einer vorherigen Flasche mit einer lysierten infizierten Kultur. Das Volumen von 5 μL ermöglicht einen lytischen Zyklus von 6–7 Tagen pro 25 cm² Kolben.
  3. Stellen Sie die neu infizierte Flasche in einen Inkubator mit 5 %CO2, einer feuchten Atmosphäre und einer Temperatur von 37 °C.

8. Tachyzoit-Quantifizierung

  1. Entfernen Sie das Medium aus dem Kulturkolben mit den neu ausgetretenen Parasiten mit einer Pasteur-Pipette und übertragen Sie es in ein 15-mL konisches Rohr.
  2. Zentrifugiere das Rohr bei 760 x g bei Raumtemperatur für 2 Minuten. Wenn der Schleuderzyklus abgeschlossen ist, ist am Boden des Rohrs eine sichtbare Kugel zu sehen.
  3. Entsorge das Supernatant vorsichtig.
  4. Setzt das Parasitenpellet mit 1 ml frischem RPMI-1640-Medium mit 2 % FBS wieder auf.
  5. Homogenisieren Sie die Parasitensuspension mit einem Wirbelmischer.
  6. Übertragen Sie 10 μL der Parasitensuspension in ein 1,5-mL-Rohr mit 490 μL 4%ige Formaldehydlösung (1:50 Verdünnung) mit einer Pipette mit steriler Spitze.
  7. Befolgen Sie die in 6.10 bis 6.12 beschriebenen Schritte.
  8. Bestimmen Sie die Anzahl der Tachyzoite pro 1 ml.
    HINWEIS: Anzahl der Tachyzoite (pro mL) = [(n° Tachyzoite im Quadrat)/4] x Fd x 104
    Wobei:
    Fd (Verdünnungsfaktor) = 50

9. Plaque-Assay-Vorbereitung für aktive Moleküle aus einer Chemobibliothek

HINWEIS: Dieser Test zielt darauf ab, Moleküle zu identifizieren, die die Proliferation von T. gondii bei einer Konzentration von 1 μM um mehr als 50 % reduzieren. Vor Beginn dieses Tests muss ein Zytotoxizitätstest (z. B. MTS-Methode oder MTT-Methode) durchgeführt werden, um sicherzustellen, dass die im Plaque-Test verwendeten Stoffkonzentrationen für die Wirtszellen nicht toxisch sind.

  1. Bestätigen Sie, dass die Zellkulturen 100 % Konfluenz in den 12- oder 6-Well-Platten erreicht haben.
  2. Verwerfen Sie das alte Medium und fügen Sie 1 oder 2 ml frisches, ergänztes RPMI-1640-Medium mit 2 % FBS in die 12- bzw. 6-Well-Platten hinzu.
  3. Gib die zu testenden Verbindungen in jedem Brunnen in der gewünschten Konzentration ein. Für das erste Screening wird eine Konzentration von 1 μM empfohlen.
    HINWEIS: Verwenden Sie folgende Formel, um das Volumen zu berechnen, das zu jedem Brunnen hinzugefügt werden soll.
    V (μL) = (Endkonzentration im Bohrloch (μM) x Volumen im Bohrloch (μL))/(Lagerlösung (μM))
  4. Fügen Sie 600 Tachyzoite (für die 12-Well-Platte) oder 1.000 Tachyzoite (für die 6-Well-Platte) der RH-Stämme zu jeder Platte hinzu.
    HINWEIS: Variationen in der Parasitenproliferation können aufgrund von Unterschieden bei den Lieferanten des Kulturmediums (FBS) oder durch die verwendeten Zelllinien entstehen. Daher wird empfohlen, ein Pilotexperiment durchzuführen, um die optimale Anzahl von Parasiten für jede Laborbedingung zu bestimmen. Passen Sie bei Bedarf die Menge des für dieses Experiment verwendeten Parasiten an.
  5. Stellen Sie die Platten für 7 Tage ohne Störung in den Brokubator bei 37 °C mit 5 %CO2 und einer feuchten Atmosphäre.
    VORSICHT: Die Platten dürfen während der 7-tägigen Inkubationszeit nicht bewegt oder berührt werden. Wenn dies geschieht, ist das Experiment ruiniert.

10. Plattenfärbung mit Kristallviolett und Bildaufnahme

  1. Nach 7 Tagen entferne du das Medium aus jedem Brunnen.
  2. Wasche jeden Behälter sorgfältig mit 1x PBS bei Zimmertemperatur.
  3. Verwerfen Sie das PBS und fügen Sie vorsichtig 1 ml 70 % Alkohol zu jedem Behälter hinzu. 15 Minuten bei Zimmertemperatur stehen lassen und dann entsorgen.
  4. Gib die 0,5%ige kristallfarbene violette wässrige Lösung hinzu und lasse sie 30 Minuten bei Zimmertemperatur stehen.
  5. Entferne die Kristall-Violettlösung.
  6. Waschen Sie jeden Brunnen sorgfältig einmal mit deionisiertem Wasser.
    VORSICHT: Wenn Sie das Medium oder PBS während der Waschschritte entfernen, berühren Sie den Boden des Brunnens nicht mit der Pipettenspitze, da dies die Integrität der Monoschicht beschädigen kann. Während der Waschschritte sollten Sie keinen Strahl PBS oder Alkohol direkt auf die Zellen werfen. Fügen Sie sie gründlich entlang des Brunnenrandes hinzu.
  7. Legen Sie den Teller mit der Bildfront nach unten auf saugfähiges Papier, um das überschüssige Wasser abzulassen, und lassen Sie ihn 24 Stunden bei Zimmertemperatur trocknen.
  8. Fotografieren Sie die Platten mit einem hochauflösenden Flachbettscanner28,29 oder einem Bilddokumentationssystem, das für die Coomassie Blue Gel Option 21,22,30 konfiguriert ist.

11. Reversibilitätstest

HINWEIS: Das Hauptziel des Reversibilitätstests mit T. gondii-Tachyzoiten ist zu bestimmen, ob die Proliferationskapazität behandelter Parasiten nach der Entfernung der Verbindungen aus dem Kulturmedium31 vollständig aufgehoben oder verringert ist.

  1. Säen Sie eine 6-Well-Platte mit NHDFcells wie in Schritt 6 beschrieben aus. Für jedes Bohrloch fügen Sie 1 x 10Zellen hinzu , die in 2 mL ergänzten RPMI-1640 mit 10 % FBS resuspendiert sind.
    HINWEIS: Sobald die Zellmonoschicht in jedem Bohrloch 100 % Konfluenz erreicht hat, ist die Platte bereit für den Plaque-Test.
  2. Entsorge das Medium und gib 1 x 10 x4 Tachyzoite, die in 2 ml frischem Medium mit 2 % FBS in jede Welle resuspendiert werden.
  3. Nachdem die Tachyzoite 1 Stunde lang mit den NHDF-Zellen interagieren dürfen, fügen Sie die ausgewählten Verbindungen in einer Endkonzentration nahe dem 90%igen Inhibitor-Konzentrationswert (IC90) hinzu. Ein Brunnen, der nur das Verdünnungsmittel enthält, wird als positive Kontrolle verwendet.
  4. Behandeln Sie die Tachyzoite 4 Tage lang in einem Inkubator bei 37 °C, 5 %CO2 und einer feuchten Atmosphäre.
  5. Nach der 4-tägigen Behandlungsphase wird die Platte dreimal mit 1x PBS bei 37 °C gewaschen, um die vollständige Entfernung der Verbindungen sicherzustellen.
  6. Geben Sie jedem Brunnen 2 ml frisches Medium ohne die Verbindungen hinzu und lassen Sie die Platte weitere 7 Tage im Inkubator aufbewahren.
  7. Beizen Sie die Platte mit Kristall-Violettfarbe und fotografieren Sie sie wie in Schritt 10 beschrieben.

12. Bildanalyse mit der ImageJ-Software

  1. Öffnen Sie die Bilder mit der ImageJ-Software32.
  2. Wählen Sie mit dem ovalen Auswahlwerkzeug die Fläche eines Brunnens aus (Abbildung 1A,B).
    HINWEIS: Bei der Auswahl ignorieren Sie Bereiche an den Brunnengrenzen, die Defekte aufweisen. Diese sind häufig an den Rändern des Brunnens vorhanden.
  3. Kopieren und ein neues Bild erstellen: Kopieren Sie den ausgewählten Bereich durch Drücken von Strg + C; eine neue Bilddatei durch Drücken von Strg + N erstellen; fügen Sie das kopierte Bild mit Strg + V in das neue schwarze Fenster ein.
    HINWEIS: Beim Erstellen des neuen Bildes verwenden Sie die Standardeinstellungen: 8-Bit, Schwarz füllen, 512 x 512 Pixel und einen Schnitt (Abbildung 1C).
  4. Navigiere zu: Bild > Anpassen > Schwellenwert oder drücke Strg + Shift + T (Abbildung 1D).
  5. Im Schwellenwertfenster wählen Sie die Huang - und Rot-Optionen aus und klicken Sie dann auf Auto (Abbildung 1E).
  6. Klicken Sie auf Analysieren und wählen Sie dann Teilchen analysieren (Abbildung 1F). Behalten Sie die Standardoptionen im angezeigten Fenster und klicken Sie auf OK (Abbildung 1G).
  7. Ein neues Fenster wird sich öffnen. Kopieren Sie den in %Fläche angezeigten Wert (durch ein rotes Rechteck in Abbildung 1H hervorgehoben), um den Prozentsatz der Parasitenproliferation oder -hemmung zu berechnen.
  8. Wiederholen Sie diese Schritte für jeden Brunnen auf der Platte.
  9. Um den Prozentsatz der Verbreitung zu berechnen, verwenden Sie folgende Formel:
    % der Proliferation = (%Fläche gut behandelt/%Flächenkontrolle gut) × 100
  10. Um den Hemmungsprozentsatz zu berechnen, verwenden Sie folgende Formel:
    % der Hemmung = [1- (%Fläche gut behandelt/%Flächenkontrolle gut)] × 100

Abbildung 1
Abbildung 1: Schritt-für-Schritt-Analyse der Ergebnisse in der ImageJ-Software. (A) "Oval"-Werkzeugauswahl. (B) Auswahl des Interessensgebiets im Bild. (C) Neues Bildfenster (Strg + N) mit empfohlenen Einstellungen. (D) Schritte für "Schwellenwertanalyse nach Einfügen des interessanten Bereichs im neuen Bildfenster. (E) Huang- und rote Optionsauswahl im Schwellenwertfenster, wodurch alle weißen Bereiche rot ausgefüllt werden. (F) Abfolge der Schritte, die für die "Partikelanalyse analysieren" verwendet werden. (G) Das Setting, das zur Analyse der Partikel verwendet wird. (H) Das Ergebnis des Prozentsatzes der gesamten zerstörten Fläche wird im Übersichtsfenster angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

13. Statistische Analy-Sis

  1. Organisieren Sie die Daten in einer Excel-Tabelle innerhalb der Office-Software, nachdem Sie den Prozentsatz der Verbreitungshemmung berechnet haben.
  2. Öffnen Sie die Software GraphPad Prism 5.0 und klicken Sie auf XY (Unter neuer Tabelle & Graph).
  3. Im Abschnitt Y (unter "X:Fehlerleiste") geben Sie die Anzahl der Datenwiederholungen ein (typischerweise drei biologische Repliken). Diese Anzahl kann je nach Anzahl der durchgeführten Wiederholungen variieren.
  4. Wählen Sie neben dem Plot nur Mean und wählen Sie NICHT "Geben Sie Fehlerwerte ein, die bereits anderswo berechnet wurden", und klicken Sie dann auf Erstellen.
  5. Platzieren Sie die Konzentrationsdaten auf der X-Achse und die Prozentsätze der Proliferationshemmung in die Spalten A, A:Y1, A:Y2, A:Y3, A:Y4, A:Y5.
  6. Klicken Sie auf = Analysieren und dann auf Transformieren, und dann OK. Ein neues Fenster wird sich öffnen. In diesem neuen Fenster klicken Sie auf Transformieren X-Werte mit X = Log(X), dann klicken Sie auf Erstellen eines neuen Diagramms der Ergebnisse und dann auf OK.
  7. Klicken Sie auf = Analysieren und dann auf Normalisieren. Ein neues Fenster wird sich öffnen. Im Abschnitt Wie ist 0 % definiert?, klicken Sie und setzen Sie Y = 0,0. Im Abschnitt Wie ist 100 % definiert? Klicken Sie und setzen Sie Y = 100; Wählen Sie Prozentsätze aus und klicken Sie auf Erstellen eines neuen Diagramms der Ergebnisse.
  8. Klicken Sie auf das Symbol: Eine Kurve mit nichtlinearer Regression oben anpassen = Analyse. Klicken Sie auf Dosis-Antwort – Hemmung, dann auf Log (Inhibitor) vs. normalisierte Antwort – Variable Slope, und klicke dann auf OK.
    HINWEIS: Ein Fenster öffnet sich mit folgenden Ergebnissen: dem IC50 (Inhibitorische Konzentration von 50 %), dem 95%-Konfidenzintervall und dem R2-Wert. Diese Werte sind entscheidend und sollten in einer Ergebnistabelle im Artikel enthalten sein.
  9. Um andere inhibitorische Konzentrationen wie IC25, IC90 oder IC95 zu schätzen, verwenden Sie den Link (https://www.graphpad.com/quickcalcs/Ecanything1.cfm), Quick Calcs - GraphPad; EC: effektive Konzentration. Melden Sie das IC50 und den HillSlope, die durch die Prism-Software für jedes getestete Medikament erhalten wurden.

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Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Für die Bewertung des Plaque-Tests nach der Behandlung sind sowohl die positiven (mit Tachyzoiten infizierte und unbehandelte Zellen) als auch die negativen (nicht infizierten Zellen mit 0,1 % DMSO) Kontrollen entscheidend. Am Ende des Experiments sollte der positive Kontrollbrunnen klar definierte leere Räume mit Überresten haftender Zellen aufweisen (Abbildung 2). Im Gegensatz dazu sollte das Negativkontrollfeld eine intakte Monoschicht ohne leere Räume anzeigen. Die negative Kontrolle ist...

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Standardisierung neuer Protokolle für antiproliferative Tests ist ein grundlegender Schritt zur Förderung der wissenschaftlichen Forschung zur Identifikation zukünftiger Medikamente. Das hier vorgestellte Protokoll bietet einen alternativen Ansatz zur in-vitro-Bewertung der Aktivität bioaktiver Moleküle gegen Tachyzoite von T. gondii. Da T. gondii ein obligater intrazellulärer Parasit ist, der sich durch Gleitbewegung bewegt, werden die Parasiten, wenn sie ...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren erklären, dass sie keinen Interessenkonflikt haben.

Danksagungen

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Die Autoren danken auch der Finanzierung durch das Conselho Nacional de Desenvolvimento e Pesquisa (CNPq), die Fundação de Amparo à Pesquisa de Minas Gerais (FAPEMIG) und CAPES/PROEX. Die Autoren möchten Pró-Reitoria de Pesquisa von der Universidade Federal de Minas Gerais für die Unterstützung dieser Forschung danken. ESMD (CNPq 308082/2023-0) und RWAV (CNPq 305574/2021-3) sind CNPq-Produktivitätsstipendiaten.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,05 % Trypsin-EDTALebenstechnologien25300-062
10 ml serologische PipetteOlenK17-110
15-mL Falcon-RöhrenzentrifugeFanemModell: 206
5 ml serologische PipetteOlenK17-115
6-Well-KulturplatteSarstedt833920
Analytisches GleichgewichtMettler Toledo Modell: AB204 Seriennummer: 1116473813
Antibiotikum-Antimykotikum (100X)Lebenstechnologien15240-062
Automatische PipetteKasviK1-AID
ZentrifugeEppendorfModell 5415 R Seriennummer: 0023591
CO2 InkubatorPHC CorporationModellnummer: MCO-230AICUVL-PA Seriennummer: 210360090
Kulturflasche 25 cm²Sarstedt833910
Dimethylsulfoxid (DMSO) P.A.Merck 1,02,95,21,000
Ethanol P.AMerck1,00,98,31,000
Fetales Rinderserum (FBS)Lebenstechnologien12657-029
Formaldehyd 37-38 %Panreac131328
GraphPad Prism GraphPad-Software-Version 8.0.1
ImageJ  software --Version 1.52e
BilddokumentationssystemeBio-RadModel:  ChemiDoc MP Bildgebungssystem Seriennummer: 734BR2249
Laminarer FlusshaubeVeco do BrasilModell: VLFS-09
L-Glutamin 200 mM (100X)Lebenstechnologien25030-081
Mikroröhre 0,5 mLSarstedt72,699
Neonataler normaler humaner dermaler Fibroblast (NHDF)LonzaCC-3132Großzügig bereitgestellt von Dr. Sheila Nardelli aus Fiocruz Paran, Brasilien
Neubauer-Kammer 0,100 mm 0,0025 mm²Neue Optik7301-1
pHmeterMicronalModell: B374 Seriennummer: 30/37
Pipette 20-200 & Mikro; LKasvi Basic22032893
Pipette 2-20 & Mikro; LLabmate Pro656630226
Pipette  0.2-2 & Mikro; LLabmate Pro556610114
Pipette  1000–5.000 & Mikro; LUniwissenschaftenYM4A021482
Pipette  100-1000 & Mikro; LEppendorf Research PlusQ34354C
Kaliumphosphat monobasisch  (KH2PO4) P.A Synth01F2002.01.AF
RPMI-1640 MediumSigma-Aldrich R0883
Natriumchlorid (NaCl) P.A. Cromoline Quí Glimmer Fina -
Natriumphosphat-dibasische (Na2HPO4) P.A.CRQ Produtos Quimicos EireliR2715920500
Tipp 1.000 & Mikro; LSarstedt7,01,186
Tipp 10 & Mikro; LSarstedt7,03,010
Tipp 5.000 & Mikro; LSarstedt70,11,83,001
Tipp  200 & Mikro; LSarstedt7,03,030
Pipettenübertragung  (3,5 mL) Sarstedt86,11,71,001
Röhre 15 mLSarstedt6,25,54,502
Violetter KristallMerck101408
Vortex-MixerPhoenixModell: AP56 Seriennummer: 6633
WasserbadHemoquimica do BrasilModell: HM1003 Seriennummer: 700001556

Referenzen

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