Methoden zur In-situ-Quantifizierung der mitochondrialen Morphologie in Muskel- und terminalen Schwannzellen von Mäusen

Summary

Lokale Injektionen einer mitochondrialen Farbstoffbeschriftung terminaler Schwann-Zellmitochondrien in vivo zur konfokalen Mikroskopie. Diese Methode nutzt einen Proof of Concept, der im Skelettgewebe von Mäusen mit gesunden oder kranken Muskeln demonstriert wurde, um eine hochauflösende mitochondriale Visualisierung zu ermöglichen.

Abstract

Die Morphologie des mitochondrialen Netzwerks wird häufig als Indikator für die zelluläre Gesundheit verwendet; Die Quantifizierung der mitochondrialen Architektur in intakten Geweben bleibt jedoch technisch herausfordernd. Terminale Schwann-Zellen (tSCs), die für die Erhaltung und Regeneration neuromuskulärer Verbindungen unerlässlich sind, sind aufgrund ihrer anatomischen Lage und ihrer Empfindlichkeit gegenüber Gewebestörungen besonders schwer in situ zu analysieren. Dieses Protokoll beschreibt einen reproduzierbaren Ansatz zur Markierung und Quantifizierung der dreidimensionalen Morphologie des mitochondrialen Netzwerks in ganzmontiertem Skelettmuskel und in tSCs bei Mäusen mittels Standard-Konfokalmikroskopie. Die Methode verwendet in vivo die Abgabe eines membranpotenzialsensitiven mitochondrialen Farbstoffs, gefolgt von schneller Gewebeverarbeitung und hochauflösender konfokaler Bildgebung. Bildstacks werden analysiert, um die Verbindung des mitochondrialen Netzwerks, die Fläche und die Fragmentierung zu quantifizieren. Das Protokoll wird zunächst in dystropher und gesunder Skelettmuskulatur validiert, um erwartete Unterschiede in der mitochondrialen Morphologie zu bestätigen, und anschließend angepasst, um mitochondriale Netzwerke in tSCs, die mit S100β-Reportermäusen identifiziert wurden, zu visualisieren und zu quantifizieren. Dieser Ansatz ermöglicht die Analyse der mitochondrialen Morphologie in intakten neuromuskulären Geweben, ohne transgene mitochondriale Reporter oder spezialisierte Bildgebungsplattformen zu benötigen. Das Protokoll benötigt nur Geräte, die in Universitätskerneinrichtungen üblicherweise verfügbar sind, und kann an andere dünne oder oberflächlich zugängliche Gewebe angepasst werden.

Introduction

Mitochondrien sind bemerkenswert plastische Organellen, die als Lunge der Zelle fungieren und während der zellulären Atmung Sauerstoff aufnehmen, um die Produktion von Adenosintriphosphat (ATP) als Reaktion auf den Stoffwechselbedarf^zu unterstützen. Während sie früher als diskrete Organellen galten, ist heute bekannt, dass Mitochondrien hoch integriert^{sind, 2,3,4} und sich im gesamten Netzwerk ein Energiesubstrat entsprechend den lokalen Anforderungen teilen. Integration bietet einen deutlichen Vorteil gegenüber der Isolation: Verbundene Mitochondrien unterstützen Energiedefizite und erhalten elektrochemische Gradienten für oxidative Phosphorylierung bei erhöhtem Stoffwechselbedarf aufrecht. Tatsächlich entsprechen Verteilung, Volumen und Morphologie der Mitochondrien dem Energiebedarf in ihrer Nähe⁵. Im Gesundheitswesen wird der regelmäßige Austausch mitochondrialer Netzwerke durch mitochondriale Biogenese, Fusions- und Spaltungsereignisse sowie Mitophagie ^2,3 aufrechterhalten. Die mitochondriale Biogenese ist erforderlich, um gesunde Mitochondrien zu erhalten und auszubauen. Die metabolische Bedarf, wie etwa körperliche Betätigung, erhöht die Expression des peroxisome-proliferator-aktivierten Rezeptors γ Co-Aktivator 1α (PGC-1α)⁵. Dieser Prozess erfolgt über primäre Ausdauersignale, insbesondere über die durch Belastung induzierte Erhöhung der AMP-aktivierten Proteinkinase (AMPK), Kalzium und reaktiven Sauerstoffspezies ^6,7. Fusion erweitert Netzwerke, fördert die Überlebensfähigkeit und ergänzt Defizite, während Spaltung weitere mitochondriale Schäden durch den bevorzugten Ausschluss der dysfunktionalen Region ^2,3,8 mindert. Nach der Entfernung müssen ausgeschlossene Regionen eine Mitophagie unterziehen, um die Ansammlung dysfunktionaler Organellen und Proteine zu verhindern ^6,9.

Skelettmuskulatur macht etwa 40 % der Körpermasse aus und ist auf Mitochondrien für den aeroben Stoffwechsel und die zelluläre Signalübertragung angewiesen, um die Homöostase aufrechtzuerhalten. Insgesamt sind bei Erkrankungen einer Skelettmuskeldysfunktion die mitochondrialen Qualitätskontrollmechanismen beeinträchtigt¹⁰. Untersuchungen zur Muskeldysfunktion messen typischerweise die mitochondriale Atmung, das Volumen, die Morphologie und die Produktion reaktiver Sauerstoffspezies (ROS), um die mitochondriale Qualität^{zu bewerten 3,10}. In dieser Hinsicht ist bei längerer Muskeldysfunktion die mitochondriale Atmung reduziert, während die ROS erhöht ist und die Netzwerke^{um 3,10} fragmentiert sind. Störungen in der mitochondrialen Morphologie entstehen hauptsächlich durch die Aktivierung von mitochondrialen Spaltproteinen, dem dynamin-bezogenen Protein 1 (DRP1) und der mitochondrialen Spaltung 1 (FIS1)^2,8,11. Als Reaktion auf Muskelatrophie rekrutiert FIS1, das sich auf der Oberfläche der äußeren Mitochondrienmembran befindet, DRP1 dazu, mit mehreren DRP1-Dimeren zu oligomerisieren und so einen Filament um die Mitochondrien zu bilden, der in der Größe abnimmt, bis ein bestimmter Abschnitt der Mitochondrien "abgekneift" wird, was die Fragmentierung ^3,11 fördert. Zusammen sind Überaktivität der mitochondrialen Spaltung, Verringerungen der Fusion neu gebildeter Mitochondrien und dysfunktionale Mitophagie verantwortlich für das fragmentierte Auftreten dysfunktionaler mitochondrialer Netzwerke, wie sie in inaktiven oder kranken Muskeln^{beschrieben sind 2,12}.

Der neuromuskuläre Übergang (NMJ) ist der Ort der muskulären Anregung. Aktionspotenziale, die im Soma initiiert werden, propagieren entlang von Axonen, die von myelinisierenden Schwannzellen (SCs) umhüllt sind, und enden an NMJs, die von terminalen Schwann-Zellen (tSC) eingeschlossen sind. NMJs können sich nach einer Verletzung regenerieren. Allerdings nehmen die Wahrscheinlichkeit und Geschwindigkeit der Regeneration ab, da der Abstand zwischen der Verletzungsstelle und dem NMJ^{um 13,14} steigt. Nach einer Nervenverletzung durch Durchschnitt, Quetschung oder Dehnung dedifferenzieren die SCs in einen demyelinisierten, progenitorähnlichen Zustand^15,16. Demyelinisierte SCs vermehren sich und arbeiten gemeinsam mit Makrophagen zusammen, um die lokale Umgebung für die Regeneration umzugestalten, indem sie Ablagerungen zwischen der Verletzungsstelle und dem proximalen Axonstumpf durch Wallerianische Degeneration^17,18 entfernen. Migrierende SCs signalisieren eine Entzündungsreaktion, die das Umfeld für eine erfolgreiche Nervenregeneration^umgestaltet. Die Nervenregeneration findet in der neuronalen Hülle statt, die von den progenitorähnlichen SCs gebildet wird, welche Bünger-Bänder bilden, durch die die Axone¹⁹ nachwachsen. Der Axonstumpf dehnt dann die Filopodien aus, um die Wiedernervation¹⁴ einzuleiten. Nach der Wiedernervation kann die Presynapse vollständig regenerieren, vorausgesetzt, tSCs reinvestieren am NMJ²⁰.

Die mitochondriale Morphologie variiert deutlich zwischen Zelltypen und entspricht der Gewebefunktion²¹. Berichte aus Lebergeweben deuten darauf hin, dass Mitochondrien kompakter und kugelförmiger sind, während die in der weißen Substanz im Gehirn länglicher und röhrenförmiger²² sind. Bei einer Herausforderung, wie bei Alterungsbedingungen und oxidativem Stress, zeigen Mitochondrien in diesen Geweben einen donutähnlichen Phänotyp. Bei Osteoblasten hingegen war die Bildung und Fragmentierung von mitochondrialen Donuts mit einer erhöhten Sekretion von Mitochondrien und mitochondrial abgeleiteten Vesikeln sowie mit der Osteoblastenreifung^{verbunden 23}. Obwohl die mitochondrialen Netzwerke der Skelettmuskulatur über mehrere Arten hinweg umfassend untersucht wurden, bestehen weiterhin Einschränkungen bei der Bildgebung mitochondrialer Netzwerke von tSCs des peripheren Nervensystems. Diese sind in ihren natürlichen Lebensräumen schwer einzufangen, da die Zellultrastruktur nach der Isolierung stark verändert wird und diese Gewebe schwer mit Farbstoff in vivo anzugreifen sind, ohne zusätzlich die begleitende Skelettmuskulatur zu belasten.

Bildgebende Techniken, die zur Erfassung der mitochondrialen Morphologie in lebenden Systemen verwendet werden, können entweder als Licht- oder Elektronenmikroskopie^{kategorisiert werden}. Mit der traditionellen Lichtaufnahmemikroskopie können Farbstoffe lebende Zellen markieren, fixierte Zellen immunmarkiert und Mitochondrien genetisch^{markiert werden 5,24}. Die Live-Cell-Bildgebung erfordert typischerweise 20–60 Minuten Inkubation von Zellen, bevor die Fluoreszenzanalyse durchgeführt wird. Farbstoffe werden über das Membranpotential zu den Mitochondrien geleitet und können daher unter Bedingungen mit verändertem Membranpotential⁵ verändert werden. Die Erfassung der mitochondrialen Morphologie von tSCs im Skelettmuskel durch Farbstoffladung ist theoretisch möglich; Allerdings wäre eine Bildgebung ganzer Gewebe und detaillierte Markierungstechniken erforderlich. Insbesondere erfasst es Mitochondrien innerhalb intakter Strukturen, ohne Beeinträchtigung durch die Markierung des Skelettmuskels. Um diese Einschränkungen zu überwinden, wurde die mitochondriale fluoreszierende Färbung verwendet, um lebende Skelettmuskulatur bei gesunden und dystrophen Mäusen zu markieren, gefolgt von der Markierung von tSC-Mitochondrien für in vivo- und in situ-Bildgebung. Der Tibialis anterior (TA) wurde ausgewählt, um die Bildgebung der Skelettmuskulatur aufgrund seiner oberflächlichen anatomischen Lage, seines gut charakterisierten Injektionsvolumens, der myofaszialen Dispersion 25,26,27 sowie seiner Eignung für gleichzeitige funktionelle Messungen zu optimieren. Der Musculus gluteus maximus (GM) wurde für die tSC-Bildgebung ausgewählt, basierend auf dem etablierten Injektionsverfahren^28,29, seiner dünnen Architektur, die die Hintergrundfluoreszenz minimiert, und der oberflächlichen ventralen Positionierung neuromuskulärer Verbindungen zwischen GM und Gluteus medius, was eine bevorzugte Markierung von tSCs vor den Skelettmuskelfasern ermöglicht.

Protocol

Sechs Monate alter (n=3) erwachsener männlicher DBA/2J [Wildtyp (WT)] (RRID: IMSR_JAX:000671) und D2.B10-DMD^D2.mdx/J [D2.mdx (mdx)] (RRID: IMSR_JAX:013141), während ein drei- bis fünf Monate alter (n=8) erwachsener Mann und Weibchen B6; D2-Tg(S100-EGFP)^1Wjt/J (S100B) (RRID: IMSR_JAX:005621) [ebenfalls mit WT zusammengelegt, da keine Unterschiede von DBA vorhanden sind] wurden aus einer fortlaufenden Kolonie von von Forschern gehaltenen Mäusen verwendet. Der gesamte experimentelle Arbeitsablauf für TA- und GM-Injektionen, Gewebeverarbeitung und Bildgebung ist in Abbildung 1 zusammengefasst. Ein zusätzlicher D2. mdx mouse wurde für die tSC-Bildgebung in MDX (n=1) von einem Forscher gespendet. Alle Tierverfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der Texas A&M University (AUP 2022-0215) genehmigt und gemäß dem National Research Council Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (8. Auflage)³⁰ durchgeführt. Die Euthanasie erfolgte durch eine zervikale Verrenkung unter einer anästhetischen Überdosis von Isofluran.

1. Herstellung einer fluoreszierenden mitochondrialen Färbe-Arbeitslösung von 2 μM

1. Suspendieren Sie die mitochondriale Färbung (50 μg) in 322 μL Dimethylsulfoxid (DMSO) gemäß den Anweisungen des Herstellers, um eine 200 μM große Serienlösung herzustellen.
2. Um 30 mL 2 μM Arbeitslösung herzustellen, werden 300 μL 200 μM Lagerlösung in 29,7 mL sterile Kochsalzlösung übertragen. Gründlich mischen.
3. Aliquot 250 μL der 2 μM Arbeitslösung in Mikrozentrifugenröhren und bis zur Nutzung bei -80 °C gelagert.
   HINWEIS: Nach 3 Jahren Lagerung bei -80 °C wurde keine nachweisbare Signalverschlechterung festgestellt.

2. Farbstoff und Tiervorbereitung

1. Einen gefrorenen Aliquot 15 Minuten vor dem Experiment auftauen. Ziehen Sie die Lösung in eine 30-G-Insulinspritze mit 1 cc.
2. Betäube das Tier mit Isofluran. Tragen Sie eine Augensalbe auf, rasieren Sie die Injektionsstelle und halten Sie die Körpertemperatur mit einer Wärmelampe mit einer Temperatursonde zwischen Tier und Wärmequelle aufrecht.
3. Reinigen Sie die rasierte Injektionsstelle mit 70 % Isopropylalkohol.

3. Tibialis anterior (TA) mitochondriale Farbstoffverabreichung und Funktion

1. TA-Farbstoffverabreichung
   1. Injizieren Sie 50 μL 2 μM mitochondriale Färbung in den rechten TA-Muskel der narkosierten WT- und D2.mdx-Mäuse.
   2. Führe die Nadel an der distalen Sehne in Richtung des Knies ein und drücke den Pümpel, während du die Nadel entlang des Einstichwegs zurückziehst.
   3. Inkubieren Sie den Farbstoff in vivo für 1 Stunde vor der Sektion.
2. TA-Muskelfunktionsmessungen
   1. Nach 45 Minuten Farbstoffinkubation betäubt man die Maus mit Isofluran (2 %–3 % Induktion, 1,5–2 % Sauerstofferhaltung).
   2. Den linken TA-Muskel operativ freilegen und gleichzeitig das umliegende Gewebe erhalten. Verbinden Sie die distale Sehne mit dem Lastträger des Muskeltestsystems.
   3. Wickle den freiliegenden Muskel mit einem Labortuch und spüle bei 3 mL Min⁻¹ mit 0,9 % steriler Kochsalzlösung, erwärmt auf 40 °C. Halten Sie die Muskeltemperatur mit einer Wärmelampe bei 32 °C.
   4. Positioniere Platin-/Iridium-Drahtelektroden quer über den Muskelbauch für direkte Stimulation.
   5. Den Laststrahl an einen Mikrometer anschließen und die optimale Länge (L₀) mit Twitch-Kontraktionen (T_w) bei 1 Hz einstellen. Zeichnen Sie L₀ mit einem digitalen Kaliper auf.
   6. Maximale tetanische Kontraktionen (P₀) werden dreimal bei 140 Hz mit 60 Sekunden Ruhe zwischen den Kontraktionen induziert. Zeichnen Sie den höchsten Kraftwert (g) auf. Sammeln Sie Daten mit dem Muskelfunktionssystem und Analysesoftware.
3. TA-Gewebeverarbeitung
   1. Nach der Inkubation wird der TA-Muskel vor der Euthanasie isoliert und seziert.
   2. Lege isolierte Muskelfaserbündel in 4 % Paraformaldehyd bei Raumtemperatur für 15 Minuten, während du die Fasern sanft unter einem Stereomikroskop berührst.
      VORSICHT: Paraformaldehyd ist giftig und sollte in einer chemischen Abzugshaube mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (Laborkittel, Handschuhe und Augenschutz) behandelt werden.
   3. Fügen Sie zellpermeant Nukleinsäurefärbung zu einer Endkonzentration von 5–10 μg/mL hinzu, um die Kerne zu kennzeichnen.
   4. Waschen Sie die Proben jeweils 5 Minuten lang in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), um überschüssige Farbe zu entfernen.
   5. Dehydriere die Proben nacheinander in 50 %, 75 % und jeweils 5 Minuten lang 100 % Ethanol.
   6. Proben werden sequentiell in den Gewebereinigungslösungen I und II für jeweils 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, wobei ausreichend Volumen verwendet wird, um das Gewebe vollständig zu untertauchen.
   7. Lege die freigeräumten TA-Bündel auf einen Deckdeckel und glätte sie vorsichtig mit einem Glasblock (2,5 cm × 2 cm × 1 cm; Masse 7,8 g)²⁶.

4. Bildgebung von TA-Muskelproben

1. Bildmuskelproben mit einem konfokalen Mikroskop, um hochauflösende dreidimensionale (3D) optische Schnitte zu erhalten.
2. Nehmen Sie Z-Stack-Bilder in einer Tiefe von etwa 100 μm für Muskeln mit einem 63-fachen Vergrößerungsobjektiv auf (N.A. 1.40).
3. Verwenden Sie die konfokale Software des Bildgebungssystems mit einer Anregungswellenlänge von 646 nm, um die größtmögliche Klarheit mit möglichst wenig Hintergrund zu erzielen.
4. Bilder werden im Dekonvolutionsmodus aufgenommen, wobei "Systemoptimierte" Parameter mit 1 μm Schrittweite verwendet werden.
   HINWEIS: Um Dehydrierung und Photobleaching entgegenzuwirken, überführen Sie das Gewebe in Gewebereinigungslösung II und legen Sie es auf einen Deckzettel. Geben Sie vor der Bildnahme zwei Tropfen Klarlösung 2 direkt auf das Gewebe.

5. GM-Muskel-tSC-Farbstoffladung und Bildgebung

1. Verwenden Sie S100β-Mäuse zur spezifischen fluoreszierenden Identifikation von tSCs.
2. Führen Sie einen kleinen Hautschnitt über dem GM-Muskel durch. Injizieren Sie 75 μL einer 2 μM großen, weitroten fluoreszierenden mitochondrialen Färbung unter dem GM, vor dem Wundverschluss²⁵.
3. Schließen Sie die Wunde und lassen Sie den Farbstoff 45 Minuten lang inkubieren, um tSCs selektiv zu markieren, ohne die darunterliegenden Muskelfasern signifikant zu markieren.
4. Seziere die GM-Muskeln und lege sie sofort in gekühlte, 0,9% sterile Kochsalzlösung. Reduzieren Sie schnell überschüssiges Fett und Bindegewebe.
5. Übertragen Sie die dissektionierten Spielleiter auf einen Deckzettel zur Bildgebung.
6. Nur bei Verwendung von D2.mdx-Mäusen sollte ein fluoreszierender Acetylcholinrezeptor-(AChR)-Farbstoff mit einer Verdünnung von 1:500 in das Mikrodissektionsbad gegeben werden. Inkubieren Sie das Gewebe für 30 Minuten, um die postsynaptischen Komponenten der neuromuskulären Verbindung (NMJ) sichtbar zu machen.
7. Verwenden Sie diesen dual-labeling-Ansatz, um postsynaptische Mitochondrien von tSC-spezifischen Mitochondrien zu unterscheiden.
   VORSICHT: Beschränken Sie die Sektion und Reinigung des GM auf höchstens 10 Minuten vor dem Auftragen auf einen Deckzettel zur Bildgebung, um morphologische Veränderungen nach der Sektion zu minimieren. Dieses Zeitlimit ist entscheidend, um morphologische Veränderungen nach der Sektion und den mitochondrialen Abbau zu minimieren.
8. Führen Sie eine Konfokalmikroskopie durch, um hochauflösende, dreidimensionale (3D) optische Schnitte zu erhalten.
9. Nehmen Sie Z-Stack-Bilder in einer Tiefe von etwa 16 μm für tSCs mit einem 20-fachen Vergrößerungsobjektiv auf (N.A. 0,75). Aufnehmen Sie hochauflösende, repräsentative Bilder einzelner tSCs mit einem 63-fachen Vergrößerungsobjektiv.
10. Führen Sie Montageverfahren durch, um Gewebedehydrierung und Photobleaching während der Bildgebung zu minimieren.
    VORSICHT: Übertragen Sie Gewebe in Kochsalzlösung auf einen Deckdeckel, wobei die Bauchseite für die inverse Mikroskopie nach unten zeigt.
11. Tragen Sie 2 μL allgemeines Befestigungsmedium auf die dorsale Oberfläche des GM auf.
12. Glätten Sie das Gewebe vorsichtig mit einem kalibrierten Glasblock (2,5 cm × 2 cm × 1 cm; Masse 7,8 g), um eine gleichmäßige Bildfläche zu gewährleisten.

6. Fokussierte Ionenstrahlmikroskopie

1. Führen Sie eine fokussierte Ionenstrahl-Rasterelektronenmikroskopie (FIB-SEM) gemäß den zuvor festgelegten Protokollen²⁶ durch.
   1. Wenden Sie FIB-SEM speziell an, um neuartige morphologische Merkmale, die während der konfokalen Bildgebung identifiziert werden, zu bestätigen und zu visualisieren.

7. Bildanalyse

1. TA-Muskelproben
   1. Durchführung einer quantitativen Analyse von konfokalen optischen Schnitten (1 μm) von TA-Scans (ca. 75–112 μm dick) mit KI-gesteuerter Bildanalysesoftware.
      HINWEIS: Führen Sie vor der automatisierten Segmentierung mehrere überwachte Trainingssitzungen durch, um die Anpassung des Algorithmus zu verbessern.
   2. Importiere einzelne optische Abschnitte (Z-Schnitte), um der Software beizubringen, pixelige Informationen zu behalten, die weiße mitochondriale Farbstoffe darstellen, während der schwarze Hintergrund ausgeschlossen wird.
   3. Entwickeln Sie Bildmasken für die Überprüfung durch Ermittler, um eine hochwertige Analyse und Genauigkeit sicherzustellen.
   4. Separate 3D-Bildstapel in einzelne optische Abschnitte nach Algorithmusoptimierung.
   5. Wählen Sie jeden fünften Z-Schnitt aus jedem 3D-Bild zur Analyse aus, wobei jeder Datenpunkt den Durchschnitt dieser einzelnen Abschnitte pro Probe darstellt.
   6. Quantifizieren Sie die mitochondriale Morphologie, um räumliche Verteilung und Netzwerkkonnektivitätsmetriken herzuleiten.
   7. Standardisieren Sie Intensitätsschwellenwerte, Kantenerkennungseinstellungen und Voxelgrößenkalibrierung über alle Proben, um die experimentelle Variabilität zu minimieren.
2. tSCs auf GM-Proben
   1. Setze 1 μm große optische Abschnitte in Z-Stacks (etwa 6–25 μm dick) zusammen und trenne Bilder in einzelne Farbkanäle mit 2D-Bildanalysesoftware.
   2. Kalibrieren Sie Software mit Skalenbalken und wenden Sie Schwellenwerte an, um die Visualisierung der tSC-Mitochondrien mit minimaler Hintergrundstörung zu optimieren.
   3. Führen Sie eine Binarisierung durch und entfernen Sie Hintergrundrauschen, um tSC-Mitochondrien oder tSCs für die Messung von Flächen- und Partikelzahlen zu isolieren.
   4. Speichern Sie binäre Bilder, um eine konsistente Verarbeitung zu gewährleisten, und führen Sie alle Bildversuche unter identischen Bedingungen durch, um die Reproduzierbarkeit über biologische Replikationen hinweg zu gewährleisten.

8. Immunhistochemie

1. Links von TA-Muskelproben wurde in eine optimale Schnitttemperatur (OCT)-Verbindung eingebettet, um die Querschnittsfläche (CSA) zu bewerten.
   1. Schnittproben mit 10 μm Dicke werden mit einem auf -17°C eingestellten Kryostat geschnitten und auf Mikroskopobjektträgern gesammelt.
   2. Färbung der Muskelquerschnitte für Laminin, um Myofasergrenzen zu identifizieren, wobei Kaninchen-Antilaminin-Primärantikörper (1:400) und Ziegenanti-Kanin-Rhodamin Sekundärantikörper (1:400) verwendet werden.
   3. Montage der Schlitten vor der Bildgebung mit einem geeigneten Montagemedium.
2. Bildabbilder werden mit einem Konfokalmikroskop durchgeführt, indem pro Probe 2–3 Interessenbereiche (580 x 580 μm) mit einem 20x (N.A. 0,75) Objektiv ausgewählt werden.
3. Durchschnittswerte über Regionen pro Muskel hinweg und analysieren etwa 400 Myofasern pro TA-Muskelabschnitt.
4. Verwenden Sie halbautomatische Muskelsegmentierungssoftware, um CSA (μm²) zu bestimmen, indem Sie die Myofasern maskieren.

9. Statistische Analyse

1. Berichte zusammenfassende Daten als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (S.E.M.).
2. Führen Sie statistische Analysen mit einer speziellen Statistiksoftware durch, wobei parametrische, ungepaarte Schüler-t-Tests verwendet werden, um die Signifikanz zwischen den Gruppendurchschnittsunterschieden zu bestimmen.
3. Führen Sie einfache lineare Regressionen zu CSA und Muskelkraft aus TA-Muskeln durch, wobei diese als Marker der DMD-Pathologie verwendet werden, um die mitochondriale Morphologie von TA-Muskeln und GM-tSCs zu vergleichen.
4. Bewertung der Pearson-R-Korrelationskoeffizienten, um die Korrelation zwischen DMD-Pathologie und mitochondrialer Pathologie zu bestimmen. Definieren Sie die statistische Signifikanz als P ≤ 0,05.

Results

Mitochondriale Netzwerke zeigten erwartete Verringerungen der Konnektivität
Repräsentative 3D-fluoreszierende Bilder von TA-Muskelkonfokalscans in zwei Gruppen, WT und MDX, werden präsentiert (Abbildung 2). Im Vergleich zur WT-Gruppe scheint die mitochondriale Konnektivität bei MDX-Mäusen im Vergleich zur WT vermindert zu sein (Abbildung 2A–D). Bei mdx-Mäusen wurden größere Mengen kleiner mit...

Discussion

Die Lage der Mitochondrien in zellulären Strukturen sowie deren Morphologie korrelieren mit der Mitochondriengesundheit und dem metabolischen Bedarf²¹. Angesichts der klinischen Relevanz der mitochondrialen Gesundheit, verbunden mit unterschiedlichen Atmungskinetiken und Morphologien verschiedener Zelltypen, wurde nach der ersten Untersuchung der Methode in der Skelettmuskulatur eine leicht anwendbare, konfokalmikroskopische Methode zur Bewertung mitochondrialer M...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-in-1 Whole Animal System	Aurora Scientific, Ontario, Canada	1300A	Muskelfunktionssystem mit Analysesoftware
AIVIA	Leica Microsystems, Bellevue, WA, USA	15	KI-gesteuerte Bildanalysesoftware
anti-laminin	MilliporeSigma	L9393-.2mL	Myofiber-Randbeschriftung
B6; D2-Tg(S100-EGFP)1Wjt/J Mausstamm	Jackson Labs, Bar Harbor, ME	JAX:005621	S100β
Cryostar NX50 Kryostat	Epredia, Kalamazoo, MI, USA	https://www.epredia.com/products/histology-instruments/cryotomy/cryostar-nx50	Kryostat
D2.B10-DMDD2.mdx/J Mausstamm	Jackson Labs, Bar Harbor, ME	JAX:13141	D2.mdx
DBA/2J Mausstamm	Jackson Labs, Bar Harbor, ME	JAX:00671	WT
Dimethylsulfoxid (DMSO)	Fisher Scientific; Hampton, NJ, USA	BP231-100	Mitochondriales Färbemittel zur Rekonstitution
Hoechst 33342	Thermo Fisher Scientific	H1399	Zellpermeable Färbung der Nukleinsäure
ImageJ/Fiji	National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA	SCR_002285	2D-Analysesoftware
Invitrogen ProLong Gold Antifade-Reagenz mit DAPI	Fisher Scientific, Hampton, NJ, USA	P36941	Einbettungsmittel
KimWipe	Kimberly-Clark, Irving, TX, USA	06-666A	Labor-Wischtücher
Leica LAS_X Software	Leica Biosystems, Wetzlar, Germany	SCR_013673	Konfokal-Software
MitoView Fix 640	Biotium	70075-50ug	Far-Red Fluoreszenz mitochondrialer Farbstoff
NIS-Elements Advanced Research Software	Nikon, Melville, NY, USA	SCR_014329	Software zur Analyse der Querschnittsfläche
Permount Einbettungsmittel	Fisher Scientific, Waltham, MA 02454, USA	#SP15-100	Allgemeines Einbettungsmittel
Prism 9 Software	GraphPad Software, La Jolla, CA, USA	RRID: SCR_002798	Statistische Analysesoftware
Rhodamin (TRITC)	Fisher Scientific; Hampton, NJ, USA	AP132RMI	Sekundärantikörper
Stellaris 5 White Light Konfokalmikroskop und entsprechende Dekonvolutionssoftware	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany	158301313:158201310:158004752: 158301312:158301314:158401100: 158209011:158301130:158204510: 158301120:158401140:158204511: 15500332:15506428:15506517:155 13859:15521522:15525226:155252 32:15525314:15555009:15555017: 15555046:27100022:155933660: 155933666:155933668:158000640 :158002407:158003150:158004141 :158004201:158004421:158004423 :158200681:158202140:158203114: 158203200:158203220:158204201: 158204510:158204709:158301200: 9I_LL_STELLARIS_C:9T-CLSM-APP _CLASSC:9WE_LAS_405:9WE_ LAS_WLL:9WE_LL_STELLARIS_C	Konfokalmikroskop
SZ61	Olympus, Breinigsville, PA, USA	sz61	Stereomikroskop
Tissue-Plus O.C.T. Compound	Scigen, Fischer Scientific, Hampton, NJ, USA	23-730-571	Optimale Schneidtemperatur-Verbindung
Visikol I	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	H1-30	Gewebeklarlösung 1
Visikol II	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	H2-30	Gewebeklarlösung 2
α-Bungarotoxin 552	Biotrend, Köln, Germany	00014	Acetylcholin-Rezeptor-Farbstoff