Methodenartikel

Ein präklinisches Modell der Synovitis unter Verwendung ex vivo menschlichen Synovialgewebes mit erhaltener Funktion und Architektur

DOI:

10.3791/69734

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20. März 2026

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1Department of Emergency Medicine, University of Iowa Health Care, 2Interdisciplinary Graduate Program in Immunology, University of Iowa, 3Department of Orthopedics and Rehabilitation, University of Iowa Health Care, 4Carver College of Medicine, University of Iowa, 5Office of Research and Development, Iowa City Veterans Affairs Health Care System, 6Department of Internal Medicine, University of Iowa Health Care, 7Iowa State University, 8Department of Veterinary Biosciences, Ohio State University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Wir entwickelten ein humanes ex-vivo-Transwell-System , das in der Lage ist, akute entzündliche, infektiöse und strukturelle Veränderungen im Synovium zu bewerten.

Zusammenfassung

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Arthritis ist ein entzündlicher Zustand in Gelenken, der zu Knorpelschäden, Schmerzen und Verlust der Beweglichkeit führt. Jüngste Fortschritte in der Arthritisforschung zeigen insbesondere, dass die Gelenkkapsel (z. B. Synovium) eine wichtige Quelle dieser Entzündung ist, aber es gibt keine menschlichen Modelle, die die wesentliche synovale Architektur replizieren. Um dem entgegenzuwirken, wurde das Joint Space Analysis System, oder JSAS, geschaffen. Das vordere Synovium wurde intraoperativ von Patienten erhalten, die sich einer Total Knee Arthroplasty (TKA) unterzogen hatten. Das Synovium wurde seziert und in 3-mm-Biopsiekerne zerschnitten. Die Kerne wurden im oberen Brunnen eines 5 μm oder 0,4 μm großen Transwells mit 300 μl DMEM und 10 % FBS platziert. Im unteren Brunnen wurden 600 μL Medium hinzugefügt und alle 2-3 Tage ausgetauscht. Die Lebensfähigkeit wurde bis zu 7 Tage unter hyperoxischen (50 %), atmosphärischen/standardisierten (~21 %) und physiologischen (5 %) Inkubationsbedingungen bewertet. Zu den Reizen im unteren Brunnen gehörten das monozytische Chemoattractant-Protein 1 (MCP-1/CCL2), Lipopolysaccharid (LPS), N-Acetylcystein, S. aureus und B. burgdorferi. Das Medium wurde für ELISA gespeichert, und Gewebe für die Formalin-Fixed-Paraffin-Embedded (FFPE)-Analyse. Unter Standardbedingungen blieb das Synovium 3 Tage lang vollständig lebensfähig. Der Reiz veränderte die Struktur und Funktion der intimen und sublinierenden Synovialzellen, einschließlich des Verlusts der residenten Makrophagengrenze, Sublining-Expansion, Hochregulierung pathogener Fibroblasten und Produktion von Zytokinen IL-1β und TNFα. Immunzellen und Fibroblasten wanderten laut Durchflusszytometrieanalyse in die untere Kammer (5 μm Poren). Mobile B. burgdorferi wanderte bei einer Porengröße von 0,4 μm ins Gewebe, während der nicht bewegliche S. aureus dies nicht tat. Relevante Zytokine wurden in ausreichender Menge für ELISA exprimiert. JSAS ist ein modulares System, das in der Lage ist, akute Veränderungen am menschlichen Synovium zu untersuchen und die Komplexität von 3D-Strukturen in einem präklinischen Modell zu ermöglichen, während biologisch relevante Struktur und Funktion erhalten bleibt.

Einleitung

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Arthritis betrifft über 20 % aller Erwachsenen in den USA und 50 % der über 65-Jährigen mit chronischen Erkrankungen1. Es ist auch eine der weltweit führenden Ursachen für Behinderung2. Arthritis umfasst nicht nur Knorpelschäden, sondern auch eine Entzündung der Gelenkkapsel oder des Synoviums (z. B. Synovitis). Chronische Synovitis ist wahrscheinlich eine Hauptquelle proinflammatorischer Zytokine, die Knochen- und Knorpelschäden bei Arthrose und rheumatoider Arthritis verstärken 3,4. Daher ist das Verständnis der immunvermittelten Veränderungen im Synovium wahrscheinlich unerlässlich, um neue therapeutische und möglicherweise präventive Optionen für Patienten mit Arthritis zu entwickeln.

Das Synovium ist eine organisierte Struktur, die aus zwei Hauptschichten besteht: der zellulären Intimverkleidung (IntL) und der Sublinierung (SubL). Das IntL verbindet sich mit der Synovialflüssigkeit (SF), und das SubL bildet SF-Komponenten und enthält Gefäßstrukturen5. Im IntL gibt es sowohl Makrophagen als auch fibroblastähnliche Synoviozyten (FLS). Die Makrophagen des IntL sind ansässige Zellen, die lokal durch interstitielle Makrophagen innerhalb desSubL-6 erneuert werden. Diese residenten synovialen Makrophagen (RSMs) sind durch die Expression von CD206 und TREM2 M2-verzerrt, epithelialisiert und exprimieren Marker für enge Übergänge. Diese Unterstruktur des IntL könnte entscheidend für die funktionelle und physische Aufrechterhaltung der Gelenkraumhomöostase 5,6 sein. Dies wurde bei rheumatoider Arthritis (RA) beobachtet. Zum Beispiel erleben Patienten mit rheumatoider Arthritis, wenn das IntL zusammenbricht, Schübesymptome, die verschwinden, wenn sich die Schleimhaut wiederaufbaut 6,7. Spontane RA-Remission ist speziell mit MerTK +CD206+ synovialen Makrophagen7 assoziiert. RSMs wurden auch in SF bei Patienten mit akuten Gelenkschmerzen identifiziert, wobei festgestellt wurde, dass die Schwere der Infektions- oder Entzündungskrankheit mit der Menge der RSMs und entzündlichen Zytokine8 korrelierte. Leider ist die Beziehung zwischen den IntL- und SubL-Strukturen, funktionellen Veränderungen von RSMs und FLS sowie der Produktion von entzündlichen Mediatoren, die Knorpel und/oder Knochen schädigen könnten, besonders beim Menschen schwer zu hinterfragen.

Um die zugrunde liegenden Mechanismen der Synovitis in mehreren klinisch relevanten Umgebungen zu untersuchen, wurde ein humanes ex vivo Modell namens Joint Space Analysis System (JSAS) entwickelt. Dieses System liefert reproduzierbare Ergebnisse mit modularen Elementen, um eine umfassende Untersuchung von entzündlicher und infektiöser Arthritis zu ermöglichen. Dieser Artikel beschreibt die Prozesse der Gewebeaufnahme durch gängige offene Gelenkoperationen, wie den vollständigen Gelenkersatz, das JSAS-Design, die Histomorphometrie, die zur Quantifizierung akuter struktureller Veränderungen im Synovium notwendig ist, sowie die funktionellen Reaktionen des Gewebes, einschließlich Immunfluoreszenz (IF), RNAscope und enzymgebundener Immunsorbent-Assay (ELISA). JSAS unterscheidet sich von gängigen menschlichen In-vitro-Modellen dadurch, dass die IntL- und SubL-Strukturen erhalten bleiben, was nahezu in vivo Einblicke in akute oder akute chronische Synovitis, die zu Knorpelschäden führt, ermöglicht. Durch die Erhaltung der natürlichen Struktur des Synoviums ist es möglich, die intrinsischen Fähigkeiten des RSM und FLS zu zerlegen, um Entzündungen zu dämpfen oder zu perpetuieren. Als ex vivo Modell erfordert es weder die Differenzierung peripherer Immunzellen in synovale Makrophagen noch eine Vereinfachung des Synoviums auf nur 1–2 einzelne Zelltypen. Es unterscheidet sich von Tiermodellen wie Kollagen-induzierter Arthritis (CIA) durch die Verwendung von natürlich krankem menschlichem Gewebe, was eine pathogenspezifische Bewertung ermöglicht, die für den Menschen relevant ist. Schließlich können mehrere Infektionen simuliert werden, was ein Modell von septischer Arthritis neben Arthrose und entzündlicher Arthritis ermöglicht. Die Haupteinschränkung ist die Kultur von 3 Tagen unter normalen Bedingungen vor Beginn der Apoptose.

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Protokoll

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Die Patienteneinwilligung und das Gewebeverarbeitungsprotokoll wurden vom örtlichen Institutional Review Board (IRB) genehmigt. Die Reagenzien und die verwendeten Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Gewebeaufnahme und Biopsie

  1. Identifizieren Sie Patienten präoperativ basierend auf den Zeitplänen des Chirurgen. Rekrutieren Sie Patienten im Alter von 18 bis 65 Jahren, die sich einer offenen Gelenkoperation unterziehen, wie der totalen Kniearthroplastik (TKA) oder der Tibialtuberkelosteotomie (TTO, auch bekannt als Fulkerson), und die keine systemische immunmodulative Medikation einnehmen.
    HINWEIS: Idealerweise sollten Patienten ausgeschlossen werden, die mehr als eine Arthroskopie oder mehr als eine Glukokortikoid-Injektion erhalten haben, da diese Patienten aufgrund von Fibrose ein höheres intraoperatives Versagen der Gewebeaufnahme hatten als andere Populationen. Angesichts des Infektionsrisikos sollte die Rekrutierung von Patienten mit einer Vorgeschichte von Hepatitis C oder Humanem Immundefizienzvirus (HIV) aufgeschoben werden, sofern dies für die Ergebnisse relevant ist. Praktizieren Sie jederzeit sichere Handhabungspraktiken mit frischem menschlichem Gewebe, unabhängig vom Infektionsstatus.
  2. Orthopädische Chirurgen führen Arthrotomie und Dissektion als Teil des Standardverfahrens durch. Identifizieren Sie das vordere Synovium unmittelbar proximal zur Trochlearrille und verwenden Sie Elektrokauterie, um das Synovium en bloc zu entfernen, wobei die Dissektion des Musculus articularis genu oder der Nähe der medialen und lateralen Epikondylen vermieden wird. Die Synovektomie ist relativ neutral für TKA-Ergebnisse und kann bei entzündlichenBedingungen vorteilhaft sein. Geben Sie das Synovium steril an das Forschungsteammitglied und legen Sie es in einen sterilen Probenbehälter mit kaltem Dulbeccos phosphatgepufferter Kochsalzlösung (DPBS) auf Eis.
    HINWEIS: Beenden Sie die Gewebeaufnahme, wenn vom Operationsteam Auffälligkeiten festgestellt werden oder wenn eine Synovektomie den Verschluss oder das Operationsergebnis beeinträchtigen würde. Letzteres wäre insbesondere bei TKA sehr selten, da die Synovium-Exzision als Streckverfahren zur Lockerung engerer Gelenke eingesetzt werden kann. Die Menge der Exzision hängt von der Größe des Experiments ab. Es ist möglich, etwa vier 3-mm-Biopsiekerne pro 1 cm² Gewebe zu erhalten. In vielen Fällen ist es möglich, 24 cm2 oder mehr Gewebe zu erhalten. Das Gewebegewicht hängt stark von der chirurgischen Dissektion ab und ist daher nicht so zuverlässig wie die Oberfläche zur Bestimmung der Angemessenheit für das Experiment. Abbildung 1 zeigt die Schritte 1.2–1.7.
  3. Bring das Synovium ins Labor zurück und wasche zweimal in kaltem DPBS für 10 Minuten auf einer Plattenschaukel.
  4. Übertragen Sie das Synovium unter sterilen Bedingungen in eine 10 cm oder größere sterile Petrischale in einem Biosicherheitsschrank der Stufe 2 (BSL2). Fügen Sie kaltes, steriles, glukosearmes Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) mit Natriumpyruvat und L-Glutamin hinzu, genug, um die Schale halb zu füllen. Identifizieren Sie die Synovialauskleidung anhand der perlmuttbildenden IntL-Schicht (Abbildung 2A) im Gegensatz zur kauterisierten Seite (Abbildung 2B).
    HINWEIS: Die IntL ist zerbrechlich. Achte darauf, ihn nicht abzuziehen, sonst dissoziiert er von der Sublinne (Abbildung 2A, gehalten von Hämostat). Die Perlemärzzigkeit kann durch eine vorherige Vorgeschichte von Hämarthrose (die durch Hämosiderin gelb-orange erscheint), einen hohen BMI (mit Fett bedeckt) oder Entzündungen (rot, brüchig und zockig) verändert werden. Es ist absolut notwendig, die IntL vor dem Fortschreiten korrekt zu identifizieren. Untersuchen Sie sorgfältig Anzeichen für chirurgische Exzision, Kauterisation, Blutung und Gerinnung, um festzustellen, dass die folgenden Schritte im IntL nicht stattfinden.
  5. Entfernen Sie überflüssiges Fett- und Stromalgewebe auf der kauterisierten Seite, um das Synovium zu isolieren, wobei die Gewebetiefe in allen Bereichen etwa 4–5 mm erhalten bleibt. Irisscheren oder Skalpelle können nach persönlicher Vorliebe verwendet werden. Ändern Sie das Petrischaal-Medium nach Bedarf, um das Sichtfeld zu erhalten.
    HINWEIS: Hinteres stromales oder fetthaltiges Gewebe lässt sich leicht entfernen. Allerdings sind Schwierigkeiten bei der Dissektion oder starker Widerstand ein Hinweis auf zurückgebliebene Bänder, Gewebemetaplasie wie ungeeignete Knorpelablagerung oder das Durchschneiden des IntL.
  6. Nach der Zerlegung auf die entsprechende Tiefe werden 3-mm-Biopsiekerne nach Bedarf benötigt, um mindestens 2 technische Replikationen pro getesteten Zustand zu erhalten. Führen Sie die Synovialauskleidung mit dem Kernwerkzeug aus, statt gegen die Oberfläche der Petrischale. Ein hochwertiger Biopsie-Punch kann etwa 10–15 Mal verwendet werden, bevor er aufgrund von Abstumpfung ersetzt werden muss, da ein stumpfer Biopsie-Punch zu Schäden an der intimen Schleimhaut führt.
    1. Führe Kernbohrungen mit kräftiger senkrechten Belastung und sanftem Drehen durch. Wenn dadurch das Gewebe verdreht wird, ist das Biopsiewerkzeug stumpf geworden und muss ersetzt werden. Stabilisiere mit der nicht-dominanten Hand mit einer Pinzette oder Hämostaten.
      HINWEIS: 3-mm-Kerne wurden verwendet, um die Gewebeperfusion sowie die Anzahl der Kerne pro Patient zu maximieren und genügend technische Replikationen für diese Experimente zu gewährleisten. Alternative Größenkerne können verwendet werden, aber für dieses Protokoll wurden nur 3 mm getestet.
      HINWEIS: Überschüssiges zurückgehaltenes Fett durch unzureichende Dissektion kann dazu führen, dass der Kern in JSAS schwimmt, was suboptimal ist. Wenn die Kerne an die Oberfläche schwimmen, anstatt untergetaucht zu bleiben, kehren Sie zur Dissektion zurück oder wählen Sie einen untergetauchten Kern.
  7. Öffne eine zweite Petrischale und fülle sie mit 5–10 ml erwärmtem (37 °C) Medium mit 10 % FBS. Mit flachen oder nicht gezahnten Zangen werden die Kerne auf diese Schale übertragen, um Schmutz mit 1-2 Sekunden sanfter mechanischer Bewegung abzuwaschen. Kneifen Sie die Kernen nicht fest zusammen, da dies die Intimschleimhaut beschädigen könnte.
    HINWEIS: Kann hier für ≤24 Stunden pausiert werden, indem Gewebekerne im Inkubator mit einer Standardeinstellung von 37 °C und 5 %CO2 platziert werden.

2. Einrichtung des Joint Space Analysis System (JSAS)

  1. Bereite den unteren Brunnen von JSAS mit 600 μL erwärmtem (37 °C) niedrigem Blutzucker-DMEM mit 10 % FBS vor. Obwohl 1 % Penicillin-Streptomycin in diesem System ohne spürbare Nebenwirkungen getestet wurden, werden Antibiotika in der Regel nicht in die Medien gegeben, wenn die Sterilität ausreichend aufrechterhalten wurde.
    HINWEIS: Bei Kokultivierung mit Bakterien oder einer Zelllinie, die ein anderes Medium benötigt, kann der Bodenbrunnen ein anderes Medium sein. Vermeiden Sie Antibiotikum, wenn Sie mit Bakterien kokultivieren.
  2. Am Ende fügen Sie die bevorzugte Behandlung hinzu. Zum Beispiel Lipopolysaccharid (LPS). Um Osmolaritätsunterschiede zu vermeiden, wird empfohlen, dass das Behandlungsvolumen 2,5 % des Gesamtvolumens nicht überschreitet (z. B. ≤15 μL für 600 μL). Puffere alle pH-Veränderungen durch Behandlungen, um den pH-Wert von 7,0 bis 7,4 aufrechtzuerhalten. Ansonsten nutzen Sie Fahrzeugsteuerungen.
  3. Wählen Sie die Porengröße des Transwells abhängig vom gewünschten experimentellen Ergebnis (Abbildung 3).
  4. Fügen Sie 300 μL niedriges Glukose-DMEM mit 10 % FBS zum Transwell hinzu.
  5. Übertragen Sie einzelne Kerne vorsichtig mit steriler Pinzette in das Medium des Transwells. Die Orientierung des Gewebes kann nicht kontrolliert werden; Allerdings sorgt die Fettigkeit und natürliche Auftriebskraft des stromalen Gewebes dafür, dass die Intimusschicht für die meisten Gewebekerne mit dem Rücken nach unten verkehrt.
    1. Stellen Sie sich die Kerne sorgfältig vor, da der Bohrprozess die Intimschleimhaut stören kann, und vermeiden Sie die Verwendung von Kernen, die zu Beginn des Experiments ausgefranst erscheinen. Wenn der Kern schwimmt, verbessern Sie die Dissektion und wählen Sie einen alternativen Kern.
      HINWEIS: Betrachten Sie eine Kollagenmatrix, wenn die Gewebeorientierung wichtig ist; Dies wirkt sich jedoch auf die Zeit aus, bis ein chemischer Gradient mit dem Bodenbrunnen entsteht.
  6. Im Inkubator bei 37 °C und 5 %CO2 für die gewünschte Zeit platzieren.
    HINWEIS: Der früheste empfohlene Zeitpunkt für biologische Veränderungen ist 8 Stunden. Der aktuellste validierte Zeitraum für die biologische Aktivität beträgt 3 Tage.

3. Experimentelle Entfernung und Analyse

  1. Für die Histologie verwenden Sie sterile, nicht gezahnte Pinzetten, um Gewebe auf 3–5 ml 10 % neutrales gepuffertes Formalin (NBF) für die formalinfixierte, paraffin-eingebettete (FFPE)-Analyse zu übertragen. Lagere 3-7 Tage im NBF auf, bevor du einbettest und teilst.
    1. Lassen Sie das Gewebe nicht über längere Zeit ruhen, da dies die Autofluoreszenz verschlechtert. Führen Sie eine histologische Analyse durch, einschließlich Hämatoxylin- und Eosin-(H&E)11-Färbungen für Histomorphometrie, Immunfluoreszenz (IF)12 und/oder RNA-Skope mit IF13 gemäß Standardmethoden.
      HINWEIS: Achten Sie darauf, das Transwell beim Entfernen des Gewebes nicht mit einer Pinzette zu durchstochen. Seien Sie äußerst vorsichtig beim Bewegen des Kerns, sonst könnte sich die Intimschleimhaut dissoziieren. Setzen Sie den Kern vorsichtig in die Fixation und bewegen Sie nicht. NBF sollte in einer zertifizierten chemischen Abzugshaube verwendet werden, muss gemäß den örtlichen Umweltschutz- und Sicherheitsrichtlinien (EHS) entsorgt werden und darf nicht in Waschbecken gegossen werden. Ungenutztes menschliches Gewebe aus dem Experiment wird 30 Minuten lang mit mehr als 10 % Bleichmittel behandelt, dann gemäß den lokalen EHS-Anforderungen in eine sekundäre Eindämmung gelegt und anschließend in beschrifteten Biohazard-Behältern zur Verbrennung entsorgt. Die Bleichlösung kann in die Spüle gegossen werden, wenn sie von der örtlichen EHS genehmigt ist. Befolgen Sie lokale Richtlinien, die je nach Institution unterschiedlich sein können.
  2. Stecke technische Replikate im selben FFPE-Block ein. Verwenden Sie abgeschirmte Kassetten, um den Verlust der Probe zu vermeiden. Querschnitt in der Längsachse bei 5 μm Dicke. Platziere drei Serienabschnitte auf einer Folie (ergänzende Abbildung 1).
  3. Bild H&E zeigt mit 10x und 40x mit Hellfeldmikroskopie. Identifizieren Sie das IntL als die organisierte zelluläre Schicht an der Grenzfläche zwischen Gewebe und leerem Raum.
    1. Erwerben Sie 3 repräsentative 10-fache Schnitte und 10 repräsentative 40-fache Schnitte über mindestens 2 technische Replikationen pro Behandlungsbedingung, wobei das IntL im Sichtfeld erhalten bleibt. Nehmen Sie Bilder als hochauflösende TIFFs auf. Führen Sie eine Histomorphometrieanalyse durch:
    2. Führen Sie Messungen in ImageJ/FIJI durch. Zuerst stellen Sie die Skala über das Menü Analysieren → Skalierung festlegen. Set Scale erfordert die Verwendung eines Kalibrierungsdias, der auf jedem jeweiligen Mikroskop an jedem Objektiv abgebildet wird. Verwenden Sie zunächst das Geradelinien-Werkzeug, um eine Linie bekannter Länge basierend auf dem Kalibrierungsdiabild zu erstellen. Weisen Sie die Skala global zu.
      HINWEIS: Bei 10x beträgt die Skala 3 px/μm. Bei 40x beträgt die Skala 12 px/μm.
    3. Misse die SubL-Dicke mit den 10x-Bildern und dem Geradelinien-Werkzeug. Messen Sie die Dicke als lodrale Tiefe von der IntL-Oberfläche bis zum unteren Ende des SubL (μm). Nach dem Zeichnen jeder Linie verwenden Sie die Tastenkombination m , um die Länge der Linie zu messen.
      1. Durchschnittlich mindestens 5 Messungen pro 10x-Bild (Abbildung 4A,B). Der Übergang zwischen SubL- und Stromgewebe wird durch einen Übergang zu weniger organisierten, weniger zellulären Bereichen mit Kollagen und Fettgewebe markiert (Abbildung 4B). Den Übergangspunkt zwischen den Gewebekompartimenten halbieren.
    4. Für 40-fache Messungen der IntL-Dicke, der IntL-Zellintensität, der IntL-Integrität und der SubL-Zellularität beginnen Sie damit, das 40x-TIFF in Adobe Photoshop (oder einem ähnlichen Bildeditor) zu öffnen. Das IntL ist definiert als eine Schicht von ~1–5 Zellen dick, die an der Grenzfläche zwischen Gewebe und leerem Raum (z. B. Synovialflüssigkeit) zu einer deutlichen zellulären Schicht organisiert ist (Abbildung 4C).
    5. Erstelle eine neue Ebene. Wählen Sie das Polygonal-Lasso-Werkzeug . Mit einem Mausklick, um das Lasso sowie Anker-Inflexionen in der Linie auszulösen, teilt man den Übergang zwischen IntL und SubL über das gesamte Bild hinweg. Dann setzt man das Lasso direkt außerhalb des IntL im leeren Raum fort.
      1. Schließe das Lasso mit einem Doppelklick. Invertiere den ausgewählten Bereich (wähle → Inversen) und fülle den Raum dann mit dem Farbeimer-Werkzeug mit Schwarz. Dies deckt alle Bereiche ab, die nicht die IntL sind. Speichere dieses Bild als hochauflösendes JPG, das das IntL darstellt, und blende dann die Ebene aus.
    6. Erstelle eine neue Ebene. Unter den Polygon-Lasso-Einstellungen wählt man die Schnittstellenfunktion , die nur anzeigt, wo sich der neue und der alte Lassobereich kreuzen. Lasso-Schicht um die Sublining-Schicht herum, indem man durch die Mitte des IntL, an den linken und rechten Rändern des Bildes in die Hintergrundleinwand klickt und dann den Übergang zwischen SubL und azellulärem Gewebe dahinter halbiert.
      1. Wenn der untere Teil des SubL die Abmessungen des 40x-Bildes übersteigt, wählen Sie einfach die Hintergrundleinwand um die verbleibende Kante herum. Wähle erneut das Inverse dieses Bereichs wie oben aus und fülle dann mit dem Farbeimer-Werkzeug mit Schwarz. Speichere dieses Bild als hochauflösendes JPG, das das SubL darstellt. Speichere dieses geschichtete Bild als PSD für die spätere Referenz.
        HINWEIS: Erythrozyten sind in diesen Objektträgern häufig und können zukünftige Zellzählmessungen beeinträchtigen. Wenn es große Gefäßflächen gibt, verwenden Sie das Polygon-Lasso-Werkzeug, das Pinselwerkzeug oder andere bevorzugte Werkzeuge, um Masken auf einer separaten Schicht zu erstellen, die diese Bereiche abdeckt.
    7. In FIJI öffnen Sie das IntL-Maskenbild . Messen Sie die IntL-Dicke (μm) als Durchschnitt von mindestens 5 Messungen über das 40x-Bild mit dem Geradenlinien-Werkzeug wie in Schritt 3.3.2-3.3.3.
    8. Missen Sie die Gesamtlänge (μm) des IntL mit dem segmentierten Linienwerkzeug. Messen Sie dann nur die Länge der intakten Flächen, ebenfalls mit dem segmentierten Linienwerkzeug (Abbildung 4D, E). IntL-Schnitte, die nicht vollständig sind, sind durch Lücken zwischen den Zellen, ein mottengefressenes Aussehen sowie das Abbrechen oder Abblättern von IntL vom Gewebe markiert.
      1. Berechnen Sie den % intakten IntL-Rand in als (intakte IntL/gesamt IntL)*100. Dies muss mit denselben Zeitpunktkontrollen verglichen werden, um etwaige Sektionierungsartefakte auszugleichen.
    9. Misse die Zellularität des IntL mit dem IntL-Maskenbild. Zuerst transformieren Sie auf 8-Bit (Bild → Typ → 8-Bit). Dann Schwellenwert (Bild → Schwelle), um Rauschen zu minimieren und die Zellenidentifikation zu maximieren. Im Schwellenmenü deaktivieren Sie den dunklen Hintergrund und verwenden Sie den unteren Schalter für Anpassungen.
      1. Manuelle Bestimmung des Schwellenwerts pro Bild, unterstützt durch das Verschwinden von Rauschen (z. B. Hintergrundartefakte), während die ursprüngliche Anzahl der Kernkörper beibehalten wird. Vergleichen Sie häufig das Originalbild, um die Treue zu gewährleisten. Wenn das Rauschen minimiert wird (falsch positiv), aber das Hämatoxylinsignal maximiert wird (echtes nukleares positiv), ist es angemessen, die Schwelle festzulegen (ergänzende Abbildung 2).
        HINWEIS: Der Schwellenwert ist über einen einzelnen Dia-Scan hinweg konstant, variiert aber zwischen den Dia-Scans und auch zwischen einzelnen 10- oder 40x-Bildern. Sie unterscheidet sich auch zwischen H&E-Chargen, da die Farbtiefe wahrscheinlich nicht konstant ist. Daher sind einfache Makros ungeeignet, wenn es Unterschiede in einer der folgenden Kategorien zwischen den Bildern gibt: Patient, H&E-Charge, Schnittdicke, Lichtbedingungen (Helligkeit/Farbtemperatur im Raum oder Mikroskop), Software zur Bildaufnahme, Mikroskop zur Bildaufnahme und Verwendung von Weißabgleichs- oder Farbausgleichsalgorithmen. Diese Liste ist nicht vollständig. Mit dem AmScope T390B-3M-Mikroskop mit kompatibler Kamera und Software, mit maximalem Mikroskoplicht in einem schwach beleuchteten Raum, automatischen Weißabgleichseinstellungen, 10 zufällige 40x-Aufnahmen mit 3 Patienten, lag der Schwellenwert zwischen 96 und 182, mit einem Durchschnitt von 137. Dieser große Bereich spiegelt die Unterschiede in den zugrunde liegenden 8-Bit-Histogrammen wider, nicht die Benutzerinkonsistenz. Daher ist es unerlässlich, die visuelle Genauigkeit zwischen dem Originalbild und dem Schwellenbild sicherzustellen, nicht die genaue Zahl des Schwellenwerts. Die Automatisierung dieses Prozesses liegt außerhalb des Aufgabenbereichs eines typischen Laborwissenschaftlers und würde eine Programmierung durch einen Bildanalyse-Profi erfordern.
    10. Verwenden Sie Analyze Particles (Analyze → analyze particles) mit Zellgröße 8–150 μm² , um Kerne als Ersatz für die Zellzahl zu identifizieren und zu zählen. Wählen Sie in den Einstellungen Overlay-Masken aus, um die identifizierten Zellen zu visualisieren und erneut mit dem Originalbild zu vergleichen. Da das IntL in erster Linie eine lineare, nicht volumetrische Struktur ist, normalisiere diese 100 μm IntL-Länge (z. B. #cells/100 μm). Dies betrug im Durchschnitt etwa 13,19 (Bereich 5,4–21,9, SD 3,9) Zellen pro 100 μm in frisch entnommenem Synovialgewebe.
      HINWEIS: Der Bereich 8–150 μm2 wurde anhand der Set Scale und iterativem visuellen Vergleich des Schwellenwertbilds mit dem Originalbild bestimmt. Die empirisch durch den Datensatz festgelegten Grenzwerte entsprechen Formannahmen, die auf Makrophagen basieren, deren Zelldurchmesser etwa 8–20 μm14,15 variieren kann. Größere Größen wurden ausgeschlossen, da dies oft mehrere diskrete Kerne in unmittelbarer Nähe darstellte, die als eine Zelle ausgelesen wurden.
      HINWEIS: Ähnliche Arbeitsabläufe können beispielsweise in QuPath eingerichtet werden.
    11. Öffnen Sie die SubL-Maske mit ausgeschlossenen Erythrozyten (Abbildung 4G). Führen Sie 8-Bit-Transformationen durch, Schwellenwert und analysieren Sie Partikel wie in den Schritten 3.3.9-10 erwähnt. Da die SubL eine volumetrische Schicht ist, normalisieren Sie die Anzahl der gezählten Zellen auf 100 μm² SubL-Fläche (z. B. Messung nicht maskierter Flächen) (Abbildung 4H).
  4. Für die Durchflusszytometrie der wandernden Zellen im unteren Brunnen zentrifugieren Sie bei 300 x g bei 4 °C für 10 Minuten und lassen Sie das Zellpellet auf Eis. Erwarten Sie ~20.000 lebende, wandernde Zellen pro 3-mm-Biopsiekern bei 24 Stunden. Flowzytometrie-Methoden wurden bereits zuvorveröffentlicht 8.
  5. Für ELISA wird das Medium mit maximaler Geschwindigkeit (>5000 x g) für 5 Minuten bei 4 °C zentrifugiert, um Zellen oder Zellreste zu pelletieren. Lagern Sie bei der gewünschten Temperatur. ELISA-Methoden wurden bereitsveröffentlicht 8.

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Ergebnisse

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Optimierung der Sauerstoffkulturbedingungen

Die physiologische Gewebeperfusion beträgt etwa 6–8 % Sauerstoff, während die Standardinkubationsbedingungen für Zellkultur atmosphärische Sauerstoffwerte (~21%)16 sind. Im Vergleich dazu kann Hyperoxygenierung die Lebensfähigkeit von Zellkulturen verbessern oder toxischsein. Eine ausreichende Nutzung von JSAS erforderte eine frühzeitige Bestimmung der Lebensfähigkeit des Synovialgewebe...

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit demonstrierte die Fähigkeiten von JSAS, insbesondere die Erhaltung des lebenden Synovialgewebes mit intakter, funktional responsiver Synovialarchitektur. In den meisten Inkubationsbedingungen gab es minimalen Zelltod bis zu 72 Stunden Kultur. Zur Bewertung der mikroskopischen Veränderungen der Synovialstruktur wurde ein einzigartiges histologisches Messsystem beschrieben, das strukturelle Veränderungen des IntL und SubL quantifiziert. Solche Veränderungen deuten auf eine aku...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Es gibt keine Interessenkonflikte.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieses Protokoll wäre ohne die Großzügigkeit der Patienten, die ihr Gewebe gespendet haben, und die Kompetenz unserer orthopädischen Chirurgenkollegen, die bereit sind, Gewebe im Auftrag der Arbeit sicher zu erwerben, nicht möglich gewesen. K.I.C. wird von NIAMS K08 AR084605 unterstützt, und C.P.P. wird vom Veterans Affairs Career Development Program [IK2BX004532] unterstützt. Diese Gruppe würdigt die Nutzung der University of Iowa Central Microscopy Research Facility, einer Kernressource, die vom Vizepräsidenten für Forschung der University of Iowa unterstützt wird, sowie des Carver College of Medicine. Flowzytometriedaten wurden in der Flow Cytometry Facility gewonnen, einer Kernforschungseinrichtung des Carver College of Medicine / Holden Comprehensive Cancer Center an der University of Iowa. Die Einrichtung wird durch Nutzergebühren und die großzügige finanzielle Unterstützung des Carver College of Medicine, des Holden Comprehensive Cancer Center und des Iowa City Veteran's Administration Medical Center finanziert. Die in dieser Veröffentlichung berichtete Forschung wurde unterstützt von: dem National Center for Research Resources der National Institutes of Health unter der Genehmigung Nummer 1 S10 OD034193-01; und das National Cancer Institute der National Institutes of Health unter der Auszeichnungsnummer P30CA086862.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
10 cm Petri dishesCorningCLS430167
23srRNA RNAscope probeACD/Biotechne468211
24 well platesLife Sciences3524
3 mm biopsy punchesIntegra12460406
50 mL conicalsN/A
70% ethanol (zur Sterilisation)N/A
Borrelia burgdorferiATCC35210 muss in der späten exponentiellen Phase für maximale Pathogenität verwendet werden
BSK-HSigma-AldrichB8291
CD68-AntikörperInvitrogen14-0688-821:1000
CO2-Tank (Standardbedingungen)N/A
Dulbecco's Phosphat-gepufferter Saline (Ca-/Mg-)Thermofisher14190144
fetal bovine serumBiotechneS11150Wärme inaktiviert Lot: F22100
Forceps (ohne Zähne)N/A
HämostatN/A
Befeuchteter Zellinkubator (Standardbedingungen)N/A
Hypoxie-InkubatorN/A
Hypoxie-Tank (5% O2, 5% CO2, Rest N2, physiologische Bedingungen)N/A
IL-4-AntikörperThermofisherMA5-424701:100
iNOS-AntikörperThermofisherPA1-0361:100
Iris-SchereN/A
LipopolysaccharidSigma-AldrichL2630
DMEM mit niedriger Glukose (+Natriumpyruvat, +L-Glutamin)Life Technologies11885084
MMP9-AntikörperThermofisherMA5-327051:1000
Modulare Inkubatorkammer (hyperoxische Bedingungen)Emrbient, IncMIC-101
Monozyten-Chemoattraktives Protein 1Peptrotech300-04-20UG
N-AcetylcysteinSigma-AldrichA9165Muss für jedes Experiment frisch hergestellt und in äquimolarem Natriumbicarbonat auf einen pH-Wert von 7-7,4 gepuffert werden
OPG ELISAMilliporeRAB04841:1 Verdünnung
Sauerstofftank mit Liter pro Minute DurchflussreglerN/A
PDPN-AntikörperInvitrogen14-9381-821:100
PropidiumiodidThermofisherJ66764.MC
RNAscope Multiplex Fluoreszenz V2 AssayACD/Biotechne323100
sRANKL ELISAMyBioSourceMBS2626241:1 Verdünnung
Staphylococcus aureus USA 300 MRSAATCCBAA-1717
SYBR GreenThermofisherS756310.000-facher Vorrat
TNF-AntikörperThermofisherPA5-198101:100
Transwell-Inserts - 0,4 µm GrößeMillicellPICM01250
Transwell-Inserts - 5 µm GrößeCorningCLS3421

Referenzen

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